PIANTE TRANSGENICHE. PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE IMPORTANTE caratteristica delle cellule...
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PIANTE TRANSGENICHE
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PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE
IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZAQuesta caratteristica è alla base della possibilità di creare piante transgeniche
la possibilità di rigenerare un’intera pianta da singole cellule differenziate
in vitro è possibile ri-generare un organismo vegetale variando il rapporto di auxina e citochinina (ormoni vegetali che regolano
proliferazione e differenziamento)
•CALLI :ammassi cellulari sdifferenziati propagabili in vitro all'infinito.
•GERMOGLI•RADICI
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Foglia sterilizzata
Auxina/Citochina
Auxina/Citochina
Auxina/CitochinaRADICI
GERMOGLI
CALLO
RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO
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RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO
Auxina/CitochinaAuxina/Citochina
germogliradici
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PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE
1)Agrobacterium tumefaciens2)Bombardamento
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Agrobacterium tumefaciens Batterio del suolo Gram-
Fitopatogeno che trasforma geneticamente le piante colpiteCOLPISCE LE DICOTILEDONI (vite, rose, piante frutto carnoso e seme legnoso)
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Agrobacterium tumefaciens
Plasmide Ti (induttore del Tumore)Contiene il T-DNA (transfer DNA)
T-DNA 12-24Kb
Il batterio è attirato da compostifenolici escreti dalla ferita della piante
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Agrobacterium tumefaciens Il batterio è attirato da composti
fenolici escreti dalla ferita della piante
Queste sostanze ATTIVANO i geni VIR (7/8) del plasmide TiL’attivazione dei geni VIR è necessaria per l’integrazione nel DNA della pianta
T-DNA è trasferito come molecola lineare a singolo filamento con meccanismo simile a coniugazione batterica
Le regioni ripetute alle estremità (25bp) IMPORTANTIper meccanismo di taglio e integrazione
PRIMA: si attivano i geni VIR importanti per trasferimento T-DNADOPO: si attivano i geni del T-DNA AUXINA-CITOCHINA-OPINA
Fonte di Carbonio utilizzabile solo da A.t.
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Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE
Svantaggi:
1)Auxine/Citochine prodotte dal T-DNA impediscono corretta rigenerazione della pianta2)Produzione dell’Opina non è utile per la pianta (dannosa?)3)Plasmidi Ti sono grandi (200-800Kb)4)Plasmidi Ti non hanno ORI
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Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE
2 METODI
Neomicina trasferasiResistenza alla Kanamicina
Per amplificare il plasmidein E.Coli
1) VETTORE BINARIO
No geni VIR
Aiuta il trasferimento del T-DNA del VETTORE BINARIO
geni VIR
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Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE
2) VETTORE COINTEGRATO
RICOMBINAZIONE
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1) VETTORE BINARIO 2) VETTORE COINTEGRATO
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Agrobacterium tumefaciens per produzione
di PIANTE TRANSGENICHE
DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI
Alcuni protocolli elaborati hanno permessol’utilizzo di A.tumefaciens anche in mais e riso
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• Trasformazione mediata da microproiettili rivestiti da DNA• Utilizzato per saggi RAPIDI• BASSA frequenza di integrazione stabile ed ereditabile del DNA nel genoma della pianta• Possibilità di inserzioni MULTIPLE
BombardamentoUtilizzato per la maggior parte delle Monocotiledoni
Utilizzato per inserire DNA in:
•Monocotiledoni•Sospensioni di cellule vegetali
•Colture di callo•Embrioni immaturi
•Polline di molte piante•Mitocondri e cloroplasti
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Bombardamento
Particelle d’oro o tungsteno,ricoperte da DNA (precipitato con CaCl2/spermidina) sonoaccelerate a 300-600 m/s con un “cannone da particelle” (polvere da sparo, elio, aria compressa)
A questa velocità il DNA supera la parete vegetale e penetra nel NUCLEOIl DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti
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Agrobacterium e Bombardamento
Introduzione del DNAsolo nel NUCLEO
Introduzione del DNAanche in cloroplasto/mitocondrio
Infetta soloDICOTILEDONI
InfettaMONOCOTILEDONI
DICOTILEDONIEMBRIONI
etc
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ALTRI METODI
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ORGANISMO MODELLO: Arabidopsis Thaliana
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L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO:
Le piccole dimensioni
Il breve ciclo vitale
Il piccolo genoma (più piccolo tra tutte le piante 125 Mb)
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L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO:
Facilità nel divenire transgenica
Notevole disponibilità di mutanti
Elevata produzione di semi (1 pianta: 10.000 semi)
d:0,5mm
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Utilizzo di GENI REPORTER nelle cellule vegetali trasformate
Importante poter rilevare se la trasformazione è avvenuta
GFP: Green Fluorescent protein
LUCIFERASI
GUS: -D-glucuronidasi
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GUS: -D-glucuronidasida E.coli
GENE reporter uidA codifica per GUS
Numerosi glucorinidi possono essere usati come substrato della reazione enzimatica:
•Colorazione istochimica: X-Gluc•Saggi spettrofotometrici: il p-nitrofenil β-D-glucuronide •Saggi fluorimetrici: il 4-metilumbelliferil-beta-D-glucuronide
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Studio dei PROMOTORI/ENHANCER(promoter trap/enhancer trap)
Neomicina trasferasiResistenza alla Kanamicina/G418
Per amplificare il plasmidein E.Coli
PROMOTOREassente/PROMOTOREminimo
Gene REPORTER
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ENHANCER TRAP (GUS)
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ENHANCER TRAP (GFP)
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GAL4/GFP-ENHANCER TRAP
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COLLEZIONE di ArabidopsisGAL4/GFP-ENHANCER TRAP
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T1-T6 lunedi 10/05 ora:16-18T7-T12 giovedi 13/05 ora:16-18
D1-D6 lunedi 17/05 ora:16-18D7-D11-P4 giovedi 20/05 ora: 16-18
P1-P7 lunedi 24/05 ora: 16-18P8-P14 giovedi 27/05 ora: 16-18