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PREUVE COMMUNE DE TIPE 2008 - Partie D TITRE : Comment saffranchir de la limite de la diffraction en microscopie optique? Temps de prparation : ...2 h 15 minutes Temps de prsentation devant le jury : .10 minutes Entretien avec le jury : ..10 minutes GUIDE POUR LE CANDIDAT : Le dossier ci-joint comporte au total : 17 pages Document principal (16 pages) : Comment saffranchir de la limite de la diffraction en microscopie optique? Travail suggr au candidat : Le candidat donnera tout dabord le principe gnral de fonctionnement dun microscope optique. Il dtaillera ensuite plus particulirement la microscopie de fluorescence. Enfin il essaiera de montrer comment la microscopie PALM a permis de saffranchir de la limite de la diffraction pour obtenir des images avec une prcision nanomtrique. CONSEILS GENERAUX POUR LA PREPARATION DE L'EPREUVE : * Lisez le dossier en entier dans un temps raisonnable. * Rservez du temps pour prparer l'expos devant le jury.

- Vous pouvez crire sur le prsent dossier, le surligner, le dcouper mais tout sera remettre au jury en fin doral.

- En fin de prparation, rassemblez et ordonnez soigneusement TOUS les documents (transparents, etc.) dont vous comptez vous servir pendant loral, ainsi que le dossier, les transparents et les brouillons utiliss pendant la prparation. En entrant dans la salle d'oral, vous devez tre prts dbuter votre expos.

- A la fin de l'oral, vous devez remettre au jury le prsent dossier, les transparents et les brouillons utiliss pour cette partie de l'oral, ainsi que TOUS les transparents et autres documents prsents pendant votre prestation.

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Comment saffranchir de la limite de la diffraction en microscopie optique?

Introduction : 5

En science, les recherches qui ont besoin de dvelopper des optiques de plus en plus

complexes sont trs nombreuses. On peut citer lexemple des recherches en astronomie qui

doivent dvelopper des tlescopes toujours de plus en plus performants pour observer toujours

plus loin. Dans des domaines dchelle dtudes compltement opposs, le microscope est un

instrument optique conu pour observer des objets de trs faible taille, il permet de grossir 10

l'image d'un objet de petites dimensions et de sparer les dtails de cette image afin qu'ils

soient observable l'il nu. Lemploi en histoire naturelle du microscope simple, constitu

dune seule lentille convergente, remonte au XIVe sicle. Cest en 1667 que Robert Hooke

prsente le premier microscope compos de plusieurs optiques avec lequel il observe de

nombreuses cellules vgtales. Jusqu nos jours, de nombreux dveloppements ont eu pour 15

objets de corriger les aberrations optiques de l'appareil mais le principe dun microscope

optique na pas vraiment chang depuis sa dcouverte et nous verrons tout dabord dans une

premire partie son principe simplifi. Nous dvelopperons ensuite la dernire microscopie

optique en vogue: la microscopie de fluorescence qui est utilise dans plus de 80% des tudes

en biologie. 20

Dans une deuxime partie, on sintressera plus particulirement la proprit la plus

importante dun microscope : son pouvoir de rsolution. Ernest Abbe a montr en 1873, par

une formule qui porte son nom, que la rsolution dun microscope optique est limite par le

caractre ondulatoire de la lumire. La diffraction de la lumire au niveau de lobjet observ

combine aux proprits des optiques composant le microscope conduit un pouvoir de 25

rsolution de 200 nm pour un objet observ laide dune lumire dans le visible. Plus dun

sicle aprs la formule tablie par Ernest Abbe, au dbut des annes 2000, il a t montr quil

tait possible en microscopie de fluorescence de saffranchir du problme inhrent du la

diffraction de la lumire et il a obtenu des images avec une prcision nanomtrique. Nous

reviendrons sur ltablissement de la formule du pouvoir de rsolution en microscopie optique 30

par Ernest Abbe et sur cette dcouverte fondamentale qui a permis de saffranchir dune

proprit intrinsque la lumire.

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1) Le microscope optique. 35

Une dfinition simplifie du microscope optique est celle dun instrument optique qui utilise

la lumire visible pour obtenir une image grossie ou agrandie (grossissement) dun objet en la

projetant sur la rtine de lil ou un appareil dimagerie pour en sparer les dtails (pouvoir

de rsolution). Avant de voir plus en dtails le principe dun microscope optique, nous allons

revenir sur la notion de grandissement en tudiant la formation dune image par une lentille 40

convergente, le principe de fonctionnement de lil et la notion de grossissement en optique.

a) Grandissement dun objet par une lentille convergente

Prenons le cas dune lentille mince convergente et plaons-nous dans l'approximation de 45

Gauss. La thorie de l'optique gomtrique permet d'tudier la formation d'images par une

lentille mince convergente. Cette thorie nglige l'aspect ondulatoire de la lumire et la

construction gomtrique de l'image d'un objet produite par une lentille s'effectue l'aide de

trois rayons principaux (Figure 1). Selon la position de l'objet tudi par rapport au foyer de la

lentille convergente, on observe la formation d'une image relle ou virtuelle de lobjet. 50

Limage virtuelle reprsente le principe de la loupe. On dfinit le grandissement comme tant le rapport de la taille de l'image celle de l'objet (Equation 1).

ffx'

xx'

AA'BB'

relle===

ffy'

yy'

BB'CC'

virtuelle+=== Equation (1)

55

Figure 1 : Construction gomtrique de l'image d'un objet produite par une lentille convergente en fonction de la distance de lobjet par rapport la distance focale.

60

3

b) Lil

L'il est un systme optique complexe. L'il humain n'est sensible qu' une bande restreinte

de longueurs d'onde allant de 660 nm (rouge) 410 nm (violet); la sensibilit maximale se

situe aux environs de 550 nm (jaune-vert). Un rayon lumineux qui pntre dans lil traverse 65

successivement la corne, l'humeur aqueuse, le cristallin et l'humeur vitreuse pour,

finalement, tomber sur la rtine. Tous ces milieux sont caractriss par des indices de

rfraction diffrents. On peut cependant faire un modle simple de l'il en le considrant

comme form par une seule lentille convergente projetant une image relle sur un cran (la

rtine) situ 17 millimtres du centre optique (Figure 2). 70

Figure 2 : Modlisation en optique de lil.

Les muscles entourant le cristallin permettent d'en modifier la courbure ce qui fait de l'il un

systme optique distance focale variable. Un il normal permet une vision distincte entre 75

une distance minimale a0 et l'infini. La distance minimale de vision nette a0 est gale en

moyenne 25 cm. L'ouverture angulaire sous laquelle un objet apparat l'il constitue

l'angle de vision, . Cet angle dtermine la taille de l'image sur la rtine (Figure 3). L'angle de vision est limit infrieurement par le phnomne de la diffraction de la lumire par la pupille

(voir paragraphe 3). Une personne ayant une vision normale ne peut distinguer des dtails 80

d'un objet dont la distance angulaire est infrieure 26 secondes d'arc. Cela signifie que, pour

un objet situ la distance minimale de vision nette, des dtails de moins de 30 m ne peuvent tre rsolus. Mais en utilisant une loupe avec une seule lentille, une image virtuelle

agrandie est obtenue et lil peut alors observer des dtails de dimension infrieure.

85

4

c) Le grossissement

Pour caractriser les tailles de l'image et de l'objet, la notion de grandissement a t utilise 90

(paragraphe 1.a). On caractrise par contre de faon absolue linstrument optique par son

grossissement. Soit l'angle sous lequel est vu l'objet tudi lorsqu'il est plac la distance minimale de vision nette a0 et l'angle sous lequel est vu ce mme objet lorsqu'il est observ travers un instrument optique (Figure 3), on dfinit le grossissement (not G) par le rapport

(Equation 2) : 95

tantanG

'

= Equation (2)

Figure 3 : Schma optique reprsentant la notion de grossissement. 100

Un raisonnement gomtrique combin aux quations 1 et 2 permet dexprimer finalement le

grossissement par lEquation 3.

dy'fy'

fa

G 0 ++= Equation (3) 105

Le grossissement G est d'autant plus important que le terme (y'+d) est petit. Compte tenu des

caractristiques de l'il, le grossissement maximal est obtenu lorsque y' = a0 et d = 0 : l'il est

"coll" la loupe et l'image virtuelle est la distance minimale de vision nette du centre

optique de la lentille. Dans cette situation le grossissement vaut (Equation 4) : 110

fa

1G 0+= Equation (4)

5

En rduisant la distance focale le grossissement augmente. La lentille peut alors tre utilise

comme une loupe trs puissante place trs prs de lobjet dun ct et trs prs de lil de

lautre. Cest ce qui constituait au tout dbut de la microscopie en 1600, le microscope simple. 115

Cependant les lentilles de faible distance focale f ont une forte courbure : en augmentant la

courbure des faces et en gardant le diamtre de la lentille constant, l'paisseur augmente et la

lentille dforme les images et attnue fortement l'intensit des rayons lumineux. Ces

problmes sont rsolus en diminuant le diamtre des lentilles pour des courbures de faces

donnes. Mais, lorsque le diamtre de la lentille devient infrieur au diamtre de la pupille de 120

l'il (quelques millimtres), son usage en tant que loupe devient problmatique car cette

lentille de petite dimension ne recueille quune faible quantit de lumire. Pour ces raisons, on

n'utilise pas de loupes dont le grossissement dpasse 30.

d) Principe du microscope optique 125

Pour obtenir des grossissements

suprieurs 30, on utilise des systmes 130

optiques forms de plusieurs lentilles.

Ainsi, un microscope se compose au

minimum de deux lentilles jouant

respectivement le rle d'objectif et

d'oculaire. L'objet tudier (Figure 4) se 140

place devant l'objectif une distance

suprieure la distance focale fobj de

l'objectif et ainsi une image relle

intermdiaire est obtenue. Cette image

est observe l'aide de l'oculaire qui 150

travaille comme une loupe, produisant

une image virtuelle agrandie de l'image

relle. Cette image virtuelle visualise

par lil est situe la distance

minimale de vision nette. On dfinit la

longueur de tube t du microscope 160 Figure 4 : Principe de formation dune image

dun microscope.

6

comme la distance entre les foyers de l'objectif et de l'oculaire. Le grossissement Gmic dun

microscope est gal au produit du grandissement de lobjectif et du grossissement de

loculaire.

Figure 5 : Eclairage dun objet par transmission. 165

Les objets examins en microscopie sont rarement lumineux par eux-mmes et il est

ncessaire de les clairer laide dun dispositif d'clairage qui se compose le plus

couramment par une lampe blanche filament, dun collecteur concentrant le flux lumineux

de la lampe et dun condenseur permettant de focaliser la lumire provenant de la lampe sur 170

une partie de lobjet observer. La solution la plus simple, longtemps utilise, consiste

projeter directement la source dans le plan de lobjet laide du collecteur. Cet clairage

critique prsente linconvnient de ne pas tre uniforme, limage du filament tant confondue

avec celle de lobjet. Cet clairage critique non uniforme est maintenant universellement

remplac par un systme dclairage introduit par Khler ds 1893. Avec cet clairage (Figure 175

5) la source S est projete dans le plan de la pupille d'entre du microscope matrialise par

un diaphragme plac dans le plan focal objet du condenseur situ en avant de l'objet. Chaque

point de celui-ci reoit alors de la lumire de tous les points de la source et est clair

uniformment au mme titre que le collecteur. On place donc contre ce dernier un second

diaphragme : le condenseur en forme une image dans le plan de l'objet, ce qui en limite les 180

7

dimensions et, rduisant ltendue gomtrique du faisceau, limine la lumire parasite

provenant en dehors du champ.

La Figure 6 reprsente le premier microscope compos de plusieurs optiques utilis par

Robert Hooke en 1667 pour observer des chantillons biologiques. Les deux composants

importants dun microscope optique sont lobjectif qui collecte la lumire contenant limage 185

de lobjet, et le condenseur qui permet dclairer lobjet. Lensemble solidaire de lobjectif,

tube, oculaire est point sur lobjet ou lchantillon pos sur une platine dote dorganes

permettant le positionnement de lobjet dans son plan, gnralement par deux mouvements de

translation et/ou un mouvement de rotation. Limage relle intermdiaire vue par lil a

toujours une position fixe. Un dispositif de translation parallle laxe optique (rapide et lent) 190

permet de dplacer la platine pour placer limage relle de lchantillon cette position fixe.

Il est possible de trouver des microscopes o lchantillon est fixe et on ralise la mise au

point en dplaant lensemble objectif-tube-oculaire. La liaison de ces divers lments, ainsi

que leur stabilit, sont assures par une monture mcanique, le statif. Le condenseur et la

source, dans un microscope moderne, sont le plus souvent galement solidaire du statif et 195

logs dans son pied. La source de lumire peut prendre diffrentes formes suivant le type

dobservation que ncessite lobjet (lampe de lumire blanche, infrarouge, ultraviolet, lumire

monochromatique). En fonction des clairages utiliss, un rcepteur adquat (il,

camra) est destin fournir limage de lobjet observ. Dans les microscopes optiques

modernes, lobjectif et le condenseur contiennent de nombreuses lentilles qui permettent de 200

travailler aux limites thoriques de loptique. Nous allons ensuite dfinir louverture

numrique dun objectif qui est une grandeur fondamentale le caractrisant.

205 Figure 6 : Schma descriptif dun microscope ( gauche le premier microscope)

8

e) Ouverture numrique

Pour collecter la quantit maximale de lumire et obtenir

un grossissement maximal, lobjectif doit tre plac le

plus prt de lchantillon. Pour viter tout contact avec 210

lobjet, celui-ci est recouvert par une lamelle de verre trs

fine (environ 170 m) et un liquide dimmersion assure le

contact entre lobjectif et la lamelle de verre. Considrons

un point A dun objet dindice no, recouvert dune lamelle

dindice nV, spare de la frontale de lobjectif par un 215

liquide dimmersion dindice n et supposons que le rayon

ABCD (Figure 7) soit le plus inclin sur laxe entrant

dans lobjectif susceptible den ressortir, son inclinaison la traverse des dioptres plans

sparant les milieux prend les valeurs successives uo, uV, U et vrifie lEquation 5 :

220

nsinUsinunsinun VV0o == Equation (5)

La quantit invariante n sin U est louverture numrique de lobjectif (ON). LON est une

grandeur fondamentale dun objectif qui caractrise la quantit de lumire entrante. En

pratique les objectifs immersion les plus performants ont une ON de 1.3. 225

2) La microscopie de fluorescence

a) Le phnomne de fluorescence 230

Lorsquon irradie une molcule avec de la lumire ayant une nergie approprie (E=h=hc/), il est possible de promouvoir la molcule qui se trouve dans son tat lectronique fondamental

(E0) dans un tat lectronique dnergie suprieure (tat excit). Une fois la molcule porte

dans un tat excit par labsorption de lumire, la molcule peut revenir son tat

fondamentale soit en mettant de la lumire (, ) comme pour les spectres de raies 235 dmission de lampe, soit de faon non radiatives par relaxation vibrationnelle. Lmission de

lumire a gnralement lieu partir du premier tat excit et on parle alors de fluorescence

(Figure 8). Les longueurs donde dabsorption et dmission de fluorescence dune molcule

Figure 7 : Propagation des rayons optiques pour un objectif

immersion

9

sont spcifiques chaque molcule et lmission de lumire par fluorescence a toujours lieu

des longueurs donde suprieures celles de labsorption. 240

Figure 8 : Processus physique aprs absorption de lumire dnergie (E=h=hc/). Traits horizontaux fins : niveaux dnergie vibrationnelle. Traits horizontaux gras : niveaux

dnergie lectronique. Transitions radiatives : flches verticales droites. Transitions non 245

radiatives : flches ondules.

b) la microscopie de fluorescence

Un objet, par exemple une cellule en biologie, est en gnral compos de diffrentes rgions-250

molcules (lextrieur de la cellule, la membrane, lintrieur de la cellule, le noyau) qui

absorbent et mettent de lumire par fluorescence des longueurs diffrentes. Si les longueurs

dondes dabsorption et dmission sont bien diffrencies, il est possible de se servir du

phnomne de fluorescence pour observer une rgion spcifique de la cellule. Si les rgions

ne sont pas assez diffrencies naturellement, on injecte une molcule fluorescente 255

(marqueur), dont on connat parfaitement les longueurs donde dabsorption et dmission par

fluorescence, qui diffuse dans l'chantillon et se fixe prfrentiellement dans certains sites

chimiques, par exemple la membrane. La fluorescence va permettre de rendre uniquement la

membrane lumineuse. Lobjectif collecte cette lumire et on obtient une image de la

membrane. 260

Lutilisation dun laser de rayonnement monochromatique permet dexciter uniquement le

marqueur fluorescent (Figure 9). Le faisceau lumineux provenant du laser passe tout dabord

dans un systme optique (deux lentilles convergentes) pour agrandir sa taille et obtenir un

10

faisceau uniforme. Le faisceau du laser tant gnralement polaris linairement, une lame

/4 permet lobtention dun faisceau polaris circulairement pour avoir une absorption 265 isotrope de la part des marqueurs fluorescents dans le plan de polarisation du faisceau laser.

Dans un milieu isotrope, la fluorescence est mise dans toutes les directions. En microscopie,

lchantillon est gnralement dpos sur une lame de verre et lclairage de lchantillon se

fait par le dessous pour permettre une meilleure manipulation des chantillons (Figure 6). Des

chercheurs ont montr que lorsquune molcule est situe une interface, elle met de la 270

lumire par fluorescence essentiellement en direction du milieu le plus rfringent. Par

consquent, lmission de lumire par fluorescence est mise essentiellement en direction du

condenseur. Pour rsoudre ce problme, la mme optique, lobjectif, est utilise pour clairer

et collecter. Le faisceau du laser est dvi vers l'chantillon par un miroir qui possde un

coefficient de rflexion proche de 100% pour la longueur d'onde du laser et un coefficient de 275

transmission proche de 100% pour les longueurs donde suprieures la longueur donde du

laser. Le faisceau rflchi par le miroir est dirig vers lobjectif qui permet dilluminer

lchantillon. Pour obtenir un clairage de type Khler (Figure 5), une lentille est insre dans

le trajet optique du faisceau du laser pour permettre de focaliser celui-ci dans le plan focal

arrire de lobjectif. Seuls les marqueurs fluorescents absorbent la lumire monochromatique 280

du laser et mettent une longueur donde suprieure en direction de lobjectif. Lmission de

lumire par fluorescence de la surface claire par le faisceau laser est collecte par le mme

objectif, traverse le miroir, une lentille de tube qui joue le rle doculaire et focalise limage

de lobjet lumineux sur une camera CCD qui est plus sensible que lil (Figure 9).

Lavantage de cette microscopie est la possibilit dobserver lextrme limite un seul 285

marqueur fluorescent (une molcule) dilu dans une matrice non fluorescente. Soit un

marqueur fluorescent absorbant la lumire 532 nm ayant un diamtre caractristique de 1

nm dilu dans une matrice polymre de polystyrne (PS), la concentration du marqueur est

denviron de 10-9 mol.L-1 pour assurer statistiquement que dans un volume de 1 m3 un seul marqueur fluorescent est prsent. La matrice polymre utilise est transparente et permet 290

dimmobiliser le marqueur pendant le temps dtude. Les diffrents paramtres de

lexprience sont :

une diode laser 532 nm polaris linairement de 40 mW une lentille convergente de focale 30 cm qui permet de focaliser le faisceau laser dans

le plan focal arrire de lobjectif pour obtenir une illumination circulaire au niveau de 295

lchantillon de diamtre 50 m

11

un miroir qui rflchit la longueur du laser et transmet la fluorescence mise par les marqueurs (Figure 9)

un objectif de grossissement 100, immersion huile avec une ON de 1.3 un systme optique insr juste avant la camera CCD permettant dagrandir limage 300

dun facteur 3.3 et visualiser une surface de 24.624.6 m2

une camera CCD silicium avec 512512 pixels couple un multiplicateur de gain permettant dobtenir un rapport signal sur bruit lev.

La Figure 9 donne limage obtenue dun film polymre de moins d1 m dpaisseur contenant les marqueurs fluorescents. Chaque point lumineux reprsente un unique marqueur 305

fluorescent. En regardant attentivement limage obtenue, le diamtre des points lumineux est

suprieur 1 nm, il est gale environ 250 nm. Ce phnomne sexplique par le pouvoir de

rsolution dun microscope optique qui est de 250 nm dans cette exprience.

(b)

(a)

(c)

Figure 9 : (a) Microscopie de fluorescence (M : miroir) (b) Image de marqueurs fluorescent 310 dans un film de PS (c) Courbe de transmission de la lumire 45 du miroir.

3) Diffraction et pouvoir de rsolution dun microscope Il est ncessaire partir de maintenant de faire intervenir le caractre ondulatoire de la 315

lumire. Soit une source ponctuelle de lumire monochromatique place une distance x

d'une paroi perce d'une ouverture circulaire de diamtre D, sur un cran plac derrire

12

l'ouverture, on observe exprimentalement une figure de diffraction consistant en un disque

brillant entour d'anneaux alternativement sombres et lumineux. La Figure 10 reprsente le

profile de lintensit observe en fonction de la distance angulaire . Le premier disque 320 brillant, qui contient environ 84% de la lumire, sappelle le disque dAiry. La distance

angulaire du maximum central de la figure de diffraction au premier minimum est donne par lEquation 6 :

D1,22sin = Equation (6) 325

Figure 10 : Figure de diffraction dun objet ponctuel observ travers une ouverture

circulaire.

330

Se basant sur ce fait et sachant que de la mme faon un objet lumineux observ par des

optiques de diamtre D sera diffract, le physicien Rayleigh a nonc le critre suivant pour

dterminer le pouvoir de rsolution d'un instrument optique (Figure 11): deux sources

ponctuelles A et A' distantes de d, claires par une lumire monochromatique de longueur

d'onde et observes l'aide d'une lentille de diamtre D, peuvent tre distingues l'une de 335 l'autre condition que les maxima des figures de diffraction de A et A' produites par la lentille

soient spars par une distance angulaire suprieure ou gale la distance angulaire du maximum central au premier minimum de la figure de diffraction d'une source ponctuelle

(Figure 10, Equation 6).

13

Soit louverture angulaire sous laquelle la lentille est perue depuis le point A, et en faisant 340 lhypothse que les angles et sont petits, on obtient pour la distance minimale d pouvant tre rsolue au moyen d'une lentille de diamtre D :

sin1,22d Equation (7)

345 Figure 11 : Critre de Rayleigh

Dans le cas dun microscope, louverture angulaire correspond lON dans lEquation 7. Il est aussi ncessaire de rendre compte que lobjet doit tre clair ce qui donne finalement un

pouvoir de rsolution maximale pour un microscope optique : 350

condenseurobjectif ONON1,22d + Equation (8)

Si lON du condenseur est suprieure ou gale celle de lobjectif (microscopie de

fluorescence), cest lobjectif qui limite le pouvoir de rsolution et celui-ci est gal 355

0,61/ONbjectif. Dans le cas de lexprience de visualisation de marqueurs fluorescents uniques en microscopie de fluorescence, une rsolution de 250 nm est obtenue ce qui explique

que mme si le marqueur fluorescent a une taille de 1 nm, la diffraction de la lumire

implique que son image, un disque dAiry, a un diamtre au minimum de 250 nm. Pour

pouvoir diffrencier deux marqueurs fluorescents, ils doivent tre spars dau moins 250 nm 360

mme si leur taille nest que de 1 nm, ce qui justifie la concentration de marqueurs

(paragraphe 2b) et lpaisseur du film de PS pour nobserver quun seul marqueur lintrieur

dune sphre de diamtre 250 nm.

14

Avant de voir comment saffranchir de la diffraction pour augmenter le pouvoir de rsolution

dun microscope, revenons sur le principe de formation dune image en microscopie optique 365

si lon considre maintenant le caractre ondulatoire de la lumire. Il pourrait apparatre que

la diffraction de la lumire est une caractristique ngative en microscopie si lon ne se rfre

quau pouvoir de rsolution. Ernest Abbe a tudi la thorie de la formation dune image

laide dun microscope optique et il observe la lumire diffracte dun objet priodique. Celle-

ci donne une image diffracte dans le plan focal de lobjectif due linterfrence entre lordre 370

0 et les ordres suprieurs des rayons diffracts. Il faut bien remarquer que si lobjet ne

diffracte pas la lumire, il ny a pas dimage qui se forme dans le plan image (Figure 12).

Figure 12 : Formation dune image par linterfrence des diffrents ordres des rayons

diffracts dun objet priodique. 375

4) La microscopie PALM Au dbut des annes 2000, une nouvelle microscopie de fluorescence qui permet daugmenter

artificiellement le pouvoir de rsolution dun microscope optique a t dveloppe : la 380

microscopie PALM (Photo-activation Localisation Microscopie).

Cette microscopie se base sur le principe quil est possible de dterminer prcisment la

position dun objet unique dans le plan image. Reprenons le cas de lexprience prcdente

avec les marqueurs fluorescents de taille caractristique 1 nm, le maximum dintensit de la

figure de diffraction pour un seul marqueur fluorescent donne la position du marqueur 385

fluorescent (figure 10). La prcision avec laquelle la position dune source ponctuelle peut

tre dtermine sera dpendante de la taille dun pixel et du rapport entre lintensit maximum

et minimum. Il existe toujours un peu de signal au minimum, cela peut tre du la lumire

environnante, aux bruit lectroniques des dtecteurs (les dtecteurs optiques transforment un

15

signal lumineux en un signal lectrique), aux molcules non fluorescentes qui absorbent et 390

mettent toujours un peu de lumire sachant que lintensit lumineuse du laser au niveau de

lchantillon est de lordre du kW.cm2. Aujourdhui dans le meilleur des cas, une prcision de

quelques nm peut tre obtenue.

Considrons plusieurs marqueurs de 1 nm qui sont lintrieur dun cercle de diamtre

infrieur au pouvoir de rsolution. Limage de cet ensemble de marqueurs par microscopie de 395

fluorescence donne une seule figure de diffraction, un seul disque dAiry. Lide est de

pouvoir visualiser pendant un temps t1 un seul marqueur lintrieur du cercle et de mesurer

sa position. Ensuite un autre temps t3, on visualise un autre marqueur et on dtermine sa

position. En mesurant la position des marqueurs une par une, on peut reconstruire une image

prcise au nanomtre prs de lobjet observ (Figure 13). Le pouvoir de rsolution de 400

linstrument ne peut pas tre amlior intrinsquement car on ne peut saffranchir de la

diffraction de la lumire. Nanmoins la microscopie PALM permet de reconstruire une image

avec une prcision nanomtrique.

Au dbut des annes 2000, cette ide a pu tre applique grce la dcouverte de nouveaux

marqueurs dont les proprits de fluorescence peuvent tre photo-commutes : ces nouveaux 405

marqueurs existent sous deux formes A (fluorescente) et B (non fluorescentes), la forme A

absorbe la lumire de longueur donde A et met de la lumire par fluorescence, la forme B nabsorbe pas la lumire de longueur donde A et nmet donc aucune lumire par fluorescence. Les marqueurs peuvent passer de la forme B la forme A en absorbant de la

lumire de longueur donde B (diffrente de A) et retourne rapidement la forme B. Cest le 410 mme principe qui est utilis pour les verres progressifs, la lumire du soleil les verres

absorbent les rayons ultra-violet et se noircissent. Lorsquil ny a plus de lumire, les verres

redeviennent transparents.

Le principe de la mesure est alors le suivant (Figure 13):

tous les marqueurs sont tout dabord dans la forme B lintrieur dun cercle de 415 diamtre infrieur au pouvoir de rsolution, t0

on claire lchantillon pendant un temps court avec de la lumire de longueur donde B de trs faible intensit (photo-activation)

un seul marqueur passe de la forme B la forme A fluorescente avant que ce marqueur revienne la forme B, on claire lchantillon avec une lumire 420

de longueur donde A et un seul marqueur met de la fluorescence. On dtermine sa position au nanomtre prs (localisation), t1

16

le seul marqueur qui tait dans la forme A revient la forme B, t2 On recommence la procdure (t3). Statistiquement le marqueur qui passera de la forme B la

forme A ne sera pas toujours le mme et en rptant suffisamment la procdure, la position de 425

tous les marqueurs sera dtermine au nanomtre prs. Le passage de la forme B vers A se

nomme photo-activation car on fait passer un marqueur de la forme B qui nmet pas de

lumire la forme A qui met de la lumire par fluorescence en utilisant de la lumire (B).

5) Conclusion 430

La Figure 13 montre comment le principe de la microscopie PALM permet de visualiser la

double hlice dun brin dADN. Chaque brin dADN est marqu par des marqueurs

fluorescents. En imageant le brin dADN par des marqueurs classiques, la distance entre deux

brins dADN ntant que de quelques dizaines de nanomtres au maximum, il nest pas 435

possible de diffrencier les deux brins. Par contre en utilisant la microscopie PALM et les

nouveaux marqueurs, la double hlice du brin dADN peut tre visualise.

Figure 13 : Microscopie PALM applique pour la visualisation dun double brin dADN.

FIN 440