BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

ĐẬU THỊ KIM DUNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI

CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ

ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN

Luận văn kỹ sư

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI

CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ

ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN

Luận văn kỹ sư

Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện :

TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG

PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006

CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING

NONG LAM UNIVERSITY, HCMC

DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON

SEMI SOLID MEDIUM

Graduation thesisMajor : Biotechnology

Professors : Student :

PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG

Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006

BA. ĐO THI TUYEN

TPHCM, 09/2006

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến :

* Ban Giám hiệu trường đại học

Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng

tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại

trường.

* Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng

hướng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

* Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ

Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện

Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có

thể hoàn tất khóa luận này.

* Anh Nguyễn Diên Sanh, anh

Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ

trợ cũng như cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài.

* Các bạn lớp CNSH K28 đã động

viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng như chia xẻ những vui buồn trong suốt thời

gian học tập.

* Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt

Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

* Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ

đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin

và động lực bước vào đời.

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT

HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC

ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG

BÁN RẮN”. Đề tài được thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh

Học Nhiệt Đới TP.HCM.

Hội đồng hướng dẫn :

PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

TS. NGUYỄN NGOC HẢI

CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và

Aspergillus kawasaki được chiết bằng nước cất, thu được dịch chiết enzyme thô. Dịch

chiết thô này được tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60,

65, 70, 75 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6

Cặn tủa thu được hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra

nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ưu

cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu được từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn

tối ưu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định

trọng lượng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu được như sau :

Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ưu để

tủa protease.

Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470C.

Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus

kawasaki.

v

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANGBìa.................................................................................................................................... iTrang tựa......................................................................................................................... iiLời cảm tạ.......................................................................................................................iiiTóm tắt khóa luận...........................................................................................................ivMục lục............................................................................................................................vDanh sách các chữ viết tắt............................................................................................viiiDanh sách các bảng........................................................................................................ixDanh sách các hình và đồ thị..........................................................................................xiPHẦN 1. MỞ ĐẦU.........................................................................................................11.1 Đặt vấn đề..................................................................................................................11.2 Mục đích nghiên cứu.................................................................................................21.3 Yêu cầu......................................................................................................................22.1 Khái quát chung về enzyme......................................................................................32.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme...........................................................32.1.2 Định nghĩa về enzyme............................................................................................52.1.3 Phân loại enzyme....................................................................................................62.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme........................72.1.4.1 Hoạt tính enzyme.................................................................................................72.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme.........................................72.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống..........................................92.1.5.1 Nguồn thu nhận...................................................................................................92.1.5.2 Vai trò................................................................................................................112.2 Khái quát chung về enzyme protease......................................................................112.2.1 Định nghĩa enzyme protease................................................................................112.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease..............................................................12 2.2.2.1 Protease từ động vật..........................................................................................122.2.2.2 Protease từ thực vật...........................................................................................122.2.2.3 Protease từ vi sinh vật........................................................................................132.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease.........................................................................132.2.3.1 Từ động vật........................................................................................................132.2.3.2 Từ thực vật.........................................................................................................132.2.3.3 Từ vi sinh vật.....................................................................................................142.2.4 Ứng dụng của enzyme protease............................................................................142.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ......................................15

vi

2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.....................................................152.3.1.1 Phân loại ...........................................................................................................152.3.1.2 Đặc điểm............................................................................................................152.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt................................162.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease.................................182.5.1 Trích ly enzyme....................................................................................................192.5.2 Quá trình tủa........................................................................................................202.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký.......................................................222.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS – PAGE.............................................................................................................................27PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................................293.1 Thời gian và địa điểm..............................................................................................293.2 Vật liệu....................................................................................................................293.2.1 Chế phẩm enzyme thô..........................................................................................293.2.2 Hóa chất................................................................................................................293.2.3 Thiết bị..................................................................................................................293.3 Phương pháp thí nghiệm..........................................................................................303.3.1 Bố trí thí nghiệm...................................................................................................303.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme thô..................................................................................................................................303.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa enzyme protease............................................................................................................363.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease....373.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel......................................373.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện di SDS – PAGE.............................................................................................................413.4 Phương pháp xử lý số liệu.......................................................................................44PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..........................................................................454.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô................................................454.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu cho việc tủa protease...........................................454.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae........................................................................464.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki....................................................................484.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease.....................................................................494.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae........................................................................494.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki....................................................................514.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4....................534.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease......................544.5.1 pH tối ưu...............................................................................................................544.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae.........................................................544.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki....................................................544.5.2 Nhiệt độ tối ưu......................................................................................................554.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae.....................................................................554.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki.................................................................564.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel...................................................................................564.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae...................................................................................574.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki..............................................................................59

vii

4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki.................................................................624.7.1 Tủa protease bằng muối........................................................................................624.7.2 Tủa protease bằng cồn..........................................................................................624.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.............................................................................................................................63PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................675.1 Kết luận...................................................................................................................675.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.....................................................................675.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki.................................................................675.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki..........................685.2 Đề nghị....................................................................................................................68TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................69PHỤ LỤC......................................................................................................................70

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ

Asp.oryzae : Aspergillus oryzaeAsp.kawasaki : Aspergillus kawasakiCP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh

ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp).

CBB : Coomasie Brilliant Blue.ĐVHT : Đơn vị hoạt tính.HT : Hoạt tínhHTR : Hoạt tính riêng.TCA : Trichloacetic acidA.U : Độ hấp thụ.mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lường độ dẫn điện).UI : Đơn vị hoạt tính enzyme.

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein..........................................22

Bảng 3.1 Đường chuẩn Albumin...................................................................................32

Bảng 3.2 Đường chuẩn Tyrosine...................................................................................34

Bảng 3.3 Khối lượng (NH4)2SO4 tương ứng với mỗi nồng độ......................................36

Bảng 3.4 Thể tích cồn tương ứng với các tỷ lệ..............................................................36

Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô

của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki..................................................................45

Bảng 4.2 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch

hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối................................................46

Bảng 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối............................................................46

Bảng 4.4 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch

pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối..................................................48

Bảng 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.......................................................48

Bảng 4.6 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch

hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn..................................................50

Bảng 4.7 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn..............................................................50

Bảng 4.8 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch

pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn....................................................51

Bảng 4.9 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme

x

thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn..........................................................52

Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng

Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki.................................................................53

Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH................54

Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH............55

Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ.........55

Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ....56

Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel.......59

Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel....61

Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease

bằng muối......................................................................................................................62

Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease

bằng cồn.........................................................................................................................62

Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của những protein trong thang..............65

Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae..........66

Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki.....66

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Đường biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ

phản ứng .........................................................................................................................8

Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ

cơ chất .........................................................................................................................8

Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease...............................................................11

Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi...............................................16

Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi

trường CBS – MEA2%..................................................................................................16

Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký.........................23

Hình 2.7 Quá trình lọc gel.............................................................................................26

Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis.................................................................................31

Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ....................................38

Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng

muối đối với nấm Aspergillus oryzae ...........................................................................58

Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng

cồn đối với nấm Aspergillus oryzae..............................................................................58

Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng

muối đối với nấm Aspergillus kawasaki........................................................................60

Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng

cồn đối với Aspergillus kawasaki..................................................................................60

xii

ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lượng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch

chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki.....................45

Đồ thị 4.2 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô

của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối...................................................................47

Đồ thị 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô

của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.............................................................49

Đồ thị 4.4 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô

của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn.....................................................................51

Đồ thị 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô

của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn.................................................................52

Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae........54

Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki.....55

Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae..............55

Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki........56

Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa

protein bằng muối..........................................................................................................62

Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa

protease bằng cồn..........................................................................................................63

Đồ thị 4.12 Sự tương quan giữa Lg của trọng lượng phân tử và giá trị Rf...................65

xiii

1

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU

1.2 Đặt vấn đề

Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa

sinh. Như vậy điều gì đã giúp các phản ứng này được tiến hành mau lẹ phi thường mà

vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme.

Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc

tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi

tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục

năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát

triển với tốc độ rất mạnh mẽ.

Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp

sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo

enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra

một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng

tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm

môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.

Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và

phổ biến trong đời sống. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác

nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của

enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Điều

kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme

hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó.

Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng

trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh

sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus

kawasaki trên môi trường bán rắn”.

Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi

cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta

2

chỉ biết đến như là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta

có thể đánh giá được hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki.

1.2 Mục đích nghiên cứu.

Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng

nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki.

So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus

oryzae và Aspergillus kawasaki.

1.3 Yêu cầu.

Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa và tỷ lệ cồn tối

ưu trong việc tủa enzyme - bước đầu trong quá trình tinh sạch enzyme.

Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.

Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.

Xác định trọng lượng phân tử của enzyme protease bằng kỹ thuật điện di SDS

– PAGE.

3

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát chung về enzyme

2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme

Từ trước thế kỷ 17, khi loài người hoàn toàn chưa hiểu biết gì về ezyme,

người ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế như

làm bánh mì, làm bia, rượu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có

tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế

bào vi sinh vật.

Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa

học người Hà Lan Van Heltmon đề xướng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio”

nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu

tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rượu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là

điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào

thực nghiệm, quan sát, mô tả.

Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn

giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa được nhà tự nhiên học người Pháp

Réaunur tiến hành vào năm 1713 và được Spallanzani người Ý khẳng định lại một

cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt.

Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov người Nga

làm thí nghiệm chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển

hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40 – 600C .

Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí

nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý

học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên người ta

đã chứng minh được rằng hiện tượng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học,

nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ

những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”.

Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận

được chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ

hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đường và được gọi

4

là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme

vào nửa sau thế kỷ 19.

Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của

enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tượng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc

tác và chất gây ra hiện tượng này là chất xúc tác.

Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men

rượu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dưới kính hiển

vi là nguyên nhân gây ra hiện tượng lên men rượu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay

vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái

niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn được

(ferment hòa tan).

Năm 1862, nhà khoa học người Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc

biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật

“phương pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và

“phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện

nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”.

Năm 1894, nhà khoa học người Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme

mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta

Rhus succedanea.

Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu được chú ý nghiên cứu nhiều

hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà

khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách được pepsine và trypsine dưới dạng tinh thể.

(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).

Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc

tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phương pháp quang học và phương

pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta

“phương trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme.

(Nguyễn Hữu Chấn, 1984).

Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất

nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa

lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản

hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương

5

pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái

sinh lý và bệnh lý.

2.1.2 Định nghĩa về enzyme

Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do

tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau

phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)

Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể

sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với

tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt

động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống

nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của

Anghen : “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv,

1982).

Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhưng mỗi loại mô, mỗi

loại tế bào thường có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham

gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng

ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984).

Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp

suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học

cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn

lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng.

(Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).

Các loại enzyme trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để

sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt

xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn

cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do

gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức

Lượng, 2004).

Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt

như sau :

Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng

sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.

6

Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển

hóa rất cao.

Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản

ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.

Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.

Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng

enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy

ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi

enzyme.

Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa

học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này

là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã

biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lượng,

2002).

2.1.3 Phân loại enzyme

Khi số lượng enzyme được phát hiện còn ít, người ta đặt tên enzyme theo ý

thích từng người tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày càng

nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ước quốc tế. Enzyme được phân loại

theo tính chất của nó, được xếp vào từng nhóm nhỏ tương ứng với các enzyme có bản

chất tương tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn.

Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được đặt theo cơ chất đặc

hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme

thường có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản

ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn được gọi theo tên cũ, không theo

hệ thống như trypsine, pepsine.

Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme

ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho

mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ

thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai

chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm như

sau :

7

I. Oxydoreductase

a. Dehydrogenase

b. Oxydase

c. Oxygenase

d. Peroxydase

II. Transferase

a. Acyltransferase

b. Glucosyltransferase

c. Aminotransferase

d. Phosphotransferase

III. Hydrolase

a. Peptide hydrolase

b. Lipase

IV. Liase

a. Pyruvate decarboxylase

b. Fumarate hydrolase

V. Isomerase

VI. Ligase

2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme

2.1.4.1 Hoạt tính enzyme

Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các

phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm,

hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác.

Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau

như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ,

pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất

hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982).

2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme.

a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng

độ enzyme. Đường biểu diễn có dạng như ở hình 2.1

8

Hình 2.1 : Đường biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng

b) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme được giữ cố định và

nồng độ cơ chất thay đổi, người ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ

chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đường biểu diễn uốn cong và với

nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đường biểu diễn tiệm cận

với giá trị vmax.

Km : Hằng số Michalis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc bằng 1/2 vận tốc vmax.

Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

c) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng

enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng

chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ

giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.

Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị

giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.

V

[E]

V = k[E]

Vmax

[S]

v2

Km0

9

Ngược lại, ở nhiệt độ 00C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi

đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu.

Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta

thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng với hai hiện tượng khác nhau :

Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng.

Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.

Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C),

vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80

– 1000C.

Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ

chất, pH, lực ion của môi trường.

d) Ảnh hưởng của pH

Sự thay đổi pH gây nên :

Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của

enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ

chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.

Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn

cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở

dưới dạng ion.

Như vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường. Đó là vì

pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm

hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.

Người ta có thể xác định một giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một

enzyme. Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy

tầm quan trọng của môi trường phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng

enzyme in vitro.

Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2),

hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá

trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ

thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch

đệm, nhiệt độ.

10

2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống

2.1.5.1 Nguồn thu nhận

Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ

dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ

thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với

quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền

kinh tế quốc dân. Như vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu

vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu

nhận từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa các

enzyme từ động vật và thực vật :

Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lượng

lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm

cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công

nghiệp khác nhau.

Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng

hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động

vật không thể đồng hóa được.

Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.

Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.

Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,

kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất

chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.

Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh

vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền như

các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.

Ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường

sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực

cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với

nguồn dinh dưỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động

lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như

hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi

11

cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận

được enzym có độ thuần khiết cao.

2.1.5.2 Vai trò

Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các

nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả

cao. Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như

trong hoá phân tích để định tính, định lượng các chất trong nông nghiệp, y học, công

nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp nhẹ như công nghiệp dệt, công

nghiệp da.

Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các

sinh tố và các chất kháng sinh.

Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm

nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt

trước khi gieo.

Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym được sử dụng khá rộng

rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất

bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thường làm tăng nhanh

quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử

dụng enzym còn có thể tái tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến.

Ngày nay, người ta cũng đã đạt được nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme

trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.

2.2 Khái quát chung về enzyme protease

2.2.1 Định nghĩa enzyme protease

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân

liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,

một ít peptid ngắn, pepton.

Hình 2.3 : Công thức cấu tạo enzyme protease

12

2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease

2.2.2.1 Protease từ động vật

Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn

cả.

Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm

rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu

hóa thịt.

Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch

vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme này.

Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên

thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.

Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã tách

được trypsine với amylase tụy tạng. Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên

cứu tinh chế enzyme và protein.

Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin).

Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những

nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có

enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã

tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác

dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.

2.2.2.2 Các protease từ thực vật

So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật được phát hiện

muộn hơn.

Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận được protease từ hạt của một

loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động

phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ

các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu

Biure.

Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp

tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz được xem như là người đầu tiên tách chiết thành công

protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có

13

chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm enzyme không

tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain.

2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật

Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950,

mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein

của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật

tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực

vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp

phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.

Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp

để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong

nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.

2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease

Các enzyme protesae như đã nói ở trên được thu nhận từ nhiều nguồn khác

nhau.

2.2.3.1 Từ động vật

Protesae động vật thường có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ

dày…

Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng,

chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.

Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.

Renin chỉ có ở ngăn thứ tư ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme

đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.

2.2.3.2 Từ thực vật

Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây như

thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả .

Ví dụ:

Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh

Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.

Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.

14

2.2.3.3 Từ vi sinh vật

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này

có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy

(protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các

protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và

được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y

dược.

Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có

nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào

cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi

sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau :

Protease serine

Protease kim loại (metallo protease)

Protease acid

Protease tiol

2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease

Các protease nói chung cũng như protease vi sinh vật nói riêng được sử dụng

rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…

Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi

chế biến,…

Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…

Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.

Trong hương mỹ phẩm : Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem

xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ

dàng lớp tế bào già.

Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng

dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.

Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong

sản xuất formate, sữa đông tụ.

Trong y học :

15

+ Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật,

sản xuất huyết thanh miễn dịch.

+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh

mạch…

+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc

trưng.

+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị

tiêu hóa kém…

Trong nông nghiệp : Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu

đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.

Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các

nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp

nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các

loại phim và giấy ảnh quý.

2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.

2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

2.3.1.1 Phân loại

Giới : Fungi

Ngành : Ascomycota

Ngành phụ : Pezizomycota

Lớp : Ascomycetes

Bộ : Plectascales

Họ : Aspergillaceae

Giống : Aspergillus

Loài : Aspergillus oryzae

2.3.1.2 Đặc điểm

Hình thái

Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển

rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm

đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.

16

Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi

Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên

môi trường CBS – MEA2%.

Điều kiện phát triển :

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45%.

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%.

Độ ẩm không khí : 85 -95%.

pH môi trường : 5,5 - 6,5.

Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 300C.

2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt.

Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng như các enzyme khác có thể

dùng hai phương pháp nuôi cấy : phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu. Phương

pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp bề sâu thường dùng đối

với vi khuẩn.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được

nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lượng

17

enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương

pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những

nguyên liệu có nguồn gốc thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi

sinh vật để thu nhận protease, người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như

những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng

phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi

cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng rất chậm.

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.

+ Khối môi trường còn rời rạc.

+ Enzym mới bắt đầu được hình thành.

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối

không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.

Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này

có những thay đổi cơ bản sau:

+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển

rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi

trường, trong lòng môi trường.

+ Môi trường được kết lại khá chặt.

+ Độ ẩm môi trường giảm dần.

+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.

+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của

nấm sợi.

+ Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội

hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn.

+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai

đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-

30oC là tốt nhất.

18

Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có

một số thay đổi cơ bản như sau:

+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng

sẽ chậm lại.

+ Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí

môi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt

độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng

enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất

cần thiết.

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm này

được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa

sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường). Người ta

thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm

enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.

2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease

Quá trình tinh sạch enzyme được tóm tắt như sau :

Chế phẩm enzyme thô

Trích ly

Lọc

Kết tủa enzyme

Thu nhận kết tủa

Tinh chế kết tủa bằng sắc ký lọc

gel

Kiểm tra độ tinh sạch, xác định trọng lượng

phân tử

19

2.5.1 Trích ly enzyme

Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzyme thô đã sấy được đem đi nghiền nhỏ.

Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần

của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội

bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.

Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nước nên sau khi nghiền mịn, người

ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone).

Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt và dễ

được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể

chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất

không tan. Nước thường dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. (Lương Đức Phẩm,

1998)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly :

Tỷ lệ nước trích

Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn chế phẩm

ẩm, tỷ lệ nước trên chế phẩm khác nhau sẽ trích được lượng enzyme khác nhau.

Lượng nước dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc.

Thời gian trích

Enzyme thủy phân dễ tan trong nước, thời gian trích ly càng lâu càng có

khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết

và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.

Nhiệt độ trích

Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm

hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly

tối thích là 20 – 300C.

Để tăng cường khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích

để đạt được kích thước hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thường dùng hệ

thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ

Sản phẩm enzyme tinh khiết

20

trích được nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và

hàm lượng enzyme trong dịch chiết thu được.

2.5.2 Quá trình tủa

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa

nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô

thường chứa một lượng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì

thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.

Để làm được điều đó người ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác

nhân gây kết tủa. Tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bước ban đầu

trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này người ta loại được một số protein tạp ở giai

đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.

Nguyên tắc :

Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung

môi.

Ở phân tử enzyme, các gốc ưa nước và kỵ nước thường nằm trên bề mặt.

Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau.

Trong đó, các nhóm kỵ nước có xu hướng nằm trong lòng phân tử protein, một phần

không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi,

các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lưỡng cực khác có vai trò quyết

định đến tính chất enzyme.

Độ hòa tan của enzyme được coi là kết quả của tương tác lưỡng cực của chất

hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành

màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tương tác

này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung

dịch, thường gọi là tủa protein.

Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có

thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch,

hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.

Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein

a) Kết tủa bằng muối

21

Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử

muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein,

do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.

Khi cho một lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình

này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính.

Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối

thấp.

Phương pháp này thường được sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó

cũng được sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân

tử protein lớn có khuynh hướng kết tủa trước, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong

dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên

cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối

khác nhau.

Như vậy với quá trình này ta có thể thu được protein mong muốn một cách

tinh sạch hơn.

b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một

trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi

có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tương tác

giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của

protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone,

ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó độ hòa

tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi

hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan

trong nước (như acetone) vào dung dịch chứa protein.

Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960 có nhiều thuận lợi do tương đối rẻ,

có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do

nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme

bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.

Có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung

môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự

tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc

22

với dung môi. Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành

kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, ta bắt

buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.

Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thường

mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ.

Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –

100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định

bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch

enzyme.

2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký

Sắc ký sinh học là phương pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh

học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh

sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.

Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein

Đặc tính Kỹ thuật

Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)

Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)

o Sắc ký giấy.

o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)

o Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction

Chromatography – HIC)

Kích thước Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)

Nhận biết sinh học

(tính đặc hiệu của

ligand)

Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)

23

Hình 2.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký

Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại

SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh

sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.

Nguyên tắc :

Lọc gel là phương pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật

này dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho

chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel

sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển

bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm

hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :

a) Phân tách nhóm (Group separations)

Các thành phần của một mẫu được phân tách thành hai nhóm chính theo

phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hay các

phân tử tạp chất nhỏ (như đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao

đổi đệm.

b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution

fractionation of biomolecules)

Các thành phần của cùng một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích

thước phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập

24

một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác

định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.

Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel

a) Ưu điểm

Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh

học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác

động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt.

Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các

cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ

ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí

nghiệm.

Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và

dễ dàng khử muối.

b) Nhược điểm

- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)

- Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.

- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó

đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử

dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.

Một số thông số vật lý của phương pháp

Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lượng phân tử (MW) nhỏ nhất

không chui vào bên trong hạt gel, như vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lượt ra khỏi

cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000

Da đều không chui vào hạt gel.

Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách

từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được

phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50.

Độ ngậm nước (Water Regain-WR) : Là trọng lượng nước mà 1g bột gel khô

hút nước. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao

quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột.

Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trương nở

trong nước. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.

25

Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh

hoặc đường kính hạt theo m. Hạt có kích thước lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho

tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400

mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường

người ta chọn hạt gel có kích thước 100-200 mesh, 50-150 m.

Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác

định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da.

Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.

Phân tách bằng sắc ký lọc gel

Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi

trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn

định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản

ứng).

Nền nhồi được cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ

của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được

xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các

hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất

(isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân

tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm

kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu

trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.

Quá trình lọc gel

1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột.

2. Mẫu được nạp vào cột.

3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử

khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân

đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu

trong chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.

4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích

thước lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử

nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống

dưới đáy cột.

26

5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình

tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung

môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi

trường lọc gel.

Hình 2.7 : Quá trình lọc gel

27

2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện

di SDS – PAGE

Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, người ta thường kiểm tra lại độ tinh

sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng

lượng phân tử và độ tinh sạch của chúng.

Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách

cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường.

Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel

Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của

SDS.

Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử

acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác

bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine

(TEMED).

Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước

của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử

sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide :

nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích

thước lớn và ngược lại.

SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ

thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là

mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi

thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó,

sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những

phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi

đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử

tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển

về cực âm của điện trường.

Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một

thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác

nhau đã biết.

28

Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự

phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên

tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:

Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại

và tạo một lớp băng mỏng.

Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có

trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.

Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide

và vị trí.

Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng

lượng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn

hơn 200.000 daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.

29

PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 10/2/2006 đến tháng 1/6/2006 tại Viện Sinh

Học Nhiệt Đới TPHCM.

3.2 Vật Liệu

3.2.1 Chế phẩm enzyme thô

Chế phẩm enzyme protease dạng bột thô của hai chủng Aspergillus oryzae và

Aspergillus kawasaki do phòng Vi Sinh Ứng Dụng - Viện SHNĐ cung cấp.

3.2.2 Hóa chất

Hóa chất để pha dung dịch đệm phosphate : Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4

Hóa chất để tủa enzyme : Cồn 960, (NH4)2SO4

Hóa chất để xác định hàm lượng protein : Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml,

thuốc thử Bradford (Coomasie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid Phosphoric)

Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme : dung dịch Tyrosine 1mg/ml; HCl

0,1M; Na2CO3 0,4M; dung dịch Trichloacetic acid 0,4M (TCA); thuốc thử Folin; dung

dịch đệm phosphate 0,1M; casein dạng bột.

Hóa chất dùng trong phương pháp sắc ký.

Hóa chất dùng trong phương pháp điện di.

3.2.3 Thiết bị

Máy đo quang phổ UV – Vis

Máy khuấy từ

Thiết bị lọc hút chân không

Máy ly tâm

Máy đo pH

Cân phân tích

Bể ổn nhiệt

Tủ sấy

Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Biorad gồm phễu đổ gel, flow

adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch.

Ống nghiệm

30

Bình định mức

Ống đong

Giấy lọc

Phễu lọc

Đũa khuấy

Pipette thủy tinh, pipetman 50 – 300 l, 100 – 1000 l

Các dụng cụ để chạy điện di : Bộ điện di dứng, bộ nguồn chạy điện di,

đầu típ, eppendorf, phao để eppendorf.

3.3. Phương pháp thí nghiệm

3.3.1. Bố trí thí nghiệm

3.3.1.1. Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease

của dịch chiết enzyme thô.

Cân 100g chế phẩm enzyme thô của mỗi chủng, hòa tan trong 750 ml nước

cất.

Khuấy đều hỗn hợp trong thời gian 1 tiếng bằng máy khuấy từ.

Lọc hỗn hợp qua vải thô. Dịch lọc thu được tiếp tục lọc bằng thiết bị lọc hút

chân không.

Dịch sau lọc được đem đi ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút.

Loại bỏ cặn và thu lấy dịch . Định mức đến 650 ml.

Bảo quản ở 100C.

Dịch chiết enzyme thô được xác định hàm lượng protein theo phương pháp

Bradford và hoạt tính protease theo phương pháp Amano.

a) Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

Bradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein.

Phương pháp này có một số ưu điểm sau :

Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử).

Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20 g)

Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định.

Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

protein.

31

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay

đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid.

Trong dung dịch mang tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm

có bước sóng hấp thu cực đại ở 465 nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp

thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm liên hệ trực tiếp với

nồng độ protein.

Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ.

Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các

nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang

điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện

sau hai phút và ổn định trong gần một giờ.

Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Dung dịch Albumin chuẩn.

Thuốc thử Bradford.

Thiết bị

Máy đo quang phổ UV - Vis

Hình 3.1 : Máy quang phổ UV-Vis

32

Các bước tiến hành

Xây dựng đường chuẩn Albumin

Pha dung dịch Albumin chuẩn 1mg/ml : Cân 100 mg Albumin dạng bột trên

cân phân tích, định mức đến 100 ml bằng nước cất.

Pha thuốc thử Bradford :

Coomasie Brilliant Blue (CBB) : 0,005 g

Ethanol tuyệt đối : 23,5 g

Acid phosphoric 85% : 42,5 g

Phẩm màu CBB được làm tan trong ethanol, bổ sung acid phosphoric 85%

và chỉnh tới 500 ml bằng nước cất. Bảo quản trong chai tối.

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa dung dịch Albumin chuẩn ở các nồng độ xác

định như bảng 3.1

Bảng 3.1 : Đường chuẩn albumin

Ống nghiệmĐối

chứng1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ

(g/ml)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch

albumin chuẩn

(l)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Nước cất (l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910

Thuốc thử

Bradford (ml)2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm ở bước sóng 595 nm.

Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối

chứng sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ( OD) theo

nồng độ protein.

Xác định nồng độ protein của mẫu

Dịch chiết enzyme thô của hai chủng nấm mốc cũng được tiến hành tương tự

như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của

33

đường chuẩn. Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối

chứng, rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí

nghiệm (g/ml).

b) Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano

Nguyên tắc

Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme

protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu

với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng

sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme được biểu diễn

bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme.

Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

HCl 0,1M

Na2CO3 0,4M

Dung dịch TCA 0,4M

Tyrosine tinh khiết

Thuốc thử Folin

Đệm phosphate pH7 0,1M

Dung dịch casein 1% : Cân 1g casein từ sữa (Hãng Merck), thêm vào 100 ml

dung dịch đệm phosphate 0,1M; pH = 7.

Dụng cụ và thiết bị

Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc.

Bể ổn nhiệt

Máy đo quang phổ UV – Vis

Máy đo pH

Các bước tiến hành

Xây dựng đường chuẩn tyrosine

34

Bảng 3.2 Đường chuẩn tyrosine.

Ống số Đối

chứng1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ (g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch tyrosine

chuẩn (l)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Dung dịch HCl (l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910

Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Thuốc thử Folin

(ml)1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,

80, 90 gtyrosine/mlHCl như bảng 3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào dung dịch

tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch

hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp

thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40,

As50, As60, As70, As80, As90.

Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ

hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso.

Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối

chứng sẽ được giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo

nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine.

Xác định hoạt tính enzyme protease

Hoạt tính enzyme được khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7.

Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 0,50C

trong 10 – 15 phút.

Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn

hợp này ở 37 0,50C trong một giờ.

Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme.

Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc

để loại tủa.

Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc.

35

Thêm 1 ml thuốc thử Folin.

Trộn đều, để yên ở 37 0,50C trong 20 phút.

Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm

(ghi nhận kết quả này là Am).

Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến

hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ

hấp thụ là A0.

Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng

cách lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ

protease theo tính toán sau :

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng

enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 g tyrosine trong 1 ml dịch

lọc dưới điều kiện thí nghiệm.

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) =

F = [10/ As10 + 20/ As20 + 30/ As30 + 40/ As40 + 50/ As50 + 60/ As60 +

70/ As70 + 80/ As80 + 90/ As90]/9

Am : độ hấp thu của mẫu

A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng

F : Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu ở bước sóng

660 nm trên đường chuẩn.

n : Hệ số pha loãng của enzyme

1/100 : Hệ số chuyển đổi

V : Thể tích của dung dịch enzyme

m : khối lượng chế phẩm enzyme thô.

Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease

Từ kết quả hàm lượng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml)

tính hoạt tính riêng của enzyme.

HTR (UI/mg) =

(Am – A0).F.1/100.n.V

Số đơn vị hoạt tính

mg protein enzyme

m

36

3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu

để tủa enzyme protease.

Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết thu

được đem đi tủa với các tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 và cồn 960 .

a) Tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hòa khác nhau

Bảng 3.3 : Khối lượng (NH4)2SO4 tương ứng với mỗi nồng độ.

Nồng độ

(NH4)2SO4 (% độ

bão hòa)

50 55 60 65 70 75

Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50

(NH4)2SO4 (g) 15,7 17,55 19,5 21,5 23,6 25,3

Tiến hành tủa trong điều kiện nhiệt độ thấp để đảm bảo hoạt tính enzyme

không bị ảnh hưởng và quá trình tủa xảy ra tốt.

Thể tích dịch enzyme và khối lượng muối (NH4)2SO4 tương ứng với mỗi nồng

độ được sử dụng như bảng 3.3

Dịch chiết enzyme thô được cho vào becher đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn

xung quanh. Tất cả được đặt trên máy khuấy từ.

Cho từ từ muối (NH4)2SO4 vào để muối có thời gian hòa tan trong dịch enzyme.

Tiếp tục khuấy từ thêm 15 phút.

Lấy dịch đi ly tâm 5000 vòng /phút trong 20 phút.

Thu tủa, hòa lại trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7.

Cho dịch pha tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C .

b) Tủa enzyme bằng ethanol 960 ở các tỷ lệ khác nhau

Bảng 3.4 : Thể tích cồn tương ứng với các tỷ lệ

Tỷ lệ dịch : ethanol 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50

Ethanol (ml) 50 100 150 200 250 300

37

Để tránh làm biến tính protein, ethanol 960 phải được giữ lạnh trước khi tiến

hành tủa.

Thể tích dịch enzyme và thể tích cồn tương ứng với mỗi nồng độ được sử dụng

như bảng 3.4

Lắc đều hỗn hợp, bảo quản lạnh trong một giờ.

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút.

Bỏ dịch, thu tủa, hòa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7.

Cho dịch hòa tan tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C.

c) Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa enzyme

protease.

Dịch hòa tan tủa thu được từ việc tủa dịch chiết enzyme thô bằng (NH4)2SO4 và

C2H5OH 960 ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau được xác định hàm lượng protein và

hoạt tính protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) như ở thí nghiệm 1. Nồng độ muối và tỷ lệ

cồn tối ưu cho việc tủa enzyme protease là giá trị mà ở đó hoạt tính protease thu được

cao nhất.

3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của

protease.

Dịch hòa tan tủa thu được khi tủa protease ở nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu ở

thí nghiệm 2 được xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano ở các giá trị

pH và nhiệt độ khác nhau.

a) Xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease

Khảo sát hoạt tính protease ở các giá trị pH : 4, 5, 6, 7, 8, 9 trong cùng điều

kiện nhiệt độ (370C). Ở giá trị pH nào cho hoạt động của protease mạnh nhất (hoạt tính

cao nhất) thì đó là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme.

b) Xác định nhiệt độ tối ưu

Khảo sát hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ (0C) : 37, 47, 57, 67, 77 trong cùng

một điều kiện về pH (pH tối ưu xác định được ở thí nghiệm trên). Ở nhiệt độ nào hoạt

tính enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme.

3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel

a) Hóa chất và dụng cụ

Dụng cụ và thiết bị

Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ.

38

Phễu đổ gel

Bình hút chân không.

Flow Adapor 1,5 cm.

Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm; thể tích : 53 ml [thể tích =

chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14].

Bình đựng dung dịch đệm.

Ống nghiệm: 50 cái.

Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch

Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp,

hãng Bio-Rad, Mỹ

Hóa chất

Gel Bio-Gel P-100, hãng Bio-Rad : là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, được

điều chế bằng quá trình đồng polymer hóa acrylamide và N, N’-methylene-bis-

acrylamide. Các gel này rất ưa nước và không mang điện tích, giúp việc lọc các hợp

chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Đặc tính của Bio-Gel P-100 : dạng hạt mịn, kích

thước hạt 45 – 90 m, khả năng ngậm nước : 12ml/1g gel khô, phạm vi phân tách :

5000-100000 daltons.

Đệm phosphate 0,1M; pH7 : khử bọt khí trước khi dùng.

b) Các bước tiến hành

Chuẩn bị gel

Cân 5 g gel Bio-gel P-100 khô. Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm

phosphate 0,1M, pH = 7 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate pH = 7 nhiều

39

gấp hai lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 =

106 ml dung dịch đệm.

Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển

dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không Khử khí của

dung dịch trong khoảng từ 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa

khuấy vì nó có thể làm hư gel.

Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và

lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi

trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn.

Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm

đầy 20% thể tích cột.

Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn

gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí.

Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho

đến khi cột được nạp đầy gel.

Khi cột đã được nạp đầy gel, mở khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor.

Mở khóa đầu ra của cột, cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền

chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy.

Đóng đầu ra của cột, điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp

mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua

flow adaptor.

Chuẩn bị mẫu

Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu ở

thí nghiệm 2 được chạy qua sắc ký lọc gel.

Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn),

hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm.

Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền và

thời gian sử dụng của cột .

Thu và xác định mẫu tách được.

Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector

trong hệ sắc ký và được thể hiện độ hấp thu dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP

40

Data View trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi

phân đoạn 2 ml..

Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme protease

Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các

peak sẽ đuợc phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính

protease theo phương pháp Amano sau tinh sạch như thí nghiệm 2

c) Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme

sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.

Hiệu suất về hoạt tính enzyme =

Trong đó :

HT enzyme 1 : Hoạt tính enzyme protease trước tinh sạch (UI/ml dung dịch

enzyme trước tinh sạch.

HT enzyme 2 : Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (UI/ml dung dịch

enzyme sau tinh sạch.)

HTR của enzyme protease sau tinh sạch =

Độ tinh sạch của enzyme =

Trong đó :

HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng enzyme trước mỗi lần tinh sạch.

HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng enzyme tương ứng sau mỗi lần tinh sạch.

Độ tinh sạch của protease sau sắc ký =

Trong đó :

HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng của enzyme protease trước tinh sạch

HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch.

HT enzyme 2 HT enzym 1

HT enzyme 2Hàm lượng protein sau

tinh sạch

HTR enzyme 2 HTR enzyme1

HTR enzyme 2HTR enzyme 1

41

3.3.1.7 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng

phương pháp điện di SDS - PAGE

a) Thiết bị và dụng cụ

Bộ điện di đứng

Bộ nguồn chạy điện di Biorad.

Pipetteman

Đầu típ

Eppendorf

Dụng cụ làm gel (tấm kính, lược, kẹp...)

Hóa chất

N,N,N’,N’-tetramethylennediamide(C6H16N2 – TEMED)

Dung dịch Acrylamide/Bisacrylamide 40% (29:1)93,3%C)

-Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH)

Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-rad), gồm các protein chuẩn có kích

thước xác định sau :

Myosin : 200000 daltons.

-galactosidase : 116250 daltons

Phosphorylase b : 97400 daltons

Bonvine serum albumin : 66200 daltons

Ovalbumin : 45000 daltons

Carbonic anhydrase : 31000 daltons

Soybean trypsin inhibitor : 21500 daltons

Lysozyme : 14400 daltons

Aprotinin : 6500 dalons

Sodium dodecyl sunfate (SDS)

Ammoniumpersulfate [(NH4)2S2O8]

Coomasie Brilliant Blue G-250 (Bio-rad)

Cồn tuyệt đối (99,50)

Methanol (CH3OH)

Tris (hydroxymethyl) aminomethane

Acid acetic

Bromophenol blue

42

Glycerol (C3H8O3)

Glycine (C2H5O2N)

Acid Clohydric (HCl)

Sodium dodecyl sunfate (SDS) 10% : cân 10g SDS, cho 100 ml nước cất vào

khuấy cho tới khi tan hết.

Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1,5M; pH8,8-

0,4% SDS : cân 36,3g Tris pha trong 100 ml nước cất, thêm dần HCl 6N và khuấy

dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8,8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm

nước cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40C

Ammoniumpersulfate 10% (chỉ pha trước khi dùng) : cân 0,1g cho vào một

eppendorf 1000 l, thêm 1 ml nước cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng.

Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8,3 : pha dung dịch mẹ 10X chứa 30

g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000 ml nước cất.

Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần như sau : 2,5 ml

dung dịch đệm Tris-Cl 0,5M; pH 6,8; 4 ml 10%SDS; 2 ml Glycerol; 2 mg

Bromophenol Blue; 0,2 ml mercaptoethanol; thêm nước đủ 10 ml.

Dung dịch nhuộm gel : chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625g

Coomasie Blue G 250;112,5 ml ethanol tuyệt đối; 112,5 ml nước cất và 25 ml acid

acetic; lắc đều; giữ trong chai màu tối.

Dung dịch giải nhuộm : 30 ml methanol, 10 ml acid acetic, 60 ml nước cất.

b) Phương pháp

Đổ gel

Gel phân tách (separating gel)

Cho các thành phần sau theo thứ tự, vào becher 50 ml sạch :

40% Acrylamide/Bis (29:1) : 2,5 ml

Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 2,5 ml

Nước cất : 4,445 ml

TEMED : 5 l

Ammoniumpersulfate 10% : 50 l

Tổng thể tích : 10 ml

Sau khi cho Ammoniumpersulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần

(tránh tạo bọt khí), dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho

43

mức dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng

đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20

– 30 phút).

Gel gom (Stacking gel):

Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch khác :

40% Acrylamide/Bis (29:1) : 0,5 ml

Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 1 ml

Nước cất : 2,476 ml

TEMED : 4 l

Ammoniumpersulfate 10% : 20 l

Tổng thể tích : 4 ml

Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến

hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn.

Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn

gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di cho dung

dịch điện di vào buồng điện di.

Chuẩn bị mẫu và chạy điện di

Xử lý mẫu

Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và

Aspergillus kawasaki đồng thời với peak được dự đoán là protease mà ta quan tâm của

cả hai chủng khi tủa protein bằng cồn.

Hút 30 l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30 l dung dịch mẫu

protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5 –

10 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1-5 giây.

Chú ý nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lượng protein trong

một giếng không vượt quá 20 – 40 g và hàm lượng protein/band không vượt quá 0,1

g.

Đối với thang chuẩn protein (Biorad) hút 2 l vào eppendorf 1 ml chứa 8 l

nước cất và 10 l dung dịch nạp mẫu.

Tiến hành chạy điện di

Dùng pipetteman 10 l nạp mẫu vào các giếng (20 l/giếng)

Tiến hành chạy điện di ổn định dòng : 100V.

44

Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước (2-4 giờ)

trong một giờ. Sau đó tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải

nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong,

protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.

Xác định trọng lượng phân tử của protein

Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các

band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng.

Tính giá trị Rf :

Rf =

Vẽ biểu đồ lg của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và

các giá trị Rf của chúng.

Trọng lượng phân tử của các vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử có

thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng.

Trọng lượng phân tử của các protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể

xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phương pháp ngoại suy từ đồ thị.

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel.

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Hàm lượng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô

Khoảng cách di chuyển của protein

Khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue

45

Chiết enzyme từ 100g chế phẩm enzyme thô bằng nước cất. Dịch chiết thu

được đem xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease theo thí nghiệm 1 ở mục

3.3.1.1. Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính

protease trong 100g chế phẩm thành hàm lượng và hoạt tính trên một gam chế phẩm.

Kết quả được trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1 : Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết

enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp.kawasaki

Hoạt tính protease

(UI/g CP)

Hàm lượng protein

(mg/g CP)HTR(UI/mg)

Asp.oryzae 29,01 31,20 0,93

Asp. kawasaki 12,85 20,40 0,63

Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lượng protein và hoạt tính enzyme protease trong

dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki

Nhận xét : Từ đồ thị 4.1 cho thấy hàm lượng protein và hoạt tính protease của

Asp.oryzae cao hơn Asp.kawasaki.

4.2 Nồng độ muối tối ưu cho việc tủa protease

Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết

được tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ 50, 55, 60, 65, 70, 75% độ bão hòa. Sử

dụng 50 ml dịch chiết enzyme thô cho mỗi nồng độ. Ly tâm để thu tủa. Sau đó cặn tủa

thu được hòa tan vào 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định tổng hàm

lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) trong 15 ml

dịch hòa tan tủa này. Ở nồng độ nào cho hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nồng độ

tối ưu cho việc tủa enzyme protease.

4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae

05

101520253035

Asp.oryzae Asp.kawasaki

Hàm lượng (mg/g CP)Hoạt tính (UI/g CP)

46

Bảng 4.2 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml

dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.

Nồng độ muối

(NH4)2SO4 (% độ

bão hòa)

Tổng hoạt tính

(UI)

Tổng hàm lượng

(mg)HTR (UI/mg)

50 271,67 106,12 2,56

55 385,98 129,96 2,97

60 495,85 159,95 3,1

65 805,91 204,56 3,94

70 702,29 208,4 3,37

75 625,2 216,09 2,89

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lượng

protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lượng và hoạt tính

trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả được trình bày ở bảng 4.3.

Bảng 4.3 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô

của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối

Nồng độ (NH4)2SO4

(% độ bão hòa)

Hoạt tính

(UI/g CP)

Hàm lượng

(mg/g CP)HTR (UI/mg)

50 35,33 13,8 2,56

55 50,19 16,9 2,97

60 64,48 20,8 3,1

65 104,80 26,6 3,94

70 91,33 27,1 3,37

75 81,3 28,0 2,89

05

1015202530

50 55 60 65 70 75Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa

(% độ bão hòa)

Hàm

lượn

g pr

otei

n (m

g/g

CP)

0

20

40

60

80

100

120

Hoạt

tính

pro

teas

e (U

I/g C

P)

Hàm lượng proteinHoạt tính protease

47

Đồ thị 4.2 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.

Nhận xét :

Kết quả từ bảng 4.3 cho thấy :

Về hàm lượng : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 75% độ bão hòa

thu được hàm lượng protein tủa là nhiều nhất. Nồng độ muối (NH4)2SO4 càng tăng thì

hàm lượng protein tủa được càng nhiều. Điều này có được là do khi nồng độ muối

càng cao, các phân tử muối phân ly thành các ion càng nhiều. Chính các ion này bắt

lấy các phân tử nước khỏi protein càng nhiều, do đó các protein có điều kiện tiếp xúc

nhau và sa lắng.

Về hoạt tính : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 65% độ bão hòa cho

hoạt tính enzyme protease cao nhất.

Hoạt tính riêng của enzyme ở nồng độ muối 65% độ bão hòa cao nhất.

Như vậy, nồng độ muối tủa được nhiều protein nhất không phải là nồng độ tối

ưu để thu nhận enzyme protease. Bởi vì, ở các nồng độ muối khác nhau sẽ tủa được

các protein khác nhau. Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lượng protein tủa được

nhiều nhất nhưng chứa nhiều protein tạp, không phải là enzyme protease. Ngược lại, ở

nồng độ muối 65% độ bão hòa, hàm lượng protein tủa được không cao nhất nhưng

hoạt tính protease mạnh nhất . Điều này chứng tỏ ở nồng độ muối 65% độ bão hòa tủa

được nhiều protease nhất. Từ đây có thể kết luận, nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ

bão hòa là tối ưu để tủa enzyme protease vì vừa cho hoạt tính protease cao, vừa tiết

kiệm lượng muối sử dụng.

4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki

Bảng 4.4 : Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15

ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối

48

Nồng độ (NH4)2SO4

(% độ bão hòa)

Tổng hoạt tính

(UI)

Tổng hàm lượng

(mg)HTR(UI/mg)

50 96,89 53,83 1,80

55 148,18 72,29 2,05

60 197,04 89,97 2,19

65 276,84 103,05 2,68

70 232,47 106,1 2,19

75 202,01 109,2 1,85

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein

có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lượng và hoạt tính trong 1g

chế phẩm enzyme thô. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5

Bảng 4.5 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối

Nồng độ muối (NH4)2SO4

(% độ bão hòa)

Hoạt tính

(UI/g CP)

Hàm lượng

(mg/g CP)HTR (UI/mg)

50 12,6 7 1,8

55 19,27 9,4 2,05

60 25,62 11,7 2,19

65 36 13,4 2,68

70 30,2 13,8 2,19

75 26,27 14,2 1,85

0

5

10

15

50 55 60 65 70 75Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa (% độ bão hòa)

Hàm

lượn

g pr

otei

n (m

g/g

CP)

0

10

20

30

40

Hoạt

tính

pro

teas

e (U

I/g C

P)

Hàm lượng protein

Hoạt tính protease

49

Đồ thị 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.

Nhận xét :

Tương tự với chủng Asp.oryzae, đối với chủng Asp.kawasaki :

Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lượng protein tủa được là nhiều nhất.

Nồng độ muối 65% độ bão hòa chính là nồng độ tối ưu để tủa enzyme

protease.

4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease

Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết

được tủa với cồn lạnh ở các tỷ lệ dịch enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Sử

dụng 50 ml dịch trích enzyme thô cho mỗi tỷ lệ. Ly tâm để thu tủa sau đó hòa tan tủa

trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định hàm lượng và hoạt tính của

dịch hòa tan tủa. Ở tỷ lệ nào hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là tỷ lệ cồn tối ưu cho

việc tủa enzyme.

4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae

Bảng 4.6 : Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15

ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn.

Tỷ lệ dịch enzyme : cồnTổng hoạt tính

(UI)

Tổng hàm lượng

(mg)

HTR

(UI/mg)

1:1 247,46 130,11 1,9

50

1:2 337,98 155,03 2,18

1:3 454,48 185,48 2,45

1:4 701,63 216,55 3,24

1:5 563,68 197,79 2,85

1:6 524,30 193,48 2,71

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lượng

protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lượng và hoạt tính

trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7.

Bảng 4.7 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn

Tỷ lệ dịch trích : cồnHoạt tính

(UI/g CP)

Hàm lượng

(mg/g CP)

Hoạt tính riêng

(UI/mg)

1:1 32,18 16,92 1,9

1:2 43,95 20,16 2,18

1:3 59,1 24,12 2,45

1:4 91,24 28,16 3,24

1:5 73,3 25,72 2,85

1:6 68,18 25,16 2,71

0

510

15

2025

30

1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Tỷ lệ dung dịch enzyme và cồn lạnh

Hàm

lượ

ng p

rote

in (m

g/g

CP)

0

20

40

60

80

100

Hoạ

t tín

h pr

otea

se

(UI/g

CP)

Hàm lượng proteinHoạt tính protease

51

Đồ thị 4.4 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn.

Nhận xét : Ở tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1:4, hàm lượng protein và hoạt tính

protease đều cao nhất. Như vậy có thể kết luận rằng, tỷ lệ dịch trích enzyme thô : cồn

= 1:4 là tỷ lệ tối ưu để tủa enzyme protease.

4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki

Bảng 4.8 : Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15

ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn.

Tỷ lệ dịch trích : cồnTổng hoạt tính

(UI)

Tổng hàm lượng

(mg)HTR(UI/mg)

1:1 78,8 47,75 1,65

1:2 119,09 66,90 1,78

1:3 147,58 80,21 1,84

1:4 268,15 125,89 2,13

1:5 202,59 109,51 1,85

1:6 195,17 108,43 1,80

Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein

có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lượng và hoạt tính trong 1g

chế phẩm enzyme thô. Kết quả được trình bày ở bảng 4.9.

Bảng 4.9 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn

Tỷ lệ dịch trích : cồn Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lượng (mg/g CP)HTR

(UI/mg)

52

1:1 10,25 6,21 1,65

1:2 15,49 8,70 1,78

1:3 19,19 10,43 1,84

1:4 34,86 16,37 2,13

1:5 26,34 14,24 1,85

1:6 25,38 14,10 1,80

Đồ thị 4.5 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme

thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn.

Nhận xét : Từ kết quả ở bảng 4.9 cho thấy, khi tủa enzyme bằng cồn ở tỷ lệ 1:4,

hàm lượng protein thu được nhiều nhất đồng thời hoạt tính protease cũng cao nhất.

Như vậy tỷ lệ dịch trích enzyme thô : cồn ở tỷ lệ 1:4 là tối ưu để kết tủa enzyme

protease.

4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4.

Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng

Asp.oryzae và Asp.kawasaki.

0

5

10

15

20

1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Tỷ lệ dung dịch enzyme và cồn lạnh

Hàm

lượn

g pr

otei

n (m

g/g

CP)

0510152025303540

Hoạt

tính

pro

teas

e (U

I/g C

P)

Hàm lượng proteinHoạt tính protease

53

ChủngTác nhân

tủa

HT cao nhất

(UI/g CP)

HL cao nhất

(mg/g CP)

HTR ở nồng độ muối và

tỷ lệ cồn tối ưu (UI/mg)As

p.or

yzae Cồn 960 91,24 28,16 3,24

Muối

(NH4)2SO4

104,80 28 3,94

Asp.

kaw

asak

i

Cồn 960 34,86 16,37 2,13

Muối

(NH4)2SO4

36 14,2 2,35

Từ kết quả của cả hai chủng cho thấy, hàm lượng protein thu được từ tác nhân

tủa là cồn cao hơn tác nhân tủa là muối. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme protease khi tủa

bằng cồn lại thấp hơn khi tủa bằng muối. Điều này là do khi kết tủa bằng cồn, tạp chất

trong chế phẩm lớn hơn khi kết tủa bằng muối. (Lê Ngọc Tú, 1982). Hơn nữa, có thể

xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Khi

hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt

động. Trong khi đó muối (NH4)2SO4 là muối trung tính thường được sử dụng vì tính

hòa tan tốt và ít gây biến tính protein ở nhiệt độ thường

Đối với tủa bằng cồn: Thu được hàm lượng protein cao, dễ dàng thực hiện

trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp tủa bằng

cồn là hoạt tính protease không cao so với tủa bằng muối, hoạt tính riêng thấp hơn so

với muối, cần dụng cụ tủa có thể tích lớn nên không tiện áp dụng ở quy mô công

nghiệp.

Đối với tủa bằng muối : Hoạt tính protease cao, hoạt tính riêng cao. Tuy

nhiên, nhược điểm của phương pháp tủa bằng muối là hàm lượng protein không cao so

với tủa bằng cồn. Việc sử dụng muối trong sản xuất quy mô lớn bị hạn chế do việc rất

khó tách nó hoàn toàn ra khỏi tủa protein. Vì trong quá trình lắng tủa, tuy phần lớn

muối tồn tại trong dung dịch trên cặn, nhưng vẫn có một phần nhỏ có mặt trong tủa

protein.

4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease.

54

Như đã trình bày trong phần 4.3.2 việc tủa enzyme trong cồn lạnh dễ áp dụng ở

quy mô phòng thí nghiệm. Do đó để xác định pH và nhiệt độ tối ưu của enzyme

protease, chúng tôi sử dụng dịch pha tủa ở tỷ lệ cồn tối ưu (tỷ lệ dịch enzyme : cồn =

1:4).

4.5.1 pH tối ưu

Khảo sát hoạt tính enzyme ở các giá trị pH : 4, 5, 6, 7, 8, 9 trong cùng điều kiện

về nhiệt độ (370C) để xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.

4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae

Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH

pH 4 5 6 7 8 9

Hoạt tính (UI/g CP) 84,98 87,57 89,56 91,73 88,12 85,21

Đồ thị 4.6 : Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae.

Nhận xét : Enzyme rất nhạy với pH của môi trường. pH môi trường thường ảnh

hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme. Chính

vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với

một vùng pH nhất định. Từ đồ thị 4.6 cho thấy pH tối ưu cho hoạt động của protease

từ Asp.oryzae là pH = 7. Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ưu , hoạt tính enzyme đều

giảm.

4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki

Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH

pH 4 5 6 7 8 9

82848688909294

4 5 6 7 8 9pH

Ho ạ

t tín

h (U

I/gCP

)

55

Hoạt tính (UI/g CP)

29,82 31,50 34,12 36,23 33,46 30,71

Đồ thị 4.7 : Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ

Asp.kawasaki

Nhận xét : Qua đồ thị 4.7 cho thấy pH = 7 là pH tối ưu cho hoạt động của

enzyme protease từ Asp.kawasaki.

4.5.2 Nhiệt độ tối ưu

Khảo sát hoạt tính enzyme theo dãy nhiệt độ (0C) : 30, 37, 47, 57, 67, 77 trong

cùng điều kiện về pH (pH = 7).

4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae

Bảng 4.13 : Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ.

Nhiệt độ (0C) 30 37 47 57 67 77

29

31

33

35

37

4 5 6 7 8 9

pH

Hoạ

t tín

h (U

I/g

CP)

56

Hoạt tính (UI/g CP)

77,89 90,7 94,89 91,41 85,7 60,2

Đồ thị 4.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae

Nhận xét :

Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme,

chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất. Thông thường khi

nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một

giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm.

Từ đồ thị 4.8 cho thấy protease của chủng Asp.oryzae hoạt động mạnh nhất ở

nhiệt độ 470C. Vượt quá nhiệt độ này, hoạt tính enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở

770C do sự biến tính của enzyme.

4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki

Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ

Nhiệt độ (0C) 30 37 47 57 67 77

55

65

75

85

95

105

30 37 47 57 67 77

Nhiệt độ (oC)

Ho

ạt tí

nh (U

I/gC

P)

57

Hoạt tính (UI/g CP)

24,84 36,73 39,16 30,12 15,2 10,14

Đồ thị 4.9 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki.

Nhận xét : Tương tự chủng Asp.oryzae, đối với Asp.kawasaki nhiệt độ tối ưu

cho hoạt động của protease cũng ở 470C. Sau nhiệt độ tối ưu, hoạt tính protease giảm.

4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel.

Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với muối 65% và cồn ở tỷ lệ dịch chiết

enzyme thô : cồn là 1:4 được chạy qua hệ sắc ký lọc gel với các thông số sau :

Gel : Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5000 – 100.000 daltons).

Cột : 30 x 1,5 cm

Flow adaptor : 1,5 cm.

Tốc độ dòng : 0,14 ml/phút.

Vmẫu : 1ml.

Phân đoạn : 2 ml/phân đoạn.

A280 : Độ hấp thụ protein ở bước sóng 280 nm.

5

15

25

35

45

30 37 47 57 67 77

Nhiệt độ (0C)

Hoạ

t tín

h (U

I/gC

P)

58

4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae

a) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 sau khi tủa protease bằng

muối.

Hình 4.1 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease

bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae.

Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 thu được 3

peak với thứ tự như sau :

Peak1 : từ ống số 8 đến ống 11 : 8 ml

Peak2 : từ ống số 17 đến ống 19 : 6 ml.

Peak3 : từ ống số 25 đến 31 : 14 ml.

Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi

nhận thấy cả ba peak thu được đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm

lượng protein của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan

tâm.

b) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 sau khi tủa protease bằng

cồn.

59

Hình 4.2 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 khi tủa bằng cồn

đối với nấm Aspergillus oryzae.

Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng cồn thu được 3 peak với thứ

tự như sau:

Peak 1 : từ ống số 7 đến ống 12 : 12 ml

Peak 2 : ống 13 và 14 : 4 ml

Peak 3 : ống 19 đến ống 27 : 18 ml.

Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi

nhận thấy cả ba peak thu được đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm

lượng protein của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan

tâm.

c) Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae khi tủa protease bằng

cồn và muối qua sắc ký lọc gel.

60

Bảng 4.15 : Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel.

HT protease

(UI/g CP)

HL protein

(mg/g CP)

HTR

(UI/mg)

Độ tinh

sạch

Hiệu suất

về HT (%)

Chế phẩm enzyme

thô29,01 31,2 0,93 1 100

Dịch thu được sau

khi chạy sắc ký qua

Biogel P-100 khi

tủa muối

19,293 3 6,43 6,91 66,49

Dịch thu được sau

khi chạy sắc ký qua

Biogel P-100 khi

tủa cồn

10,059 1,7 5,9 6,34 34,67

Nhận xét kết quả lọc gel :

Sau quá trình tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel, hoạt tính riêng của

protease tăng lên đáng kể. Hoạt tính riêng của protease khi tủa bằng muối sau khi qua

sắc ký cao hơn khi tủa bằng cồn. Độ tinh sạch của enzyme sau khi qua sắc ký như sau :

+ Khi tủa protease bằng muối : Độ tinh sạch gấp 6,91 lần so với chế phẩm

enzyme thô ban đầu.

+ Khi tủa protease bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 6,34 lần so với chế phẩm

enzyme thô ban đầu.

4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki

a) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng muối.

61

Hình 4.3 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa bằng

muối đối với nấm Aspergillus kawasaki.

Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng muối thu được 2 peak với thứ

tự như sau :

Peak1 : từ ống số 7 đến ống 12 : 12 ml

Peak2 : từ ống số 22 đến ống 29 : 16 ml.

Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi

nhận thấy cả hai peak thu được đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm

lượng protein của peak 2 cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa protease quan

tâm.

b) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 khi tủa protease bằng cồn.

Hình 4.4 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa bằng cồn

đối với Aspergillus kawasaki.

Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng cồn thu được hai peak với thứ

tự như sau :

Peak 1 : Từ ống số 7 đến ống 13 : 14 ml.

62

Peak 2 : từ ống số 14 đến ống 31 : 36 ml

Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi

nhận thấy cả hai peak thu được đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm

lượng protein của peak 2 cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa protease quan

tâm.

c) Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki khi tủa protease bằng

cồn và muối qua sắc ký lọc gel.

Bảng 4.16 : Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc

gel.

HT protease

(UI/g CP)

HL protein

(mg/g CP)

HTR

(UI/mg)

Độ tinh

sạch

Hiệu suất

về HT (%)

Chế phẩm enzyme

thô12,852 20,40 0,63 1 100

Chạy sắc ký qua

Biogel P-100 khi

tủa muối

8,045 1,38 5,83 9,25 62,7

Chạy sắc ký qua

Biogel P-100 khi

tủa cồn.

5,534 1,05 5,27 8,37 43,1

Nhận xét kết quả lọc gel :

Sau quá trình tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel, hoạt tính riêng của

protease tăng. Độ tinh sạch của enzyme sau khi qua sắc ký như sau :

+ Khi tủa protease bằng muối : Độ tinh sạch gấp 9,25 lần so với chế phẩm

enzyme thô ban đầu.

+ Khi tủa protease bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 8,37 lần so với chế phẩm

enzyme thô ban đầu.

4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc

Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki.

4.7.1 Tủa protease bằng muối

63

Bảng 4.17 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa

protease bằng muối.

Asp.oryzae Asp.kawasaki

Hoạt tính riêng

(UI/mg)

Dịch thô 0,93 0,63

Dịch tủa muối 3,94 2,68

Dịch sau sắc ký 6,43 5,83

4.7.2 Tủa protease bằng cồn

Bảng 4.18 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa

protease bằng cồn.

Asp.oryzae Asp.kawasaki

Hoạt tính riêng

(UI/mg)

Dịch thô 0,93 0,63

Dịch tủa cồn 3,24 2,13

Dịch sau sắc ký 5,9 5,27

Đồ thị 4.10 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa protein bằng muối

01234567

Asp.oryzae Asp.kawasaki

Dịch enzyme thôDịch tủa muốiDịch sau sắc ký

64

Nhận xét :

Qua hai đồ thị 4.10 và 4.11 cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn hay

muối hoạt tính riêng của protease từ hai chủng nấm mốc qua các bước tinh sạch đều

tăng dần. Sau quá trình tủa, hoạt tính protease tăng lên do đã loại bớt được một số

protein tạp. Tuy nhiên, enzyme vẫn hoàn toàn chưa sạch do trong đó vẫn còn chứa một

số protein lạ khác. Các protein lạ này sẽ bị loại bỏ qua quá trình sắc ký. Do đó, hoạt

tính riêng của protease sau khi qua sắc ký cao nhất.

Từ hai đồ thị trên, chúng ta cũng thấy được hoạt tính protease của Aspergillus

kawasaki không cao bằng hoạt tính protease từ Aspergillus oryzae. Như vậy, nếu đưa

vào sản xuất, chủng Asp.kawasaki vẫn không thể là nguồn vi sinh vật thay thế

Asp.oryzae để thu nhận enzyme protease.

4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel

SDS – PAGE.

Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và

Aspergillus kawasaki. Đồng thời, dịch enzyme thu được từ các peak sau khi chạy sắc

ký của mẫu tủa bằng cồn của cả hai chủng cũng được chạy điện di đồng thời với dịch

chiết enzyme thô.

Phương pháp chuẩn bị mẫu như ở mục 2.2.3

Đồ thị 4.11 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa protease bằng cồn.

0

2

4

6

8

Asp.oryzae Asp.kawasaki

Dịch enzyme thô

Dịch tủa cồn

Dịch sau sắc ký

65

Kết quả điện di như hình 4.5.

Hình 4.5 : Kết quả chạy điện di của các dịch enzyme protease

Thứ tự cho mẫu vào các giếng :

Giếng 1 : Thang protein chuẩn

Giếng 2 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae

Giếng 3 : Dịch enzyme thu được từ peak 1 của Aspergillus oryzae.

Giếng 4 : Dịch enzyme thu được từ peak 2 của Aspergillus oryzae.

Giếng 5 : Dịch enzyme thu được từ peak 3 của Aspergillus oryzae.

Giếng 6 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus kawasaki.

Giếng 7 : Dịch enzyme thu được từ peak 1 của Aspergillus kawasaki.

Giếng 8 : Dịch enzyme thu được từ peak 2 của Aspergillus kawasaki.

Từ kết quả điện di, tính giá trị Rf của từng protein trong thang chuẩn. Từ đó xây

dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lg trọng lượng phân tử của các

protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.

Kdal 200

116,25

1 2

97,466,2

45

31

21,514,4

3 4 5 6 7 8

66

Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của những protein trong thang.

Rf Trọng lượng phân tử (daltons) Lg(trọng lượng phân tử)

0,0317 200.000 5,301

0,1111 116.250 5,065

0,2539 974.000 4,988

0,3174 662.000 4,820

0,5555 45.000 4,653

0,7460 31.000 4,491

0,9206 21.500 4,332

0,9682 14.400 4,158

Đồ thị 4.12 : Sự tương quan giữa Lg của trọng lượng phân tử và giá trị Rf.

Phương trình hồi quy tuyến tính thu được từ đồ thị 4.12 như sau :

Y = - 1,0576X + 5,2426

Trong đó : Y = lg(trọng lượng phân tử protein)

X = Rf : Tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng

cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tách.

Từ phương trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng

phân tử của protein :

Trọng lượng phân tử protein = 10Y

y = -1.0576x + 5.2426

44.24.44.64.8

55.25.45.6

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Rf

Lg(t

rọng

lượn

g ph

ân tử

)

67

Từ hình 4.5 cho thấy :

Đối với Aspergillus oryzae:

Giếng 2 xuất hiện bốn vạch, là bốn loại protein có trong dịch chiết

enzyme thô.

Giếng 3 và 4 không xuất hiện vạch protein, kết quả này là do hàm lượng

protein trong peak 1 và 2 thấp nên không hiện vạch trên điện di đồ.

Giếng 5 xuất hiện 2 vạch. Vì hoạt tính của peak 3 cao nhất nên có thể dự

đoán hai vạch này chính là hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra. Giá trị Rf và trọng

lượng phân tử của hai loại protease được tính toán dựa vào kết quả điện di và phương

trình hồi quy tuyến tính. Kết quả như bảng 4.20.

Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae

Thứ tự vạch X = Rf YTrọng lượng phân tử của protease

(Daltons)

Vạch 1 0,6031 4,6046 40.242

Vạch 2 0,7619 4,4368 27.340

Đối với Aspergillus kawasaki:

Trong hai peak thu được của Asp.kawasaki sau khi chạy sắc ký, peak 2 có hoạt

tính protease và hàm lượng protein cao nhất và cho hai vạch trên điện di đồ, peak 1

cho hoạt tính protease thấp và không xuất hiện vạch trên điện di đồ. Từ đó có thể dự

đoán hai vạch của peak 2 chính là hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra. Giá trị Rf

và trọng lượng phân tử của hai loại protease được tính toán dựa vào kết quả điện di và

phương trình hồi quy tuyến tính. Kết quả như bảng 4.21.

Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki.

Thứ tự vạch X = Rf YTrọng lượng phân tử của

protein (daltons)

Vạch 1 0,5873 4,3192 41.828

Vạch 2 0,873 4,3192 20.859

68

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết Luận

Từ những kết quả thu được qua các thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết

luận sau :

5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ưu để tủa enzyme

protease.

Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ưu để tủa enzyme protease.

Điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở

nhiệt độ 470C và pH = 7.

Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 960, hoạt tính riêng của

protease tăng lên :

+ Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg

tăng lên 6,43 UI/mg.

+ Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg tăng

lên 5,9 UI/mg.

Sau khi qua sắc ký :

+ Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế

phẩm thô ban đầu là 66,49% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,91

lần so với chế phẩm enzyme thô.

+ Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm

thô ban đầu là 34,67% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,34 lần so

với chế phẩm enzyme thô.

Trọng lượng phân tử của hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra lần lượt là

40.242 và 27.340 daltons.

5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki

Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ưu để tủa enzyme

protease.

Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ưu để tủa enzyme protease.

69

Điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở

nhiệt độ 470C và pH7.

Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 960, hoạt tính riêng của

protease tăng lên :

+ Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg

tăng lên 5,83 UI/mg.

+ Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg tăng

lên 5,27 UI/mg.

Sau khi qua sắc ký :

+ Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế

phẩm thô ban đầu là 62,7% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 9,25 lần

so với chế phẩm enzyme thô.

+ Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm

thô ban đầu là 43,1% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 8,37 lần so

với chế phẩm enzyme thô.

Trọng lượng phân tử của hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra lần lượt là

41.828 và 20.859 daltons.

5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki

Protease của cả hai chủng đều hoạt động tốt nhất ở pH7 và nhiệt độ 470C.

Protease thu được từ Aspergillus oryzae có hoạt tính cao hơn protease từ

Aspergillus kawasaki.

5.2 Đề nghị 

Khảo sát thêm các phương pháp tủa protein khác như lắng tủa đẳng điện, lắng

tủa bằng các chất đa điện phân.

Tiến hành chạy sắc ký với các loại gel khác Biogel P-100 nhằm tìm ra loại gel

tốt nhất để phân tách protease cho kết quả tinh sạch hơn.

Tinh sạch tiếp tục protease bằng sắc ký trao đổi ion sau khi qua sắc ký lọc gel.

Thực hiện western blot để kiểm tra vạch protease sau khi chạy điện di. Từ đó

hoàn thiện quy trình tinh sạch protease.

70

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Hữu Chấn, 1984. Enzyme và xúc tác sinh học. Nhà xuất bản Khoa

học và Kỹ Thuật.

2. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Qốc Gia

TP.HCM.

3. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại

học Quốc Gia TP.HCM.

4. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia TP.HCM.

5. Nguyễn Văn Mùi, 2001. Thực hành hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc

Gia Hà Nội.

6. Lương Đức Phẩm, 1998 . Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp

7. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982. Enzyme

vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học Kĩ thuật.

8. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, 1994 . Công nghệ sinh học và một số ứng dụng tại

Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

9. Nguyễn Tiến Thắng, 2004. Giáo trình Công nghệ enzyme.Tủ sách trường Đại

học Nông Lâm TP.HCM.

10. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Tủ

sách Viện Sinh Học Nhiệt Đới.

TIẾNG NƯỚC NGOÀI

11. Amersham Biociences, 2004. Gel Filtration – Principle and Methods.

Edition A1.

71

PHỤ LỤC

1) Đường chuẩn Albumin

72

2) Đường chuẩn Tyrosine

73