Parte 1.- Genoma humano:organización, expresión y

regulación génica.

Biología = Información/ Genoma humano: ADN Material genético de un ser vivo. Es el juego completo de instrucciones hereditarias para la formación, desarrollo y mantenimiento de un ser humano, y pasar la vida a la siguiente generación.

Conjunto de genes que especifican todos los caracteres que pueden ser expresados en un organismo.

El material genético de eucariotas está formado por ADN.

Localización del ADN en la célula eucariótica Unidad básica de los organismos vivos pluricelulares.

Organismo humano formado por 100 de trillones de células de diversos tipos (piel, sangre, epitelio intestinal...) y diversas funciones.

Contiene una copia completa del genoma o material genético (ADN) en el núcleo en forma de cromosomas compactos (cromatina, histonas). La célula diploide contiene 46 cromosomasagrupados en 22 pares y los cromosomas X e Y (uno del padre y uno de la madre).

Estructura molecular del ADN

Molécula helicoidal de dos cadenas antiparalelas compuesta de cuatro unidades básicas: nucleótidos.

Cada nucleotido: grupo fosfato, azucar y una base nitrogenada: adenina (A), guanina (G),citosina (C), y timina (T).

Dos cadenas unidas por puentes de hidrógeno entre las bases G con C y A con T. El exterior de la molécula está cargado negativamente y el interior tiene naturaleza hidrofóbica.

5’ end

3’ end

Una cadena doble de ADN puede separarse (desnaturalización): se rompen los puentes de hidrógeno entre los pares de bases y las cadenas se separan.

La hibridación consiste en pegar dos cadenas de ácidos nucléicos: ADN-ADN, ARN-ARN o ADN-ARN determinada por la complementaridad de sus bases.

in vivo, enzimas; in vitro, T

Propiedades del ADN

La replicación del ADN

Elementos constituyentes del ADN

Exons; 1%

Introns; 24%Other intergenic DNA; 22%

Simple repeats; 3%

Large duplications;

5%

Transposons; 45%

Genoma Humano: ~3.3 × 109 pb

20000-25000 genes25% genoma (intron + exon):

1% genes (exon): codificante de proteínas

Proteoma: ∼90000 proteínas ?

Muchas cuestiones aún sin resolver: Funciones de una buena parte de los 25000 supuestos genes Papel de las alteraciones de la secuencia de ADN Papel de las secuencias no-codificantes

150000 genes? 90000 proteínas= 90000genes?Caenorhabditis elegans: ∼1000 células, 19500 genesMaiz: 40000 genes

Secuencias no codificadoras de proteínasLa mayor parte del genoma humano se transcribe en ARNpero solo ∼1% codifica proteínas

Chatarra genética o otras funciones?

Como se consiguen tantas proteínas a partir de tan pocos genes?

Incremento de la complejidad reguladora

Proteínas y también ARN como elementos reguladores

‘Alternative splicing’: edición alternativa

Flujo de información: dogma central La expresión de la información

genética del ADN ocurre en dos etapas:

Transcripción: el ADN se transcribe a ARNm.

Traducción: el ARNm se traduce en la formación de proteínas (tres nucleótidos: 1 aa).

La mayoría de los genes son codificadores de proteínas aunque entre un 2-5% son ARN funcional(ARN ribosómico, ARN transferencia, miRNAsregulación de la expresión).

rRNA

tRNA

20-25 min

> 4 hours

Processing

Transcripción del ADN a ARNm

Molécula de igual secuencia que la cadena codificante de ADN: la base T se sustituye por la base U (uracilo).

(40 nucleótidos seg-1)

1 gen de 10000 pb tardaunos 5 min en transcribirse

‘template’

‘codificante’

Flujo de información: dogma central a tiempo real

Procesado del ARNm: núcleo

Regulatoryelements

Coding region

TAATAGTGA

Cap Poly-A

Splicing

Las moléculas de ARNm son bastante estables (4-24 h de vida media).

Transcriptionfactors RNApol

Regulatoryelements

En eucariotas la mayoría de los genes estan interrumpidos en exones e intrones eliminados por ‘splicing’.

Procesado del ARNm: núcleo

‘Edición alternativa’ da lugar a diferentes tránscritos (diferentes proteínas).

Regulación de la expresióngénica: múltiple y compleja

1. Genoma: cromatina, histonas, metilación del ADN (epigenética)

2. Transcripción: Factores de transcripción

3. Procesado y transporte del ARNm

4. Degradación o inhibición de la traducción de ARNm por ARN de interferencia o silenciación (microARNs)

Factores externos

Alteraciones en la secuencia del ADN

o Alteraciones puntuales(cambio o deleción de una base)

o Inserciones (transposones) o delecciones de fragmentos; secuencias repetidas

o Cromosomas: rotura y recombinación; pérdida y ganancia (aneuploidías, poliploidías); variaciones estructurales

o Metilación inapropiada de las bases (epigenética)

Cambios en la secuencia de ADN: inducidos (agentes mutágenos, radicales) o expontáneos (mal funcionamiento del sistema de reparación de ADN).

Es la forma más común de variación de la secuencia de ADN humana donde una base única (o unas pocas bases) difiere entre individuos (sustitución o deleción).

Aparecen con una frecuencia de 1 cada ~100-300 pares de bases. Varios millones de ‘snips’ posibles en el genoma humano (< 10 millones). Frecuencia estable en la población.

Puede afectar a regiones codificadoras y no codificadoras (reguladoras) produciendo un efecto o ninguno. Puede afectar a la calidad (función ) como a la cantidad de una proteína (expresión).

Single Nucleotide Polymorphisms: SNPsPolimorfismo C/TDos alelos: C y T

Polimorfismos de nucleótido simple (SNPs)

Individuos con diferentes SNPs (‘genetic make up’) tendrán diferentes respuestas a agentes xenobióticos (drogas o nutrientes), diferente

capacidad metabólica, diferente susceptibilidad a enfermedades (cáncer, CDVs),

Diferentes requerimientos (tratamientos con fármacos, dietas):Medicina o Nutrición personalizada

Parte 2.- Dieta, Genes y Salud:Genómica Nutricional .

Dra. María Teresa García Conesa

Nutrición y Salud (el pasado)

2.- ‘Que tu alimento sea tu medicamento y tu medicamento tu alimento’ Hipócrates

Alimentos(vitaminas, minerales)

Salud vs Enfermedad

Alimentos(proteínas, grasas,

carbohidratos, vitaminas y minerales)

Niveles adecuados de energía y materia para:

desarrollo y mantenimiento de la estructura y funcionamiento celular

(homeostasis)

1.- ‘You are what you eat’

Conjunto de procesos de transformación,

Absorción, metabolismo,asimilación en tejidos

y eliminación

HipócratesMédico griego s. V a.C.

NUTRIENTES(requerimientos)

GENOMA(saludable)

Mantener una vida saludable y largareemplazando nuestras células con nuevas células

que tengan un genotipo normal y una expresión génica apropiada al tejido y función celular.

La dieta tiene un impacto enorme y esencial en nuestro genoma y en la expresión y regulación de

nuestros genes desde que nacemos.

Interacción genes y dieta (el presente)

Enfermedades crónicas (multifactoriales):CáncerAlzheimerDiabetesObesidadCardiovascularesDaño inmunológico

Algunos de los problemas de salud actuales

Epidemiología Factores:

Agentes ambientales (tabaco, radiaciones, contaminates químicos)

Estilo de vida (sedentarismo, stress)

Dieta (alta en calorias, grasa y azúcares refinados)

Agentes infecciosos (virus)

Mapa genético individual(polimorfismos) y factores epigenéticos.

Multiples factores

Dieta: mezcla de sustancias tóxicas (contribuyen a la iniciación y desarrollo) y beneficiosas (protectoras) que alteran o modulan el equilibrio salud/enfermedad.

Enfermedades crónicas

Fibra fermentable (SCFA, butirato)Ácidos grasos mono- y poli-insaturados

(ϖ3: ϖ6)Micronutrientes (vitaminas, minerales)Otros: folatos, glucosinolatos, compuestos

fenólicos ...)Probióticos y prebióticos

Prevención/Retardo

Exceso de caloríasExceso y naturaleza grasas (saturadas)Carbohidratos refinados (índice glucémico)Bajo consumo de micronutrientesMutágenos químicos (procesado, cocinado,

conservación)

Desarrollo

Dieta: factor fundamental - enfermedades

La interacción dieta-genes afecta al equilibrio salud-enfermedad.

‘Nutrición adecuada’para mantener la salud

(dieta equilibrada)

DIETA GENES

Complejidad del conjunto de

compuestos que ocurren en los

alimentos.

Variabilidad del mapa genético humano (SNPs,

epigenética, interacción gen-

gen).

Complejidad y variabilidad de la respuesta del

organismo, del estado de salud o de la enfermedad.

DOS PERSONAS COMIENDO LOS MISMOS ALIMENTOS Y HACIENDO EL MISMO EJERCICIO, NO TIENEN EL MISMO PESO

Las diferencias individuales en la respuestaa la dieta pueden ser explicadas en parte por variaciones en el Genoma

MODELOS TRANSGÉNICOS: Ratones a los que se les suprime algún gen relacionado con el metabolismo lipídico y presentan mayor obesidad que ratones control de la misma edad, sexo, y otras características

Hipercolesterolemia familiar Enfermedad del metabolismo de las lipoproteínas y modulada por la dieta.

>700 mutaciones/alteraciones diferentes descritas en el gen LDLR (receptor de las LDL, cromosoma 19).

Diferentes mutaciones, diferentes niveles de severidad en la enfermedad.

Incluso con la misma mutación, diferentes grados de enfermedad.

Otros factores intervienen: interacción gen-factores ambientales (estilo de vida, dieta) ó interacciones gen-gen

VARIABILIDAD EN LA RESPUESTA INDIVIDUAL FRENTE A UNA INTERVENCIÓN DIETÉTICA

Descenso en los niveles de colesterol en plasma

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0 1 2

perc

ent L

DL-

C c

hang

e

MenALTA RESPUESTA

BAJA RESPUESTA

RESPUESTA NORMAL

Las recomendaciones dietéticas deben tener en cuenta la dotación genética de cada individuo

Efectos de la dieta en los genes (regulación expresión): efectos moduladores de la exposición a la dieta (nutriente) en el riesgo de desarrollo de enfermedades en personas con diferentes mapas genéticos (genotipo).

Impacto de las diferencias genéticas en la respuesta a la dieta: efectos diferentes del genotipo sobre el desarrollo de la enfermedad en personas expuestas a diferentes dietas.

Interacción genes y dieta

Nutrición en el presente/futuro

Nutrientes Estado delGenoma

Salud

Nutrición diseñada para cada genotipo.

Optimizar la salud del genoma y prevenir el desarrollo de enfermedades causadas por daño genómico (CDVs, cáncer, alzheimer…etc)

• La genómica nutricional es la ciencia que estudia la interacción funcional entre los alimentos y sus componentes con el genoma de los individuos a nivel molecular, celular y sistémico; su objetivo es utilizar una dieta personalizada para prevenir o tratar la enfermedad.

• Dentro de ella se puede distinguir:• Nutrigenética• Nutrigenómica

Genómica Nutricional

‘Entendimiento de los mecanismos moleculares y genéticos por los cuales los componentes de la dieta afectan la expresión, regulación y estructura genética

de un individuo y como esta interacción afecta a su vez al balance entre salud y enfermedad’

Nutrigenómica

Nutrigenética‘Examina el efecto de la variación genética en la interacción entre dieta y enfermedad. Identifica y caracteriza las variantes genéticas asociadas o responsables de las diferentes respuestas a los

nutrientes.

Adaptación de la dieta a los requerimientos nutricionales para prevenir, mitigar o curar enfermedades crónicas (cáncer,

cardiovasculares…).

Mecanismos biológicosimplicados en

salud y enfermedadBIOMARCADORES(sistemas biológicos) Factores genéticos

(Nutrigenética)

Estudios a nivel individual y de población

Alimentos funcionales,nutracéuticos ysuplementos

Genómica Nutricional: establecer requerimientos nutricionales adecuados/personalizados.

Futuro??? Chips

Nutrigenómicos Personalizados

???

‘Una vez descifrado y entendido en su totalidad el genoma humano y

establecidos los mecanismos biológicos que expliquen la relación entre salud y

dieta…’

El Pais, Miercoles 5 de Abril, 2006

Interacción genes y dieta (el futuro?)

Parte 3.- Ómicas. Microarrays aplicados al estudio del

transcriptóma

Unos genes se expresaran y otros se reprimirán(diversos ARNm en

distintas cantidades)

No todos los genes se expresan igual:

Algunos se expresan todo el tiempo (procesos básicos): ‘House Keeping Genes’.

Otros se expresan en un tipo de tejido u otro, o en diferentes estados de desarrollo, o en caso de una enfermedad.

Otros se expresan frente a determinados estímulos o señales(hormonas, drogas…)

El TRANSCRIPTOMA es el conjunto de transcritos de ARN producidos a partir del genoma en un momento dado y bajo unas condiciones determinadas.

Transcriptoma

Proteoma Proteoma completo: de un organismo que puede ser conceptualizado como las proteínas de todas las variedades de proteomas celulares. Es aproximadamente, el equivalente proteínico del genoma

Proteoma celular: la totalidad de proteínas expresadas en una célula bajo condiciones de medioambiente y etapa de desarrollo específicas.

MetabolomaEl metaboloma representa la colección de todos los metabolitos que se hayan en una célula, tejido, órgano u organismo en un momento dado (endógenos y de origen externo) y que son los productos finales del metabolismo y procesos celulares.

Tecnología ómica

Genómica (secuencia, regulación, epigenoma, SNPs)Transcriptómica (MICROARRAYS)

Proteómica (identificación, función, modificaciones post-traducción)Metabolómica (perfil), Metabonómica (función)

Proceso celular

ADN

ARNm

Proteínas

Metabolitos

Respuesta fenotípica: mecanismos celulares

Transcripción

Traducción

OcurrenciaActividad

‘Phenoma’

El reto no es encontrar la explicación a un comportamiento o respuestas en un solo gen o proteína, sino una explicación que sea consistente y bien cimentada en el contexto de la

información complementaria de posiblemente cientos o miles de genes, proteínas y metabolitos.

Tecnología ‘Ómica’como herramienta

investigadora Ómicas Estudio simultáneo de miles

de genes, mensajeros, proteínas y metabolitos en un

solo experimento

BIOLOGÍA DE SISTEMAS

Análisis del pérfil transcriptómicoQUE? Determinación simultánea de los niveles de expresión (ARNm) de cientos a miles de genes en condiciones/tiempos determinados.

Células: líneas celulares primarias, tumorales o aisladas del organismo (linfocitos).

Tejidos animales, biopsias humanas.

Diferentes tejidosde un

organismo(cerebro vs.

higado).

El mismo tejidode un organismo

(tumoral vs.normal).

Efectos de un tratamiento con

droga(tratado vs. no

Identificación de genesregulados/reguladores (diana, marcadores moleculares).

Identificación de perfiles de expresión específicos.

Identificación de funcionesbiológicas alteradas.

Obtención de ARN puro y cuantificación

260 nm

28S18S

ARN puro preparado

para análisis

Microarrays de ADN: principios básicos

Se basan en dos principios fundamentales:

Transcripción reversa: convierte de nuevo el ARNm en ADN.

Capacidad de hibridación del ADN.

Una cadena doble de ADN puede separarse (desnaturalización) por temperatura que destruye los puentes de hidrógeno entre los pares de bases.

La hibridaciónconsiste en pegar dos cadenas de ADN que se complementan o de ARNm a su ADN del que se originó (complemetario).

Propiedades del ADN

Microarrays: fundamento

Amplificación y marcaje de cadenas de ADNc o ARNc a partir del ARNm

G U A A U C C U C1) Transcriptasa Reversa

ARNm

ADNc

C A T T A G G A G

C A T T A G G A G

C A T T A G G A G

C A T T A G G A G

C A T T A G G A G

C A T T A G G A G

2) Polimerasa3)

Molecula marcadora

Fragmentos de ADNc u oligonucleótidos específicos

de un gen (’probes’ o ’sondas’) unidos

covalentemente al soporte (’spots’).

Soporte estable (cristal, silicona)

Desde cientos a varios miles

Microarrays: chips con secuencias de ADNc

Microarrays: fundamento Hibridación de dos cadenas de ácido nucleico que se complementan

Gen no se expresa

Gen se expresa

Detector

Análisis y procesado de imagen

Escaneado

Intensidad de señal es una medida directa de

expresión

Muestra Control

Muestra ProblemaARNm

ADNc marcado ADNc marcadoHibridación

sobre el microarray

ARNm

Adquisición de datos y

procesado

Adquisición de datos y

procesado

0

20

40

60

80

100

C P0

20

40

60

80

100

PC

Fold-change: 2

Ratio:

PC

10050

2= =

Inducción de la expresión

Fold-change: -1,4

Ratio:

PC

75100

0,75= =

Represión de la expresión

Microarrays: expresión diferencial

Microarrays: Affymetrix

Alta densidad: más de 54000 sondas y 1300000 oligonucleótidos que cubren más de 47000 transcritos correspondientes a ~25000 genes humanos anotados.

1.28 cm HG U133 Plus 2.0

ARNc marcado con biotina es hibridado sobre el microarray y teñido con un

conjugado fluorescente de estreptavidina-ficoeritrina (PE)

que se une a la biotina.

Microarrays: análisis de expresión diferencial

OBJETIVO: Identificación de aquellos genes cuyos niveles de expresión son diferentes y reproducibles entre las muestras comparadas (control vs. tratada)

Datos normalizados

Lista sondas (Affymetrix ID)Datos grupo TratadosDatos grupo Control

Paquetes informáticos: Expresión diferencial

Existen numerosos paquetes informáticos comerciales o disponibles en la red para el análisis de microarrays:

Incluyen diferentes métodos analíticos para estudiar y comparar los datos (fáciles de usar).

Integrados con múltiples bases de datos para ayudar al investigador a organizar la información y desarrollar hipótesis y modelos biológicos.

Métodos de visualización de los resultados para ayudar a comprender los datos obtenidos.

GEPAS: Análisis de Expresión Génica

http://gepas.bioinfo.cipf.es/

Análisis de expresión diferencial: T-Rex

Resultados del análisis diferencial (t-test con corrección de multitest (FDR- B-H)

Lista de genes con cambios de expresión

significativos entre dos condiciones

Extracción de los fenómenos biológicos que predominan en los resultados

Determinan si una determinada categoría o anotación funcional esta

estadísticamente representada en el grupo de genes seleccionados.

Información recogida en la bibliografía y

bases de anotaciones biológicas

Lista de genes con cambios de

expresión significativos

entre dos condiciones

Herramientas bioinformáticas

Pistas sobre posibles funciones biológicas, rutas y mecanismos moleculares en los que los genes

modulados pueden estar implicados.

Determinan interacciones entre genes y entre genes y sus

funciones: Redes Funcionales.

PUBMED:

CYP1A16097

Liver CYP1A13057

Human liver CYP1A1 972

Human liver CYP1A1 drug 652

Interpretación de datos: análisis funcional

http://www.ingenuity.com/

INGENUITY ANALYSIS PATHWAY: ‘Top Functions’

Funciones que aparecen mas significativamente asociadas a la selección de genes con expresión alterada.

Genes reprimidos están representados en verde y genes inducidos en color rojo.

Interacciones entre genes están representadas en azul.

Redes Funcionales Gráficas

PARTE 4. - NUTRITRANSCRIPTÓMICA: APLICACIONES ACTUALES Y PERSPECTIVAS

ÓMICAS EN ALIMENTOS

Tecnología ómicaProceso celular

Alimentos:Nutrientes yNo nutrientes

Secuencia, regulación, epigenoma, SNPs

Niveles de expresión (MICROARRAYS)

Identificación, función, modificaciones post-traducción

Perfil de metabolitos, función (Nutrimetabonómica)

ADN

ARNm

Proteínas

Metabolitos

Respuesta fenotípica: mecanismos celulares

Transcripción

Traducción

OcurrenciaActividad

Nutrigenómica

Nutriproteómica

Nutrimetabolómica

Nutritranscriptómica

CÉLULA

ÁNALISIS TRANSCRIPTÓMICO APLICADOS AL ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE DOS CONDICIONES NUTRICIONALES

NUTRITRANSCRIPTÓMICA COMPARATIVA

QUE?Determinación simultánea de los niveles de expresión (ARNm) de cientos a miles de genes en condiciones/tiempos determinados.

Identificación de genesregulados/reguladores (marcadores moleculares).

Identificación de perfiles de expresión específicos.

Identificación de funcionesbiológicas alteradas.

Mayor entendimiento de los procesos celulares (respuestas a los componentes de alimentos, efecto en patologías).

Descubrimiento de nuevas y mejores ‘dianas’ para el tratamiento y/o prevención de enfermedades.

Identificación de perfiles génicos asociados a la aparición o retardo de enfermedades.

EJEMPLOS DE ESTUDIOS DE TRANSCRIPTÓMICA

• Mecanismos moleculares en respuesta a moléculas específicas• Tipos celulares apropiados frente a compuesto y dosis adecuadas (biodisponibilidad real)

In vitro:modeloscelulares

Metabolito activo de colon

O OH

HO

O

Urolitina A

(Mw: 228)

ARN ARN

In vivo:modelosanimales

• Evaluación de la significación biológica de los efectos in vivo

• Biodisponibilidad; dosis dietéticas equivalentes a dosis humanas, plazos.• Gran variedad de modelos: roedores, cerdos; modelos transgénicos; modelos inducidos

• Muestras de todos los tejidos.• Heterogeneidad de las muestras de tejidos

Extracción materialgenético (ARN)

In vivo:estudios

humanos

• Evaluación de la significación biológica de los efectos in vivo

Intervención dietética:- Alimento o producto- Duración (agudos vs crónicos)- Controles y/o placebos- Dosis dietéticas reales

• Tamaño muestra• Heterogeneidad vs homogeneidad• Características de la población muestra• Voluntarios sanos y/o enfermos

(prevención vs tratamiento)

Toma de muestras: Dificultad toma de muestras / heterogeneidad tejidos

Extracción materialgenético (ARN)

Futuro

Mayor conocimiento del genoma y de su biología: mayor precisión pero también mayor complejidad de los planteamientos.

Microarrays mejor diseñados (‘sequencing technology’) y más económicos: mayor Nº de muestras, más reproducibilidad.

Mejores y más fáciles y accesibles herramientas de análisis (bioinformática para todos).

Cambio en los planteamientos: Necesidad de desarrollar más y mejores estudios in vivo (1º) e in vitro (2º).

Integración con estudios de proteómica, variabilidad genética (polimorfismos), epigenética… Bases de Datos, Bioinformática

SYSTEMS BIOLOGY

36 voluntarios sanos

• Mezcla de AOX (resveratrol, extracto de tomate, extracto de te, vit. C, a. grasos insaturados)• 4 capsulas al día

4 × 5 semanas = 20 semanas

Linfocitos y tejido adiposoSangre y orina

Metabolitos (lípidos) en sangre(Metabolómica)

Expresíon génica en linfocitos y adiposo (Transcriptómica)

Proteínas en sangre (marcadores de inflamación) (Proteómica)

Ejemplo interacción polimorfismo-componente de la dieta

Perilipina (PLIN) rodea las gotas lipídicas en adipocitos y regula metabolismo de estas células (inhibe lipolisis, promueve acumulación de grasa, TG). Gen de interés en relación con la obesidad. Variantes genéticas de PLIN afectan el metabolismo de adipocitos y riesgo de obesidad.

256 hombres y 664 mujeres hispanos de entre 47 y 74 años de edad (Boston). Obesidad medida como perímetro cintura. Polimorfismo PLIN 11482 G>A (GG, GA, AA) Ingesta de carbohidratos complejos (alta >144 g/d vs baja <144 g/d).

Pequeñas contribución de múltiples polimorfismos: riesgo de enfermedad

Singh AS et al. (2005) Mechanisms of Disease: polymorphisms of androgen regulatory genes in the development of prostate cancer. Nat Clin Pract Urol 2: 101–107 doi:10.1038/ncpuro0091

Transcriptionactivation

Regulation of cell proliferationand differentiation

Prostatecancer

Polimorfismos de genes relacionados con metabolismo de andrógenos:• CYP1B1, g355t: sustitución de 1 aa• SRD5A2, g888a: sustitución de 1 aa• HSD3B2, N367T: sustitución de 1 aa

Polimorfismos de AR:• g1733a: ↑ riesgo de cancer• a748t: ↓ estabilidad de AR