İ ÜPAROKSİSMAL NOKTÜRNAL HEMOGLOBİNÜRİ VEHEMOGLOBİNÜRİ VEAKIM SİTOMETRESİAKIM SİTOMETRESİ

Dr TÜRKAN PATIROĞLUDr. TÜRKAN PATIROĞLUERCİYES ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ PEDİATRİK HEMATOLOJİ

KAYSERİ

Tanım

PNH intravasküler hemoliz, Kİ yetmezliği ve tromboza meyil ile karakterize bir hastalıktırtromboza meyil ile karakterize bir hastalıktır

TarihçeTarihçeP Strübing 1882 yılında tanımlamış

H van den Bergh Eritrositlerin CO2 ileasidifiye edildiğindeasidifiye edildiğindenormal serumda da lizisini

Ham 50 Yıl önce enzimatikaktiviteyi gösteren testiy g

Marchiafava-Michelis Kan h. yüzeyinde Pİ anchorkaybını

X-linked PİG-A 100 yıl sonragen defekti

TanımPNH X 22 1d l PİG A i d biPNH, Xp22.1de yerleşen PİG-A geninde birbozukluğa yol açan akkiz kök hücrehastalığıdır.

Hsi ED,Am J clin Pathol 2000:114

Genetik

>100 mutasyon (+)PİG-A X kromozomu üzerinde diğerleriPİG-A, X kromozomu üzerinde, diğerleriotozomlarda yerleşir

Brodsky R A ASH 2006Brodsky R A. ASH 2006

PatofizyolojiPatofizyolojiPrimitif kök hücrede PİG-Ageninde somatik mutasyongeninde somatik mutasyonsonucu hematopoeitik hücrelerinyüzey proteinleri için gerekliy y p ç golan glikozil fosfatidil inositolsentezi olmaz.Buna bağlı olarak da hücreyüzeyindeki tüm GPİ-anchoredproteinler eksiktir CD55 ve 59proteinler eksiktir. CD55 ve 59GP anchored komplemanregülatör proteinlerdir.g p

Ruiter ED,J Medicine 2003:61

Patofizyoloji* PNH’lı hastalarda normal ve PNH klonuna sahip

kök hücrelerin oranı değişiktir. Tipik hemolizliğ ş phastalarda PİG-A mutasyonuna sahip kök hücre oranı daha fazladıroranı daha fazladır

*AA’li h t l d i PNH kl hi kök hü*AA’li hastalarda ise PNH klonuna sahip kök hücreoranı daha azdır

Ertrositlerde bu proteinlerinyokluğu C3 konvertazve kompleman faktörlerinindepolanmasına yol açar,i t kül h li lintravasküler hemoliz olur,serbest Hb salınır, NO tüketimiartar ve bulantı ağrı özefagealartar ve bulantı, ağrı,özefagealspazm, erektil disfonksiyon vetromboza meyil oluşur.

Granülositlerde PNH klonu%60 i b l l t>%60 ise bulgular ortaya

çıkar.

Brodsky R A. ASH 2006

Patofizyoloji*Sağlıklı insanlarda % 0.005 oranında nonklonal

PNH benzeri hücre bulunabilir. Bunların % 0 01’d d h d kl l t0.01’den daha azında klonal mutasyon veya klinik gözlenir.

*PİG A mutasyonları sağlıklı kontrollerin koloni*PİG-A mutasyonları sağlıklı kontrollerin koloni-forming hücrelerinde de (+) olabilir ama stem hücrede olmadığı için patolojik değildir.hücrede olmadığı için patolojik değildir.

*CAMPATH-1H ile tedavi alan RA’li kişilerin monosit, T ve B lenfositlerinde mutasyon o os t, e e os t e de utasyosaptanmasına rağmen PNH gelişmemiş ve tedavi sonrası mutasyon kaybolmuş.

Brodsky R A. ASH 2006

Patofizyoloji

PNH için PİG-A mutasyonu gereklidir ama hastalık için yeterli değildir.

Brodsky R A. ASH 2006

EpidemiyolojiHastalık sinsi başlarAilevi yatkınlık yoky yHer yaşta ve her iki cinsiyette olabilirGüneydoğu Asya ülkelerinde daha sıkGüneydoğu Asya ülkelerinde daha sıkOrtalama yaşam 10-15 yılS t i (+) %15Spontan remisyon (+) %15Ölüm nedeni: Venöz tromboz

Richards SJ,Cytometry Part B 2007:728

Klinik BulgularKlinik Bulgular

K ik İ t kül h liKronik İntravasküler hemolizVenöz trombozKİ süpresyonuPNH sıklığı: 2 5/milyon/yılPNH sıklığı: 2-5/milyon/yıl

PNH, de novo veya aplastik anemiden sonra oluşabiliro uşab

Brodsky R A. ASH 2006

KlinikKlasik PNH Hipoplastik PNHKlasik PNH Hipoplastik PNH

Sitopeni (hafif, orta) Kİ yetmezliği

Kİ ( N, hiperplazi) A. A’lerin yarısında küçük PNH klonu (+)

Retikülositoz Pansitopeni (orta, ağır)

LDH yüksek LDH N veya hafif ↑LDH yüksek LDH N, veya hafif ↑

Tromboz riski fazla

GPİ-AP eksik > %60(Granülositlerde)

GPİ-AP eksik > %20(Granülositlerde)(Granülositlerde) (Granülositlerde)

Eculizumab tedavisi KİT

Prednizon ( cevap kötü)

Klinik

Aplastik a. %15 hasta Aşikar PNHş

Aplastik a. %30-35 hastaAplastik a. %30 35 hasta Subklinik PNH

PNH fenotipleri

Aplastik anemiMiyeloproliferatif hastalıklar (MDS AML)Miyeloproliferatif hastalıklar (MDS,AML)Lenfoproliferatif hastalıklar ( Non-Hodgin,

Hodkin, ALL)

D ki G F li Hi t h C t bi l 2005 43Dworacki G,Folia Histoch Cytobiol 2005:43

Hiperkoagülabilite

Kompleman ile platelet aktivasyonuMonosit ve granülositlerdeki fibrinolizisin bozulması

KomplikasyonlarKomplikasyonlarİntravasküler hemolizİntravasküler hemoliz

HemoglobinüriFe eksikliğiAkut böbrek yetmezliğiAkut böbrek yetmezliği

Venöz trombozS i f VSup. ve inf. Vena cavaHepatik venler (Budd-Chiari)p ( )Mesenter venler vs.

KomplikasyonlarBozuk hematopoez

pansitopenip pmakrositozaplastik anemiaplastik anemiAML’ye dönüşüm

EnfeksiyonEnfeksiyonsinopulmonersepsis

Laboratuvar Bulguları( f )(nonspesifik)

Sitopeni (1veya daha fazla)Makrositoz, anizositoz,

polikromaziRetkülositozNöt fil lk l f f t dNötrofil alkalen fosfatazında

azalma Laktik dehidrogenaz artmasıLaktik dehidrogenaz artmasıHaptoglobin azalmasıHemoglobinüri, g ,

hemosiderinüriDemir ve folik asit eksikliği

Laboratuvar Bulguları

Kemik iliği bulguları -Hiperplaziden hipoplaziye kadardeğişik hematopoezdeğişik hematopoez

-Sitopeni (1veya daha fazla)-Mast hücre sayısında artma

Sitogenetik -Normal

Spesifik testler -Periferik kan veya kemik iliğiörneklerinde GPİ ilişkili yüzeyproteinleri (CD 55 ve CD 59) ninproteinleri (CD 55 ve CD 59) nin flow sitometrik analizi

Tanı testleriKlasik PNH testleri

HamHemoliz testleri

Kan sayımıHemosiderinüriSukroz lizis testi

yRetikülosit sayısıLDHSukroz lizis testi LDHBilirubin

İGPİ-AP ekspresyonu

FC Testleri

En uygun örnek: periferik kan (Kİ de olabilir)GPİ ilişkili antijen ekspresyonuGPİ ilişkili antijen ekspresyonu

- Eritrositler- Granülositler

FLAER (Fluorescently Labeled Aerolysin)FLAER (Fluorescently Labeled Aerolysin)- Granülositler

FC TestleriFC Testleri

PNH klonunu saptamak için monosit veya nötrofiller

eritrositlere tercih edilir.eritrositlere tercih edilir.Nedeni: Eritrosit ömrünün kısalması

TransfüzyonlarTransfüzyonlar Nötrofillerde PNH klonu eritrositlere göre 3 kat fazladırfazladır.Sorunlar: Ciddi öt iCiddi nötropeniTeknik sorunlar (Ab seçimi, kapılama)

TanıÇok renkli FC kullanılmalıAvantaj: Hızlı ve kantitatif olarak GPİ proteinlerininj p

çalışılması mümkünTicari kitler: redquant ve cellquantTicari kitler: redquant ve cellquant

floresan beadleri kullanarak hücrelerde CD 55 CD 59’ b li i iCD 55 ve CD 59’un boyanmasını ve analiziniyapar.

Hsi ED,Am J clin Pathol 2000:114

Taze PNH örneğinin Biocytex Redquant ve Cellquant Kiti ile analizi. CD55- ve 59- için kapılama alfa ve beta beadleri kullanılarak yapıldı. R2 bölgesindeki nötrofiller CD55 ve 59 için kapılandı ve yönteme uygun olarak analiz edildi.ç p y yg

Tanı*10000 eritrosit sayılmalı

Anormal hücre >%3*5000 granülosit sayılmalı

Anormal hücre >%3Anormal hücre >%3Her 2 kit için 4 markerin (CD55,59, 66 ve 14) 3’ü

l i (>%3’d d h f l hü danormal ise (>%3’den daha fazla hücredeekspresyon azalmış ise) PNH kabul edilmeli

Hsi ED,Am J clin Pathol 2000:114

FLAER fl tl l b l dFLAER-flourescently labeled aerolysineaerolysine

Proaerolizin 52 k Da’luk AeromonasProaerolizin 52-k Da luk Aeromonas hydrophiliadan oluşan bir toksindir. GPİ h d i l li i i iGPİ-anchored proteinler, proaerolizin için reseptördür. Floresan proaerolizin variant (FLAER) GPİ-anchora bağlanır. PNH’lı hücreler bu toksineanchora bağlanır. PNH lı hücreler bu toksine dirençlidir.

Brodsky R A. ASH 2006

FLAER fl tl l b l dFLAER-flourescently labeled aerolysineaerolysine

Bu teknik ile küçük bir klonu (%0 5) dahiBu teknik ile küçük bir klonu (%0.5) dahi saptamak mümkündür.

P li i i i l k i i kli i i ü iProteolizini işlemek için gerekli enzimi yüzeyine bağlama yeteneği olmadığından bu teknik eritrositlerde kullanılamaz

FLAER, CD 59’dan daha hassastır, stabildir veFLAER, CD 59 dan daha hassastır, stabildir ve çok pahalı değildir

Brodsky R A. ASH 2006

CD33 CD45 CD14’üCD33, CD45 ve CD14’ün FLAER ile boyanmış normal periferal kan örneği. R2 bölgesinde k l hü l lkapılanan hücreler normal monosit fenotipini gösterir (CD45+, CD33 parlak, CD14+ ve FLAER+). R3 böl i d k lbölgesinde kapılanan hücreler nötrofil fenotipini gösterir (CD45 zayıf, CD33 zayıf, CD14 zayıf

FLAER ) R4ve FLAER+). R4 bölgesinde kapılanan hücreler lenfosit fenotipini gösterirr (CD45 kuvvetli, CD33 CD14CD33-, CD14- ve FLAER+). Monosit ve nötrofillerin %0.5’ten azı CD14- ,FLAER- PNH f ti i i ö t ifenotipini gösterir.

CD33 CD45CD33, CD45 ve CD14’ün FLAER ile b tboyanmış taze PNH örneği. R2’deki CD14-monositler (%71) FLAER-PNH fenotipini gösterir (alt sol). R3’teki nötrofiller (%51) CD14-FLAER-PNH fenotipini göstermektedir (alt orta).

YÖNTEM(Eritrositler)

*4 ml PBS+2 μl kan4 ml PBS+2 μl kan*1800 devirde 5 dk santrifüj edilip üst kısım pipet ile

alınıp atılıralınıp atılır*Hafif vortekslenir, 200 μl PBS eklenir*CD55(10 μl)+CD 59(10 μl) bulunan tüpeCD55(10 μl)+CD 59(10 μl) bulunan tüpe

hazırlanankarışımdan 100 μl eklenip votekslenirkarışımdan 100 μl eklenip votekslenir

*Buz dolabında (+4 C0) 45 dk. beklenip vortekslenir*300 μl PBS eklenip vortekslenir300 μl PBS eklenip vortekslenir*1800 devirde 5 dk. Santrifüjden sonra üst kısmı

pipetle atılırpipetle atılır*350 μl cell wash veya PBS eklenip Flowda okunur

Granülositlerde normal C55 ve CD59 ekspresyonu

Kantitatif ölçümün önemiGranülositlerdeki PNH klonu >%50 ise tromboz riski yüksektiryPNH klonu düşük aplastik anemiden, yüksek PNH klonuna sahip hemolize y pdoğru ilerleme olabilirAnti C5a (eculizumab)’nın tedavi ediciAnti C5a (eculizumab) nın tedavi edici etkisi değerlendirilebilirrhCD59-P’nin düzeltici etkisininrhCD59-P nin düzeltici etkisinin monitorizasyonu

FC TestleriEritrositlerde kantitatif değerlendirmeye göre (transfüzyon almamışlarda):(transfüzyon almamışlarda):

N ekspresyon (Tip I),K i kl k (Ti II)Kısmi yokluk (Tip II),Tam yokluk (Tip III),

Vakaların çoğu (%20) tip III’tür. Sorunlar: Eritrosit transfüzyonuSorunlar: Eritrosit transfüzyonu

Teknik sorunlar (aglütinasyon, Abseçimi)seçimi)

TanıCD55 ve CD59 azalmış ise: Tip1CD55 kısmen azalmış ise: Tip 2

Thomason RW,Am J Clin Pathol 2004:122

CD 59 eksikliği hemoliz veya diğer klinik semptomlardan sorumludurp

Gupta R,Int Lab Hem 2007:29

Litik testler: Asidik veya düşük iyonik medyumda y ş y yeritrositlerin kompleman lizisine yatkınlığı artar

Asidifiye serum lizis (Ham) testiSukroz hemoliz testi

Dezavantaj: Kantitatif değil Transfüzyon alanlarda nonspesifik

Jel kart testi: Ag-Ab reaksiyonuna dayalı bir t t ti CD55 59 k ik it itl i ttarama testi. CD55,59 eksik eritrositleri saptarFCMI: Eritrosit, lökosit ve plateletlerde 1 veya daha fazla GPI-anchored proteinin yokluğunudaha fazla GPI-anchored proteinin yokluğunu veya farklı ekspresyonlarını gösteren hassas bir test

Gupta R,Int Lab Hem 2007:29

FLAER( floresan aerolizin) assay:Eritrositlerde kullanılır ama PNH klonunu saptamada sınırlıdır. Eritrositlerde glikoforin proaerolizine zayıf bağlanır.

PNH’daki Hemolitik Durum

PNH’lı eritrositlerin yaşam süresini hesaplamak için;W/100=RxM/( (100-R)x 120+RxM)W/100 RxM/( (100 R)x 120+RxM)W: %eritrosit (CD 59 -)R: %retikülosit (CD59 -)M: CD59(-) eritrosit ömrü(gün)( ) (g )

Ninomiya H. Inter J Lab Hematol 2008;30

Ayırıcı TanıParoksismal soğuk hemoglobinürisiSoğuk antikor sendromuSoğuk antikor sendromuHEMPAS (Herediter Eritroblastik Multinüklearite Pozitif Asidifiye Serum lizis)

Tedavi

*KİT*İmmünosüpresyon (ATG+Cys-A)İmmünosüpresyon (ATG+Cys-A)*Büyüme faktörleri*Destek tedavisi (uzun süreli antikoagülan, Fe

ve folat desteği eritrosit süsp )ve folat desteği, eritrosit süsp.)*Eculizumab (anti C5) hemolizi azaltır

Eculizumab TedavisiEculizumab TedavisiC5’e karşı Mo AbşTerminal yolu inhibe ederNeisseria enf. için aşılanmalı (2 hf önce)e sse a e ç aş a a ( ö ce)600 mg/hf x 4 iv900 mg/2 hf x 6 ay900 mg/2 hf x 6 ayYan etkiler: baş ağrısı, nazofaenjit,sırt ağrısı,ÜSYEÜSYEİntravasküler hemoliz ve transfüzyon ihtiyacını

azaltır. Tromboz riskini azaltıyor mu ?y

Brodsky R A. ASH 2006

PNH’daki Hemolitik Durum

W/100=RxM/( (100-R)x 120+RxM)W/100=RM/((100-R)120)+RM

100/W=((100 R)120)+RM/RM100/W=((100-R)120)+RM/RM100/W=ı+((100-R)120)/RM(100/W)-ı=(100-R)120)/RMM= =(100-R)(120)W/R(100-W)M (100 R)(120)W/R(100 W)