PAMAM 的 PEG化

组会汇报

一、为什么要对 PAMAM dendrimer 进行 PEG 化？

树枝状大分子：由中心核 (core) 、内层重复单元 (repeatunits) 以及外层端基 (end groups) 组成。由多步重复的方法合成，有高度对称、高度支化、单分散、精确的分子结构、外部带有大量的官能团、内部具有空腔、分子量可控以及纳米尺寸等多种独特性质，是一类三维高度有序并且可以从分子水平上控制、设计分子的大小、形状、结构和功能的新型高分子化合物。

其外层多种官能团，可同时连上药物、靶向基团以及各种修饰基团。内部疏水空腔可包埋疏水性的药物，而其表层亲水性的基团从而增加药物的溶解度（大量的末端官能团和内部空腔，具备包裹药物的能力，可与药物通过共价键结合形成轭合物（ conjugates ）或非共价键作用、孔腔包埋形成包合物）。

树枝状大分子在与药物分子的作用过程中，不仅能够增加其溶解度，并且通过静电力等非键合力或键合力与其相结合，可以对药物起到缓释和控释及介导药物靶向输送的目的。

聚酰胺一胺树枝状大分子 (Polyamidoamine ， PAMAM) ：

是目前研究最为广泛 和成熟的一类树枝状大分子，目前已合成到 10 代。

是以乙二胺和丙烯酸甲酯为重复单元通过反复的 Michael 加成和酰胺化反应可得到不同代数 (Go 代～ G10 代 ) 的树枝状大分子。

每重复反应 一次增加一代，表面氨基数增加一倍。

PAMAM 具有一般树枝状大分子的结构特点跟优点，具有稳定、良好的生物相容性、无免疫原性、末端氨基可以用来结合靶向或客体分子，也可以对其功能化得到更有效、对生物活性物质转运效率更高的树枝状大分子等优点。

PAMAM 作为药物载体，与其它线性载体分子比较具有明显的结构优势：首先，其表面有大量的官能团，经过表面修饰可连接大量药物分子；其次， G3 代以上的 PAMAM 空间呈球状分布， 内部存在较大空腔，可以包埋药物分子，经表面修饰 后的 PAMAM 可提高其载药量。

除了可作为药物载体， PAMAM 树状大分子在基因转染、磁共振成像造影等领域也有很大的进展。

但整代 PAMAM 树状大分子表面具有的大量末端氨基，在生理 pH 条件下易质子化而带正电，使其具有一定的细胞毒性和溶血毒性（且毒性有代数依赖性），在体内与细胞产生非特异性的吸附 ，因此其体内应用受到限制。

聚乙二醇 (Polyethylene glycol ）

优点：具有良好的水溶性，稳定性，生理惰性、温和性，与许多有机溶液有良好的相溶性；具有柔韧的亲水性长链结构，可以生物降解；无毒；无免疫原性；好的药物动力学；好的生物分布

经 PEG 修饰后，许多药物载体或蛋白质在体内的药物动力学性质都发生了显著改变，血浆半衰期明显延长，肾清除率显著降低。目前认为这种变化主要是基于以下 3 点：

(1)许多经静脉给药的纳米药物载体或蛋白质很快被网状内皮组织、肾、肝、脾消除，这种消除依赖于其分子的大小、电荷及与特定细胞内受体的亲和力，而用 PEG 修饰后，上述性质均发生了改变； (2) 纳米载体或蛋白质易被体内的各种消化酶代谢，半衰期和滞留时间较短，PEG 可利用空间位阻作用减少受水解酶攻击的几率，从而减少降解(3) 纳米载体或非人源性蛋白质都具有一定的免疫原性，进入体内后易被免疫系统消除， PEG 的空问位阻作用可掩蔽蛋白质上的抗原决定簇，从而减少被免疫系统清除的几率。

PAMAM 表面经 PEG 修饰以后，可以形成亲水的外壳，从而形成单分子胶束。可改善以下性质，

(1)降低细胞毒性和溶血性：一方面， PEG 与 PAMAM 表面的氨基共价连接，减少了表 面氨基的数量；另一方面，柔顺的 PEG链可能缠绕 PAMAM的表面，减少 PAMAM 表面的剩余氨基与细胞的非特异性结合，细胞毒性和溶血性大大降低，且随 PEG 化程度的增加其毒性降低； (2)改善药动学性质：延长药物半衰期和血液循环时间，控制药物释放 ； (3)降低免疫原性； (4) 增加稳定性 (5)改善体内分布； (6) 增加生物相容性；

NH2 CH3(OCH2CH2)OSO2CH2CF3+ NH(CH2CH2O)nCH3

三氟乙磺酸化的PEG

对硝基氯甲酸苯酯

二、 PEG 化方法

用单官能团的PEG, 原因：避免生成环或与PAMAM发生交联

三、测 PEG 化后 PAMAM未反应的氨基数目方法：

间接方法：与下列化合物反应1 、茚三酮，所有氨基酸及具有游离 α- 氨基和 α-羧基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质。此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，用分光光度计在 570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸或 α- 氨基的含量。

2 、荧光胺：本身与水解产物不显荧光。但与含有伯氨基的化合物 ( 包括蛋白质、肽、氨基酸及其他各种多肽 ) 分别生成类似的、具有强烈荧光性的化合物。生成物的最大激发波长为 390nm，最大发射波长为 475nm。

3 、三硝基苯磺酸：与 α- 氨基反应后，用分光光度计测吸光度

但是 PEG链屏蔽了 PAMAM 上未反应的氨基，测得的数据不准直接方法：

1 、 1 H NMR2 、 MS

文献部分

文章思路：对硝基氯甲酸苯酯

TEART 反应 24h

溶在 THF 中，分子量 550 和 2000

溶在 DMSO 中

RT 反应 5天

a 过量

一 、 Encapsulation of Drugs by M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers ：

阿霉素

甲氨蝶呤

1 、 Encapsulation of ADR by M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers ：

M-PEG-attached PAMAM dendrimer

(10 mg)

加入一定体积含有 ADR-HCl 的 DMF (0.5

mg/mL) 中，黑暗室温下，搅拌 24h

待溶液蒸发

后真空干燥

加入 2ml氯仿

搅拌 6h

M-PEG-attached dendrimer -ADR complex

离心 10min

上层清液真空干燥

溶在 10 mM 醋酸盐缓

冲溶液 ( pH 4.5, 1 mL)

在 481 nm 测 ADR 的吸光度，计算包埋 ADR 的量

ADR-HCl发生质子化，不溶于氯仿

2 、 Encapsulation of MTX by M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers ：

M-PEG-attached PAMAM dendrimer

(5 mg)

加入 一定体积的 MTX 水溶液 (1.0

mg/mL) ，黑暗室温下，搅拌 24h

冻干，加入 1ml氯仿，

搅拌 24h ，

过滤，滤液蒸发，

真空干燥

M-PEG-attached dendrimer -MTX complex

溶在 0.01 M NaOH (2 mL) 中

加入 0.1 M Tris-HCl 溶液 (pH 8.0)

在 372 nm 测 MTX 的吸光度，计算包埋 MTX 的量

二 、 Release of Drugs from M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers ：

移到透析袋中，

在 20 mL PBS 中透析

M-PEG-attached dendrimer -ADR complex 溶解在PBS(pH 7.4, 1.0 mL) 中

用分光荧光计在 544nm

处测透析到 PBS 中的ADR荧光强度

1 、 Release of ADR from M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers

2 、 Release of MTX from M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers

M-PEG-attached dendrimer - MTX complex 分别溶解在 Tris-HCl-buffered solution (pH 7.4, 1 mM 2.0 mL) 和含有 150 mMNaCl 的 Tris-HCl-buffered solution (pH 7.4, 1 mM 2.0 mL)

移到透析袋中，

在 20 mL Tris-HCl 中透析

用分光光度计在 372nm

处测透析到 Tris-HCl中的 MTX吸收强度

结果与讨论1 、 Synthesis and Characterization of M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers.

CH2CH2OOCH3

a,b,f

d e c

根据 1 H NMR spectra 中 PAMAM c处亚甲基（ ~2.2 -2.3 ppm ）和 M-PEG 中 OCH3(~3.23) ，积分求得接到 PAMAM上的 M-PEG 分子链数

acetylated G3 PAMAM ：

NH2 + NHCOCH3Ac2O

e

d

b

f

ca

-CH2NH2

-CH2NH-

66.9-73.860.8

161.0

A 和 C出现杂峰原因： M-PEG含有少量 HO-PEG-OH ，两端 -OH都与对硝基氯甲酸苯酯反应，生成两端都有对硝基苯基碳酸链的化合物，进而与 PAMAM发生交联，生成杂质。

从 GPC图可知 M-PEG-attached dendrimers 不含 free M-PEGs

PAMAM 的 Mn 和 Mw 由 GPC测得， DMF做淋洗液， PEG做标准校正

Mw/Mn 接近 1 ，窄分子量分布 GPC测得的分子量比理论分子量低： PAMAM 呈球形，流体力学半径比理论值小

2 、 Encapsulation of Drugs by M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers ：

包埋 ADR 的能力依赖于 PAMAM代数和 M-PEG链数。

M-PEG(2000)-G4 dendrimers 包埋 ADR 最多，原因：1.PAMAM 代数大，空腔大2. M-PEG链较长，覆盖在 PAMAM表面，创造一个相对隔离的空间，稳定 ADR-bound dendrimer3. M-PEG链较长，改变了 PAMAM的构象，伸展使 PAMAM 空腔在水溶液中扩张到最大，4. M-PEG layer 有 ADR ，增溶了ADR

包埋 MTX 的能力依赖于PAMAM 代数和 M-PEG链数。

M-PEG(2000)-G4 dendrimers包埋 MTX 最多，原因同上

包埋 MTX 的能力比 ADR强，原因：MTX 是酸性药， PAMAM 核呈碱性，静电作用

3 、 Release of Drugs from M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers ：

Release of ADR from M-PEG-Attached PAMAM Dendrimers:

The increase in the ADR concentration in the outer phase was followed and compared with the case of dialysis of free ADR. We observed that the concentration of ADR in the outer phase increased at about the same rate in both cases.

原因： hydrophobic interaction between ADR and the dendrimer 不是足够强，以至于不能包埋在 PAMAM 的内腔中。

含 NaCl

不含 NaCl

不含 NaCl 时，对 MTX 起到缓释作用，原因： MTX是酸性药， PAMAM 核呈碱性，静电作用；

含 NaCl 时，释放速率一样，原因： Na+ 和 Cl-破坏了静电作用

PEG 化的 PAMAM 树枝状大分子包埋药物的能力随着 PAMAM 代数和PEG 的链长增加而增加；

PEG 不仅稳定包埋的药物分子，改变了 PAMAM 构象使空腔更大，从而使包埋能力增加，同时在 PEG 层增溶了药物分子；

PEG 化的 PAMAM 树枝状大分子对 MTX 起到缓释作用。

结论

芘

不溶于水，用于染料、合成树脂、分散性染料和工程塑料

聚合物胶束由两亲嵌段共聚物组成，其 CMC 比传统低分子胶束的低很多，但仍然依赖于温度，浓度。最近发展的单分子胶束是有两亲特征的高度支化的聚合物，其 CMC 不依赖于温度和浓度。低代数 PAMAM 毒性和免疫原性小，但空腔小，包埋药物能力低，高代数PAMAM 包埋能力大，但同时毒性也大。所以对 PAMAM 进行 PEG 化

文章思路

为了避免柔顺性下降和 PEG产生的空间位阻， PEG链数和分子量应加以控制，考虑到尺寸大小和柔顺性，本文刻意避免了高代数的 PAMAM 和分子量大的PEG

MW= 750, 2000, 5000

Solubilization test

过量的芘溶解在 PEG-PAMAM 溶液中， 50℃超声处理 6h ；冷却到RT ，平衡两天；用 0.45-µm PTFE 过滤膜过滤两次；用 UV–VIS spectropho-tometer at 334 nm检测芘的吸收强度。

1 、 Characterization of dendritic unimolecular micelles

结果与讨论

根据积分面积算出每个PAMAM 分子上接有 28 个PEG-750 ， 25 个 PEG-2000 ，23 个 PEG-5000： PEG 空间位阻导致 PEG链接的越来越少

2 、 PEG effect on pyrene solubility

随着胶束浓度增加， pyrene 溶解性 增加，从低浓度到高浓度都能增溶pyrene ，说明 pyrene 在胶束里的增溶不依赖于胶束浓度 (PEG-PAMAM dendritic micelles没有 CMC) 。PEG-PAMAM dendritic micelles 对芘的增溶效果比 PAMAM 大，原因：1 、 PEG链的伸展使 PAMAM 空腔在水溶液中扩张到最大，2 、 PEG链覆盖在 PAMAM 表面，创造一个相对隔离的空间， 3 、 PEG layer 有芘，

可用来做增溶剂

Micelle-2000

Micelle-5000

Micelle-750

消光系数 29,500 M−1cm−1

把吸光度转化为胶束的浓度

Micelle-5000 比 Micelle-2000 的增溶能力差，原因：

高浓度下， PEG2000链比较长，分子间发生聚集，导致细胞毒性增大

文章思路：基因载体中的病毒载体：有毒性，免疫原性，转染效率低；PAMAM 末端阳离子很容易与 DNA 中带负电的磷酸基相互作用；PAMAM 内部有空腔，促进 DNA 结合的复合物的稳定性PAMAM 增加 DNA 转染效率；PEG 增加生物相容性，降低毒性和免疫原性。

在偏碱性环境下， NHS-PEG-tBOC 的一 NHS 端很容易与 PAMAM 表面氨基共价结合为稳定的酰胺键。

NHS- PEG3400-NH-tBoc PAMAM-PEG3400-NH-tBoc

硼酸盐缓冲溶液， pH = 8.0

SuperFect 是目前可用的转染效率最好的试剂之一

NH2 CH3(OCH2CH2)OSO2CH2CF3+ NH(CH2CH2O)nCH3

NH2 + NHCOCOCl

三氟乙磺酸化的 PEG

月桂酰氯

pH=8.0

TEA

人结肠腺癌细胞

MTT 法测细胞毒性

IC50 ： concentration at which 50% inhibition of mitochondrial dehydrogenase （线粒体脱氢酶） activity ，

IC50值越大，毒性越小

用粗粒度的分子动力学模拟（ coarse-grained (CG) molecular dynamics (MD)simulations ）证明了：有长链 PEG 的 PEG-PAMAM 分子间没有发生聚集，而是阻止聚集。

TG4P5000 -60 有相似的现象

PEG密度较大时， PEG链非常拥挤，向水中伸展的趋势更大

8PEG5000-G4 32PEG5000-G4

分子间聚集，引起 PEG互穿

32PEG5000-G3

占据空腔，使空腔变小，包埋药物能力下降

不是分子间聚集，而是 PEG自穿