Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques
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Atelier Paludisme 2007
Outils molOutils molééculaires disponibles culaires disponibles
pour surveiller la rpour surveiller la réésistance aux sistance aux
antipaludiquesantipaludiques
Claude GIRY
Centre Hospitalier de Mayotte
EVALUATION
par les FACILITATEURS
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Atelier Paludisme 2007
Problématique
� La résistance aux antimalariques repose sur 3 mécanismes :
� Mutations ponctuelles
� Amplification génique
� Activité transcriptionnelle
� A chaque mécanisme correspond un ou plusieurs gènes dont l’altération est associée à une résistance médicamenteuse
� Chaque mécanisme fait l’objet d’études réalisées au moyen d’outils moléculaires
� Applications
� Surveiller le développement des souches résistantes
� Discriminer un échec thérapeutique d’une réinfection
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Atelier Paludisme 2007
Mutations ponctuelles
Y268S/Ncyt bAtovaquone
Codon sauvage N86
� Nb copies gène mdr1 > 1
mdr 1Mefloquine, Quinine,
Halofanthrine, Lumefantrine
N86Y, Y184F, S1034C, N1042D, D1246Ymdr 1
C72S, M74I, N75D/E, K76T, A220S,
Q271E
crtChloroquine
A16V, S108T
ou N51I, C59R, S108N, I164L
dhfrProguanil, Chlorproguanil
N51I, C59R, S108N, I164L
ou C50R, N51I, S108N, I164L
dhfrPyriméthamine, Trimethoprim
S436A/F, A437G, K540E, A581G,
A613S/T
dhpsSulfadoxine, Dapsone
Remplacement acide aminRemplacement acide aminéé induit par induit par
une mutation ponctuelleune mutation ponctuelleGGèène ne
ciblciblééAntipaludiqueAntipaludique
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Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCR en temps finalPCR en temps final
� Principe d’une réaction de PCR
� AS PCR � RFLP PCR
� SSOPDIG PCR ELISA
Alifrangis et al. (2005). Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); pp. 155–162
NZILA-MOUNDA, A. et al.
(Jan. 1998). Antimicrobial
Agents and Chemotherapy.
p. 164-169
DURAISINGH, M.T. et al.
(1998).
Exp Parasitol. 89;1-8
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Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCR en temps rPCR en temps rééelel
� Principe � SYBR Green I
� Sondes d’hydrolyse Taqman � Sondes d’hybridation
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Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
SSééquenquenççageage
� Pyroséquençage� Séquençage direct
Zhou et al. (2006). J Clin Microbiol. 44(11); p 3900–3910.
Pyrosequencing, a High-Throughput Methodfor Detecting Single NucleotidePolymorphisms in the DihydrofolateReductase and Dihydropteroate SynthetaseGenes of Plasmodium falciparum
2.28 USDPyroséquençage
3.66 USDSéquençage
direct
6.58 USDRFLP
Coût
/échantillon/SNP
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Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
DNA ChipsDNA Chips
BRYANT et al. (2004). Lancet Infect Dis 2004; 4: 100–111
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Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCRPCR--RFLP RFLP PfPf. DHPS K540E. DHPS K540E
M
ndd
D’après Mbugi et al. (2006).
Malaria Journal, 5:94. p 1-11
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Mutations ponctuellesMutations ponctuelles
PCR temps rPCR temps rééel el PfPf. DHFR S108N. DHFR S108N
Thermocycleur
temps réel
(TaqMan 48
Roche)
Extracteur d’acides
nucléiques (MagNA Pure
Compact Roche)
Laboratoire de biologie – Centre Hospitalier de Mayotte D’après une adaptation du protocole de Alker et al. (2004). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 2924–2929
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Amplification gAmplification gééniquenique
PCR temps rPCR temps rééel el -- PfPfmdrmdr--11
� SYBR Green I / Taqman
� Gènes de référence présents à 1 ou plusieurs copie(s)
� Souche Pf. à tester vs. souche Pf. contrôle
� Méthode du ∆∆CT
� Nb de copies relatif
= 2−∆∆CT=2 −( (CTER-CTEC)-(CTBR-CTBC) )
� R: gène de référence
� C: gène cible
� E: souche à tester
� B: souche de référence
Exemple: Price et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and
increased pfmdr1 gene copy number ». Lancet. 364; p 438-47
Illustration: C. GIRY – Centre Hospitalier de Mayotte
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Atelier Paludisme 2007
ActivitActivitéé transcriptionnelletranscriptionnelle
PCR temps rPCR temps rééel el -- PfPfmdrmdr--11
Quantification relative
� SYBR Green I
� Gènes de référence
(housekeeping genes) dont
l’expression n’est pas affectée par
l’antipaludique.
� Méthode du ∆∆CT
Echantillon
Extraction d’ARN
DNase I
Purification ARNm
cDNA synthesis
Random priming
OligodT priming
Sp. primer priming
Real time PCR
Real time PCR
1-step qRT-PCR
2-step qRT-PCR
Stratégie
Optimisation
� Volume d’échantillon
� dNTPs, Mg2+ / Mn2+
� Concentration en primers
� t°et temps d’annealing/extension
� Efficacité de l’amplification
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Atelier Paludisme 2007
Applications (I)Applications (I)
Surveillance de la propagation des rSurveillance de la propagation des réésistancessistances
Chloroquine Pyriméthamine Sulfadoxine
D’après Jelinek et al.(2002). Malaria Journal. I:II; p 1-7
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Atelier Paludisme 2007
Applications (II)Applications (II)
Discriminer rDiscriminer rééinfection infection vs.vs. recrudescencerecrudescence
� Recrudescence témoigne d’un échec thérapeutique précoce ou tardif
� Utilisation de marqueurs polymorphiques
�Msp1, Msp2, Glurp
�Microsatellites
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Atelier Paludisme 2007
ConclusionsPerspectives
Quantification
d’ARNm
PCRTEMPSREEL
Amplification
génique
Génotypage
RFLP Séquençage
DélétionVariants d’épissage
Détection / Quantification absolue de pathogènes
Translocation
Réarrangement
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Références� ALIFRANGIS, M. et al. (2005). « A Simple, High-Throughput Method to Detect Plasmodium
falciparum Single Nnucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase, DihydropteroateSynthase, and P. Falciparum Chloroquine Resistance Transporter Genes Using Polymerase Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Technology ». Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); p. 155–162
� BERRY, A. et al. (2006). « Prevalence of Plasmodium falciparum cytochromeb gene mutations in isolates imported from Africa, and implications for atovaquone resistance ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 986-988
� DURAISINGH, M.T. et al. (2005). « Contribution of the pfmdr1 gene to antimalarial drug-resistance ». Acta Tropica. 94; p 181–190
� HYDE, J.E. (2002). « Mechanisms of resistance of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs ». Microbes and Infection. 4; p165-174
� HYDE, J.E. (2005). « Drug-resistant malaria ». TRENDS in Parasitology. 21(11); p 494-498� JONES, P.M. et al. (2005). « Multidrug resistance in parasites: ABC transporters, P-glycoproteins
and molecular modelling ». International Journal for Parasitology. 35 ; p 555–566� LE BRAS, J. et al. (2006). « Les résistances aux médicaments antipaludiques ». Médecine et
maladies infectieuses. 36 ; 401–405� MBUGI, E.V. et al. (2006). « Drug resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in Plasmodium
falciparum malaria in Mlimba, Tanzania”. Malaria Journal. 5(94) ; p 1-11� PLOWE, C.V. (2003). « Monitoring antimalarial drug resistance: making the most of the tools at
hand ». The Journal of Experimental Biology. 206; p 3745-3752� PRICE, R.N. et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased
pfmdr1 gene copy number ».Lancet. 364; p 438–47� RANDRIANARIVELOJOSIA M. et al. (2006). « First evidence of pfcrt mutant Plasmodium
falciparum in Madagascar ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 826-830
� WILSON, P.E. et al. (2005). « Real-time PCR methods for monitoring antimalarial drug resistance ». TRENDS in Parasitology. 21(6); p 278-283
� WOODROW, C.J. et al.(2006). « Antimalarial drugs: recent advances in molecular determinants of resistance and their clinical significance ». Cell. Mol. Life Sci. 63 ; p 1586–1596
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