Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Mgr. Kamil Tóth

Univerzita Pavla Jozefa ŠafárikaKatedra biochémie

Yellowstone 1969... …Danišovce 2006

●biokatalyzátory chemických reakcií

●enzýmy proteíny

●metabolické premeny urýchľujú ~ 106

x●najrýchlejší enzým orotidín monofosát dekarboxyláza ~ 1017 molekúl/sek.

●v primárnej sekvencii zložené z 20 AMK

Enzýmy

Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov


●aktívne miesto – oblasť katalýzy

●dynamické štruktúry

●vysoká špecificita ”key and lock”

●evolúcia – selekcia katalytických skupín

●prevaha nekovalentných interakcií

●ich štruktúra je tvorená:

kofaktor

apoenzým


Kde sa enzýmy vyskytujú?... všade tam, kde prebieha život

●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov●niektoré organizmy sa prispôsobili

extrémnym podmienkam...

●metabolické dráhy ●imunitný systém ●proteosyntetický

aparát...


Extrémofily

Termofily

Psychrofily

BarofilyAcidofily

Halofily

(Mezofily)

● odolnosť v extrémnych podmienkach-vnútorná vlastnosť„dynamická povaha termostability“

50-105°C25-40°C -10 až 20°C

1-700 atmosférpH 1-5

>2M soľ

termofily 50-80°Chypertermofily >80

°C


NADH oxidáza z Thermus thermophiluskooperácia Prof. Sprinzl, Lehrstuhl Biochemie, Universität Bayreuth,

Nemecko

●50 kDa homodimér ●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér

●NADH dehydrogenáza

●pI 9,26●hypertermofil Topt.=82°C●neznáma fyziologická

funkcia


NADH oxidáza je flavoproteín●proteíny, ktoré majú ako kofaktor naviazaný FAD, FMN alebo iný flavínový derivát●až 65% flavoproteínov viaže FAD ako

kofaktorBiologická všestrannosť ●Citrátový cyklus●oprava poškodených reťazcov

DNA●rezistencia na tetracyklínové antibiotiká

●indikátory metabolického a nutričného stavu buniek

●Cirkadiálny rytmus – regulácia biologických hodín


Štruktúra FAD

adenozín

izoalloxazín flavín

D-ribitol

flavínadenindinukleotid (FAD)

adenozínmonofosfát (AMP)

flavínmononukletid (FMN)

ribolflavín


Chinón Semichinón Hydrochinón

NN

NNH

R

O

O NN

NH

NH

R

O

O NNH

NH

NH

R

O

O

e-, H+ e-, H+

●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém

zbalená forma rozbalená forma

„Motýlí ohyb“


Ciele práce:

●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy

●sledovanie preferenčných konformácií voľného FAD a viazaného v aktívnych

miestach

●charakteristika interakcií kofaktora a proteínovej časti

A

B ●vytvorenie nehomológnej databázy FAD viažúcich proteínov


Význam:

●biotechnologický priemysel

●základný výskum


Aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázyi) zásahom do primárnej sekvencie – bodové

mutácieii) pôsobením externe modulovaných podmienok

soli Hofmeisterovej sérieNa+, Gdm+, NH4+, Li+,

K+ ,Cs+...ako je to in vivo

?●cytozol 300mg

proteínov/ml●existencia voľnej H2O?

●priama interakcia s proteínom●nepriama s molekulami

H2O


KM,NADH KM,FMN

Mechanizmus pôsobenia

●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát

max,

[ ][ ] NADH

m app

NADHv VNADH K

rovnica Michaelis-Mentenovej

●v ~ aktivita enzýmu


6543210

3

2

1

0

Salts (M)

Rel

ativ

e ac

tivity

NH4+

Cs+

Na+ K+

Li+

Gdm+

●pozitívne nabité aktívne miesto

●nešpecifická aktivácia

●nepriamy efekt na oblasť aktívneho miesta

●nízka koncetrácia solíelektrostatické interakcie●vysoká koncetrácia

solíHofmeisterov efekt


K+ Na+ Cs+ > NH4+ > Li+ >> Gdm+

?

15

10

5

0

300

200

100

cations

KM

, NA

DH [

M]

no cation

Cs+

Na+ K+

NH4+

Li+

Gdm+

chaotropic kosmotropic

Stanovenie KM konštanty pre substrát NADH

●pre 2M soli

●charakteristika interakcie enzým-substrát

●konformačná bariéra


Stanovenie KM konštanty pre FMN ako kosubstrát

●komplexný problém objasnenia Hofmeisterovho efektu

30

25

20

15

10

5

0

cations

KM

, FM

N [

M]

no cation

Cs+

Na+ K+ NH4

+

Li+

chaotropic kosmotropic

●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií

●chaotrópne katióny znižujú afinitu

●kozmotrópne Li+ stabilizuje štruktúru


B.Analýza flavínových kofaktorov v aktívnych miestach

●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD

,(%) 100 ligand ligand proteinburial

ligand

ASA ASAA x

ASA

●plocha prístupná pre rozpúšťadlo: ASA v Å2

N

i iig rmM

R1

21

●gyračný polomer: Rg v Å


Databáza flavoproteínov

●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank)

●55 ortológov

●100 kofaktorov●priemerné rozlíšenie

~ 2.06 Å

46% α/β štruktúra

98% oxidoreduktázy


Distribúcia vodíkových väzieb v aktívnych centrách enzýmov

● kritérium rozlíšenia: < 2Å

● 24 flavoproteínov

● parameter popisujúci interakcie v aktívnych miestach

sila interakcie vodíkovej väzby:izoalloxazín < pyrofosfát ~ adenozín <

ribityl

108642

0.6

0.4

0.2

0

Rg (A)

Hus

tota

dis

tribu

čnej

funk

cie

I.

II.

Obr.1 Flavodoxin Reductase

FAD 259, Rg = 4.87

Obr. 2 Ferredoxin Reductase

FAD 259, Rg = 5.69

Obr. 3 Nitric Oxide Synthetase

FAD 1501, Rg = 6.28

Obr. 4 Cholesterol Oxidase

FAD 510, Rg = 7.50

Obr. 5 Apoptosis iducting factor

FAD 1449, Rg = 7.67


Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov


Charakteristika rozbalenej konformácie FAD● ASA – plocha prístupná pre

rozpúšťadlo ● Rg - gyračný polomer ● schopnosť tvorby vodíkových

väzieb

121086420

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

Rg (A)

AS

A

(A) kofaktor FAD

tota

l

o

o

●korelácia ASA – plochy prístupnej pre rozpúšťadlo a

gyračného polomeru Rg (R=0.844)


Zhrnutie:

537 flavoproteínov → databáza 55 nehomológnych flavoproteínov → 100 kofaktorov

určená ASA a bimodálna distribúcia konformácie kofaktora pre oblasť aktívnych miest

75% FAD v rozbalenej a 25% v zbalenej konformácii

úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série


...čo do budúcna?

●stanovenie nitroreduktázovej aktivity NADH oxidázy z Thermus thermophilus

●viazanie flavínového derivátu do apoformy enzýmu

●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach


Poďakovanie

RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD.

RNDr. Erikovi Sedlákovi, PhD.Prof. Dr. Mathiasovi Sprinzlovi

Vám za vašu pozornosť!

Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

Documents

Transcript of Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov