Opracowanie i charakterystyka elektrochemicznych w Białymstoku Wydział Biologiczno-Chemiczny...
Transcript of Opracowanie i charakterystyka elektrochemicznych w Białymstoku Wydział Biologiczno-Chemiczny...
Uniwersytet w Biaymstoku
Wydzia Biologiczno-Chemiczny
Rozprawa doktorska
Opracowanie i charakterystyka elektrochemicznych
genoczujnikw przeznaczonych do wykrywania wirusa
ptasiej grypy typu H5N1
Kamila Dorota Malecka
Praca wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Jerzego Radeckiego
w Zakadzie Biosensorw Instytutu Rozrodu Zwierzt i Bada ywnoci Polskiej
Akademii Nauk i przedstawiona Radzie Wydziau Biologiczno-Chemicznego
Uniwersytetu
w Biaymstoku
Biaystok 2016
2
Praca bya realizowana w Instytucie Rozrodu Zwierzt i Bada
ywnoci Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie i wspfinansowana w
ramach:
Programu Innowacyjna Gospodarka, nr WND-POIG.01.01.02-00-007/08,
Projektu 679 / N-BELGIA / 2010/0,
Projektu COST Action CM10005 "Supramolekularna Chemia w Wodzie"
3
PODZIKOWANIA
Skadam serdecznie podzikowania
Panu Profesorowi Jerzemu Radeckiemu
oraz
Pani Profesor Hannie Radeckiej
za powicony czas oraz cenne wskazwki podczas wykonywania niniejszej
rozprawy
Koleankom i Kolegom z Zakadu Biosensorw i Pracowni Bioelektroanalizy
Instytutu Rozrodu Zwierzt i Bada ywnoci PAN w Olsztynie za pomoc,
wsparcie i atmosfer pracy
4
STRESZCZENIE
Wykrywanie wirusw jest bardzo istotne w wielu dziedzinach, m.in. w ochronie
zdrowia, procesach biotechnologicznych, produkcji ywnoci, monitoringu rodowiska
czy w ochronie rolin. Konwencjonalne metody, takie jak reakcja acuchowa
polimerazy (PCR) bd test immunoenzymatyczny (ELISA) czsto wymagaj obrbki
wstpnej analizowanej prby, wykwalifikowanego personelu, kosztownego sprztu oraz
drogich odczynnikw chemicznych. Nadal poszukiwane s szybkie, czue, proste
w zastosowaniu i stosunkowo tanie metody wykrywania patogenw w warunkach poza
laboratoryjnych. W ostatnich latach obserwuje si wzrastajce zainteresowanie
bioczujnikami chemicznymi bdcymi alternatyw dla dotychczas stosowanych metod
oznaczania. Wysoka czuo i selektywno wzgldem danego analitu oraz prostota
wykonania szybkiej analizy to gwne zalety, dziki ktrym czujniki mog zastpi
tradycyjne metody. Ponadto posiadaj one duy potencja miniaturyzacji, dziki czemu
oferuj moliwo prowadzenia analiz rodowiskowych (w miejscu poboru prbek)
w niewielkich objtociach. Ze wzgldu na rozwj produkcji masowej, mog uzyska
stosunkowo nisk cen jednostkow.
Przedmiotem niniejszej rozprawy byo opracowanie czuych genoczujnikw
elektrochemicznych i zastosowanie ich do selektywnego wykrywania specyficznych
sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1. Opracowano trzy bioczujniki
DNA za pomoc ktrych z powodzeniem udao si wykrywa sekwencje DNA i/lub
RNA. Do tego celu zastosowano zote elektrody dyskowe. Przedstawione bioczujniki
DNA oparte o warstwy Au/SH-ssDNA/6-MCH oraz Au/11-MUA+6-MCH/NH2-ssDNA
dziaay wedug mechanizmu jonokanaowego. Natomiast podstaw trzeciego bya
warstwa redoks-aktywna Au/AET/Phen-Epoksy/Fe(III)/Phen-Epoksy/NH2-ssDNA.
Czujniki typu kanau jonowego wymagay obecnoci zewntrznego znacznika
elektroaktywnego do obserwacji procesw hybrydyzacji. Z kolei bioczujnik posiadajcy
warstw redoks-aktywn posiada centrum odpowiadajce za generowanie sygnau
analitycznego na powierzchni elektrody. Kady z nich rni si sposobem przyczenia
sondy DNA do powierzchni elektrody zotej. Sonda SH-ssDNA bya bezporednio
przymocowana do powierzchni elektrody zotej za pomoc wizania kowalencyjnego
zoto siarka. Natomiast sond NH2-ssDNA unieruchamiano na dwa sposoby.
W przypadku czujnika typu kanau jonowego za porednictwem grupy karboksylowej
tiokwasu (11-MUA) poprzez wizanie amidowe utworzone przy wspudziale
5
pochodnych karbodiimidowych (EDC/NHS). Z kolei na warstwie redoks-aktywnej
sond aminow osadzono za pomoc reakcji click tj. nukleofilowego otwarcia
piercienia epoksydowego.
Przeprowadzono szereg bada, w wyniku, ktrych zoptymalizowano procedury
modyfikacji powierzchni zotych elektrod roboczych, a take warunki procesw
hybrydyzacji z poszczeglnymi kwasami nukleinowymi. Do pomiarw zastosowano
trzy techniki elektrochemiczne: woltamperometri cykliczn, woltamperometri fali
prostoktnej oraz elektrochemiczn spektroskopi impedancyjn w ukadzie
trjelektrodowym. Jako analitw uyto 20-merowych sekwencji DNA, ok. 180 pz
sekwencji DNA (PCR), a take ok. 280-merowych transkryptw RNA. W zalenoci
od dugoci testowanego analitu posiaday one 20-merowe sekwencje komplementarne
lub niekomplementarne, a take 20-merowe sekwencje komplementarne w dugim
acuchu DNA czy RNA znajdujce si w rnych pooeniach (na kocu 3, na kocu
5 lub na rodku).
Podjto rwnie prb miniaturyzacji najprostszego z zaproponowanych
genoczujnikw opartego o warstw Au/SH-ssDNA/6-MCH z zastosowaniem elektrod
sitodrukowanych z pracujc elektrod zot. Za jego pomoc udao si wykry m.in.
niewymagajce odwrotnej transkrypcji sekwencje RNA o dugoci okoo 280-mer,
co moe stanowi podstaw do aplikacji w warunkach poza laboratoryjnych.
Biorc pod uwag czuo i selektywno trzech przedstawionych genoczujnikw,
mona stwierdzi, e kady z nich z powodzeniem nadaje si do wykrywania materiau
genetycznego wirusa ptasiej grypy typu H5N1. Znaczcy walor stanowi rwnie
moliwo wykrywania fragmentw komplementarnych do sondy ssDNA znajdujcych
si w ok. 180-pz acuchach DNA oraz ok. 280-merowych transkryptach RNA.
Opracowane genoczujniki umoliwiay rwnie rozrnienie pooenia sekwencji
komplementarnych znajdujcych si w analizowanych oligonukleotydach.
Na podstawie aktualnie przenalizowanej literatury naukowej takie prace nie zostay
dotychczas opublikowane.
Ponadto, w przeciwiestwie do czsto pojawiajcych si w literaturze naukowej,
bioczujnikw zawierajcych znakowane oligonukleotydy DNA, zaproponowane
w rozprawie uniwersalne systemy (jonokanaowy i z warstw redoks-aktywn)
nie wymagaj skomplikowanych modyfikacji i znakowania sond DNA. Mona
je zastosowa do unieruchamiania rnych sond DNA posiadajcych jedynie grup
tiolow bd aminow na kocu 5.
6
SPIS TRECI
STRESZCZENIE ........................................................................................................... 4
WYKAZ SYMBOLI I SKRTW UYTYCH W ROZPRAWIE ......................... 10
WSTP .......................................................................................................................... 16
CEL PRACY .................................................................................................................. 18
CZ LITERATUROWA ......................................................................................... 19
1. Bioczujniki .................................................................................................................. 20
1.1. Wprowadzenie ......................................................................................................... 20
1.2. Bioczujniki oparte o kwasy nukleinowe .............................................................. 24
1.2.1. Budowa kwasw nukleinowych ........................................................................................ 24
1.2.2. Metody osadzania kwasw nukleinowych na podoach staych ..................................... 27
1.2.2.1 Adsorpcja ..................................................................................................................................... 29
1.2.2.2 Puapkowanie w matrycy ............................................................................................................. 31
1.2.2.3 Metody kowalencyjne .................................................................................................................. 31
1.2.2.4 Powinowactwo awidyna/streptawidyna biotyna ....................................................................... 35
1.2.3. Sposoby generowania sygnau w bioczujnikach elektrochemicznych opartych
o kwasy nukleinowe .......................................................................................................... 36
2. Metody wykrywania wirusw ptasiej grypy ............................................................... 44
2.1. Metody etiologiczne ............................................................................................... 46
2.2. Metody serologiczne .............................................................................................. 46
2.3. Metody molekularne ............................................................................................... 48
2.4. Bioczujniki przeznaczone do wykrywania wirusw ptasiej grypy .................. 49
3. Rodzaje bioczujnikw elektrochemicznych zaprezentowanych w niniejszej
rozprawie ................................................................................................................. 53
3.1. Czujniki typu kanau jonowego ............................................................................ 53
3.2. Czujniki oparte o warstwy redoks-aktywne ........................................................ 57
4. Charakterystyka technik pomiarowych stosowanych w niniejszej rozprawie ...... 59
4.1. Ukad pomiarowy ................................................................................................... 59
4.2. Woltamperometria cykliczna (z ang. Cyclic Voltammetry, CV) ...................... 60
4.3. Woltamperometria fali prostoktnej (z ang. Square Wave Voltammetry, SWV)
................................................................................................................................... 63
4.4. Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna (z ang. Electrochemical
Impedance Spectroscopy, EIS) .......................................................................................... 65
7
CZ EKSPERYMENTALNA................................................................................ 68
5. Odczynniki i materia biologiczny .......................................................................... 69
5.1. Odczynniki ............................................................................................................... 69
5.2. Materia biologiczny ............................................................................................... 71
5.2.1. Sekwencje DNA ................................................................................................................ 71
5.2.2. Sekwencje RNA ................................................................................................................ 72
6. Aparatura ................................................................................................................ 74
6.1. Potencjostat/galwanostat ........................................................................................ 74
6.2. Mikrobipotentiostat/galwanostat .......................................................................... 74
7. Czujniki typu kanau jonowego przeznaczone do wykrywania specyficznych
sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 ........................................ 75
7.1. Przygotowanie elektrochemicznego genoczujnika opartego o modyfikacj
elektrod zotych poprzez wizanie kowalencyjne Au-S ................................................ 75
7.1.1. Przygotowanie powierzchni dyskowych elektrod zotych ................................................ 75
7.1.2. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 76
7.1.3. Przygotowanie powierzchni sitodrukowanych elektrod zotych ....................................... 76
7.1.4. Modyfikacja elektrod sitodrukowanych ............................................................................ 77
7.1.5. Oznaczanie kwasw nukleinowych za pomoc elektrod dyskowych ............................... 77
7.1.6. Oznaczanie kwasw nukleinowych przy pomocy elektrod sitodrukowanych .................. 78
7.1.7. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 78
7.1.7.1. Pomiary elektrochemiczne z zastosowaniem dyskowych elektrod zotych ................................ 78
7.1.7.2. Pomiary elektrochemiczne z zastosowaniem sitodrukowanych elektrod zotych ....................... 79
7.2. Przygotowanie elektrochemicznego genoczujnika typu kanau jonowego
opartego o modyfikacj elektrod zotych za pomoc wizania amidowego ............... 79
7.2.1. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 79
7.2.2. Oznaczanie sekwencji DNA ............................................................................................. 80
7.2.3. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 80
8. Bioczujnik zawierajcy warstw elektroaktywn przeznaczony do wykrywania
specyficznych sekwencji DNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 ........................... 82
8.1. Konstrukcja warstwy elektroaktywnej AET/Phen-Epoksy/Fe(III)/(Phen-
Epoksy/EA krok po kroku na powierzchni elektrody zotej .......................................... 82
8.1.1. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 82
8.1.2. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 82
8.2. Konstrukcja elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania
specyficznych sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1
8
z zastosowaniem warstwy redoks-aktywnej AET/Phen-Epoksy/Fe(III)/Phen-
Epoksy/NH2-NC3 ....................................................................................................... 83
8.2.1. Modyfikacja dyskowych elektrod zotych ........................................................................ 83
8.2.2. Oznaczanie kwasw nukleinowych z wykorzystaniem elektrod dyskowych ................... 84
8.2.3. Procedury pomiarowe ....................................................................................................... 84
WYNIKI BADA I DYSKUSJA .............................................................................. 85
9. Opracowanie elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania
specyficznych sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 z
zastosowaniem sondy z grup tiolow SH ........................................................... 86
9.1. Optymalizacja modyfikacji elektrod zotych i procesu hybrydyzacji ............ 86
9.2. Optymalizacja zakresu ste analitu (20-merowych sekwencji DNA)
za pomoc CV ............................................................................................................ 89
9.3. Kontrola selektywnoci opracowanego genoczujnika z zastosowaniem
20-merowych sekwencji DNA za pomoc SWV ....................................................... 94
9.4. Zaleno pooenia sekwencji komplementarnej wzgldem sondy SH-NC3
- Sekwencje PCR1, PCR2, PCR3 oraz PCR4 ............................................................ 96
9.5. Oznaczanie transkryptw RNA .................................................................... 100
9.6. Miniaturyzacja genoczujnika na sitodrukowanych elektrodach zotych ...... 102
9.6.1. Optymalizacja osadzania sondy DNA ............................................................................. 102
9.6.2. Oznaczanie 20-merowych sekwencji DNA za pomoc techniki SWV........................... 103
9.6.3. Oznaczanie ok. 280-merowych transkryptw RNA........................................................ 104
10. Opracowanie elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania
specyficznych sekwencji DNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 z zastosowaniem
sondy osadzonej na elektrodzie zotej za pomoc wizania amidowego ............. 106
10.1. Charakterystyka poszczeglnych etapw modyfikacji elektrod zotych ...... 106
10.2. Oznaczanie 20-merowych sekwencji DNA za pomoc SWV ...................... 109
10.3. Oznaczanie 20-merowych sekwencji DNA za pomoc EIS ........................ 110
10.4. Oznaczanie produktw PCR za pomoc EIS ............................................... 112
11. Opracowanie elektrochemicznego genoczujnika przeznaczonego do wykrywania
specyficznych sekwencji DNA i RNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1 z
zastosowaniem kompleksu Fe (III) z Tris(5,6-epoksy 5,6 dihydro [1,10]
fenantrolin) ......................................................................................................... 114
11.1. Opracowanie warstwy elektroaktywnej zawierajcej kompleks Fe(III)
z Tris(5,6-epoksy 5,6 dihydro [1,10] fenantrolin) ...................................... 114
9
11.2. Potwierdzenie obecnoci centrum redoks-aktywnego na powierzchni
elektrody zotej ...............................................................................................................
...................................................................................................................... 116
11.3. Potwierdzenie osadzania sondy NH2-NC3 na warstwie redoks-aktywnej
Au/AET/Phen-Epoksy/ Fe(III)/Phen-Epoksy/ ......................................................... 118
11.4. Oznaczanie sekwencji DNA ........................................................................... 120
11.5. Oznaczanie transkryptw RNA....................................................................... 122
PODSUMOWANIE ................................................................................................... 125
Podsumowanie genoczujnikw typu kanau-jonowego ....................................................... 125
Podsumowanie genoczujnika opartego o warstw elektroaktywn AET/Phen-Epoksy/
Fe(III)/Phen-Epoksy ............................................................................................................ 129
WNIOSKI.................................................................................................................... 133
SPIS ILUSTRACJI ..................................................................................................... 137
SPIS TABEL ............................................................................................................... 142
WYKAZ PUBLIKACJI I KONFERENCJI NAUKOWYCH .............................. 143
BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 146
10
WYKAZ SYMBOLI I SKRTW UYTYCH W ROZPRAWIE
SKRT PENA NAZWA
11-HUD 11-hydroksy-1-undekanetiol
11-MUA kwas 11-merkaptoundekanowy
6-MCH 6-merkaptoheksan-1-ol
Ae powierzchnia elektrody
A adenina
ACV woltamperometria prdu przemiennego
AET aminoetanotiol
AG aldehyd glutarowy
AGID immunodyfuzja na elu agarowym
AIV wirus ptasiej grypy (z ang. avian influenza virus)
AI ptasia grypa
AN acetonitryl
AQ-PNA peptydowy kwas nukleinowy znakowany antrachinonem
AuNPs nanoczsteczki zota
BRCA1 gen nowotworu piersi
BZT biochemiczne zapotrzebowania tlenu
C cytozyna
Ck cukier
C0 stenie depolaryzatora w gbi roztworu
Cdl pojemno warstwy podwjnej
CdSe nanostruktury selenku kadmu (z ang. cadmium selenide
nanostructure)
Ch chitozan
CMOS komplementarny pprzewodzcy tlenek metalu
(z ang. complementary metal oxide semiconductor)
c-NC3 sekwencja komplementarna do sondy NC3
CNT nanorurki wglowe
11
[Co(bpy)3]3+ tri(2,2-bipirydyl) kobaltu
CoPor porfiryna z kobaltem
CoPc ftalocyjanina kobaltu
Co(Phen)33+ nadchloran tris(1,10-fenantrolina) kobaltu (III)
CP sonda chwytajca (z ang. capture probe)
CV woltamperometria cykliczna
D wspczynnik dyfuzji
D-AgNP nanoczstki srebra znakowane doksorubicyn
DEZ dyskowe elektrody zote
DPV woltamperometria pulsowa rnicowa
DNA kwas deoksyrybonukleinowy
DPM dipirometen
dsDNA podwjna ni DNA (z ang. double stranded DNA)
E0 potencja piku dla czujnika w roztworze podstawowym bez
dodatku analitw
EDC chlorowodorek 1-etylo-3-(3-
dimetyloaminopropylo)karbodiimidu
EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy
EIS elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna
ELISA test immunoenzymatyczny
En potencja piku dla danej prbki
EPA potencja piku anodowego
EPK potencja piku katodowego
eSPR elektrochemiczny powierzchniowy rezonans plazmonw
ETA etanoloamina
ESW amplituda fali prostoktnej
F staa Faradaya
Fc ferrocen
G guanina
G4-PDR poliamidoaminowy dendrymer czwartej generacji
12
GCE elektroda z wgla szklistego (z ang. glassy carbon electrode)
Gr-VS2 mieszanina grafen-disiarczek wanadu
GW granica wykrywalnoci (z ang. limit of detection)
HA hemaglutynina
HBV wirus zapalenia wtroby typu B
His6-Qinghai histagowane odmiany (warianty) rekombinowanej
hemaglutyniny
HIT test zahamowania hemaglutynacji
HPAI wysokopatogenna ptasia grypa
(z ang. highly pathogenic avian influenza)
HPV wirus brodawczaka
I natenie prdu piku
I0 natenie prdu piku dla czujnika w roztworze podstawowym
bez dodatku analitu
Ic prd adowania pojemnoci warstwy podwjnej
If prd faradajowski
In natenie prdu piku dla danej prbki
Ip natenie prdu
IPA prd piku anodowego
IPK prd piku katodowego
ITO elektroda z tlenku indu domieszkowanego cynkiem
IUPAC Midzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej
(z ang. International Union of Pure and Applied Chemistry)
k staa charakteryzujca ukad elektrod
KN kwasy nukleinowe
LPAI niskopatogenna ptasia grypa
(z ang. low pathogenic avian influenza)
MB bkit metylenowy ( z ang. methylene blue)
MCB merkaptobutanol
MES kwas 2-morfolinoetanosulfonowy
MP mykoplazmatyczne zapalenie puc
13
MPA kwas merkaptopropionowy
mRT-PCR multipleksowa reakcja polimerazy acuchowej z odwrotn
transkryptaz
MWCNTs wielocienne nanorurki wglowe (z ang. multi-walled carbon
nanotubes)
n liczba elektronw biorcych udzia w reakcji elektrodowej
NA neuraminidaza
NASBA amplifikacja sekwencji kwasw nukleinowych
nc-NC3 sekwencja niekomplementarna do sondy NC3
NH2-NC3 sonda DNA z grup aminow
NHS imid kwasu N-hydroksybursztynowego
NIT test zahamowania neuraminidazy
nt nukleotyd
NT test neutralizacji
OIE wiatowa Organizacja Zdrowia Zwierzt
OWD odczyn wizania dopeniacza
Ox utleniacz
P reszta kwasu fosforowego (V)
PAMAM dendrymery poliamidoaminowe
PBS fizjologiczny bufor fosforanowy
PCR reakcja polimerazy acuchowej (z ang. polymerase chain
reaction)
PEG glikol polietylenowy
p-ELISA peptydowy test immunoenzymatyczny
PGE owkowa elektroda grafitowa
Phen-Epoksy 5,6-epoksy-5,6-dihydro-1,10-fenantrolina
PPNWs nanodruty polipirolowe
PPV wirus ospowatoci liwy (z ang. Plum Pox Virus)
pz para zasad
Q ilo adunku
R staa gazowa
14
R0 opr przeniesienia elektronu dla czujnika w roztworze
podstawowym bez dodatku analitw
Red reduktor
Ret opr przeniesienia elektronu
rGO-GDLE zredukowany tlenek grafenu
Ri opr przeniesienia elektronu dla danej prbki
RNA kwas rybonukleinowy
RTm temperatura pokojowa (z ang. room temperature)
RT-PCR reakcja polimerazy acuchowej z odwrotn transkryptaz
RRT-PCR reakcja polimerazy acuchowej z odwrotn transkryptaz
w czasie rzeczywistym
R opr roztworu
S nachylenie krzywej kalibracyjnej
SAMs samoorganizujce si monowarstwy (ang. self-assembled
monolayers)
scFV pojedynczy acuch zmiennego fragmentu przeciwcia (z ang.
single chain variable fragments of antibodies)
SEZ sitodrukowane elektrody zote
SH-NC3 sonda z grup tiolow
ssDNA pojedyncza ni dna (z ang. single stranded DNA)
SSC bufor cytrynianowy (z ang. saline sodium citrate)
SWV woltamperometria fali prostoktnej
T tymina
TFA kwas trifluorooctowy
Tm temperatura
TRIS 2-amino-2-hydroksymetylopropan -1,3-diol
U uracyl
VFDF anatoksyna-a (z ang. Very Fast Death Factor)
WHO wiatowa Organizacja Zdrowia (z ang. Word Health
Organization)
15
XPS rentgenowska spektrometria fotoelektronw (z ang. X-ray
photoelectron spectroscopy)
Z urojona skadowa impedancji
Z rzeczywista skadowa impedancji
ZA zasada azotowa
Zw element Warburga
wspczynnik przeniesienia elektronu
stopie pokrycia powierzchni elektrody
E rnica potencjaw
Ei amplituda impulsw
I wzgldne natenie prdu piku
szybko zmian potencjau
odchylenie standardowe odpowiedzi czujnika
16
WSTP
Wirus ptasiej grypy (AIV, z ang. Avian Influenza Virus), moe rozprzestrzenia
si wrd dzikiego i domowego ptactwa, powodowa epidemie, a nawet pandemie,
a take stanowi zagroenie dla ssakw, w tym ludzi. Forma wysokopatogenna (HPAI)
typu H5N1 staa si w dzisiejszych czasach bardzo niebezpiecznym, zagraajcym nie
tylko dla drobiu patogenem (Neumann i wsp., 2010). Mimo, e H5N1 jest wirusem
grypy ptakw i zwykle nie rozprzestrzenia si wrd ludzi, od 2003 roku do czerwca
2016 odnotowano i potwierdzono 851 zakae ludzi typem H5N1 w 16 krajach. Okoo
60% z nich zakoczyo si zgonem (WHO, 2016). Gdyby czowiek chory na gryp
sezonow zarazi si ptasi gryp, wwczas istnieje prawdopodobiestwo zmutowania
si materiaw genetycznych obu wirusw, a w konsekwencji moe wiza si
to z nabyciem zdolnoci wirusa H5N1 do przenoszenia si z czowieka na czowieka.
atwo przenoszone midzy ludmi szczepy H5N1 mog mie katastrofalne skutki.
W zwizku z powyszym istnieje zapotrzebowanie na czue, szybkie i tanie testy
do diagnozowania AIV, ktre pozwoliby jednoczenie na wczesne terapie
przeciwwirusowe. Kryteria te speniaj bioczujniki elektrochemiczne. Atrakcyjno
ich stosowania wynika gwnie z ich wysokiej czuoci i selektywnoci wzgldem
badanego analitu. Dziki tym waciwociom pozwalaj one w sposb prosty i szybki
oznaczy interesujcy skadnik nawet w zoonej mieszaninie. Opracowywanie
nowoczesnych bioczujnikw jest bardzo interesujcym zagadnieniem zarwno, jeeli
chodzi o badania podstawowe, jak i aplikacyjne. Stanowi one doskona alternatyw
dla obecnie stosowanych tradycyjnych technik, takich jak test immunoenzymatyczny
(ELISA) czy reakcja polimerazy acuchowej (PCR) (Wang i wsp., 2009).
Charakteryzuj si prost konstrukcj i niskim kosztem produkcji, a take szybk
detekcj. Moliwe jest rwnie ich zminiaturyzowanie.
Opracowywanie nowych technologii bioczujnikw to dynamiczna dziedzina
bada. wiadczy o tym sukcesywnie wzrastajca liczba publikacji naukowych
dotyczcych bioczujnikw DNA Rysunek 1. W ostatnich latach w wielu orodkach
naukowych na wiecie prowadzone s intensywne badania nad zastosowaniem
bioczujnikw w analizie ywnoci, kryminalistyce, ale take w diagnostyce klinicznej
czy rodowiskowej, np. do wykrywania wirusw i innych patogenw, zarwno
17
rolinnych, jaki i zwierzcych (Ahmed i wsp., 2008; Pedrero i wsp., 2012; Tam i wsp.,
2009a; Civit i wsp., 2010; Cagnin i wsp., 2009).
Rysunek 1. Liczba publikacji dotyczcych genoczujnikw w bazie Web of Knowledge
w latach 1990-2016.
18
CEL PRACY
Przedmiotem bada niniejszej rozprawy doktorskiej jest opracowanie
i zastosowanie nastpujcych elektrochemicznych genoczujnikw do wykrywania
specyficznych sekwencji oligonukleotydw wirusa ptasiej grypy typu H5N1:
Bioczujnika zawierajcego sond DNA zmodyfikowan grup tiolow
unieruchomion na powierzchni dyskowej elektrody zotej oraz na elektrodzie
sitodrukowanej (miniaturyzacja ukadu) dziaajcego w oparciu o mechanizm
jonokanaowy
Bioczujnika zawierajcego sond DNA zmodyfikowan grup aminow
unieruchomion na powierzchni dyskowej elektrody zotej dziaajcego w oparciu
o mechanizm jonokanaowy
Bioczujnika posiadajcego jako centrum redoks-aktywne kompleksy elaza
(III) z pochodn fenantroliny budowane na powierzchni dyskowej elektrody zotej
19
CZ LITERATUROWA
Co my wiemy, to tylko kropelka.
Czego nie wiemy, to cay ocean.
-Isaac Newton
https://cytaty.eu/cytat/co/my.htmlhttps://cytaty.eu/cytat/co/my.htmlhttps://cytaty.eu/autor/isaacnewton.html
20
1. Bioczujniki
1.1. Wprowadzenie
Zgodnie z nomenklatur Midzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej
(IUPAC) czujnik chemiczny to urzdzenie przeksztacajce informacj chemiczn
na sygna analitycznie uyteczny. Informacja chemiczna, o ktrych mowa powyej,
moe pochodzi z reakcji chemicznej element rozpoznajcy analit lub waciwoci
fizycznych badanego ukadu (Hulanicki i wsp., 1991). Podstaw dziaania czujnikw
chemicznych stanowi oddziaywania midzyczsteczkowe, ktre posiadaj charakter
niekowalencyjny (takie jak: siy elektrostatyczne, wizania wodorowe, siy van der
Wasala) i zachodz na granicy dwch faz (warstwa analitycznie aktywna/roztwr
badany). Oddziaywania te stanowi domen chemii supramolekularnej, za ktrej
rozwj Donald J. Cram, JeanMarie Lehn i Charles Pedersen otrzymali nagrod Nobla
w 1987 roku (Cram, 1992; Lehn, 1992; Pedersen, 1992).
Czujnik skada si z dwch podstawowych komponentw:
warstwy analitycznie aktywnej, gdzie nastpuje proces rozpoznania
midzyczsteczkowego utworzenie kompleksu gospodarz-go (element rozpoznajcy
analit), w trakcie ktrego informacja chemiczna o prbce jest przeksztacana w form
energii;
elementu przetwornikowego, dziki ktremu sygna otrzymany w warstwie
analitycznie aktywnej zostaje zamieniony na mierzalny parametr analityczny,
tzn. nadajcy si do obrbki
W zalenoci od natury zastosowanego materiau analitycznie aktywnego czujniki
mona zakwalifikowa do dwch grup:
czujniki chemiczne materiaem analitycznie aktywnym w tej grupie
s syntetyczne czsteczki zdolne do selektywnego rozpoznania czsteczek analitu.
bioczujniki nale do grupy czujnikw, w ktrych elementami rozpoznania
midzyczsteczkowego w warstwie aktywnej s czsteczki stanowice materia
biologiczny, np. DNA, biaka, enzymy, przeciwciaa lub cae komrki, unieruchomione
na odpowiednim noniku.
21
Schematycznie konstrukcj czujnika chemicznego przedstawiono na Rysunku 2.
Rysunek 2. Schemat budowy czujnika chemicznego.
Klasyfikacja bioczujnikw bazuje na dwch charakterystycznych parametrach
ich konstrukcji: systemie biodetekcji oraz typie elementu przetwornikowego. Pierwsze
kryterium opiera si na specyficznych reakcjach element rozpoznajcy analit,
np. przeciwciao-antygen, enzym-substrat oraz oddziaywaniach kwasw nukleinowych.
Natomiast ze wzgldu na zasad dziaania przetwornika mona dokona podziau
(Chambers i wsp., 2008) na: optyczne (Galyanin i wsp., 2015; Paliwal i wsp., 2015;
Patista i wsp., 2015), elektrochemiczne (Cagnin i wsp., 2009; Mc Caffrey i wsp., 2015;
Liu i wsp., 2015), masowe (Stoytcheva i wsp., 2013; Gltekin i wsp., 2014; Snchez-
Fraga i wsp., 2014), akustyczne (Jo i wsp.; 2013; An i Chen, 2015; Franois i wsp.,
2015) i termiczne (Reyes-Romero i wsp., 2014; Weber i wsp., 2014, Salek i wsp.,
2015). Drog prowadzc do otrzymania sygnau analitycznego schematycznie
zaprezentowano na Rysunku 3.
Prbka
analitycznaWarstwa
analitycznie
aktywna
Przetwornik Sygna
analityczny
22
Rysunek 3. Przebieg procesw prowadzcych do otrzymania sygnau analitycznych
z udziaem rnych przetwornikw i technik pomiarowych.
O praktycznej przydatnoci kadego czujnika analitycznego decyduje granica
wykrywalnoci, selektywno, powtarzalno wynikw oraz czas detekcji. Wikszo
tych parametrw zaley od warstwy analitycznie aktywnej danego czujnika (Radecki
i wsp., 2006).
Bioczujniki pozwalaj na wykrywanie biaek (Das i Kelley, 2011), DNA (Tosar
i wsp., 2010), identyfikacj szeregu metabolitw (Karim i Fakhruddin, 2012), wirusw
(Altintas i wsp., 2015) czy bakterii (Dong i Zhao, 2015; Webster i wsp., 2015), a take
skae chemicznych np. toksyn (Sharma i Mutharasan, 2013). Stosuje si je m.in. do
okrelania zawartoci metali cikich, pestycydw, zwizkw azotowych
i fosforowych, lotnych substancji organicznych, patogenw, substancji rakotwrczych
i toksycznych (pestycydw, mykotoksyn, antybiotykw), biochemicznego
zapotrzebowania tlenu (BZT) w powietrzu, wodzie czy glebie (Bahadr i Sezgintrk,
23
2015). Bioczujniki wykorzystuje si rwnie do kontroli ywnoci m.in. do
identyfikacji organizmw genetycznie zmodyfikowanych (GMO) (Radecki i wsp.,
2006; Manzanares-Palenzuela i wsp., 2015; Tam, 2015). Ponadto umoliwiaj one
detekcj ladowych iloci materiaw wybuchowych stosowanych w terroryzmie (Sun
i wsp., 2015).
Schematycznie przykadowe zastosowania bioczujnikw przedstawiono na Rysunku 4.
Rysunek 4. Przykadowe zastosowania bioczujnikw (opracowano na podstawie
http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Biosensory/).
W przypadku bioczujnikw DNA proces rozpoznania midzyczsteczkowego
odpowiedzialny za wytwarzanie sygnau analitycznego, realizowany jest przez proces
hybrydyzacji zachodzcej midzy pojedyncz nici DNA (sond, ssDNA) osadzon
na powierzchni elektrody a komplementarn sekwencj DNA lub RNA znajdujc si
w roztworze badanej prby (analitem) Rysunek 5. Jednym z najczciej stosowanych
przetwornikw w przypadku genoczujnikw jest przetwornik elektrochemiczny
(Gooding, 2002; Kerman i wsp. 2004; Liu i wsp., 2005a; Rivas i wsp., 2005; Degefa
i Kwak, 2008; Kukol i wsp., 2008; Park i Park, 2009; Zhu i wsp., 2009a; Yu i wsp.,
2014; Fernandes i wsp., 2015, Torkashvand i wsp., 2015).
24
Rysunek 5. Schemat budowy bioczujnika opartego o DNA.
1.2. Bioczujniki oparte o kwasy nukleinowe
1.2.1. Budowa kwasw nukleinowych
Kwasy nukleinowe (KN) s niezwykle przydatne w konstrukcji bioczujnikw
ze wzgldu na ich silne waciwoci rozpoznajce (Paleek, 2002; Paleek i Bartoik,
2012). W ostatnich latach nastpio due zainteresowanie wykorzystaniem kwasw
nukleinowych, jako narzdzia w biodetekcji (Berney i wsp., 2000; Vercoutere i wsp.,
2002; Sassolas i wsp., 2008).
Kwasy nukleinowe to zwizki wielkoczsteczkowe. We wszystkich komrkach
organizmw wystpuj dwa rodzaje kwasw nukleinowych: kwas
deoksyrybonukleinowy (DNA) oraz kwas rybonukleinowy (RNA). Kady z nich
zbudowany jest z trzech skadnikw (Rysunek 6):
cyklicznego piciowglowego cukru prostego (Ck) pentozy, w przypadku
DNA jest to deoksyryboza, a RNA ryboza (Rysunek 7)
jednej, dwch lub trzech reszt kwasu fosforowego (V) (P),
heterocyklicznej zasady azotowej (ZA), bdcej pochodn puryny adenina
(A), guanina (G) lub pirymidyny cytozyna (C), tymina (T), uracyl (U)
25
Rysunek 6. Budowa nukleotydu.
Rysunek 7. Cukry wchodzce w skad A) RNA ryboza oraz B) DNA deoksyryboza.
Zasady azotowe stanowice skadniki kwasw nukleinowych zawieraj w swojej
strukturze heterocykliczne piercienie aromatyczne z rnymi podstawnikami
Rysunek 8. S one kowalencyjnie poczone z piercieniem cukru pentoz tworzc
nukleozydy. Natomiast nukleozydy zwizane kowalencyjnie z jedn lub wicej grup
fosforanowych nosz nazw nukleotydw i stanowi jednostki monomeryczne tworzce
DNA lub RNA. Polimerowe czsteczki kwasw nukleinowych posiadaj adunek
ujemny pochodzcy od reszt fosforanowych.
Rysunek 8. Wzory strukturalne zasad nukleinowych tworzcych nukleotydy.
26
Przestrzenny model czsteczki DNA zosta opracowany w 1953 roku przez
Jamesa Watsona i Francisa Cricka. Zgodnie z nim czsteczk DNA tworz dwie nici
polinukleotydowe skrcone wok wsplnej osi w ksztat podwjnej helisy
prawoskrtnej, w ktrej zasady azotowe skierowane s do wntrza, a acuch cukrowo-
fosforanowy znajduje si na zewntrz powstaej w ten sposb struktury przestrzennej
(Stryer, 2003). W acuchu DNA czsteczki cukru uoone s na przemian z resztami
kwasu fosforowego (V), ktry czy ze sob dwa rne atomy wgla kolejnych
czsteczek cukru oznaczonych jako 5 i 3. Nici DNA w helisie biegn w przeciwnych
kierunkach (s antyrwnolege), co oznacza, e naprzeciwko siebie le dwa rne
koce koniec 5 jednej nici i koniec 3 drugiej nici. Jeden skrt helisy zawiera 10 par
nukleotydw (Turner i wsp., 2013; Allison, 2009).
Pod wzgldem budowy RNA rni si od DNA dwoma elementami. Po pierwsze,
cukrem w przypadku RNA jest ryboza, ktra zawiera grup 2-hydroksylow (grupa
ta nie wystpuje w DNA) (Rysunek 7A). Po drugie, jedn z zasad azotowych
budujcych RNA jest uracyl (nie wystpuje w DNA) (Rysunek 8). RNA jest rwnie
mniej odporny na dziaanie nukleaz (Stryer, 2003).
Utrzymanie staej odlegoci pomidzy dwiema nimi w helisie DNA lub
DNA/RNA jest moliwe dziki oddziaywaniom pomidzy zasadami azotowymi, ktre
cz si ze sob zgodnie z zasad komplementarnoci. Wedug niej wizania
wodorowe powstaj w przypadku helisy DNA-DNA pomidzy A, a T oraz
G i C. A czy si z T dwoma wizaniami wodorowymi, natomiast C z G trzema
wizaniami. Pojedyncze nici RNA i DNA o komplementarnych sekwencjach mog
utworzy podwjn helis RNADNA. Wwczas uracyle pochodzce z RNA cz si
z adeninami DNA, za adeniny RNA z tyminami DNA (Rysunek 9).
27
Rysunek 9. Fragment podwjnej nici DNA/RNA.
1.2.2. Metody osadzania kwasw nukleinowych na podoach staych
Wybr metody osadzania sondy na powierzchni elektrody ma kluczowe znaczenie
dla czuoci i selektywnoci konstruowanego genoczujnika. Generalnie metoda
ta powinna zapewni:
precyzyjn kontrol gstoci upakowania i przestrzennej orientacji
poszczeglnych sond DNA w osadzanej warstwie, aby nitki wzajemnie na siebie nie
oddziayway i nie blokoway dostpu analitu, nie straciy swojej aktywnoci
biologicznej zapewnienie moliwie najbardziej wydajnego przebieg procesu
hybrydyzacji (warstwa zbyt upakowana utrudnia ten proces ze wzgldu na moliwo
oddziaywania sond DNA midzy sob, blokujc do nich dostp dla analitu, natomiast
warstwa zbyt luna zwiksza prawdopodobiestwo niespecyficznej adsorpcji
na powierzchni elektrody, adsorpcja taka jest rdem wysokiego prdu ta);
utworzenie stabilnej warstwy analitycznie aktywnej w warunkach prowadzenia
eksperymentu;
powtarzalno i atwo procedury osadzania (de-los-Santos-lvarez i wsp.,
2004; Radecki i wsp., 2006)
28
Osadzanie kwasu deoksyrybonukleinowego moe by realizowane przez
oddziaywania niekowalencyjne lub tworzenie wiza kowalencyjnych (Paleek i Jelen,
2005). Pewne sposoby osadzania zapewniaj bezporedni styczno czsteczek kwasu
z powierzchni przetwornika, a w przypadku innych w kontakcie tym porednicz
dodatkowe ugrupowania chemiczne.
Obecnie w literaturze sposoby osadzania sond ssDNA na elektrodach
s niezwykle zrnicowane i nieustannie pojawiaj si nowe procedury wykorzystujce
coraz bardziej zoone ukady. Do najczciej opisywanych nale metody
schematycznie przedstawione na Rysunku 10A (Pividori i wsp., 2000; DSouza, 2001;
Wang, 2002a; Wang, 2002b; Paleek i Jelen, 2005; Di Giusto i King, 2006; Paleek
i Bartoik, 2012):
Adsorpcja fizyczna i adsorpcja przy okrelonym potencjale
Enkapsulacja (unieruchomienie w warstwie polimerowej)
Wizanie poprzez powinowactwo awidyny i biotyny,
Wizanie kowalencyjne - unieruchomienie z wykorzystaniem powinowactwa grup
tiolowych do zota lub z wytworzeniem wizania amidowego (poprzez tworzenie
samoorganizujcych si warstw tiolowych)
Najbardziej popularne sposoby osadzania DNA na powierzchniach elektrod staych
przedstawiono schematycznie na Rysunku 10B.
29
A)
B)
Rysunek 10. A) Sposoby osadzania DNA na powierzchniach staych. B) Najczciej
wykorzystywane techniki osadzania kwasw nukleinowych (Li i Lu, 2009).
1.2.2.1 Adsorpcja
Adsorpcja fizyczna jest najprostszym sposobem osadzania kwasw
nukleinowych. Stosuje si j w przypadku, np. pastowych elektrod wglowych, elektrod
grafitowych, z wgla szklistego, a sporadycznie rwnie ITO (z tlenku indu
domieszkowanego cynkiem), rtciowych, czy zotych (Pividori i wsp., 2000; Fojta,
2002; de-los-Santos-lvarez i wsp., 2004; Gherghi i wsp., 2004; Paleek i Jelen, 2005;
Wang i wsp., 2006; Pedano i Rivas, 2010). KN adsorbuj si w sposb trway
i nieodwracalny. Bioczujnik tego typu przygotowuje si poprzez nakroplenie
30
na powierzchni elektrody roboczej roztworu DNA i pozostawienie go do wyschnicia.
Skutkuje to utworzeniem cienkiej warstwy analitycznie aktywnej o przypadkowym
i nieuporzdkowanym uoeniu poszczeglnych acuchw DNA. W przypadku
tworzenia warstw analitycznie aktywnych przeznaczonych do konstrukcji bioczujnikw
metoda osadzania kwasw nukleinowych na drodze adsorpcji nie spenia oczekiwanej
roli. DNA adsorbujc si na powierzchniach elektrod moe czy si z ni
wielopunktowo, co znacznie ogranicza zmiany struktury przestrzennej nici DNA
nastpujce w wyniku oddziaywa np. hybrydyzacji DNA (Moser i wsp., 1997; Geng
i wsp., 2009; Li i Lu, 2009; Wu i wsp., 2011).
Na powierzchni elektrod wglowych mona rwnie osadza KN poprzez
adsorpcj elektrochemiczn (przy staym potencjale) (Pividori i wsp., 2000).
Ze wzgldu na hydrofilow powierzchni wgla (otrzyman na przykad przez
jej utlenienie) KN adsorbuj si za porednictwem szkieletu fosforanowego,
pozostawiajc zasady dostpne do hybrydyzacji. Naadowana dodatnio elektroda
wglowa przyciga elektrostatycznie ujemnie naadowany szkielet, co powoduje,
e adsorpcja jest jeszcze silniejsza (Paleek i Bartoik, 2012). Adsorpcj
elektrochemiczn ssDNA przeprowadza si w cigle mieszanym roztworze przy
dodatnim potencjale +0.2 V lub +0.5 V wzgldem elektrody odniesienia. Utrzymuje si
go przez okrelony czas, ktry zaley od stenia oligonukleotydu (okoo 2-5 minut)
(Marrazza i wsp., 1999; Pedano i Rivas, 2005; Bagni i wsp., 2006; Szpakowska i wsp.,
2006). Potencja ten zwiksza stabilno sond, oddziaujcych elektrostatycznie
pomidzy dodatnio naadowan powierzchni wgla a ujemnie naadowanym
hydrofilowym szkieletem cukrowo-fosforanowym. Wwczas zasady azotowe
zorientowane s w kierunku roztworu i gotowe do hybrydyzacji z analitem. Warunkiem
zajcia efektywnej adsorpcji oligonukleotydw na powierzchni elektrody jest
odpowiednio wysokie napicie. Jednoczenie nie moe przekracza pewnych wartoci,
by nie spowodowa utlenienia zasad azotowych. DNA adsorbuje si na powierzchni
elektrody wglowej dziki jej niejednorodnej i rozwinitej powierzchni, a uoenie
acuchw podobnie jak w przypadku adsorpcji fizycznej nie jest uporzdkowane
(Pividori i wsp., 2000). Przesunicie w kierunku potencjaw bardziej ujemnych
powoduje desorpcj DNA spowodowan elektrostatycznym odpychaniem (Paleek
i Bartoik, 2012).
31
1.2.2.2 Puapkowanie w matrycy
Alternatywn metod osadzania oligonukleotydw na powierzchni elektrody jest
ich wbudowanie w polimerow matryc (Ioannou i wsp., 2006; Dimitrov i wsp., 2011;
Velusamy i wsp., 2011). Pozwala ona na bardziej stabilne unieruchomienie KN ni
adsorpcja. W celu wytworzenia matrycy wykorzystuje si polimery kationowe (np.
chitosan lub poli(chlorek diallilodimetyloamonu)) (Zhang i Hu, 2007; Tiwari i Gong,
2009) bd polimery przewodzce (np. politiofenu czy polipirolu) (Ramanaviciene
i Ramanavicius, 2004; Rahman i wsp., 2015). Unieruchomienie oligonukleotydw
w matrycy polimerowej skutkuje powstaniem trjwymiarowej warstwy o duej gstoci.
Wad tej metody jest trudno kontrolowania wielkoci porw. Ruchliwo
(elastyczno) DNA i dostpno dla analitu jest w tym przypadku do mocno
ograniczona, co prowadzi do utrudnienia procesw hybrydyzacji (de-los-Santos-lvarez
i wsp., 2004; Galandov i Labuda, 2009; Li i Lu, 2009).
1.2.2.3 Metody kowalencyjne
Oddziaywania tiol-metal szlachetny s czsto stosowane do kowalencyjnego
wizania bioczsteczek na powierzchni metali. Silne powinowactwo grup tiolowych
do zota pozwala na tworzenie wiza kowalencyjnych pomidzy atomami siarki
i zota:
R-SH + Au RS-Au + e- + H+ (1)
Natur wizania S-Au, badano przy pomocy rentgenowskiej spektrometrii
fotoelektronw (XPS), spektroskopii oscylacyjnej, spektrometrii mas
i technik elektrochemicznych. Wykazano, e tiol adsorbuje si na powierzchni elektrody
zotej, tworzc silne wizanie kowalencyjne AuS (Labuda i wsp., 2010; Vericat i wsp.,
2010).
Kwasy nukleinowe nie tworz samoczynnie wiza kowalencyjnych
z powierzchni elektrody. W zwizku z tym niezbdna jest modyfikacja samych
skadnikw warstwy analitycznie aktywnej lub funkcjonalizacja powierzchni elektrody
(Li i Lu, 2009).
Powszechnym sposobem osadzania kwasw nukleinowych na powierzchniach
elektrod staych jest tworzenie wizania kowalencyjnego pomidzy grup funkcyjn
wprowadzon do sondy DNA a sfunkcjonalizowan bd niesfunkcjonalizowan
32
powierzchni elektrody zotej. Metoda ta zapobiega przede wszystkim wymywaniu
sond z warstwy analitycznie aktywnej do roztworu, co ma miejsce w przypadku
unieruchamiania oligonukleotydw w tzw. strukturach polimerowych). Ponadto z uwagi
na moliwo wyeliminowania niespecyficznej adsorpcji czsteczek warstwy
analitycznie aktywnej w znacznym stopniu redukowane s szumy oraz faszywe
odpowiedzi bioczujnika. Energia, jak naleaoby dostarczy, aby rozerwa wizanie
kowalencyjnego jest na tyle dua, e kilkukrotne odmywanie powierzchni elektrody
(usuwanie nieunieruchomionych czstek) nie powoduje wymywania si utworzonej
warstwy (Heise i Bier, 2006).
Oligonukleotydy na powierzchni elektrod zotych mona kowalencyjne osadzi
na dwa sposoby. Pierwszy z nich polega na unieruchomieniu na powierzchni elektrody
zwizkw tiolowych zaopatrzonych w odpowiednie grupy funkcyjne, ktre nastpnie
wi si z sondami DNA za pomoc wizania kowalencyjnego (Love i wsp., 2005).
Moe to by kowalencyjne wizanie amidowe (Ligaj i wsp., 2014; Malecka i wsp.,
2013, 2014; Donmez i wsp., 2015; Zhu i wsp., 2015a) lub fosforoamidowe (Xu i wsp.,
2006; Park i Park, 2009). Ten sposb osadzania KN wymaga funkcjonalizacji
powierzchni elektrody zotej poprzez osadzenie warstw alkilotioli zakoczonych
grupami NH2 lub COOH, a take wczeniejszej modyfikacji jednego
z kocw acucha oligonukleotydowego przez wprowadzenie np. acucha alkilowego
zakoczonego grup COOH lub NH2. Metoda ta zapewnia sondom DNA swobod
konformacyjn, co znacznie uatwia proces hybrydyzacji (Prashar, 2012).
Tego typu rozwizanie zostao wykorzystane w niniejszej rozprawie. Elektrod zot
zmodyfikowano mieszan warstw tioli posiadajcych grupy funkcyjne OH oraz
COOH. Pojedyncza ni DNA posiadajca na kocu 5 grup NH2 za porednictwem
mieszaniny EDC i NHS zostaa zwizana z grup COOH tworzc wizanie amidowe
(Malecka i wsp., 2013).
Drugi sposb opiera si na osadzeniu chemicznie zmodyfikowanej sondy DNA
(gwnie koca 5) cznikiem z grup SH. Najczciej stosuje si trzy- lub
szeciowglowe czniki merkaptoalkilowe. Sondy wyposaone w taki cznik su
do bezporedniego tworzenia monowarstw na powierzchni elektrod zotych. Pojedyncze
nici DNA zmodyfikowane grupami tiolowymi, bd zwizki alkilotiolowe
poredniczce w kowalencyjnym przyczeniu DNA do powierzchni elektrody,
s unieruchamiane na powierzchni zota tworzc samoorganizujce si warstwy (SAMs)
(Sassolas i wsp., 2008). Chemisorpcja czsteczek posiadajcych grupy tiolowe jest
33
to metoda polegajca na spontanicznej reakcji pomidzy powierzchni elektrody zotej
a czsteczk zawierajc grup merkaptoalkilow. Pionierskiego odkrycia
samoorganizujcych si monowarstw dokonali Nuzzo i Allara, dziki badaniom
powierzchni elektrod zotych zmodyfikowanych organicznymi sulfidami (Nuzzo
i Allara, 1983).
W pierwszym etapie przygotowania bioczujnika najczciej stosuje si warstwy
mieszane skadajce si z sondy DNA i wypeniacza. Taka strategia zostaa
zastosowana rwnie w niniejszej rozprawie. W celu eliminacji wolnych przestrzeni
na elektrodzie uywa si rozcieczalnika wypeniajcego miejsca pomidzy sondami
DNA (np. 6-MCH) (Gooding, 2002; Paleek i Jelen, 2005; de-los-Santos-lvarez
i wsp., 2004; Wong i wsp., 2005; Mannelli i wsp., 2005). Zapewnia to utworzenie
regularnej i uporzdkowanej warstwy, w ktrej czsteczki DNA stykaj si
z powierzchni elektrody tylko za porednictwem cznika tiolowego i nachylone
s do niej pod staym ktem, co zapewnia jednakow dostpno acuchw kwasu dla
substancji oddziaujcych z nimi (Pividori i wsp., 2000; de-los-Santos-lvarez i wsp.,
2004; Paleek i Jelen, 2005).
Kad z czsteczek, ktre stanowi budulec warstwy samoorganizujcej si
mona podzieli na trzy czci, co zademonstrowano na Rysunku 11:
grup gwn siarkow, ktra tworzy silne, wizanie kowalencyjne
z podoem;
acuch gwny (szkielet) wglowodorowy o rnej dugoci, ktry
stabilizuje SAM dziki niekowalencyjnym oddziaywaniom van der Waalsa; zapewnia
efektywne upakowanie monowarstwy i przyczynia si do stabilizowania struktury
ze wzrostem dugoci acucha;
kocow grup funkcyjn, ktra moe peni rne funkcje; niewielka zmiana
w grupie kocowej moe spowodowa zmiany waciwoci fizycznych i chemicznych
warstwy; grupy kocowe nadaj szczeglne waciwoci powierzchni (hydrofilowe,
hydrofobowe); mog by rwnie wykorzystywane do zamocowania rnych
bioczsteczek lub nanostruktur za pomoc sabych oddziaywa lub wiza
kowalencyjnych (Labuda i wsp., 2010; Vericat i wsp., 2010).
34
Rysunek 11. Schemat fragmentu monowarstwy samoorganizujcej si na powierzchni
elektrody zotej.
Metoda tworzenia monowarstw samoorganizujcych si posiada nastpujce
zalety:
umoliwia zorientowane pooenie sondy DNA w stosunku do powierzchni
elektrody
daje moliwo regulacji gstoci rozmieszczenia sondy na powierzchni
elektrody zotej poprzez stosowanie rozcieczalnika np. 6-MCH (Mannelli i wsp., 2005;
Wong i wsp., 2005)
zapewnia elastyczno osadzonej sondy DNA
umoliwia tworzenie tzw. warstw mieszanych zawierajcych oprcz sondy,
np. alkilotiole eliminujce niespecyficzn adsorpcj bioczsteczek pochodzcych
z analizowanej prby na powierzchni elektrody
Technika ta ze wzgldu na opisane zalety, a take relatywnie prost procedur
przygotowania jest najszerzej stosowana do konstrukcji bioczujnikw opartych
o procesy hybrydyzacji (Drummond i wsp., 2003; Liu i wsp., 2005b; Aryaa i wsp.,
2009).
35
1.2.2.4 Powinowactwo awidyna/streptawidyna biotyna
Metoda osadzania oligonukleotydw wykorzystujca naturalne powinowactwo
awidyny lub streptawidyny do biotyny jest rwnie szeroko stosowana w konstrukcji
bioczujnikw DNA. Ni DNA modyfikuje si poprzez kowalencyjne przyczenie
biotyny do jednego z jej kocw, a na powierzchni elektrody osadza si awidyn bd
streptawid (Sassolas i wsp., 2008).
Procedury unieruchomienia biotynylowanego kwasu nukleinowego w przypadku
tej metody przebiega wedug dwch schematw:
elektroda/ awidyna lub streptawidyna/ biotynylowany oligonukleotyd,
elektroda/ biotyna/ awidyna lub streptawidyna / biotynylowany oligonukleotyd.
Kada czsteczka awidyny lub streptawidyny moe wiza si z czterema
biotynylowanymi czsteczkami ssDNA, wic je niekowalencyjnie. Taka strategia
zwiksza ilo DNA na powierzchni przetwornika, zmniejsza niespecyficzn adsorpcj
i poprawia stosunek sygnau do szumu.
Uzyskana t metod warstwa cechuje si du trwaoci i stabilnoci,
porwnywaln z immobilizacj kowalencyjn. Daje ona rwnie moliwo kontroli
gstoci upakowania sond na powierzchni elektrody (de-los-Santos-lvarez i wsp.,
2004; Paniel i wsp., 2013).
W Tabeli 1 dokonano podsumowania przedstawionych metod osadzania kwasw
nukleinowych na powierzchniach staych. Nie wszystkie z przedstawionych metod
speniaj podane wymagania. Chemisorpcja, a przede wszystkim wizanie
kowalencyjne, a take powinowactwo chemiczne s obiecujcymi metodami osadzania
sond DNA ze wzgldu na moliwo jej przyczenia do powierzchni elektrody
w jednym punkcie. Jednak proces wytworzenia wizania kowalencyjnego, jest do
zoony, wymaga modyfikacji odpowiednimi grupami funkcyjnymi powierzchni
elektrody, sondy DNA lub obu tych elementw. Zatem, proste i tanie procedury
unieruchamiania kwasw nukleinowych, takie jak adsorpcja czy unieruchamianie
w matrycy polimerowej mog by rwnie brane pod uwag. W przypadku adsorpcji
fizycznej ani powierzchnia elektrody, ani DNA nie wymagaj modyfikacji. Fakt ten
potwierdza, e stanowi ona najprostszy i najtaszy sposb unieruchomienia kwasw
nukleinowych. Aczkolwiek, zdolno oddziaywa sondy z analitami jest w tym
wypadku ograniczona. Powodem tego zjawiska jest brak kontroli orientacji sondy,
36
zwizany z jej ograniczon elastycznoci spowodowan przez wielopunktowe
unieruchomienie sondy. Desorpcja w tym wypadku jest rwnie trudna do uniknicia.
Tabela 1. Ocena poszczeglnych metod unieruchomienia kwasw nukleinowych. + saba,
++ rednia, +++ dobra (de-los-Santos-lvarez i wsp., 2004)
Metoda osadzania
DNA
Gsto
upakowania
i kontrola
orientacji
Stabilno Zdolno
wizania
Prostota
wykonania
Brak
niespecyficznej
adsorpcji
Koszt
Adsorpcja fizyczna + + + +++ + +++
Adsorpcja
elektrostatyczna ++ + ++ ++ + +++
Unieruchamianie
w matrycy + ++ + ++ +++ ++
Elektrostatyczne
unieruchamianie
w matrycy ++ ++ ++ ++ +++ ++
Powinowactwo +++ +++ +++ + +++ +
Wizanie
kowalencyjne +++ +++ +++ + +++ ++
Podsumowujc, procedura osadzania sond DNA na powierzchni elektrody ma
istotny wpyw na proces jej hybrydyzacji z komplementarnymi sekwencjami DNA czy
RNA obecnymi w roztworze badanej prby. Kada z przedstawianych wyej metod
posiada wady i zalety, dlatego w literaturze wci spotykane s metody doskonalenia
ich tak, aby mogy gwarantowa jeszcze lepsz selektywno, trwao i wysok
czuo bioczujnika.
1.2.3. Sposoby generowania sygnau w bioczujnikach elektrochemicznych opartych
o kwasy nukleinowe
W ostatnim trzydziestoleciu elektrochemiczne techniki detekcji i analizy DNA
zyskuj coraz wiksz popularno jako metody molekularnej diagnostyki
w medycynie, ochronie rodowiska, kryminalistyce, czy farmacji. Metody te s
relatywnie tanie, proste i mog by stosowane poza laboratorium.
37
Po przeprowadzeniu interakcji sondy DNA z badanym analitem DNA czy RNA,
ukad detekcyjny ma na celu dokonanie analizy sprawdzajcej wytworzenie si hybrydy
na powierzchni elektrody. Do technik wykrywajcych procesy hybrydyzacji nale
techniki bezodczynnikowe (z ang. reagent-less). Nie wymagaj one zastosowania
dodatkowych odczynnikw w celu wywoania sygnau analitycznego. Stosuje si
rwnie metody bezwskanikowe (z ang. label-free), w ktrych nie ma potrzeby
chemicznej modyfikacji sond DNA, analitw czy innych substancji oddziaujcych
z oligonukleotydami (Lucarelli i wsp., 2008).
Jednym ze sposobw wykrywania hybryd kwasw nukleinowych osadzonych
na powierzchniach staych s metody oparte o naturalne waciwoci elektroaktywne
kwasw nukleinowych, wykorzystujce wskaniki redoks-aktywne (wice si z DNA
kowalencyjnie lub niekowalencyjne), a take oparte na aktywnoci katalitycznej
wybranych enzymw. Przegld technik wykrywania procesw hybrydyzacji
stosowanych w elektrochemicznych bioczujnikach DNA przedstawiono w Tabeli 2 na
podstawie raportu technicznego sporzdzonego przez Labud i wsppracownikw
(Labuda i wsp., 2010).
Tabela 2. Metody detekcji wykorzystywane w bioczujnikach elektrochemicznych DNA
wedug IUPAC (Labuda i wsp., 2010).
Zasada
wykrywania Przykady
Metoda
bezwskanikowa
(label-free)
Metoda
bezodczynnikowa
(reagent-less)
Elektroaktywno
kwasw nukleinowych
Utlenienie guaniny na
elektrodach wglowych
Tak
Tak (moe by poczona
z mediatorami redoks)
Tensametryczna
odpowied DNA na
elektrodach rtciowych
Tak
Wskaniki redoks
Elektrostatyczne (aniony
lub kationy)
Nie Interkalatory, zwizki
czce si z rowkami
DNA
Wskaniki redoks
wice si
kowalencyjnie (znaczniki)
Zwizki
metaloorganiczne,
zwizki chelatowe metali,
ugrupowania organiczne,
nanoczsteczki
Nie
Tak (moe zosta
zastosowany jako
mediator redoks przy
uyciu rozpuszczalnego
depolaryzatora)
Enzymy poczone z
DNA Fosfatazy, peroksydazy Nie
38
Powszechnie stosuje si dwie strategie generowania elektrochemicznego sygnau
analitycznego przez bioczujniki oparte na procesach hybrydyzacji: metod bezporedni
i metod poredni (de-los-Santos-lvarez i wsp., 2004; Radecki i wsp., 2006; Labuda
i wsp., 2010). Charakterystyka powyszych metod zostaa przedstawiona
na Rysunku 12.
Rysunek 12. Strategia opracowana w celu wygenerowania sygnau elektrochemicznego
w bioczujnikach przeznaczonych do wykrywania kwasw nukleinowych (de-los-Santos-
lvarez i wsp., 2004).
39
Metody bezporednie wykrywajce procesy hybrydyzacji opieraj si
na elektroaktywnoci KN osadzonych na powierzchni elektrody. Jest to moliwe dziki
katalitycznemu utlenianiu zasad i cukrw budujcych kwasy nukleinowe. Wszystkie
zasady azotowe wchodzce w skad DNA posiadaj zdolno do elektrochemicznego
utleniania si na powierzchniach elektrod wglowych. Do celw analitycznych jednak
najczciej wykorzystuje si sygna pochodzcy od guaniny, ktra wykazuje
najsilniejsze waciwoci elektroaktywne na rnych elektrodach staych (Paleek
i Fojta, 2005). Metody oparte na utlenianiu zasad azotowych s bezwskanikowe,
szybkie i proste, co niewtpliwie jest zalet. Niestety utlenianie guaniny na elektrodach
staych wymaga wysokich dodatnich potencjaw (okoo 1 V wzgldem
chlorosrebrowej elektrody odniesienia), co wie si ze znacznym sygnaem ta
powodujcym obnienie granic wykrywalnoci. Powyszy sposb wykrywania
KN umoliwia analiz procesw hybrydyzacji bez koniecznoci modyfikacji nici
kwasw nukleinowych, co z pewnoci upraszcza sam konstrukcj bioczujnika, a take
obnia koszty z tym zwizane. Jednak tego typu ukady s jednorazowe, a sam sygna
jest do saby i zaley od obecnoci guaniny w sekwencji sondy unieruchomionej
na powierzchni elektrody, co jak mona przypuszcza wyklucza go z wielu zastosowa.
Wykorzystanie znacznikw redoks-aktywnych uniezaleniajcych otrzymywany sygna
prdowy od sekwencji DNA przy jednoczesnym zwikszeniu jego intensywnoci
stanowi w tym przypadku uyteczne rozwizanie.
Wykrywanie procesw hybrydyzacji zachodzcych na powierzchni elektrod moe
odbywa si nie tylko w oparciu o bezporedni elektrochemi KN. Porednie metody
wykrywania hybrydyzacji DNA opieraj si na:
1. obserwacji zmian waciwoci na granicy fazy elektroda/ roztwr
2. wykorzystaniu znacznikw specyficznie oddziaujcych z pojedynczymi lub
podwjnymi nimi DNA obecnymi w warstwie detekcyjnej bioczujnika.
Procedury nalece do pierwszej kategorii bazuj na badaniu zmian nastpujcych
parametrw wywoanych procesami hybrydyzacji:
zmian natenia prdu faradajowskiego (Malecka i wsp., 2012; 2014; 2015;
2016; Gao i wsp., 2016)
przewodnictwa jonowego (Hianik i wsp., 2001; Tam i wsp., 2009b;
Gu, 2014)
elektrochemicznych waciwoci polimerw przewodzcych (Galandov
i Labuda, 2009; Peng i wsp., 2009; Ates, 2013; Ramanavicius i wsp., 2012)
40
pojemnoci elektrycznej (Berney i wsp., 2000; Hong i wsp., 2004; Kang
i wsp., 2010; Tsai i wsp., 2011)
impedancji badanej granicy faz (Labuda i wsp., 2010; Malecka i wsp., 2013;
Jarocka i wsp., 2016)
Znacznie czciej procesy hybrydyzacji zachodzce w warstwie detekcyjnej
bioczujnika obserwuje si z zastosowaniem znacznikw elektroaktywnych
posiadajcych zdolno wizania si z kwasami nukleinowymi w sposb
niekowalencyjny. Niekowalencyjne znaczniki redoks stosuje si do rozrniania sondy
ssDNA (wskazujc, e hybrydyzacja nie miaa miejsca) od dupleksu (wskazujc proces
hybrydyzacji). Wskaniki te mog odpowiada na zmiany iloci DNA na powierzchni
elektrody (wskaniki elektrostatyczne) lub rozpoznawa struktur DNA (wizanie
w duych lub maych rowkach helisy, czy te interkalacja) (Labuda i wsp., 2010).
Metoda ta wykorzystuje rne powinowactwo znacznikw elektrochemicznych
do pojedynczych i podwjnych nici DNA (Paleek i Fojta, 2005). Biorc pod uwag
zasad dziaania znacznikw elektroaktywnych wi si one z DNA przez
(Leszczyski i Duski, 2006):
elektrostatyczne oddziaywania na zewntrz helisy DNA
interkalacj do wntrza helisy
wizania w duych lub maych rowkach helisy (obszarach, w ktrych
wystpuj potencjalne donory oraz akceptory wodoru w wizaniach
wodorowych),
wizania kowalencyjne,
Sposoby wizania czsteczek z DNA przedstawiono schematycznie na Rysunku 13.
41
Rysunek 13. Sposoby wizania czsteczek z DNA (Leszczyski i Duski, 2006).
Niespecyficzne oddziaywanie elektrostatyczne na zewntrz helisy polega
na przyciganiu czsteczek obdarzonych adunkiem dodatnim przez ujemnie
naadowane grupy fosforanowe stanowice element skadowy szkieletu DNA (Rauf
i wsp., 2005; Ferapontova i wsp., 2011). Wskaniki elektrostatyczne odpowiadaj
na rnice w gstoci adunku ujemnego pomidzy pojedyncz nici DNA a hybryd.
Proces hybrydyzacji zachodzcy pomidzy sond unieruchomion na powierzchni
elektrody a analitem DNA skutkuje zwikszeniem gstoci adunku ujemnego przy
powierzchni elektrody. Wskaniki redoks, takie jak np. anionowy kompleks
heksacyjanoelazianu (III/II) [Fe(CN)6]3-/4- (s odpychane od powierzchni
zmodyfikowanej sond DNA) lub kationowy kompleks heksaaminorutenu
[Ru(NH3)6]3+/2+ (s przycigane do ujemnie naadowanej hybrydy) stosuje si
do monitorowania zmian gstoci adunku ujemnego za pomoc impedancji lub technik
woltamperometrycznych (Labuda i wsp., 2010; Paleek i Bartoik, 2012).
Unieruchomienie kwasw nukleinowych na powierzchni elektrody nie powoduje
zahamowania oddziaywa elektrostatycznych z w/w znacznikami redoks-aktywnymi
(McEwen i wsp., 2009).
Elektrostatyczne przyciganie lub odpychanie ujemnie bd dodatnio
naadowanych znacznikw redoks-aktywnych obecnych w roztworze przez helis DNA
unieruchomion na powierzchni elektrody, wykorzystywane byo przez profesora
42
Umezaw w tworzeniu elektrochemicznych czujnikw jonokanaowych opartych
o DNA (Aoki i Umezawa, 2002; 2003). Dokadnie czujniki tego typu zostay omwione
w Rozdziale 3.1.
W porwnaniu z oddziaywaniami elektrostatycznymi wiksz specyficzno
w odrnianiu jednoniciowego DNA od hybrydy wykazuj zwizku interkalujce
(Richards i Rodger, 2007; Neto i Lapis, 2009; Greschner i wsp., 2013; Rescifina i wsp.,
2014). Charakteryzuj si one zazwyczaj struktur, w skad ktrej wchodzi ukad
aromatyczny o minimum 3-4 piercieniach. Dziki tej budowie interkalatory wnikaj
pomidzy pary paskich zasad azotowych w podwjnej nici DNA (najczciej s to pary
GC) (Reynisson i wsp., 2003; Li i wsp., 2007). Czsteczki interkalatorw gromadz
si na powierzchni elektrody zmodyfikowanej hybryd w znacznie wikszym stopniu
ni w przypadku pojedynczej nici DNA (Paleek i Fojta, 2005). W bioczujnikach
elektrochemicznych jako interkalatory stosuje si np. daunomycyn (Cai i wsp., 2003;
Yang i wsp., 2007; Zhu i wsp., 2012), bromek etydyny (Elahi i wsp., 2012; Balvedi
i wsp., 2014; Honorato Castro i wsp., 2014), oran akrydyny (Siddiquee i wsp., 2011),
bkit metylenowy (Zhang i wsp., 2009; Radhakrishnan i wsp., 2013; Tavallaie i wsp.,
2014; Lin i wsp., 2015), czy proflawin (Gbala i wsp., 2009; 2010). Wymienione
powyej zwizki wykazuj wiksze powinowactwo wzgldem hybrydy ni pojedynczej
nici DNA.
Jednak najbardziej specyficznie wykrywaj helis DNA zwizki wice si z ni
w tzw. maych rowkach, typowych jedynie dla podwjnych nici DNA (McEwen i wsp.,
2009). Ten sposb oddziaywania substancji z DNA, w przeciwiestwie do interkalacji,
nie powoduje zmian w konformacji DNA. Bazuje on na mechanizmie podobnym
do modelu klucza i zamka obecnego w wizaniach pomidzy ligandem
a makroczsteczk. Zwizki wice si w mniejszym rowku DNA zbudowane
s z kilku pojedynczych piercieni zwykle aromatycznych typu pirol, furan czy benzen
poczonych midzy sob krtkim cznikiem. Substancjami wykazujcymi tego typu
oddziaywania z DNA s midzy innymi: berenil (Zhou i wsp., 2014), distamycyna
(Khedkar i wsp., 2007), Hoechst 33342 (Zhou i wsp., 2012), Hoechst 33258 (Safavieh
i wsp., 2012), netropsyna (Andac i wsp., 2011), czy pentamidyna (Szpakowska i wsp.,
2006).
Oprcz wizania w maym rowku, potencjalnym miejscem oddziaywa rnych
substancji w strukturze helisy DNA jest rwnie duy rowek. Tego typu wizanie
wystpuje rzadziej, gdy obszerna przestrze duego rowka uniemoliwia tworzenie
43
wielu pocze niekowalencyjnych przez mae czsteczki, jednoczenie udostpniajc
go dla wikszych moleku, np. biaek (Leszczyski i Duski, 2006). Jeli ju dana
substancja zwie si z DNA w duym rowku, czsto dochodzi do utworzenia formy
potrjnej helisy (Erdem i Ozsoz, 2002). Omawiany typ wizania dotyczy gwnie
zwizkw, w ktrych oprcz fragmentu struktury wicego si (przewanie sabo)
w duym rowku DNA, wystpuj inne struktury, pozwalajce na silne czenie
czsteczek z DNA (np. na drodze interkalacji lub wizania kowalencyjnego).
Wystpowanie dodatkowych grup funkcyjnych jest czsto kluczowe, gdy
oddziaywania wystpujce w duym rowku s zbyt sabe, by utrzyma tam ligand
(Leszczyski i Duski, 2006). Substancjami wicymi si z DNA w duym rowku
s na przykad: dimeryczne kaliksareny (Hu i wsp., 2012), norfloksacyna (Erdem
i Ozsoz, 2002), kompleksy chromu III i zasady Shiffa np.: [Cr(1,2-
bis(salicylidenoamino)etano(H2O)2]+ (Vijayalakshmi i wsp., 2000).
Wikszo wykorzystywanych zwizkw oddziaujcych z rowkami
dwuniciowych KN wykazywao wiksze powinowactwo do fragmentw zawierajcych
pary zasad A i T (Chaires, 1998; Haq, 2002).
Znaczniki czce si z DNA w sposb kowalencyjny s narzdziem czsto
stosowanym w bioczujnikach przeznaczonych do wykrywania specyficznych sekwencji
oligonukleotydw. Znakowanie polega na modyfikacji chemicznej sondy bd analitu
za pomoc zwizkw elektroaktywnych. Wprowadzenie do DNA kowalencyjnie
przymocowanego znacznika elektroaktywnego znacznie poprawia specyficzno
zwaszcza procesw hybrydyzacji, poniewa znakowane DNA mona atwo odrni
od nieznakowanego z powodu rnic potencjaw redoks skadnikw DNA
i znacznikw (na przykad znakowany analit DNA z nieznakowan sond, znakowana
sonda z nieznakowanym analitem, lub znakowany nukleotyd wprowadzony
w okrelonym pooeniu do innego nukleotydu w czsteczce DNA). Ponadto,
zastosowanie rnych znacznikw dla rnych sekwencji nukleotydowych pozwala na
analiz wielu analitw rwnolegle (Labuda i wsp., 2010). Do znacznikw
elektroaktywnych kowalencyjnie przyczajcych si do kwasw nukleinowych nale
m.in.: kompleksy tetratlenku osmu, pochodne ferrocenu, kompleksy rutenu,
antrachinon, grupy aminofenylowe i nitrofenylowe, wielocienne klastry boru,
znaczniki enzymatyczne (peroksydaza, alkaliczna fosfataza), nanoczsteczki/kropki
kwantowe, a take nanorurki wglowe (Paleek i Bartoik, 2012).
44
2. Metody wykrywania wirusw ptasiej grypy
Ptasi gryp wywouj wirusy grypy typu A nalece do rodziny
Orthomyxoviridae. Typ A spotyka si u rnorodnych gatunkw ptakw i ssakw.
Podzia wirusw grypy typu A jest oparty na waciwociach antygenowych zewntrz
powierzchniowych glikoprotein hemaglutyniny (HA) oraz neuraminidazy (NA),
podanych jako podtyp HxNy. Dotychczas zidentyfikowano 16 podtypw HA (H1-H16)
i 9 podtypw NA (N1-N9), co daje cznie 144 moliwe kombinacje segmentw
genowych i powoduje istnienie ogromnej rnorodnoci wirusw typu A, chocia nie
wszystkie kombinacje HxNy wystpuj naturalnie. Genom wirusa typu A zawiera
jednoniciowy kwas RNA o ujemnej polarnoci, podzielony na osiem segmentw (Lee
i Saif, 2009).
Wirus ptasiej grypy, podobnie jak inne szczepy wirusa grypy, rozprzestrzenia si
w organizmie ywiciela poprzez dwa biaka hemaglutynin (HA) i neuraminidaz
(NA). Umoliwiaj one wirusowi H5N1 atakowanie zarwno ptakw, jak i ludzi.
Symbol H5N1 oznacza, e na powierzchni wirusa ptasiej grypy znajduj si biaka:
hemaglutynina typu pitego i neuraminidaza typu pierwszego (Lee i Saif, 2009). HA
poredniczy w czeniu si wirusa z receptorami komrkowymi i w ten sposb pozwala
wirusowi wnika do komrek. Natomiast NA, znajdujca si w mniejszych ilociach
w otoczce wirusa, uwalnia nowopowstae czstki wirusa z zakaonej komrki w ten
sposb mog one infekowa kolejne komrki. Niewielkie zmiany tych biaek
umoliwiaj wirusowi zaraanie nowych gatunkw ywicieli. Zmiany mog powsta
wskutek mutacji lub podczas wymiany genw, gdy dwa rne typy wirusa zara
t sam komrk (Kukol i wsp., 2008).
Wirusy ptasiej grypy (AIV), w zalenoci od ich zjadliwoci, podzielono na dwie
formy: wysoko- (HPAI) i niskopatogenn (LPAI). Znane s dwa szczepy o wysokiej
patogenicznoci H5 i H7, ktre mog przyczynia si do duej miertelnoci wrd
drobiu. Szczepy te zazwyczaj jednak nie pojawiaj si wrd dziko yjcych ptakw.
Wystpuj one u drobiu przetrzymywanego w ogromnych, nienaturalnych
zagszczeniach. Dzikie ptaki mog zarazi si tymi szczepami przez bezporedni
kontakt z chorym drobiem. Zakaenia drobiu wysoce zjadliw ptasi gryp mog
spowodowa bardzo wysok miertelno zbliajc si nawet do 100%, podczas gdy
zakaenia niskimi szczepami patogennymi s agodniejsze. Spord wszystkich
45
podtypw ptasiej grypy wirus H5N1 ma szczeglne znaczenie z wielu wzgldw. H5N1
mutuje szybko i posiada skonno przyjmowania genw od wirusw zaraajcych inne
gatunki zwierzt. Ptaki, ktre przeyy zakaenie, wydzielaj wirusa w odchodach
i linie przez co najmniej 10 dni, przyczyniajc si do jego szybkiego
rozprzestrzeniania. W 16 krajach w okresie od 2003 roku do czerwca 2016 roku
zanotowano 851 przypadkw ludzkiego zakaenia ptasi gryp, w tym 450 zgonw
(WHO, 2016).
Pierwszy przypadek zakaenia czowieka wirusem H5N1 HPAI mia miejsce
w Hong Kongu w 1997 roku. W Polsce natomiast odnotowano dwie epidemie ptasiej
grypy (AI) w cigu ostatnich dwch dekad, ktre miay miejsce w roku 2006 i 2007.
Wiosn 2006 roku wykryto 64 przypadki wirusa H5N1, gwnie
w abdziach niemych. Z kolei w grudniu 2007 roku, 9 przypadkw HPAI H5N1
potwierdzono u drobiu handlowego i 1 u dzikich ptakw trzymanych w niewoli
(mietanka i Minta, 2014). Rozprzestrzenianie si zakaenia wrd ptakw zwiksza
moliwo bezporedniego zaraenia ludzi. Z biegiem czasu, ze wzrostem liczby
zaraonych ludzi, wzrasta rwnie prawdopodobiestwo, e w organizmie osoby,
jednoczenie zaraonej szczepami sezonowej i ptasiej grypy, powstanie nowy podtyp
wirusa, zawierajcy charakterystyczne dla ludzkiego wirusa geny, ktre zapewni mu
atwe przenoszenie midzy ludmi. Takie zdarzenie mogoby doprowadzi do pandemii
grypy (Charlton i wsp., 2009; Lin i wsp., 2009; Wang i wsp., 2013). Ze wzgldu
na fakt, e objawy ptasiej grypy nie s wystarczajco charakterystyczne, aby ustali
diagnoz wycznie na podstawie obrazu klinicznego wane jest, aby korzysta
z niezawodnych narzdzi diagnostycznych. Szybka identyfikacja wirusa ma istotne
znaczenie kliniczne, ekonomiczne i epidemiologiczne (Diouani i wsp., 2008).
Aktualnie rozwijane s rnorodne podejcia do wykrywania wirusw ptasiej
grypy. Cz z nich skupia si na ulepszaniu ju istniejcych metod, inne opieraj si
na cakiem nowych pomysach. Natomiast techniki rutynowej diagnostyki bazuj
gwnie na dobrze sprawdzonych metodach takich jak test ELISA, PCR czy
amplifikacja sekwencji kwasw nukleinowych (NASBA). Obecnie do wykrywania
wirusw ptasiej grypy stosuje si metody etiologiczne, serologiczne, a take
molekularne (Ping i wsp., 2015).
46
2.1. Metody etiologiczne
Do metod etiologicznych stosowanych do wykrywania wirusa ptasiej grypy
naley izolacja wirusa poprzez jego hodowl wirusa w zarodkach kurzych i dalsz
identyfikacj jego podtypw. Jest ona uwaana za zoty standard, poniewa jest
to metoda czua i dokadna, generujca wysokie miana wszystkich rodzajw wirusw
ptasiej grypy (Newton i wsp., 2000). Jednak hodowla, a nastpnie identyfikacja
wyizolowanego wirusa jest kosztowna, wymaga duego nakadu pracy
i znacznych iloci materiau biologicznego. Czas oczekiwania na wynik jest czsto zbyt
dugi (nawet do 2 tygodni), co znacznie ogranicza moliwo jej wykorzystania
w praktyce klinicznej. Ponadto, ze wzgldu na zakano i wysok zjadliwo wirusa,
moe zagraa bezpieczestwu rodowiska i zdrowia publicznego. W zwizku z tym
izolacja wirusa nie nadaje si do szybkiego wykrywania i rutynowej diagnozy. Moe
by stosowana w celu uzyskania ywych izolatw wirusa z przeznaczeniem do dalszej
szczegowej analizy laboratoryjnej. Inne techniki wykrywania, takie jak
immunodyfuzja na elu agarowym (AGID), rne testy immunologiczne
(immunofluorescencyjne, immunoenzymatyczne, np. ELISA czy immuno-
chromatograficzne) i reakcja polimerazy acuchowej w czasie rzeczywistym (RT-PCR)
mog potwierdzi i sklasyfikowa izolaty wirusa (Ping i wsp., 2015).
2.2. Metody serologiczne
Przeciwciaa skierowane przeciwko HA i NA, nukleoproteiny i biako matrycowe,
wytwarzane po wystpieniu ptasiej grypy u drobiu, mona wykrywa za pomoc metod
serologicznych, takich jak: test zahamowania hemaglutynacji (HIT), test zahamowania
neuraminidazy (NIT), ELISA, AGID, odczyn wizania dopeniacza (OWD), oraz test
neutralizacji (NT) (Cox, 1999; El Zowalaty i wsp., 2013). Ze wzgldu na ich wysok
specyficzno, testy HIT i NIT s najczciej stosowane w identyfikacji podtypu wirusa
do pomiaru poziomw odpowiednich przeciwcia dla HA i NA w prbkach surowicy
(Prince i Leber, 2003). Zalet testu HIT jest niska cena, jednake, jest uwaany
za trudne narzdzie diagnostyczne, poniewa jest pracochonny i wymaga dwch
prbek surowicy pobranych w tym samym czasie. To samo dotyczy testu NIT. Jest on
47
rwnie do skomplikowan i drog metod, a wynik nie zawsze uzyskuje si w cigu
jednego dnia roboczego. Testy te s trudne do wczenia do zautomatyzowanych
procedur i wymagaj cigego rda odpowiednich czerwonych krwinek (Pikua i wsp.,
2011). Alternatywnie, testy ELISA stosowane s do wykrywania przeciwcia
specyficznych dla wirusa grypy. Do pomiaru specyficznych przeciwcia wirusa grypy
w surowicy krwi s bardziej czue ni testy HIT czy OWD (Voeten i wsp., 1998).
Test AGID suy rwnie do diagnostyki serologicznej wirusw ptasiej grypy
(Beard, 1970; Jenson, 2014). Charakteryzuje si wieloma zaletami, uywane do badania
odczynniki (antygeny i surowica kontrolna) s komercyjnie dostpne na rynku. Jest tani,
atwy w wykonaniu i nie wymaga specjalistycznej aparatury pomiarowej. Jednak
metod t cechuje do niska czuo w porwnaniu z testami ELISA i HIT. Ponadto
dodatni wynik tego testu dowodzi jedynie zakaenia wirusem grypy typu A, nie
wskazuje na podtyp hemaglutyniny. Konieczne s wic w takim przypadku dodatkowe
badania w celu potwierdzenia bd wykluczenia najgroniejszych podtypw H5 i H7
wirusa AI (Pikua i wsp., 2011; Jenson, 2014).
Testy ELISA s czsto wykorzystywanym narzdziem w wykrywaniu wirusw
i przeciwcia przeciwko wirusowi AI. S one komercyjnie dostpne i mona
je zautomatyzowa (Ping i wsp., 2015). S proste w wykonaniu i interpretacji,
a w zwizku z tym mniej zalene od umiejtnoci i dowiadczenia wykonujcej
je osoby. Testy ELISA charakteryzuj si umiarkowanymi kosztami i nadaj si
do masowych bada przesiewowych zakae wirusowych gryp typu A (Mendoza
i wsp., 1999). Tak wic, ta metoda jest odpowiednia do kontroli wirusw ptasiej grypy
na du skal np. na fermach drobiu. Jednak i ona posiada wady. Jedn z nich jest
stosunkowo niska czuo. W przypadku wykrywania wirusa grypy typu A ELISA
w porwnaniu do metod amplifikacji KN takich jak np. PCR charakteryzuje si
czuoci nisz nawet 6-7 rzdw wielkoci (Steininger i wsp., 2002). Natomiast
uycie metod elektrochemicznych pozwala na uzyskanie stosunkowo wysokich czuoci
wynoszcych 10 ng biaka/mL. Czuo taka wystarcza do wykrycia przeciwcia
przeciwko ptasiej grypie (Ohtsuka i wsp., 2008), jednak nadal moe by
niewystarczajca w przypadku wykrywania wirusa. W oparciu o doniesienia literatury
naukowej do wykrywania przeciwcia skierowanych przeciwko wirusowi ptasiej grypy
stosuje si rne testy ELISA np. p-ELISA (peptydowa) czy "Sandwich" ELISA test
podwjnego wizania (Du i wsp., 2009; Luo i wsp., 2009; Moreno i wsp., 2009;
Velumani i wsp., 2011; Zhu i wsp., 2014).
48
Porwnujc metody serologiczne z metodami izolacji w hodowli, mona
stwierdzi, e analizy serologiczne s znacznie szybsze i mniej kosztowne, jednak
czsto cechuje je mniejsza czuo i specyficzno (Pikua i wsp., 2011).
2.3. Metody molekularne
W ostatnich latach metody molekularne wykorzystujce amplifikacj
KN odgrywaj coraz wiksz rol w wykrywaniu lub diagnostyce wirusw ptasiej
grypy. PCR jest aktualnie jedn z najczciej wykorzystywanych do tego celu metod.
Szczeglnie warta polecenia jest ona w wykrywaniu maych iloci wirusa. Ze wzgldu
na fakt, e wirusy ptasiej grypy nale do grupy wirusw RNA, w przypadku
identyfikacji tego wirusa technika PCR musi zosta poprzedzona przepisaniem
informacji genetycznej na sekwencj DNA. W zwizku z tym metod PCR modyfikuje
si dodajc etap odwrotnej transkrypcji RT-PCR (Stefaska i wsp., 2012), aby
bezporednio wykrywa wirusa.
Obecnie klasyczny PCR jest coraz czciej wypierany przez PCR czasu
rzeczywistego (RRT-PCR), czyli PCR z analiz przyrostu produktu w czasie
rzeczywistym. Koszty pojedynczej analizy przewyszaj znacznie koszty
standardowego PCR. Aczkolwiek RRT-PCR charakteryzuje si znacznie wiksz
specyficznoci, czuoci detekcji oraz skrconym czasem analizy w porwnaniu
do hodowli wirusa. Jest on preferowany take ze wzgldu na znaczn automatyzacj
techniki. Jednak podstawow zalet tej metody jest jej ilociowy charakter,
w przeciwiestwie do klasycznej metody PCR zapewniajcej jedynie wynik jakociowy
(plus/minus). Metoda ta ma rwnie sabe strony. Nale do nich m.in., pracochonno,
do trudna optymalizacja metody, stosunkowo wysokie (lecz systematycznie
spadajce) koszty zakupu aparatury, potrzeba posiadania dobrze wyposaonego
laboratorium oraz zatrudnienia wyszkolonego personelu. Mimo ogranicze metoda
ta jest aktualnie jedn z najczciej stosowanych metod szybkiego wykrywania wirusw
ptasiej grypy (Stefaska i wsp., 2012; Shojaei i wsp., 2014).
W celu usprawnienia i obnienia kosztw badania coraz czciej wykorzystuje si
tzw. multipleks PCR (mRT-PCR) przeznaczony do identyfikacji wicej ni jednego
wirusa w pojedynczej reakcji. Najwiksze zalety reakcji multipleksowych to przede
49
wszystkim mniejsze zuycie odczynnikw (a tym samym niszy koszt analizy) oraz
oszczdno czasu, szczeglnie w przypadku koniecznoci badania duej liczby prbek
(Gavin i wsp., 2003; Stefaska i wsp., 2012).
Do wykrywania wirusw ptasiej grypy stosuje si rwnie metod opart
na amplifikacji sekwencji kwasw nukleinowych (NASBA). Ta metoda pozwala
na bardzo wydajn amplifikacj RNA, pozwalajc powieli materia genetyczny
w prbce nawet 109 - krotnie w czasie zaledwie 2 godzin (Compton, 1991).
Eksperymenty NASBA nie wymagaj uycia specjalistycznego sprztu, ca
reakcj mona przeprowadzi w ani wodnej w jednej temperaturze, niezalenie
od laboratorium czy wykwalifikowanego personelu. NASBA dostarcza dokadnych,
spjnych i wiarygodnych wynikw o wysokiej czuoci. Moe dorwna lub nawet
przewyszy PCR czasu rzeczywistego pod wzgldem czuoci. Co wicej, ze wzgldu
na izotermiczny charakter metody NASBA mog by atwo standaryzowane (Lau
i wsp., 2006).
Najbardziej powszechnie do diagnozowania wirusw ptasiej grypy stosuje si
RT-PCR (Starick i wsp., 2000; Lee i wsp., 2001; Munch i wsp., 2001), RRT-PCR
(Spackman i wsp., 2002; Dovas i wsp., 2010; Zeynalova i wsp., 2015), mRT-PCR (Xie
i wsp., 2006; He i wsp., 2009; Ma i wsp., 2015), a take NASBA (Chantratita i wsp.,
2008; Moore i wsp., 2008; 2010). Wszystkie wyej wymienione metody s zalecane
przez WHO i OIE do wykrywania, diagnozowania i nadzoru wirusw ptasiej grypy
u ludzi, drobiu i dzikiego ptactwa.
2.4. Bioczujniki przeznaczone do wykrywania wirusw ptasiej grypy
Klasyczne metody diagnostyczne z racji swojej pracochonnoci
i czasochonnoci s coraz czciej zastpowane nowoczesnymi metodami, ktre
oferuj znaczce skrcenie czasu diagnozy, zwikszenie czuoci i znacznie prostsze
procedury wykonywania bada.
Wrd sposobw wykrywania wirusw ptasiej grypy rozwijanych w ostatnich
latach znajduj si bioczujniki. Najbardziej popularne, ze wzgldu na nisk cen
i wysok czuo, stay si bioczujniki elektrochemiczne. Metody opierajce si
50
na pomiarze sygnau elektrycznego maj znacznie wiksze moliwoci miniaturyzacji
ukadu pomiarowego.
Parametry, takie jak pojemno (Guiducci i wsp., 2004), natenie prdu czy oporno
(Liu i wsp., 2012) mog si zmienia w wyniku rozpoznania sekwencji
komplementarnej KN (genoczujniki) czy antygenu (immunoczujniki) w badanej prbce.
Immunoczujniki s to bioczujniki, ktre zawieraj w warstwie analitycznie
aktywnej lub wykrywaj przeciwciaa (lub ich fragmenty). Wykorzystuj one zdolno
przeciwcia (bd ich fragmentw) do rozpoznania waciwych sobie antygenw nawet
w bardzo zoonych matrycach. W wyniku takiego rozpoznania powstaj kompleksy
immunologiczne, ktre wpywaj na waciwoci powierzchni zmodyfikowanych
elektrod (Luppa i wsp., 2001). W ostatnich latach w wielu orodkach naukowych
na caym wiecie prowadzone s intensywne badania nad zastosowaniem
immunoczujnikw do wykrywania wirusw ptasiej grypy. Przykadowe
elektrochemiczne immunoczujniki zestawiono w Tabeli 3. W zalenoci od konstrukcji,
rodzaju badanej substancji i matrycy mog one osiga czuo wahajc si
w granicach od 0.43 pg/mL do kilkunastu tysicy 104 pg/mL.
Tabela 3. Przykadowe elektrochemiczne immunoczujniki przedstawione w literaturze
naukowej przeznaczone do wykrywania AIV.
Modyfikacja
elektrod
Technika
pomiarowa Analit
Granica
wykrywalnoci
[pg/mL]
Referencje
Au/16-MHA/Ab EIS H7N1 5.0 Diouani i wsp.,
2008
Au/OT+BDDT/NV/Ab EIS AIV 8 000 Hassen i wsp.,
2011
Au/Con A/HRP/BSA DPV H9N2 1 000 Zhou i wsp.,
2013
Au/OT/OGaL/BSA EIS H1N1 10 000 Wicklein i wsp.,
2013
Au/HDT/AuC/Fab/BSA EIS His6-
Qinghai 2.2
Jarocka i wsp.,
2014
Au/MCB+DPM/
Cu(II)/HA/BSA EIS
anty-
HA 2.4
Jarocka i wsp.,
2015
GCE/AuPd/Ab/BSA DPV wirus
grypy 0.43
Yang i wsp.,
2015
GCE/EDA/AG/Ab/BSA LSV H7N9 6.8 Wu i wsp.,
2015
Au/TBBT/AuC/scFv/BSA EIS His6-
Qinghai 0.6
Jarocka i wsp.,
2016
Skrty: Au elektroda zota; Ab przeciwciao; 16-MHA kwas 16-
merkaptoheksadekanowy; OT oktanotiol; BDDT biotynylowany dodekanotiol; NV
neutrawidyna; Con A konkanawalina A; HRP peroksydaza chrzanowa; BSA surowicza
albumina bydlca; DPV woltamperometria pulsowa rnicowa; Fab fragmenty przeciwcia
wicych; GCE elektroda z wgla szklistego; SA kwas sialowy; OGal oktylo-
galaktozyd; AuPd nanoczsteczki zota i palladu; AuC zoto koloidalne; EDA
etylenodiamina; AG aldehyd glutarowy, LSV woltamperometria liniowa, TBBT 4,4-
tiobisbenzenotiol, scFV pojedynczy acuch zmiennego fragmentu przeciwcia, HDT 1,6-
heksanoditiol, His6-Qinghai histagowane odmiany (warianty) rekombinowanej
hemaglutyniny, MCB merkaptobutanol, DPM dipirometen, HA hemaglutynina
Genoczujniki zawieraj w warstwie analitycznie aktywnej sondy DNA
pozwalajce na wykrywanie specyficznych fragmentw kwasw nukleinowych. Istot
dziaania genoczujnikw, bdcych tematem tej rozprawy, jest oddziaywanie sekwencji
DNA lub DNA/RNA midzy sob, czyli reakcja hybrydyzacji. Jest to zjawisko
spontanicznego parowania si zasad pochodzcych z rnych nici kwasw
nukleinowych. Moe zachodzi pomidzy dwiema czsteczkami DNA, RNA lub DNA
i RNA, o cakowitej lub czciowej komplementarnoci. W literaturze naukowej mona
spotka bardzo zrnicowane przykady genoczujnikw przeznaczonych
do wykrywania specyficznych sekwencji DNA wirusa ptasiej grypy typu H5N1.
52
Przykady przedstawiono w Tabeli 10. Dokadniej temat ten zostanie omwiony
w dalszej czci rozprawy.
Za pomoc genoczujnikw mona wykrywa wirusy bardziej specyficznie
i z lepsz czuoci ni za pomoc immunoczujnikw, ktre z kolei s szybsze i bardziej
niezawodne (Qasim i wsp., 2014).
W literaturze naukowej przedstawione s rwnie doniesienia opisujce
zastosowanie optycznych (Bai i wsp., 2012; Suenaga i wsp., 2012; Wang i wsp., 2013;
Diltemiz i wsp., 2013) i masowych (Br