UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA

DIPLOMSKO DELO

JANJA LIPUŠČEK

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA

Študijski program: Kemija in biologija

Antioksidanti v kozmetičnih izdelkih – v kremah

Antioxidants in cosmetics products – in facial creams

DIPLOMSKO DELO

Mentor: izr. prof. dr. Vesna Ferk Savec

Avtor: Janja Lipušček

Somentor: doc. dr. Borut Poljšak

Ljubljana 2013

6

IZJAVA O AVTORSTVU

Izjavljam, da sem avtorica predloţenega dela.

Janja Lipušĉek

VII

ZAHVALA

Zahvaljujem se vsem, ki so mi pomagali pri nastanku diplomskega dela.

Lepo se zahvaljujem mentorici izr. prof. dr. Vesni Ferk Savec (UL,

Naravoslovnotehniška fakulteta) in somentorju doc. dr. Borutu Poljšaku (UL,

Zdravstvena fakulteta), ter laborantki Suzani Košenina, dipl. ing. kem. tehnolog.

(UL, Zdravstvena fakulteta) , za pomoĉ, nasvete in vzpodbudo ter laborantki Vidi

Mesec (UL, Naravoslovnotehniška fakulteta).

Za lektorstvo se zahvaljujem dipl. slovenistki in komparativistki Špeli Mrak.

Posebno se zahvaljujem fantu Roku Bukovcu ter študijskemu kolegu Mihi

Slapniĉarju, ki sta me ves ta ĉas podpirala in stala ob strani.

Hvala tudi mojim bliţnjim za vso pomoĉ in podporo.

Janja Lipušĉek

VIII

POVZETEK

Kreme so kozmetiĉni izdelki, ki jih vsakodnevno uporabljamo, da koţo oskrbimo s

potrebnimi snovmi, da poskrbimo za njen ĉist, gladek in elastiĉen videz, da jo zašĉitimo

pred zunanjimi škodljivimi vplivi ter poslediĉno obvarujemo pred procesom staranja.

Farmacevtski in kozmetiĉni lobiji nas skušajo ob podpori marketinga prepriĉati k

uporabi mnoţice kozmetiĉnih izdelkov, ki naj bi bili najboljši za nego naše koţe zaradi

vsebnosti specifiĉnih snovi npr. hialuronske kisline, kolagena, liposomov,

antioksidantov, itd. Kozmetiĉna industrija nenehno raziskuje in odkriva nove uĉinkovite

formule, ki prinašajo uporabnikom "ĉudeţne" rezultate, velikokrat pa se zdi, da je

navajanje vsebnosti izbranih sestavin predvsem marketinško orodje za zvišanje prodaje

izdelkov. Tako se poraja vprašanje, ali so izdelki res tako uĉinkoviti, kot obljublja

marketing? Ali obstajajo razlike v sestavinah in po vsebnosti antioksidantov med tipi

krem glede na namen?

Na omenjena vprašanja, povezana z vsebnostjo antioksidantov v kremah, sem

skušala odgovoriti v prvem delu diplomske naloge, kjer sem eksperimentalno doloĉala

celokupno vsebnost antioksidantov v kozmetiĉnih izdelkih – v kremah razliĉnih tipov

ter kritiĉno primerjala in ovrednotila rezultate glede na zastavljene hipoteze. Za namen

eksperimentalnega dela s kozmetiĉnimi izdelki sem prilagodila in optimizirala v

literaturi opisano metodo za spektrofotometriĉno doloĉanje antioksidantov, ki je bila

opisana predvsem za uporabo na primerih prehranskih izdelkov.

Na primerih krem za obraz, ki smo jih vkljuĉili v raziskavo, smo ugotovili, da

marketinško oglaševanje pogosto ni odraz rezultatov eksperimentalno doloĉenih

vsebnosti antioksidantov. Tudi cena ni povezana z vsebnostjo antioksidativnih

uĉinkovin proizvoda. Pokazalo se je, da je visoka vsebnost antioksidantov znaĉilna za

doloĉene brande, pri katerih imajo razliĉne vrste krem visok antioksidativen potencial.

Raziskavo bi lahko v nadaljevanju razširili z veĉjim vzorcem krem, z uporabo razliĉnih

vrst ekstrakcij, širšim naborom ekstrakcijskih topili ter z vzporednim merjenjem

celokupne antioksidativne aktivnosti z razliĉnimi metodami (npr. cikliĉna voltametrija,

ORAC,..).

Drugi del del diplomske naloge predstavlja prenos ideje v šolsko prakso, pri ĉemer

sem zasnovala dvodnevni naravoslovni dan, v okviru katerega se bodo dijaki seznanili s

pomenom antioksidantov, predvsem v kozmetiki in hrani.

IX

Ključne besede: kozmetiĉni izdelki, kreme, mazila, prosti radikali, antioksidanti,

spektrofotometriĉno merjenje, antioksidativna aktivnost, vitamin C, jodometriĉna

titracija

X

SUMMARY

Creams are cosmetic products, used every day to provide the skin with necessary

substances, to take care of its clean, smooth aspect and elasticity, to protect it from

external damaging impacts and as consequence, prevent from aging process.

Pharmaceutical and cosmetic lobbies and their marketing campaigns, are targeted at

making us use myriad of cosmetic products which should be the most appropriate for

our skin care on base of specific ingredients, eg. hyaluronic acid, collagen, liposomes,

antioxidants etc.

Cosmetic industry is continually researching and discovering new successful formulas,

which bring “miraculous” results to its users, even though it seems that stating certain

substances is predominately a simple marketing tool for increasing sales of specific

product. Therefore the question of supposed effect of the products arises – are they

really as effective as they are supposed to be? Are there differences among components

and regarding antioxidant content among the cream types and purposes?

I argued about above stated questions, regarding presence of antioxidants in creams, in

the first part of the thesis, where I used a method of experiment to determine the entire

content of antioxidants in cosmetic products – in creams of different types and after

that, critically compared and evaluated the results regarding initial hypothesis. For the

purpose of experimental work with cosmetic products I adjusted and optimized the

method for spectrophotometric determination of antioxidants, which was described

predominately for use on nutritional products.

On base of examples of facial creams, involved in the research, we conducted that

advertising is often not based on a content of antioxidants, which would be determined

by an experiment. The price is not correlated with content of antioxidant substances of a

product. The results revealed that high antioxidant content is characteristic for specific

brands, where different cream types feature a high antioxidant potential. If continued,

the research could be broadened by larger sample of creams, use of different types of

extraction, larger number of extraction solvents and by parallel measuring of entire

antioxidant activity by different methods (cyclic voltammetry, ORAC, ...).

Second part of the thesis is introducing the possible implementation of presented idea in

the schools in the form of two day seminar, where the students can learn about the

meaning of antioxidants, mostly in cosmetics and food.

XI

Keywords: cosmetic products, creams, lotions, free radicals, antioxidants,

spectrophotometric determination, antioxidant activity, vitamin C, iodometric titration

XII

KAZALO

1 UVOD ................................................................................................................... 1 1.1 OPREDELITEV PODROČJA IN NAMEN DELA ................................ 1 1.2 CILJI IN HIPOTEZE NALOGE .............................................................. 2

2 TEORETIČNI DEL ............................................................................................ 3 2.1 STARANJE KOŢE ..................................................................................... 3 2.2 FAKTORJI STARANJA KOŢE ............................................................... 4

2.2.1 Endogeni faktorji staranja ......................................................................... 4 2.2.2 Eksogeni faktorji staranja ......................................................................... 5

2.3 ANTIOKSIDANTI ...................................................................................... 6 2.3.1 Antioksidanti v kozmetiki ......................................................................... 8

2.4 KREME, MAZILA IN LOSJONI ........................................................... 16

2.4.1 Sestavine v kremah za obraz ................................................................... 17 2.4.2 Nevarnost kozmetike .............................................................................. 19

2.5 METODOLOGIJA MERJENJA ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI V KOZMETIKI .................................................................................................... 21

3 EKSPERIMENTALNI DEL ............................................................................ 28 3.1 REAGENTI IN MATERIALI ................................................................. 28

3.2 METODA DELA ...................................................................................... 29 3.2.1 Priprava raztopin ..................................................................................... 29 3.2.2 Priprava umeritvenih krivulj ................................................................... 31

3.2.3 Analizni postopki .................................................................................... 31 3.2.4 Statistiĉna obdelava podatkov ................................................................ 34

3.3 REZULTATI Z DISKUSIJO ................................................................... 34 3.3.1 Vrednotenje veljavnosti zastavljenih hipotez ......................................... 34 3.3.2 Omejitve in predlogi za izboljšavo in nadgradnjo raziskave .................. 40

4 PRENOS V ŠOLSKO PRAKSO ..................................................................... 41

5 ZAKLJUČEK .................................................................................................... 68 6 LITERATURA .................................................................................................. 70

XIII

OKRAJŠAVE

RKV - reaktivne kisikove vrste

UV- ultravijoliĉno sevanje

CAA – celokupna antioksidativna aktivnost

AA - antioksidativna aktivnost

HAT - vodikov atomski transfer

ET - elektronski transfer

DPPH - 2,2 difenil-1-pikrilhidrazil

ABTS+ - 2,2'-azinobis [3-etilobenzotiazolin-6-sulfonat]

RPF - radikalski zašĉitni faktor

RSF - radikalski koţni statusni faktor

BHA - 3-terciani butil-4-hidroksi anizol

BHT - 6-diterciarni butil-p-hidroksi toluen

TBHQ - 2-terciarni butil-hidroksikinon

SPF - zašĉitni sonĉni faktor

DMDM hidantoin - dimetiloldimetilhidantion

XIV

KAZALO SLIK

Slika 1: Nastanek RKV v celicah in antioksidativni obrambni sistem (Poljšak, 2012)

.......................................................................................................................................... 6 Slika 2: Klasifikacija biološko aktivnih sestavin; s poudarkom na antioksidantih in

fitokemikalijah (Juvan et al., 2005) ................................................................................ 8

Slika 3: Vitamin A (Bates, 1995) ................................................................................... 12 Slika 4: Vitamin C (askorbinska kislina) (Wikipedia, b.d.) ........................................ 13 Slika 5: Vitamin E (Wikipedia, b.d.) ............................................................................. 14 Slika 6: Flavon (2-fenil-1,4-benzopiran) (Wikipedia, b.d.) ......................................... 15

Slika 7: Reakcija prostega radikala DPPH z dodatkom antioksidanta (Avguštin,

2009) ............................................................................................................................... 22 Slika 8: Molekula L-askorbinska kislina in izoaskorbinska kislina, vsaka reducira

po dve molekuli DPPH- ja (Brand-Williams, Couvelier & Barset, 1995). ................ 23

XV

KAZALO GRAFOV

Graf 1: Povprečna celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev

preučevanih tipov krem ................................................................................................ 34 Graf 2: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev UV zaščitnih krem . 36 Graf 3: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev anti-aging krem ...... 36

Graf 4: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev splošno negovalnih

krem ............................................................................................................................... 37 Graf 5: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev zeliščnih mazil ........ 37 Graf 6: Antioksidativna aktivnost vzorcev krem v hidrofilni in lipofilni fazi

ekstrakcije ...................................................................................................................... 38

Graf 7: Cene vzorcev posameznih tipov krem ............................................................ 39 Graf 8: Umeritvena krivulja za α-tokoferol ................................................................ 79 Graf 9: Umeritvena krivulja za troloks ....................................................................... 80

KAZALO SHEM

Shema 1: Priprava vzorcev – 1. dan ........................................................................... 32 Shema 2: Priprava vzorcev – 2. in 3.dan .................................................................... 33

XVI

KAZALO TABEL

Tabela 1: Razredčene raztopine -tokoferola ............................................................. 30 Tabela 2: Razredčene raztopine troloksa .................................................................... 30 Tabela 3: Predlagane oznake erlenmajeric za določevanje vitamina C v sadnih

sokovih ........................................................................................................................... 58 Tabela 4: Predlagane oznake erlenmajeric za določevanje vitamina C v zelenjavnih

sokovih ........................................................................................................................... 59

Tabela 5 Vsebnost vitamina C v sadnjih in zelenjavnih sokovih .............................. 67 Priloga 1: Tabela 6 Vzorci in njihove sestavine ........................................................ 78 Tabela 7: Izmerjene absorbance šestih standarnih raztopin α-tokoferola različnih

koncentracij ................................................................................................................... 79 Tabela 8: Izmerjene absorbance šestih standardnih raztopin troloksa različnih

koncentracij ................................................................................................................... 80 Tabela 9: Pregled vsebnosti antioksidantov v vzorcih ............................................... 81

Tabela 10: Vrednotenje statistične pomembnosti razlik v CAA med skupinami

krem ob uporabi metode ANOVA .............................................................................. 82 Tabela 11: Vrednotenje statistične pomembnosti razlik v CAA med specifičnimi

skupinami krem ob uporabi metode ANOVA, LSD .................................................. 82

XVII

PRILOGE

Priloga 1: Vzorci in njihove sestavine

Priloga 2: Umeritvena krivulja za α-tokoferol

Priloga 3: Umeritvena krivulja za troloks

Priloga 4: Pregled vsebnosti antioksidantov v vzorcih

Priloga 5: Metoda ANOVA

1

1 UVOD

1.1 OPREDELITEV PODROČJA IN NAMEN DELA

Kozmetiĉna industrija na trgu proizvaja in ponuja na trgu številne kozmetiĉne produkte

z razliĉnimi nameni uporabe. Na koţo jih nanašamo z namenom, da koţo nahranimo, jo

oskrbimo in povrnemo mladosten in sveţ videz. Sestavine krem kot vir antioksidantov

so kljuĉne za uĉinkovitost kozmetiĉnih izdelkov. Glede na to, da so si razliĉni tipi krem

med seboj razliĉni po namenskosti, je priĉakovati, da je tudi skupna vrednost

antioksidantov razliĉna od vrste do vrste kozmetiĉnega proizvoda.

V ta namen smo v eksperimentalnem delu naloge zajeli vzorce štirih razliĉnih tipov

krem ter jih primerjali med seboj glede na izmerjeno skupno vrednost antioksidantov v

posameznem vzorcu. V diplomski nalogi sem pod drobnogled vzela kreme za obraz. Z

uporabo spektrofotomeriĉne metode sem skušala doloĉiti celokupno antioksidativno

aktivnost razliĉnih tipov krem (UV zašĉitne, anti-aging, splošno negovalne in zelišĉna

mazila) ter izpeljati primerjavo med njimi. V drugem delu diplomske naloge - pri

prenosu v šolsko prakso, sem zasnovala dvodnevni naravoslovni dan, kjer dijaki sami

izdelujejo kreme in mazila ter se seznanijo s preprostim doloĉanjem antioksidantov v

sadnih in zelenjavnih sokovih.

2

1.2 CILJI IN HIPOTEZE NALOGE

CILJI

Temeljni cilj eksperimentalnega dela diplomske naloge je bil prilagoditev in

optimizacija obstojeĉih spektrofotometriĉnih metod (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska,

2011) za doloĉitev celokupnega antioksidativnega potenciala za podroĉje kozmetiĉnih

izdelkov. Prilagoditev in optimizacija metode je bila izvedena na vzorcu dvajsetih krem,

ki so deklarirane v enem izmed izbranih štirih tipov krem (UV zašĉitne, anti-aging,

splošno negovalne in zelišĉna mazila). Na podlagi dobljenih eksperimentalnih

rezultatov sem ţelela glede na celokupen antioksidativni potencial kreme kritiĉno

oceniti korektnost marketinškega oglaševanja za izbrani nabor krem.

V okviru prenosa ideje v šolsko prakso sem si za cilj zastavila zasnovo naravoslovnega

dne, kjer bodo uĉenci izdelali svoje kreme in se seznanili s preprostim doloĉanjem

antioksidantov v šolskem laboratoriju.

HIPOTEZE

H1: Najveĉjo celokupno antioksidativno aktivnost imajo kreme, ki jih deklaracije

opredeljujejo kot anti-aging.

H2: Najniţjo celokupno antioksidativno aktivnost imajo kreme, ki jih deklaracije

opredeljujejo kot splošno negovalne.

H3: Celokupna antioksidativna aktivnost krem, ki jih deklaracije opredeljujejo kot UV

zaščitne, je višja v primerjavi s splošno negovalnimi kremami.

H4: Kreme, ki glede na opredelitev na deklaraciji spadajo v isto skupino, imajo

primerljivo celokupno antioksidativno aktivnost.

H5: Pri vzorcih vseh tipov krem k deleţu celokupne antioksidativne aktivnosti

enakovredno prispevata lipofilna in hidrofilna faza ekstrakcije.

H6: Pri vzorcih vseh tipov krem ni razvidne povezave med celokupno antioksidativno

aktivnostjo in ceno kreme.

3

2 TEORETIČNI DEL

2.1 STARANJE KOŢE

Proces staranja povzroĉi kljuĉne spremembe na koţi, kot so mehka tkiva in spremembo

skeletne strukturne opore ĉloveškega telesa. Spremembe na koţi so odvisne od

eksogenih in endogenih faktorjev. Endogeni faktorji se nanašajo na genetsko

hormonsko zasnovo ter na biokemiĉne procese, ki povzroĉijo ireverzibilno degeneracijo

ĉloveškega tkiva, medtem ko eksogeni izvorni faktorji predstavljajo vplive okolja,

predvsem ultravijoliĉno (UV) sevanje, ki poškoduje koţo in ogroţa celovitost koţe

(Sadick, Karcher & Palmisano, 2009).

Ĉloveška koţa, tako kot ostali organi, ne uide kronološkemu in biološkemu staranju.

Koţa je v primerjavi z drugimi organi direktno izpostavljena okolju, staranje pa je

potemtakem posledica škodljivih vplivov tako notranjih kot okoljskih dejavnikov

(Fisher et al., 2002, cit. iz Poljšak, 2012). Faktorji, ki pripomorejo k prezgodjem

staranju, so odvisni od starosti, spola, pigmentacije, kajenja, celokupne izpostavljenosti

soncu, zlorabe alkohola in drugih okolijskih, genetskih faktorjev in naĉina ţivljenja

(Bermann, 2007, cit. iz Poljšak, 2012).

Staranje koţe kot rezultat temelji na dveh tipih staranja: notranje in zunanje staranje.

Notranje strukturne spremembe (kronološko staranje) temeljijo na naravnih posledicah

ţivljenjskega cikla, ki je genetsko doloĉeno. Notranje staranje je vrsta staranja, ki je

odvisno od ĉasa. Zunanje staranje (photoaging) pa je odgovor koţe na zunanje škodljive

vplive in je kontrolirano s širokim razponom dejavnikov v naĉinu ţivljenjskega stila.

(Poljšak, 2012)

Notranji (genetsko doloĉeni) in zunanji (UV sevanje in škodljivi zunanji vplivi) procesi

staranja se dopolnjujejo in so v moĉnem sorazmerju s procesom poveĉanja

koncentracije prostih radikalov v koţi. Oksidativni stres je primarni faktor v procesu

staranja. Zunanji faktorji staranja koţe so posledica številnih faktorjev: ionizirajoĉega

sevanja, fiziĉnega in psihiĉnega stresa, vnosa alkoholnih substanc, slabe prehrane,

prenajedenosti, okoljskega onesnaţevanja in izpostavljenosti UV sevanju (le-to prispeva

kar 80 %). UV sevanje je najpomembnejši okoljski faktor za razvoj koţnega raka ter

staranja koţe. Staranje se priĉne ţe ob rojstvu (morda celo ob spoĉetju), proces se

pospeši po petindvajsetem letu, ko se naravni proces obnavljanja koţe upoĉasni. Koţa

4

nadomesti stare celice poĉasneje, poĉasnejša je menjava povrhnjice koţe ter celjenje ran

(Reenstra, Yaar & Gilchrest, 1993, cit. iz Poljšak, 2012).

2.2 FAKTORJI STARANJA KOŢE

2.2.1 Endogeni faktorji staranja

Notranje staranje je zaznamovano z nastankom prostih radikalov pri normalnih

metaboliĉnih procesih. Pri tem ima pomembno vlogo NADPH oksidaza, vodikov

peroksid kot stranski produkt metabolizma mašĉobnih kislin, produkcija fagocitov pri

procesu oksidacije, aktivnost citosolnih encimov kot so ciklooksigenaze itd. Reaktivne

kisikove vrste (RKV) se v organizmu tvorijo prek razliĉnih procesov (Shivaprasad et

al., 2005), velika veĉina endogenih RKV nastane zaradi napak in poškodb pri celiĉnem

dihanju v mitohondrijih. Oksidanti, ki nastanejo, so najveĉji vzrok oksidativnih poškodb

tkiv ali organov, ki bistveno vplivajo na proces staranja (Schienaga, Hagen & Ames,

1994, cit. iz Poljšak, 2012).

Med RKV prištevamo visoko reaktivne vrste kot so hidroksil (OH.), alkoksil (RO

.),

peroksil (ROO.), superoksid (O2

.) in nitroksil (NO

.) radikal. Oznaĉba RKV prav tako

zajema nekatere neradikalske zvrsti, kot so vodikov peroksid (H2O2) in organski

hidroperoksidi (ROOH) (Simon et al., 2000, cit. iz Poljšak, 2012).

Nastanek RKV ima pomembno vlogo tako pri kronološkem kot tudi biološkem staranju

koţe. Seštevek faktorjev notranjega uniĉenja, ki so posledica kontinuiranega nastajanja

RKV v procesih celiĉnega metabolizma, se odraţajo navzven kot spremembe na koţi

(Fisher et al., 2002, cit. iz Poljšak, 2012).

V zdravih organizmih se nastajanje in nevtralizacija prostih radikalov vzdrţuje v

ravnoteţju. Ravnoteţje se podre s prekomerno produkcijo prostih radikalov ter

reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti, kar vodi do nastanka oksidacijskega stresa, ki

je povzroĉitelj nastanka razliĉnih bolezni, razliĉnih zvrsti raka ter pospešenega procesa

staranja (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011). Do porušenja ravnovesja med

antioksidanti in RKV pride tudi takrat, ko ima celica na razpolago premalo

antioksidativnih obrambnih sistemov. Za zašĉito celic in organskih sistemov telesa proti

RKV je ĉloveško telo razvilo specifiĉen in kompleksen antioksidativni zašĉitni sistem,

ki deluje povezano in sinergistiĉno, da nevtralizira proste radikale (Shivaprasad et al.,

2005).

5

2.2.2 Eksogeni faktorji staranja

Ţivi organizmi so konstantno izpostavljeni škodljivim dejavnikom iz okolja, ki lahko

prehajajo skozi telo preko prebave, inhalacije ali preko koţe. Koţa je drugi najveĉji

prehod, ki selekcionira vstop kemikalij v telo. Je neprestano izpostavljena številnim

ksenobiotikom (snov, ki je prisotna v telesu, vendar normalno ne nastane v telesu).

Najbolj pogosti ksenobiotiki so: O2, onesnaţevalci zraka (ozon, NOX, SO2), deodoranti,

nanešeni kozmetiĉni proizvodi (kreme, losjoni, mila, geli za tuširanje, šamponi, olja),

vodni toksini (klor, kovinski ioni, npr. krom), mikroorganizmi (bakterije, virusi in glive)

in sevanja (ionizirana in neionizirana) (Fuchs, 2001, cit. iz Poljšak, 2012).

Eksogeni faktorji staranja koţe po Ionescu, 2005 (Ionescu, 2005, cit. iz Poljšak, 2012),

pa so:

- izpostavljenost soncu in umetni UV svetlobi kar pospešuje koţno

degradacijo zaradi nastajanja prosto radikalskih reakcij na koţi,

- izpostavljanje toksiĉnim snovem, kot je cigaretni dim, industrijski prah,

teţke kovine, detergenti ... vsi poznani kot potencialni induktorji prostih

radikalov,

- kroniĉne infekcije/vnetja, ki nastanejo zaradi poveĉanega nastanka prostih

radikalov (superoksid, peroksinirit, hipoklorit),

- pomanjkanje spanja in stres.

Ostali eksogeni faktorji staranja koţe so (Poljšak, 2012):

- onesnaţenost zraka,

- veter,

- vroĉina,

- mraz,

- osebni kozmetiĉni izdelki,

- pomanjkanje spanja,

- teţnost,

- radiacija,

- slabe navade in slaba osiromašena hrana.

Staranje koţe rezultira v narašĉanju ali v sinergiji efektov specifiĉnih endogenih in

eksogenih faktorjev, vsak izmed njih je neodvisen od ostalih (Poljšak, 2012):

6

Slika 1: Nastanek RKV v celicah in antioksidativni obrambni sistem (Poljšak, 2012)

2.3 ANTIOKSIDANTI

Antioksidanti so spojine, ki varujejo biološke sisteme pred poškodbami, ki jih

povzroĉajo prosti radikali. Pomembna znaĉilnost antioksidantov je njihova zmoţnost

»lovljenja« prostih radikalov. Prisotni so v nizkih koncentracijah v primerjavi z

oksidirajoĉem substratom in imajo sposobnost zmanjšanja ali zaustavitve oksidacije

(Poljšak, 2012). Antioksidanti so tako sposobni stabilizacije ali deaktivacije prostih

radikalov, preden le ti povzroĉijo oksidativne poškodbe na celiĉnih sistemih

(Shivaprasad et al., 2005). Imajo torej pomembno vlogo pri vzdrţevanju ravnoteţja

nastanka prostih radikalov preko metabolizma ter preko zunanjih okolijskih dejavnikov

(Poljšak, 2012).

Naloga antioksidanta je torej zmanjšanje ali nevtralizacija oksidativnega stresa.

Oksidativni stres povzroĉa poškodbe DNK, ki vodi do nastanka razliĉnih bolezni

(Poljšak, 2012).

Antioksidante delimo na nepolarne, lipofilne (topne v mašĉobi) in polarne, hidrofilne

(vodotopne), encimske in neencimske, endogene in eksogene (Poljšak, 2012).

7

Antioksidativno obrambo delimo na:

1) primarna endogena antioksidativna obramba:

- superoksid dizmutaza,

- katalaza,

- glutation peroksidaza (GPx),

- glutation,

2) sekundarna antioksidativna obramba: DNK – popravljalni sistemi,

3) eksogena antioksidativna obramba: antioksidanti, ki jih v telo vnašamo preko zauţite

hrane hrane (Poljšak, 2012).

V telesu obstaja dinamiĉen sistem med koliĉino nastalih prostih radikalov v telesu ter

antioksidantov, ki zavirajo delovanje radikalov in tako obvarujejo pred nastankom

biološke škode. Koliĉina antioksidantov, ki predstavlja normalno fiziološko stanje

organizma, ni zadostna za nevtralizacijo vseh proizvedenih prostih radikalov. Potrebno

jih je pridobiti s pomoĉjo ustrezne prehrane z visoko vsebnostjo antioksidantov, ki

organizem šĉitijo pred nastankom raznih bolezni (Shivaprasad et al., 2005). Vnos

eksogenih antioksidantov preko sadja in zelenjave igra kljuĉno vlogo v uravnavanju

oksidativnega stresa in oksidativnih celiĉnih poškodb v bioloških sistemih. Naravni

antioksidanti kot so vitamin C in E, karotenoidi in polifenoli (tudi flavonoidi), so glavne

komponente sadja in zelenjave (Rietjens, Boersma & de Haan, 2001, cit. iz Poljšak,

2012). Nahajajo se v semenih, ţitaricah, stroĉnicah, zelenjavi, sadju, voskih, lubju,

koreninah, zaĉimbah in morskih algah (Djilas, Ĉanadanović-Brunet & Ćetković, 2002).

Antioksidativne lastnosti teh virov so kljuĉne za njihovo obogateno hranilno vrednost

ter kot obramba pred kardiovaskularnimi boleznimi, razliĉnimi oblikami raka ter procesi

staranja (Rietjens, Boersma & de Haan, 2001, cit. iz Poljšak, 2012).

8

Slika 2: Klasifikacija biološko aktivnih sestavin; s poudarkom na antioksidantih in

fitokemikalijah (Juvan et al., 2005)

2.3.1 Antioksidanti v kozmetiki

Najveĉji organ telesa je koţa, ki je izpostavljena oksidativnemu stresu. Le-ta je

povzroĉitelj nastanka RKV - tako v zunanjem delu koţe kot tudi koţi sami (Poljšak,

2012). Znotrajceliĉni oksidativni stres, ki je posledica delovanja RKV, povzroĉi staranje

koţe z nastankom gub in neznaĉilno pigmentacijo (Masaki, 2010, cit. iz Poljšak, 2012).

Antioksidanti zavirajo uniĉujoĉe delovanje RKV in so sposobni ublaţiti ali uravnavati

škodo in bolezni, povzroĉene na koţi. Ĉeprav vsebuje koţa veliko endogenih (koţi

lastnih) antioksidativnih sistemov za zmanjšanje škode povzroĉene z RKV, se tekom

ĉasa s staranjem škoda veĉa in antioksidativna moĉ pojema (Poljšak, 2012).

Poznavanje koţe in njenega naravnega obrambnega mehanizma je pripomoglo k

razvoju kozmetiĉne industrije. Antioksidativni viri, ki vsebujejo antioksidante z nizko

molekulsko maso in z visoko zmogljivostjo zmanjšanja ali redukcije razliĉnih vrst

9

radikalskih reakcij, se nahajajo v kozmetiĉnih produktih novejše kozmetologije (Ratz-

Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Antioksidanti so v kozmetiki skupina najpomembnejših sestavin, saj varujejo koţo in so

hkrati konzervansi. Veĉina jih izvira iz rastlin, saj jih rastline same sintetizirajo in s tem

ustvarjajo zašĉito pred lastnim oksidativnim stresom, zaradi moĉnih zunanjih UV

faktorjev sevanja, ki povzroĉajo nastanek prostih radikalov (Draelos, 2010).

Naravni antioksidanti so namenjeni zašĉiti pred kvarjenjem tako sveţih naravnih

materialov kot tudi konĉnega produkta, zato se jih dodaja v kozmetiĉne proizvode kot

konzervanse (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011). Skupine najpogostejših

antioksidantov iz rastlin so flavonoidi in polifenoli (Draelos, 2010).

V kozmetiĉne produkte so pogosto vkljuĉene oljne komponente, ki razmeroma hitro

oksidirajo, kar poslediĉno vodi do sprememb v senzoriĉnih parametrih in do

spremenjenih fizikalno-kemiĉnih lastnosti kozmetiĉnih izdelkov. Dodatek sintetiĉnih ali

naravnih antioksidantov prepreĉuje proces oksidacije (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska,

2011). Najbolj uĉinkoviti so sintetiĉni konzervansi, zato kozmetiĉna industrija najraje

posega po njih. Ogromno kozmetiĉnih proizvodov vsebuje veliko sintetiĉnih

antioksidantov, kot npr. 3-terciarni butil-4-hidroksi anizol (BHA) in 6-diterciarni butil-

p-hidroksi toluen (BHT). Kemijske lastnosti, ki zaznamujejo spojini BHT in BHA kot

odliĉna antioksidanta, so po drugi strani zdravju škodljive. Oksidativne karakteristike

ter metaboliti BHT-ja in BHA-ja lahko prispevajo k nastanku rakavih bolezni ter rasti

tumornih celic, vendar enake reakcije tudi zniţujejo oksidativni stres ( Helmenstine,

b.d.).

Med naravne antioksidante spadajo tudi vitamini. Vitamini imajo kot antioksidanti v

kozmetiki zelo pomembno vlogo. Vitamini so naravne komponente ĉloveškega telesa in

so del antioksidativnega sistema, ki varujejo koţo pred oksidativnim stresom. Veliko

sestavin z visoko antioksidativno aktivnostjo (retinojska kislina, vitamini, flavonoidi) je

vkljuĉenih v kozmetiĉne produkte z namenom zaviranja staranja koţe. Nekateri imajo

znanstveno dokazano uĉinkovitost, ostali pa ostajajo še v nedokonĉanih znanstvenih

tezah. Študije na osnovi vitaminov A, C, E, B3 in še veliko ostalih komponent, so

dokazale, da imajo visok antioksidativni potencial in moĉnejšo obrambo pred

uniĉenjem, vendar pa morajo biti produkti na osnovi le-teh za njihovo popolno

uĉinkovitost izdelani na osnovi pravilne absorpcije v koţo. Samo nekaj izomer teh

antioksidantov je aktivnih in imajo sposobnost prodreti skozi koţo. Nekateri produkti so

10

omejeni s svojo uĉinkovitostjo ţe s tem, da jih ni v zadostni koncentraciji in koliĉini,

niso stabilni v kremni mešanici ter da se ne vpijejo skozi zunanjo povrhnjico (Burgess,

2008, cit. iz Poljšak, 2012).

V kozmetiĉnih izdelkih pomembno vlogo odigra pravilna medsebojna kombinacija vseh

prisotnih antioksidatov. Kombinacija razliĉnih antioksidantov, ki je istoĉasno nanešena

na koţo, naj bi sproţila sinergistiĉni efekt. Npr. vitamin C regenerira vitamin E, selen in

niacin pa sta potrebna, da se glutation obdrţi v svoji aktivni obliki (Poljšak, 2012). Ker

vitamin C regenerira oksidirano obliko vitamina E, je njuna kombinacija v kozmetiĉnih

izdelkih sinergistiĉna – predvsem pri zašĉiti pred UV ţarki (Burke, 2007, cit. iz Poljšak,

2012). Kombinacija karotenoidov in koencima Q10 v produktih za nego koţe pa

izboljša zašĉito obolele koţe in jo zavaruje pred prezgodnjim staranjem, ki je vzrok

pretiranega izpostavljanja sonca (Fuller et al., 2006, cit. iz Poljšak, 2012).

Koţa ţe sama vsebuje endogene antioksidante, nekatere pa telo samo ne more

sintetizirati, ampak jih mora pridobiti s ustrezno hrano ali z neposrednim nanosom na

koţo. Številne snovi, ki so prisotne v koţi so potencialni antioksidanti: askorbat, seĉna

kislina, karotenoidi in sulfhidrili. Vodotopni antioksidani v plazmi so sledeĉi: glukoza,

piruvat, seĉna kislina, askorbinska kislina, bilirubin in glutation. Lipofilni antioksidanti

pa so: -tokoferol, ubikonon-Q10, likopen, -karoten, lutein, zeaksantin in -karoten.

Zunanji del koţe, epidermis, vsebuje veĉjo koncentracijo antioksidantov kot notranja

plast dermisa (Shindo et al., 1994, cit. iz Poljšak, 2012). Kliniĉne študije so dokazale,

da koţa pridobi z vnosom pravilne prehrane bogate s sadjem in zelenjavo, s

polnovrednimi ţitaricami in z mašĉobnimi kislinami omega-3, zdrav, mladosten in sijoĉ

videz (Poljšak, 2012). Vendar pa glede na izkoristek uĉinkovitosti na koţi v primerjavi

z oralnim naĉinom vnosa obstajata dve prednosti v neposrednem nanosu aktivne vezave

antioksidantov na koţo. Prviĉ, koţa pridobi veĉjo vrednost oz. izkoristek

antioksidantov. Drugiĉ, neposredni nanos da koţi veĉjo koliĉino antioksidantov, ki ne

morejo biti sprani ali odstranjeni, je zašĉita, ki ostane kar nekaj dni po nanosu (Burke,

2004, cit. iz Poljšak, 2012).

11

Vrste antioksidantov v kozmetiki

Nekatere aktivne sestavine v kozmetiĉnih izdelkih vsebujejo antioksidativne

komponente in so uspešne kot zašĉita pred prezgodnjim staranjem:

Vitamin A

Retionodi predstavljajo skupino naravnih in sintetiĉnih spojin, ki so karakterizirani z

biološko aktivnostjo vitamina A. Retinol je najbolj uporabljena oblika vitamina A, ki

vkljuĉuje tudi retinal, retinojsko kislino in retinil palmitat. Te kemijske oblike so

poznane kot retinoidi in vse zaznamuje biološka aktivnost all trans retinola, ki je

splošna znaĉilnost njihove strukture (Poljšak, 2012).

Retinol je aktivna oblika vitamina A. Nahaja se v ledvicah ţivali, mleku ... V telo se

absorbira v prekurzni obliki; ţivalski viri (jetra in jajca) vsebujejo retinil estre, medtem

ko rastline (korenje, špinaĉa) vsebujejo karotenoide (Poljšak, 2012). Vitamin A in ostali

naravni retinoidi igrajo kljuĉno vlogo v embriogenezi, reprodukciji, vidu, imunskem

sistemu in diferenciaciji epitelnih celic (Mangelsdorf, 1994, cit. iz Poljšak, 2012).

Retina oĉesa ga porablja v obliki specifiĉnega metabolita, svetlobno vsrkajoĉe molekule

- retinala. Ta molekula je kljuĉna za vid: daljnovidnosti ter pri barvnem gledanju (Sorg

et al., 2002, cit iz Poljšak, 2011).

Vitamin A, njegovi derivati in -karoten so v kozmetiki ţe leta popularni dodatki.

Primarni vzrok uporabe vitamina A in njegovih derivatov v kozmetiĉnih izdelkih je

njihova zmoţnost normalizacije procesa keratinizacije. Pogosto uporabljeni derivati

vitamina A vsebovani v kozmetiĉnih izdelkih so retinol, retinil palmitat, retinil acetat,

retinal in retinojska kislina (Lupo, 2001).

Uĉinek vitamina A in njihovih derivatov v kozmetiki je, da regulirajo rast epitelnih celic

in diferenciacijo. Retinol stimulira produkcijo kolagena v koţi in nanos le-tega vpliva

na zmanjšanje gub koţe ter koţne pigmentacije. (Lupo, 2001, Tucker-Samaras et al.,

2009 cit. iz Poljšak, 2012) Študija Variani et al., 1998 (Variani et al., 1998, cit. iz

Poljšak, 2012) je z uporabo kulture organa ĉloveške koţe in epidermalnih keranocitov

ter fibroblastov v monoplastni kulturi dokazala, da je retinojska kislina pospeševala rast

keranocitov in fibroblastov ter stimulirala ekstracelularni matriks za produkcijo

fibroblastov (Poljšak, 2012).

12

CH2OHCH3CH3

CH3

Retinol

CHO

CH3CH3

CH3

Retinal

COOHCH3CH3

CH3

Retinojska kislina

CH3CH3

CH3 CH3

CH3

CH3

-karoten

Slika 3: Vitamin A (Bates, 1995)

Vitamin C

Vitamin C je vodotopni vitamin, ki je prisoten v citrusih in zelenjavi, pomemben je

zaradi antioksidativnih lastnosti, kot tudi zaradi njegove funkcije kofaktorja v reakcijah

hidroksilacije produkcije kolagena (Lupo, 2001). Ĉloveško telo je nesposobno samo

sintetizirati vitamin C, zato je njegov vnos s prehrano nujen (Lupo, 2001).

V kozmetiki je vitamin C uporaben kot sestavina, ki zmanjšuje nastajanje prostih

radikalov pod vplivom UV sevanja, ter pri regeneraciji vitamina E, drugega

13

pomembnejšega vitamina (Poljšak, 2012). Nanos vitamina C na koţo stimulira

aktivnost kolagenske produkcije dermisa (Nusgens et al., 2002, cit. iz Poljšak, 2012).

Številne ostale študije pa so dokazale, da je vitamin C sposoben poveĉati kolagensko

produkcijo, zašĉititi poškodbe pred UVA in UVB ţarki, popraviti pigmentacijske

spremembe in izboljšati nepravilnosti koţe (Poljšak, 2012). Najveĉji problem uporabe

vitamina C je njegova nestabilnost v razliĉnih kozmetiĉnih produktih, saj je vitamin C

nagnjen k hitri oksidaciji in lahko izgubi svojo uĉinkovitost (Burke, 2004, cit. iz

Poljšak, 2012).

Obstajajo tri oblike vitamina C, ki so prisotne v kozmetiki: askorbil palmitat,

magnezijev askorbil fosfat in L-askorbinska kislina (Lupo, 2001). Razliĉne oblike

vitamina C, kot so L-askorbinska kislina, kalcijev askorbat, magnezijev askorbat,

magnezijev askorbil fosfat, natrijev askorbat in natrijev askorbil fosfat imajo v

kozmetiki primarno funkcijo antioksidantov (Poljšak, 2012).

Askorbil palmitat je sintetiĉni ester vitamina C, ki je topen v mašĉobi. Stabilen je v

kozmetiĉnih proizvodih v obmoĉju nevtralnega pH-ja. Nanešen na koţo z UV

opeklinami zmanjšuje rdeĉino za 50 % hitreje kot podroĉja, kjer niso bila zdravljena.

L-askorbinska kislina je najbolj bioaktivna oblika vitamina C in ima veliko pozitivnih

uĉinkov na koţi. Ta oblika vitamina C je vodotopna in je stabilna v obmoĉju nizkega

pH-ja (Lupo, 2001).

OCH3

CH3

OHOH

CH3

Slika 4: Vitamin C (askorbinska kislina) (Wikipedia, b.d.)

14

Vitamin E

Vitamin E je topen v mašĉobi in je prisoten v veliko razliĉnih hranilnih virih, predvsem

v soji, orešĉkih, polnovredni moki in oljih. Ima veliko zdravilnih uĉinkovin za oĉi ter za

kardiovaskularni sistem ker prepreĉuje lipidno peroksidacijo (Lupo, 2001). Telo

pridobiva vitamin E z vnosom zelenjave, olj, semen, koruze, soje, polnozrnate ovsene

moke, margarine, orešĉkov in nekaterih vrst mesa (Draelos, 2010).

Tokoferoli so vrsta organskih spojin, obstojeĉi iz raznolikih metiliranih fenolov.

Najpomembnejši je -tokoferol, ki ima visok antioksidativni potencial, topen je v

mašĉobi in je antioksidant, ki prekinja veriţne reakcije peroksidacije membran.

Molekule vitamina E z antioksidativno aktivnostjo vsebujejo štiri tipe tokoferolov

(α,β,ϒ,δ) in štiri tipe tokotrienolov (α,β,ϒ,δ). Vitamin E je vezni membranski

antioksidant, ki nevtralizira proste radikale ter omogoĉa zašĉito, da ne pride do

poškodb, povzroĉenih z RKV ter prepreĉuje nastanek nitrozaminov (Poljšak, 2012).

Raziskave kliniĉnih študij o antioksidativni uĉinkovitosti vitamina E so dokazale, da

zavira nastajanje gub ter zmanjšuje grobost koţe. Vitamin E je prisoten v številnih

kozmetiĉnih produktih, vendar je v nekaterih njegova koncentracija tako nizka, da

njegova uĉinkovitost ni zaznana (Burke, 2004, cit. iz Poljšak, 2012). Raziskave

dokazujejo, da ima vitamin E sposobnost stabilizacije in normalizacije koţne

povrhnjice, ki je poškodovana zaradi uniĉujoĉih zunanjih vplivov (Poljšak, 2011).

O

OH

Slika 5: Vitamin E (Wikipedia, b.d.)

Polifenolne komponente

Fenolne komponente ali polifenoli predstavljajo najbolj številĉno in široko distribuirano

skupino substanc v kraljestvu rastlin; danes je poznano veĉ kot 8000 fenolnih spojin.

Polifenoli so produkti sekundarnega metabolizma rastlin (Glauce Socorro de Barros et

al., 2010, cit. iz Poljšak, 2012).

15

Flavonoidi predstavljajo najbolj poznano in najširšo skupino rastlinskih fenolov.

Variacija v strukturi aromatskih obroĉev porazdeli flavonoide v razliĉne skupine:

flavonoli, flavoni, flavanoli, izoflavoni in antocianidi. Ti flavonoidi se vĉasih pojavijo

kot glikozidi, proces glukozilacije namreĉ naredi molekulo bolj vodotopno in manj

reaktivno proti prostim radikalom (Poljšak, 2012).

In vitro antioksidativna aktivnost fenolnih komponent je višja od antioksidativne

aktivnosti vitamina E in C (Rice-Evans, 2001, cit. iz Poljšak, 2012). Poleg visoke

antioksidativne aktivnosti imajo flavonoidi tudi anti-trombotiĉno, anti-rakotvorno, anti-

viralno, anti-mikrobiĉno delovanje ter anti-bolezenske efekte (Gerritsen, 1995, cit. iz

Poljšak, 2012).

Dokazano je, da ima široka raznolikost razliĉnih vrst polifenolov in ostalih

fitokemikalij, kot so polifenoli iz zelenega ĉaja, oligomerni proantocianidini iz grozdnih

pešk, resveratrol, silimarin, genistein itd. zmoţnost dodatno zašĉititi koţo pred

zunanjimi škodljivimi vplivi in jo obvarovati pred vnetji, pred oksidativnim stresom in

poškodbami DNK zaradi UV sevanja (Poljšak, 2012).

Flavonoidi so spojine, ki se nahajajo v sadju, zelenjavi ter v nekaterih pijaĉah (ĉaj,

kava, pivo in sadni sokovi). Flavonodi so pomembni sonĉni zašĉitni faktorji. Flavonoidi

so uĉinkovine, ki šĉitijo organizem pred pojavom kroniĉnih bolezni; antocianini iz

borovnic zašĉitijo koţo pred škodljivim delovanjem UV ţarkov in so obramba pred

eksogenimi dejavniki staranja (Bae et al., 2009, cit. iz Poljšak, 2012). Rastlinski

ekstrakti so cenjeni zaradi njihovega visokega UV zašĉitnega faktorja (grozdne peške,

ginko bilboa in zeleni ĉaj) (Poljšak, 2012).

O

O

Slika 6: Flavon (2-fenil-1,4-benzopiran) (Wikipedia, b.d.)

16

Selen

Selen je drugi pomembnejši mikroelement, ki je potreben za kompleksno

antioksidativno delovanje v ĉloveškem telesu. Je esencialen element pri ţivalih in

ljudeh, v telo ga vnašamo preko zauţite hrane, kot so ţitarice, stroĉnice in zelenjava.

Zmanjšuje oksidativni stres in oksidativne poškodbe DNK. Veĉji vnos selena preko

dodatkov naj bi povzroĉilo pro-oksidativen efekt. Previsoka koncentracija zauţitih virov

selena ali neposrednega nanosa na koţo ima lahko citotoksiĉni ali rakotvorni vpliv

(Letavayova, Vlckova & Brozmanova, 2006, cit. iz Poljšak, 2012).

Cink

Cink je naslednji mikroelement, ki je pomemben za celiĉno antioksidativno obrambo.

Ima antioksidativne lastnosti, kot je varovanje pred prezgodnjim staranjem koţe in pred

slabljenjem mišic telesa (Milbury & Richer, 2008, cit. iz Poljšak, 2012). Vkljuĉen je v

procese zdravljenja po poškodbi, pozitivne uĉinke ima tudi pri varovanju pred UVA- in

UVB-ţarki (Richard et al., 1993, cit. iz Poljšak, 2012). Viri cinka so govedina,

jagnjetina, svinjina, rakovo meso, puran, pišĉanec, školje in losos, mleko, jogurt, sir ter

kvas, orešĉki, fiţol, polnovredne ţitarice, rjavi riţ, polnovredna moka, krompir, buĉna

semena kot vir nemesne prehrane (Poljšak, 2012).

2.4 KREME, MAZILA IN LOSJONI

Kreme in losjoni (creams and lotions) so oblike poltrdih kozmetiĉnih izdelkov, poltrde

emulzije. So iz veĉfazne podlage: iz lipofilne in vodne faze (emulgatorji V/O ali V/O),

mazila pa so iz enofazne podlage (samo hidrofilna ali samo lipofilna faza) (Ĉajkovac,

2005).

Kreme, losjoni so razdeljeni na marketinški osnovi na razliĉne tipe, kot so:

- vsakodnevne,

- intenzivne,

- zašĉitne,

- uĉvrstitvene,

- specifiĉne,

- potemnjevalne,

- anti-wrinkle,

- medicinska mazila,

- sonĉne kreme (Romanowski, 2009).

17

Vzrok, zakaj ljudje uporabljamo kreme, mazila in losjone, je odvisen od razliĉnih

posameznikovih teţav s koţo. Najpogostejši problemi so suha koţa (kseroza), staranje

koţe (gube, starostne pike, povešena koţa) ter zdravstveni problemi (akne, rozacea,

luskavica, ekcema, opekline, brazgotine, bradavice, atletska noga). Najveĉ ljudi boleha

zaradi suhe koţe, ker koţa izgublja velike koliĉine vlage zaradi povzroĉiteljev, kot so

suh zrak, pretirano umivanje (izpostavitev kemikalijam), predpisanih zdravil,

hormonskih sprememb ter slabe prehrane. Rešitev za tovrstne probleme je v

vzdrţevanju koliĉine vode v koţi. K temu pripomorejo kreme oz. njihove sestavine, kot

so okluzivi, mehĉala (emolienti) in vlaţilci (humektanti) (Romanowski, 2009).

2.4.1 Sestavine v kremah za obraz

VODNA, POLARNA FAZA vsebuje sledeĉe sestavine:

- zgošĉevalci (polimeri, škrob ...),

- vlaţilci (glicerin, propilen glikol, sorbito ...),

- barvila (organska in anorganska barvila),

- konzervansi (parabeni, seĉna kislina, ftalati, DMDM hidantoin ...),

- sekundarni emulgatorji (cetil-, stearil- alkohol ...),

- aktivne uĉinkovine (rastlinski destilati, ekstrakti, poparki ...) (Romanowski,

2009).

LIPOFILNA, NEPOLARNA FAZA:

Lipidi in mašĉobe so skupno ime za kemijsko zelo heterogeno skupino organskih

spojin, so netopne v vodi, raztapljajo pa se v organskih topilih. Ker so to v vodi netopne

snovi, se uporabljajo z namenom podpore lipidnega sloja koţe, ki deluje kot glavna

pregrada pred vplivom dejavnikov iz okolja. Sloj lipidov v koţi šĉiti naš organizem

pred nekontrolirano in ĉezmerno izgubo vode ter pred hidracijo. Poleg tega pa koţo tudi

gladijo in s tem ublaţijo manjše gubice (Ĉajkovac, 2005).

Lipofilne sestavine so sledeĉe:

- okluzivi (vazelin, mineralna olja, dimetikon – naftni derivati, voski ),

- mehĉala (rastlinska olja in masla; kokosovo olje, kakavovo maslo ...),

- mašĉobne kisline/ alkoholi,

- silikoni,

- konzervansi,

18

- sekundarni emulgatorji,

- aktivne uĉinkovine (eteriĉna olja ...) (Romanowski, 2009).

Ostale sestavine:

destilirana voda, dišeĉe spojine, nevtralizatorji (EDTA, 3-etanolamin ...).

AKTIVNE SESTAVINE V KREMAH

VLAŢILCI (humektanti) – so snovi, ki zadrţujejo vodo. So obiĉajno vodotopni in se jih

v uporablja od 0.5 %-15.0 %. Primeri: glicerin, propilen glikol, sorbitol.

OKLUZIVI – so snovi, ki sĉitijo pred izgubo vlage. So lipofilni in se jih uporablja od 5

%-70 %. Primer: vazelin, mineralna olja.

MEHĈALA (emolienti) – so snovi, ki dajejo lahko prevleko z namenom, da izboljšajo

gladkost koţe. So lipofilni in se jih uporablja od 5 %-25 %. Primeri: kokosovo olje,

mandljevo olje, estri, silikoni, karitejevo maslo (Romanowski, 2009).

KREME delimo na hidrofobne in hidrofilne. Razlikujejo se glede na prevladujoĉo

vodno oz. oljno fazo emulzije (Ĉajkovac, 2005).

HIDROFOBNE KREME: Zanje je znaĉilno, da dajejo koţi teţji, mastnejši obĉutek, so

bolj uĉinkovite za suho koţo ter imajo manjšo moţnost razrasti mikrobov

(Romanowski, 2009).

Zunanja faza: hidrofobna, notranja: hidrofilna (vodna).

Emulgatorji V/O (voda v olju): lanolski alkoholi, estri sorbitana (Spani), monogliceridi

(Ĉajkovac, 2005).

HIDROFILNE KREME: Zanje je znaĉilno, da dajejo koţo laţji in nemasten obĉutek,

imajo veĉjo zmoţnost razmaza, dajejo obĉutek mrzlote in niso toliko uĉinkovite kot

hidrofobne kreme.

Zunanja faza: hidrofilna (vodna), notranja: lipofilna.

Emulgatorji O/V (olje v vodi): Na- in trietanolaminska mila, sulfatirani mašĉobni

alkoholi, polisorbati (Tweeni), estri polioksiliranih mašĉobnih kislin in mašĉobnih

alkoholov. (Ĉajkovac, 2005).

EMULGATORJI (PAS – površinske aktivne snovi) so molekule, ki imajo v strukturi

hidrofilen (polarna glava) in lipofilen (nepolarni rep) del. Zaradi svoje kemijske zgradbe

19

se razporedi na meji med fazama in zmanjša medfazno napetost. Posledica tega je

manjša medfazna energija in stabilizacija sistema (Ĉajkovac, 2005).

MAZILA delimo na hidrofobna, vodo-emulgirajoĉa in hidrofilna.

HIDROFOBNA MAZILA lahko sprejmejo le majhno koliĉino vode. Njihova sestava je

iz trdih in tekoĉih parafinov, rastlinskih olj, ţivalskih mašĉob, sinteznih gliceridov in

voskov (Ĉajkovac, 2005).

VODO EMULGIRAJOĈA MAZILA imajo sestavo iz komponent kot hidrofobna

mazila + emulgatorji V/O (lanolinski alkoholi, estri sorbitana, monogliceridi, mašĉobni

alkoholi) ali emulgatorji O/V (sulfatirani mašĉobni alkoholi, polisorbati, makrogol cetil

stearil estri, estri mašĉobnih kislin z makrogoli) (Ĉajkovac, 2005).

HIDROFILNA MAZILA imajo sestavo iz komponent, ki se mešajo z vodo. So zmesi

tekoĉih in trdnih makrogolov (Ĉajkovac, 2005).

Tudi pH- obmoĉje v kremah je zelo pomembno. pH je lastnost funkcije epidermalne

pregrade in je kljuĉna za pojasnitev topikalnega tretmaja koţe. »Koţni pH« pomeni

»potencial vodika v koţi« in je uporaben za merjenje kislosti ali baziĉnosti v zunanjih

plasteh koţe.

Normalna povrhnjica koţe ima pH med 4 in 6.5, varira pa glede na razliĉna podroĉja oz.

predele koţe (Yosipovich & Hu, 2003, cit. iz Poljšak, 2012.

2.4.2 Nevarnost kozmetike

Priporoĉljivo je, da ob nakupu kozmetike vedno pregledamo deklaracijo sestavin ter se

pozanimamo o nevarnosti pri dolgotrajni uporabi le teh.

Primeri sestavin krem, ki so zdravju škodljive:

- »Fragrance« - dišeče spojine – beseda oznaĉuje ogromno kemikalij, ki sproţajo

alergene reakcije. Arome lahko vsebujejo škodljive primesi. Veliko splošnih sestavin

vsebuje neĉistoĉe, ki povzroĉajo rakotvorne in ostale bolezni.

- Spojine kot so: DMDM hidantoin, derivati uree: diazolidinil urea, imidazolidinil

urea ter cetearilni alkohol, polietilen glikol (PEG).

- BHA, BHT, TBHQ: The National Toxicology Program klasificira BHA, BHT,

TBHQ, kot “splošno znani ĉloveški karcinogeni”. Lahko povzroĉa koţno

20

dipegmentacjo. Evropska unija ga obravnava kot nevarnega v aromah – dišeĉih

spojinah.

- DMDM hindantoin & bronopol (2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol): Kozmetiĉne

konzervanse, ki se razgradijo na formaldehid, Interational Agency on Research on

Cancer obravnava kot karcinogene. Konzervansi in njihovi sestavni delci, vkljuĉno s

formaldehidom, lahko sproţijo alergijske rekacije.

- Hidrokinon: Koţna belitvena kemikalija, ki povzroĉa koţno bolezen z modro-ĉrnimi

lisami, ki v hujših primerih postanejo trajno ĉrni izrastki v velikosti zrna kaviarja.

- Metilizotiazolinon in metilkloroizotiazolinon: Konzervansi, ki so uporabljeni v

produktih za splošno nego skupaj z ostalimi iritanti, senzitivnimi sredstvi in alergeni, so

laboratorijske raziskave na sesalĉevih moţganih dokazale, da je metilzotiazolinon

toksiĉen.

- Oksibenzon: V epidermoloških študijah je bilo dokazano, da povzroĉa iritacije,

obĉutljivost in alergije.

- Parabeni: Parabeni so konzervansi, ki posnemajo znaĉilnosti hormona estrogena.

Najdeni so bili v tumorjih prsi kar v 19 od 20 opazovanih ţensk. Po European

Comission’s Scientific Committee on Consumer Products lahko parabeni z daljšimi

verigami kot so propil in butil parabeni ter njihove izomere, izopropil in izobutil

parabeni, motijo endokrini sistem in povzroĉajo nastajanje reproduktivnih motenj.

- Polietilen glikol / Cetearilni alkohol/ Polietilenske spojine: Te sintetiĉne kemikalije

so pogosto kontaminirane z 1,4-dioksanom, ki ga vlada ZDA obravnava kot lahko

penetrirajoĉega v koţo in karcinogenega. Izdelovalci kozmetike lahko odstranijo 1,4-

dioksan iz sestavin, vendar so raziskave dokazale, da še vedno ostane v produktih.

- Ftalati: Mnoge študije, ki se nanašjo na ftalate so dognale, da ftalati povzroĉajo

motnje v reproduktivih organih ţensk. Izogibati se je potrebno produktom, ki vsebujejo

fragrance, saj opisuje kemijsko spojino, ki vsebuje ftalat.

- Retinil palmitat in retinol: Vitamin A je nujno potreben vitamin, pretirana uporaba

povzroĉi napake pri porodu, ĉe so ţenske temu podvrţene med noseĉnostjo. Zadnje

raziskave so dokazale, da nanos vitamina A na koţo, ki je izpostavljena soncu, npr. v

sonĉnih kremah, balzamih za ustnice ter v dnevnih vlaţilcih, lahko povzroĉijo

produkcijo prostih radikalov, ki poškodujejo DNA ter povzroĉijo nastanek koţnega

raka. Zadnji podatki iz FDA (Food and Drug Administration) nakazujejo, da retinil

palmitat, ki je nanešen na koţo v prisotnosti sonca, povzroĉa razvoj koţnih tumorjev in

lis.

21

- Priporoĉljivo je, da se ţenske izogibajo pripravkom za zunanje staranje koţe, ki

vsebujejo - in -hidroksi kislino, mleĉno kislino in glikolno kislino (EWG's Skin

Deep® Cosmetics Database, b.d.).

2.5 METODOLOGIJA MERJENJA ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI V KOZMETIKI

Doloĉanje antioksidativne aktivnosti posameznega antioksidanta v kozmetiĉnem

izdelku je teţka in v veĉini primerov ni moţna, zaradi sinergistiĉnega uĉinka med

prisotnimi antioksidanti. V rastlinskem materialu, hrani in kozmetiĉnih formulacijah je

zato bolj smiselno doloĉiti celokupno antioksidativno aktivnost (CAA) produkta, ki je

doloĉena z vkljuĉitvijo vseh sestavin produkta, ki vsebujejo antioksidante. Obstaja

veliko analitiĉnih metod, ki dopušĉajo doloĉanje antioksidativne aktivnosti v

rastlinskem materialu in hrani. Niso pa vse primerne za analizo kozmetiĉnih produktov,

ker gre za mešanice sestavin z razliĉnimi fizikalno-kemiĉnimi lastnostmi (Ratz-Lyko,

Arct & Pytkowska, 2011).

Doloĉitev celokupne antioksidativne aktivnosti v kozmetiki vkljuĉuje posebne specialne

metode za doloĉanje tako hidrofilnih kot lipofilnih sestavin.

Metoda doloĉanja totalne antioksidativne aktivnosti je razdeljena na in vitro, in vivo in

ex vivo. In vitro študije se nanašajo na zmoţnost antioksidantov za nevtralizacijo prostih

radikalov. Te reakcije zavzemajo analize prenosa vodikovega atoma (HAT) in

elektronski prenos (ET)-nanašajoĉe analize (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Sefarini, 2008 (Sefarini, 2008, cit. iz Poljšak, 2012) je razvrstil vrednosti analiz

celokupne antioksidativne aktivnosti v dve skupini na osnovi prisotnih kemijskih

reakcij:

- elektronsko transferni reakcijski mehanizmi

- reakcijski mehanizmi s prenosom vodika.

Elektronsko transferni reakcijski mehanizmi

Metoda s prostim radikalom DPPH

Najbolj uporabljena metoda razbarvanja je bila prviĉ omenjena v poznih 50' letih 20.

stoletja po Bloisu (Blois, 1958, cit. iz Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska). V kozmetiĉni

industriji je ena izmed najbolj primernih metod za doloĉanje antioksidativne aktivnosti

22

kozmetiĉnih izdelkov ter njihovih aktivnih sestavin, kot so vitamini in polifenoli.

Problemi povezni z merjenjem totalne antioksidativne aktivnosti kozmetiĉnega

produkta se nanašajo na prisotnost obeh faz - hidrofilne in lipofilne (Ratz-Lyko, Arct &

Pytkowska, 2011).

Iz virov je DPPH metoda najbolj uporabna za doloĉanje antioksidantov, ki so topni v

organskih topilih, predvsem v alkoholih (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Metoda temelji na mehanizmu samskega elektrona in je metoda, ki uporablja stabilen

sintetiĉni radikal 2,2 difenil-1-pikrilhidrazil DPPH (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska,

2011). Temelji na reakciji med stabilnim prostim radikalom DPPH in donorji vodika

(npr. fenoli) (Brand-Williams, Couvelier & Barset, 1995). Raztopina radikala v

metanolu ali etanolu doseţe maksimalno absorbanco v vidnem spektru valovne dolţine

od 515 do 520 nm. Je vijoliĉne barve, ki pa se spremeni kot rezultat reakcij prenosa

elektronov po dodatku antioksidantov. Absorbanca se spremeni kot posledica

spremembe koncentracije antioksidantov v vzorcu. Detekcija je moţna s

spektrofotometriĉnim merjenjem ter elektronsko spinsko resonanco (EPR) (Ratz-Lyko,

Arct & Pytkowska, 2011).

DPPH je uporaben za doloĉanje razliĉnih antioksidantov v polarnih in nepolarnih

topilih.

N

N

NO2O2N

NO2

R OH

N

NH

NO2O2N

NO2

DPPH

R O

DPPH-H

+ +

Slika 7: Reakcija prostega radikala DPPH z dodatkom antioksidanta (Avguštin,

2009)

Z metodo DPPH lahko izmerimo antioksidativno aktivnost na dva naĉina, dinamiĉno in

statiĉno. Pri dinamiĉni metodi se meri hitrost razpada reagenta DPPH po dodatku

vzorca, ki vsebuje polifenole. Pri statiĉni metodi pa se doloĉa uravnoţeno stanje

23

prisotnih antioksidantov, ki reagirajo s prostim radikalom. S prvo metodo se prouĉuje

reaktivnost antioksidanta z drugo pa stehiometriĉno razmerje med antioksidanti in

prostim radikalom (Brand-Williams, Couvelier & Barset, 1995).

Primer reakcije DPPH s cisteinom:

DPPH + RHS DPPH2 + RS

Prosti radikal RS reagira s sebi enako molekulo, ki nastane z vzporedno reakcijo.

RS + RS RS SR

To pomeni, da sta za redukcijo dveh molekul DPPH potrebni dve molekuli cisteina,

razmerje je v tem primeru 1:1.

V primeru da ima molekula, ki reagira z radikalom, dve prosti vezni mesti (npr.

askorbinska kislina – vitamin C) pa je teoretiĉno stehiometriĉno razmerje med DPPH

in askorbinsko kislino 2 :1.

Z + R C C R'

OH OH

+ R C C R'

OH O

ZH

+ R C C R'

OH O

Z R C C R'

O O

ZH +

To pomeni, da je za redukcijo dveh molekul DPPH potrebna ena molekula askorbinske

kisline (Molyneux, 2004),

ali drugaĉe ponazorjeno:

OO

OH OH

HOHC

CH2OH

OH

DPPH

DPPH-H

OO

OH O

HOHC

CH2OH

H

DPPH

DPPH-H

OO

O O

HOHC

CH2OH

H

L - askorbinska kislina semi - dehidroaskorbinska kislina dehidroaskorbinska kislina

Slika 8: Molekula L-askorbinska kislina in izoaskorbinska kislina, vsaka reducira

po dve molekuli DPPH- ja (Brand-Williams, Couvelier & Barset, 1995).

24

Prednosti in slabosti DPPH metode:

Prednosti:

- Testna metoda je poceni, lahka in hitra in za izvedbo je potreben samo UV-

vis spektrofotometer, kar sovpada z njegovo široko uporabo za detekcijo

antioksidativne aktivnosti (Prior, Wu & Schaich, 2005).

- DPPH je stabilen prosti radikal, ki je uporaben brez predhodne priprave kot

pri ABTS-ju (2,2'-azinobis [3-etilobenzotiazolin-6-sulfonatu]) (Prior, Wu &

Schaich, 2005).

- Ima uspešno in visoko stopnjo ponovljivosti (Awika et al., 2003).

- Ima visoko korelacijo z ORAC metodo (Awika et al., 2003).

Slabosti:

- Zapleti nastanejo, ko nekatere testne spojine prekrivajo DPPH pri valovni

dolţni 517 nm. Npr. karotenoidi in antocianini motijo interferenco (Prior,

Wu & Schaich, 2005).

- Razliĉna hitrost reakcij oz. stabilnost reakcij: plato stabilnosti reakcij

doseţen v eni do šestih urah, pri nekaterih komponentah tudi manj kot v eni

minuti (Brand-Williams, Couvelier & Barset, 1995)

- Barvna interferenca lahko vodi do zmanjšanja aktivnosti zaradi obĉutljivosti

na pH (obĉutljiv na nizek pH), svetlobe, kisika in tipa topila (Ratz-Lyko,

Arct & Pytkowska, 2011).

- Metoda ni standardizirana, zaradi ĉesar rezultati niso primerljivi z rezultati

drugih

laboratorijev (Awika, 2003).

DPPH lahko raztopimo tako v metanolu kot etanolu, metoda je namreĉ enako

uĉinkovita. Po izvirni metodi po Bloisu (Blois, 1958, cit. iz Molyneux, 2004) naj bi bilo

idealno pH obmoĉje med 5 in 6.5 z uporabo acetatnega pufra, vendar so kasnejše

raziskave pokazale, da vrednost pH-ja nima vpliva. Koncentracijo DPPH izberemo

med 50–100 L, da so absorbance referenĉne raztopine manjše od 1.0. Primerna

standarda ki se ju najpogosteje uporablja, sta askorbinska kislina in -tokoferol

(Molyneux, 2004). Veliko virov pa navaja kot pogosto uporabljen standard troloks.

25

Troloks (6-hidroksil-2,5,7,8-tetrametilkromova-2-karboksilna kislina) je sintetiĉen,

vodo-topni derivat vitamina E, ki je bil vpeljan s Hoffmanom–LaRoche-jem (Ratz-

Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

FRAP (ferric reducing antioxidant power) – metoda, ki temelji na redukciji

brezbarvnega ţelezovega-tripiridiltriazinskega kompleksa (TPTZ-Fe3+

) v barvni TPTZ–

Fe2+

. Metoda omogoĉa doloĉanje antioksidativne aktivnosti hidrofilne substance, ni pa

uporabna za doloĉanje antioksidativnih uĉinkovin celotnega kozmetiĉnega produkta

(Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

CUPRAC (Copper reducing assay, CRA)

Metoda doloĉanja redukcije Cu2+

(bakrova redukcijska metoda, CRA) je potencialno

uporabna v kozmetiĉni industriji. Razliĉica te metode je CUPRAC, ki temelji na

zmoţnosti redukcije Cu2+

v Cu+. Uporablja se za detekcijo obeh faz; za lipofilne in

hidrofilne antioksidante (Apak et al. 2004, Apak et al., 2005, cit. iz Ratz-Lyko, Arct &

Pytkowska, 2011).

ABTS+ (2,2'-azinobis [3-etilobenzotiazolin-6-sulfonat])

Metoda, kjer se uporablja 2,2'-azinobis [3-etilobenzotiazolin-6-sulfonat] - ABTS, je

dokazana praktiĉna metoda v kozmetiĉni industriji.

ABTS+ kationski radikal je modro-zelen barve in ima maksimalno absorbanco med

valovnimi dolţinami: 417, 645, 734 in 815 nm. V prisotnosti antioksidantov v raztopini,

se reducira in barva raztopine poslediĉno zbledi. Upadanje intenzitete barve je

sorazmerno s koliĉino antioksidantov v raztopini. Prednost uporabe ABTS+ kationa je,

da omogoĉa doloĉanje tako hidrofilnih kot lipofilnih antioksidantov v kozmetiĉnih

proizvodih (Erel, 2004, cit. iz Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Reakcijski mehanizmi s prenosom vodika

HAT mehanizmi so namenjeni merjenjenju zmoţnosti antioksidantov za nevtralizacijo

prostih radikalov v reakcijah transfera vodikovega atoma. Princip teh metod je merjenje

kinetike nastalih reakcij med antioksidanti v vzorcu ter molekularno sondo v prisotnosti

peroksidnega radikala. (Apak, 2007, cit. iz Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Metoda je priporoĉljiva za merjenje lipofilnih antioksidantov na podlagi peroksidnih

radikalov, ki so vkljuĉeni v proces lipidne oksidacije v hrani, kozmetiki in bioloških

sistemih (Apak, 2007, cit. iz Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

26

ORAC (oxygen radical absorbance capacity)

HAT mehanizem je uporaben tudi za doloĉanje absorbcijske kapacitete kisikovih

radikalov (absorbcija kapacitete kisikovih radikalov, ORAC). Ta metoda omogoĉa

merjenje upada fluorescence molekulske sonde s toplotno reakcijo z generiranimi

prostimi hidroksiperoksilnimi radikali.

Prednosti fluorescenĉnih in kemiluminiscenĉnih metod je nizek prag detekcije

antioksidantov, tako hidrofilnih kot lipofilnih in zmoţnost merjenja vsebnosti RKV v

razliĉnih bioloških sistemih. Te metode so uporabne za indirektne analize

antioksidativne aktivnosti v kozmetiki (Jentzsch, Streicger & Engelhart, 2001, cit. iz

Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Elektrokemične metode za določanje antioksidativne aktivnosti

Voltametriĉna metoda se vedno pogosteje uporablja za merjenje antioksidativne

aktivnosti kozmetiĉnih izdelkov. Metoda pripada elektrokemiĉni tehniki merjenja, kjer

se intenzivnost toka pretoka tekoĉine skozi meritveno celico nanaša na elektriĉno

napetost preko aplicirane elektrode, ki je doloĉena. Analiza je predstavljena na grafu kot

voltametriĉna krivulja.

Voltametrija z linearnim odklonom delovne elektrode (LSV) in cikliĉna voltametrija

(CV) sta najbolj praktiĉni metodi v kozmetiĉni industriji (Korotkova, Karbainov &

Shevchuk, 2002, cit. iz Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Cikliĉna voltametrija je nova metoda za ugotavljanje antioksidativne aktivnosti na koţi,

ki temelji na redukcijskih lastnostih nizke molekulske mase antioksidantov (Poljšak,

2012). Ta metoda zagotavlja direktno, hitro (manj kot 1 min), zanesljivo (toĉnost 12 %)

in neinvazivno meritev globalne antioksidativne kapacitete stratum cornea z visoko

prostorsko temporalno resolucijo (Ruffien-Ciszak et al., 2005, cit. iz Poljšak, 2012).

Določitev radikalskega protekcijskega faktorka (RPF) in radikalski koţni statusni

faktor (RSF)

Meritev RPF-ja definira moĉ antioksidantov proti testirani substanci. RPF meritve so

izvedene z uporabo spektroskopske elektronske spinske resonance (ESR) ali

ekvivalentno z elektronsko paramagnetno resonanco (EPR). Je magnetno-resonanĉna

tehnika, ki omogoĉa detekcijo vrst s prostim neveznim elektronom ter indirektno

ocenitev antioksidativne kapacitete kozmetiĉnega produkta (Herrling, Zastrow &

Groth, 1998, cit. iz Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

27

RPF tehnika je uporabna tudi za meritve sprememb antioksidativnih lastnosti po

daljšem ĉasovnem obdobju, kot kontrola kvalitete kozmetiĉne formulacije. Po študijih

Herrling et al., 1998 se antioksidativne lastnosti kozmetiĉnega produkta zmanjšajo do

60 % po treh mesecih skladišĉenja od priĉetka uporabe (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska,

2011).

RSF (radical skin/status factor) zajema razmerje med radikalskim statusom (RS)

nenegovane koţe (RSuntr) in negovane koţe (RStr). RSF je karakteriziran z vplivom

zunanje nege koţe z antioksidanti, ki jih vsebuje kozmetiĉni izdelek ter UV filtrom na

radikalski status koţe. (Herrling et al., 2006, cit. iz Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska,

2011). RSF vrednosti merjene kot funkcija ĉasa, dajajo infomacije o penetracijskem

vedenju reaktivnih sestavin (Herling, Jung & Fuchs, 2007, cit. iz Ratz-Lyko, Arct &

Pytkowska, 2011).

Velika veĉina in vitro metod ne zaznava dejanske naravne biološke procese koţnih

celic, zato se analize ter rezultati pridobljeni z uporabo umetnih celiĉnih linij, ki so

podobne naravni kondiciji, interpretirajo kritiĉno. Za pridobitev zanesljivih rezultatov je

potrebno uporabiti kar nekaj analitiĉnih tehnik, tako in vivo, ex vivo in in vitro (Ratz-

Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Vse omenjene metode pa niso primerne za optimalno merjenje antioksidativne

aktivnosti v kozmetiĉnih izdelkih. Vsaka ima svoje prednosti in slabosti. Ta omejevanja

se nanašajo predvsem na prisotnost tako lipofilne kot hidrofilne faze v kozmetiki, zato

je primerno izbrati metodo, ki je ustrezna glede na tip prisotnega antioksidativnega vira

v vzorcu (Ratz-Lyko, Arct & Pytkowska, 2011).

Metode ekstrakcije kompleksnega matriksa - kreme

Kot navaja študija (Tsai & Lee, 2008) obstajajo razliĉni analizni postopki predpriprave

vzorcev kozmetiĉnih izdelkov – kreme kot kompleksnega matriksa. Med njimi so parna

destilacija, ekstrakcije s topili ter ekstrakcija s trdno fazo. Ti analizni postopki so zelo

zamudni in/ali zahtevajo veĉje volumne topil.

Trdi in emugirani produkti, ki so pogosto vkljuĉeni v analizo kozmetike, morajo biti

spremenjeni v tekoĉe stanje pred analizo. Predpriprava zahteva kar nekaj postopkov:

homogeniziranje vzorca, ekstrakcija s topilom, raztapljanje z ultrazvoĉno kopeljo,

segrevanje in centrifugiranje. Vsi ti koraki prispevajo razliĉne napake (Lee et al., 2006).

28

3 EKSPERIMENTALNI DEL

Laboratorijski raziskovalni eksperimentalni del sem opravljala od janurja 2012 do maja

2012 v laboratorijih Zdravstvene fakultete in Naravoslovnotehniške fakultete Univerze

v Ljubljani.

3.1 REAGENTI IN MATERIALI

Kemikalije:

- radikal DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil, C18H12N5O6), Sigma Aldrich,

Nemĉija

- etanol, 97 %, Fluka®, Švica,

- metanol, 97 %, Fluka®, Švica,

- heksan, 99,9 %, Sigma Aldrich, Nemĉija,

- aceton, 99,9 %, Sigma Aldrich, Nemĉija,

- natrijev klorid (NaCl) , Sigma Aldrich, Nemĉija.

Vzorci: 20 razliĉnih vzorcev krem v skupinah:

- 5 vzorcev mazil,

- 5 vzorcev anti-aging krem,

- 5 vzorcev splošno negovalnih krem,

- 5 vzorcev UV zašĉitnih krem.

Materiali:

- merilne buĉke; 10 mL, 25 mL, 50 mL, Assistent® Nemĉija,

- merilni valji; 50 mL, Assistent® Nemĉija,

- ĉaše; 100 mL, Brand® Nemĉija,

- reagenĉne stekleniĉke z zamaškom; 100 mL, Schot Duran® Nemĉija,

- liji loĉniki; 250 mL; 500 mL, Brand® Nemĉija,

- lijaki za filtriranje, Schot Duran® Nemĉija,

- erlenmajerice; 150 mL, Schot Duran® Nemĉija,

- epruvete; ~ 10 ml, Schot Duran® Nemĉija,

29

- filter papir moder trak, premer 150 mm, Sartorius® AG, Nemĉija,

- pipete; 5 ml, 10 mL, Brand® Nemĉija,

- avtomatska pipeta in nastavki 500–5000 L, Finnpipette Thermo Labsystems,

Finska,

- avtomatska pipeta z nastavki 20-200 L, Finnpipette Thermo Labsystems,

Finska.

OPREMA

- analitska tehtnica Metttler Toledo AG204,

- ultrazvoĉna kopel, Sonis® pio,

- centrifuga, Centic 322A, Tehtnica,

- stresalnik S, Kambiĉ, Slovenija,

- spektrofotometer Shimatzu UV-VIS spectrofotometra UV-2401 PC.

3.2 METODA DELA

3.2.1 Priprava raztopin

Priprava raztopine prostega radikala DPPH v metanol (c = 1 mmol/L)

Za pripravo 100 mL metanolne raztopine smo zatehtali 52 mg prostega radikala DPPH

v 100 mL merilno buĉko in dolili 97 % metanol do oznake. Raztopino smo dobro

premešali ter dali za 30 min v ultrazvoĉno kopel.

Priprava raztopine prostega radikala DPPH v etanolu (c = 1 mmol/L)

Za pripravo 100 mL etanolne raztopine smo zatehtali 52 mg prostega radikala DPPH v

100 mL merilno buĉko in dolili 97 % etanol do oznake. Raztopino smo dobro premešali

ter dali za 30 min v ultrazvoĉno kopel.

Priprava standardne raztopine α-tokoferola v heksanu (c= 1,5 mmol/L)

V 10 ml merilno buĉko smo zatehtali 6.35 mg -tokoferola, dolili pribliţno 10 ml

heksana in ga raztopili v ultrazvoĉni kopeli pri sobni temperaturi. Raztopino smo

razredĉili do oznake in jo premešali. Iz te raztopine smo pripravili razredĉene

standardne raztopine.

30

Priprava razredčenih standardnih raztopin α-tokoferola v heksanu

V 10 ml merilne buĉke smo odpipetirali v tabeli 1 navedene volumne standardne

raztopine -tokoferola in jih dopolnili do oznake s heksanom.

Tabela 1: Razredčene raztopine -tokoferola

Toĉka

v umeritveni

krivulji

Odpipetiran volumen

osnovne standardne

raztopine -tokoferola

( µL)

Koncentracija

razredĉene standardne

raztopine -tokoferola

(µg/L)

1 7.9 0.5

2 63.0 4.0

3 126.0 8.0

4 189.0 12.0

5 252.0 16.0

6 315.0 20.0

Priprava standardne raztopine troloksa (c= 2,5 mmol/L) v raztopini

aceton/voda(1:1)

V 10 ml merilno buĉko smo zatehtali 6.35 mg troloksa, dolili pribliţno 10 ml raztopine

aceton/voda, ki smo ju zmešali v razmerju 1:1 in ga raztopili v ultrazvoĉni kopeli pri

sobni temperaturi. Raztopino smo razredĉili do oznake in jo premešali. Iz te raztopine

smo pripravili razredĉene standardne raztopine.

Priprava razredčenih standardnih raztopin troloksa v raztopini aceton/voda(1:1)

V 10 ml merilne buĉke smo odpipetirali v tabeli 2 navedene volumne standardne

raztopine troloksa in jih dopolnili do oznake z raztopino aceton /voda.

Tabela 2: Razredčene raztopine troloksa

Toĉka

v umeritveni

krivulji

Odpipetiran volumen

osnovne standardne

raztopine troloksa

( µL)

Koncentracija

razredĉene standardne

raztopine troloksa

(µg/L)

1 7.9 0.5

2 31.5 2.0

3 63.0 4.0

4 94.5 6.0

5 126.0 8.0

6 153.9 10.0

31

3.2.2 Priprava umeritvenih krivulj

Priprava umeritvenih krivulj

V epruvete smo odpipetirali po 4 mL posamezne razredĉene standardne raztopine -

tokoferola oz. troloksa, dodali 1 mL reagenta DPPH v etanolu za lipofilno fazo in 1mL

reagenta DPPH v metanolu za hidrofilno fazo. Za slepo raztopino lipofilne faze smo

vzeli heksan, za hidofilno fazo pa aceton/voda. Tako pripravljene raztopine smo pustili

v temnem prostoru 3 h in 30 min, nato pa izmerili njihove absorbance pri valovni

dolţini 517 nm.

3.2.3 Analizni postopki

Priprava vzorcev

Priprava vseh dvajsetih vzorcev je potekala po postopku opisanem v Shemi 1, ki je

povzet in nadgrajen po (Brand-Williams, Couvelier & Berset, 1995), (Singh et al.,

2006), (Teow et al., 2006), (Lin et al., 2009), (Molyneux, 2004; Bondet, Brand-

Williams & Berset, 1995).

32

Shema 1: Priprava vzorcev – 1. dan

Filtrat 1, filtrat 2 in filtrat 3 shranimo v hladilniku ĉez noĉ.

33

Shema 2: Priprava vzorcev – 2. in 3.dan

Za filtrat 2 in filrat 3 izvedemo enak postopek kot je opisan v Shemi 2.

Spektrofotometrično merjenje absorbanc

Povzeto po postopku (Molyneux, 2004; Bondet, Brand-Williams & Berset, 1997) in

(Brand-Williams, Couvelier & Barset, 1995), smo iz lipofilne oz. hidrofilne faze

filtratov (1, 2, 3) odpipetirali po 4 mL vzorca in mu dodali po 1 mL reagenta DPPH v

etanolu za lipofilno fazo oziroma po 1 mL reagenta DPPH v metanolu za hidrofilno

fazo.

Tako pripravljene raztopine smo pustili v temnem prostoru 3 h in 30 min, nato pa

izmerili njihove absorbance pri valovni dolţini 517 nm. Vse vzorce smo analizirali v

treh ponovitvah. Za slepo vrednost nepolarne faze smo uporabili topilo heksan ter za

polarno fazo mešanico aceton/ voda v razmerju 1:1. Pripravili smo jih po enakem

postopku kot vzorce.

34

3.2.4 Statistična obdelava podatkov

Eksperimentalno pridobljene podatke o CAA pri razliĉnih skupinah krem smo

statistiĉno obdelali z metodo ANOVA, LSD. Opravili smo jo v programu IBM SPSS,

verzija 20.

3.3 REZULTATI Z DISKUSIJO

3.3.1 Vrednotenje veljavnosti zastavljenih hipotez

H1: Največjo celokupno antioksidativno aktivnost imajo kreme, ki jih deklaracije

opredeljujejo kot anti-aging.

Iz grafa 1 je razvidno, da imajo v povpreĉju kreme, ki jih deklaracije opredeljujejo

kot anti-aging najvišjo CAA med preiskovanimi tipi krem, vendar razlike v vrednostih

CAA med skupinami niso statistiĉno pomembne (F=0,582, 2p>0.05, Priloga 5, Tabeli

10 in 11). Hipoteza 1 ni potrjena.

Graf 1: Povprečna celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev

preučevanih tipov krem

H2: Najniţjo celokupno antioksidativno aktivnost imajo kreme, ki jih deklaracije

opredeljujejo kot splošno negovalne.

10,09

15,76

12,63 13,62

,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

a b c d

mg

TAA

/10

0 g

kre

me

Vzorci

Nizi1a-UV zaščitne

b-anti-aging kreme

c-splošno negovalne kreme

d-zeliščna mazila

35

Iz grafa 1 lahko prav tako ugotovimo, da kreme, ki jih deklaracija opredeljuje kot

splošno negovalne kreme, nimajo najniţje povpreĉne CAA med preiskovanimi tipi

krem. Niţjo povpreĉno CAA imajo kreme, ki jih deklaracija opredeljuje kot UV

zašĉitne kreme. Ob tem je potrebno poudariti, da razlike v vrednostih CAA med

skupinami krem niso statistiĉno pomembne (F=0,582, 2p>0.05, Priloga 5, Tabeli 10 in

11), zato hipoteza 2 ni potrjena.

H3: Celokupna antioksidativna aktivnost krem, ki jih deklaracije opredeljujejo kot

UV zaščitne, je višja v primerjavi s splošno negovalnimi kremami.

Iz grafa 1 je razvidno, da imajo kreme, ki jih deklaracija opredeljuje kot UV zašĉitne v

primerjavi s splošno negovalnimi kremami nekoliko niţjo povreĉno CAA. To se sklada

s priĉakovanji, saj je razlika med tema tipoma krem predvsem v njunem namenu. UV

zašĉitne kreme šĉitijo koţo pred UV ţarki ter pred photoagingom, splošno negovalne

kreme pa koţo negujejo in oskrbujejo s hranili. UV-zašĉitne kreme, ki vsebujejo

kombinacijo UV zašĉtinih filtrov z antioksidanti, dajejo visoko zašĉito pred UV ţarki.

UV zašĉitne kreme, ki vsebujejo nanodelce titanovega oksida (TiO2 ) imajo zniţano

TAA, saj le ti pod vplivom UV ţarĉenja pospešijo nastajanje prostih radikalov in

poslediĉno poveĉanje oksidativnega stresa (Serpone et al. 2001, Poljšak, 2011). Ob tem

pa je navkljub zaznanim razlikam v povpreĉnih vrednostih TAA potrebno poudariti, da

razlike v vrednostih TAA med skupinami krem niso statistiĉno pomembne (F=0,582,

2p>0.05, Priloga 5, Tabeli 10 in 11). Hipoteza 3 ni potrjena.

H4: Kreme, ki glede na opredelitev po deklaraciji, spadajo v isti tip krem, imajo

primerljivo celokupno antioksidativno aktivnost.

Iz grafa 2 lahko razberemo, da kreme, ki jih deklaracija opredeljuje kot UV zašĉitne

kreme nimajo primerljive CAA (SD=5,52).

36

Graf 2: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev UV zaščitnih krem

Iz grafa 3 lahko razberemo, da kreme, ki jih deklaracija opredeljuje kot anti-aging

kreme nimajo primerljive CAA (SD=8,13).

Graf 3: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev anti-aging krem

003

015 015

012

006

0

5

10

15

20

25

30

a1 a2 a3 a4 a5

mg

TAA

/10

0 g

kre

me

Vzorci UV zaščitnih krem

005

009

020 021

024

0

5

10

15

20

25

30

b1 b2 b3 b4 b5

mg

TAA

/10

0 g

kre

me

Vzorci anti-aging krem

37

Iz grafa 4 lahko razberemo, da kreme, ki jih deklaracija opredeljuje kot splošno

negovalne kreme nimajo primerljive CAA (SD=7,23).

Graf 4: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev splošno negovalnih

krem

Iz grafa 5 lahko razberemo, da kreme, ki jih deklaracija opredeljuje kot zelišĉna mazila

nimajo primerljive CAA (SD=6,19).

Graf 5: Celokupna antioksidativna aktivnost (CAA) vzorcev zeliščnih mazil

018

011

003

022

010

0

5

10

15

20

25

30

c1 c2 c3 c4 c5

mg

TAA

/10

0 g

kre

me

Vzorci splošno negovalnih krem

024

007

012

015

011

0

5

10

15

20

25

30

d1 d2 d3 d4 d5

mg

TAA

/10

0 g

kre

me

Vzorci zeliščnih mazil

38

Glede na zakljuĉke za posamezne tipe krem lahko povzamemo, da v nobenem primeru

hipoteza 4 ne velja.

H5: Pri vzorcih vseh tipov krem k celokupni antioksidativni aktivnosti

enakovredno prispevata lipofilna in hidrofilna faza ekstrakcije.

Hipoteza 5 je zavrnjena. Iz grafa 6 je razvidno, da so prispevki lipofilne in hidrofilne

faze ekstrakcije k deleţu celokupne antioksidativne aktivnosti pri vseh tipih krem

neenakovredni. Opazimo lahko tudi, da se ta prispevek razlikuje tudi znotraj

posameznega tipa krem z izjemo splošno negovalnih krem, kjer je v vseh preiskovanih

vzorcih veĉji prispevek CAA iz hidrofilne faze.

Graf 6: Antioksidativna aktivnost vzorcev krem v hidrofilni in lipofilni fazi

ekstrakcije

Za namen podrobnejšega vpogleda v sestavo posameznih krem smo opravili analizo

sestavin krem v deklaracijah (Tabela 6, Priloga 1).

Ugotovimo lahko, da so nekatere sestavine specifiĉne za doloĉen tip kreme. Primer

antioksidantov kot vir sestavin aktivnih uĉinkovin: V tipu UV zašĉitnih krem so

najpogostejši antioksidanti v obliki aktivnih uĉinkovin sledeĉi: livuliniĉna kislina, p-

anisiĉna kislina, tokoferol in tokoferil acetat. V tipu krem anti-aging: askorbil palmitat,

levuliniĉna kislina, tokoferol in ubikinon. V tipu splošno negovalnih krem: askorbil

0

5

10

15

20

25

30

a1 a2 a3 a4 a5 b1 b2 b3 b4 b5 c1 c2 c3 c4 c5 d1 d2 d3 d4 d5

a b c d

mg

TA

A/1

00

g k

rem

e

Vzorci

hidrofilna faza lipofilna faza

a-UV zaščitne

b-anti-aging kreme c-splošno negovalne kreme

d-zeliščna mazila

39

palmitat, tokoferol, lecitin in askorbinska kislina. Tip zelišĉnih mazil pa antioksidantov

ne vsebuje.

Naš namen je bil, da kreme sistematiĉno razvrstimo glede na skupne sestavine v

posamezne skupine. Za posplošitev navedenih rezultatov bi morali poveĉati vzorec

posameznih tipov krem.

H6: Za vzorce vseh tipov krem ni razvidna povezava med celokupno

antioksidativno aktivnostjo in ceno kreme.

Hipotezo 6 lahko potrdimo. Vzorci krem, ki so bili vkljuĉeni v raziskavo se glede na

cenovni razpon gibljejo od 3,40 EUR/100 g kreme do 53,0 EUR/100 g kreme. Glede na

primerjavo cene posameznih krem in mazil smo ugotovili, da CAA ne vpliva na ceno.

Opaziti je celo, da je krema z najmanjšo CAA najdraţja. Kreme v srednjem cenovnem

razredu

(23,78 EUR/100 g kreme) imajo najvišje CAA. Kreme nizke cenovne vrednosti

(7,28 EUR/100 g kreme) pa imajo srednjo CAA.

Graf 7: Cene vzorcev posameznih tipov krem

0

5

10

15

20

25

30

a1 a2 a3 a4 a5 b1 b2 b3 b4 b5 c1 c2 c3 c4 c5 d1 d2 d3 d4 d5

a b c d

Ce

na

[EU

R]

Vzorci

a-UV zaščitne

b-anti-aging kreme

c-splošno negovalne kreme

d-zeliščna mazila

40

3.3.2 Omejitve in predlogi za izboljšavo in nadgradnjo raziskave

(1) Za podrobnejše razumevanje o vplivih na antioksidativno aktivnost v

kozmetiĉnih izdelkih bi bilo potrebno spremljati še dodatne dejavnike, kot so:

temperatura, prisotnost kisika, izpostavljenosti UV sevanju, ĉasovno obdobje od

odprtja izdelka do izteka roka uporabe itd. Iz študije (Graf et al., 2008) je namreĉ

razbrati odvisnost sestave in razmerja aktivnih sestavin kozmetiĉnih izdelkov od

omenjenih dejavnikov. Tako se npr. celokupna antioksidativna aktivnost emulzij

shranjenih pri sobni temperaturi s ĉasom zmanjšuje. Prav tako se CAA v s

povišanjem temperature (T= 40°C) pri vseh omenjenih formulacijah zmanjšuje s

ĉasom, vendar bistveno bolj intenzivno kot pri sobni T. V odvisnosti CAA od

UV sevanja pa študija ugotavlja, da UV sevanje zmanjšuje CAA.

(2) Ugotovitve naše raziskave bi lahko posplošili na osnovi vkljuĉitve veĉjega

števila vzorcev krem.

(3) Raziskavo bi izboljšali tudi s tem, da bi primerjali rezultate pridobljene po vsaj

dveh razliĉnih metodah (npr. DPPH in ABTS). Poleg merjenja vrednosti

celokupne antioksidativne aktivnosti , bi bilo za