VIII Ogólnopolski Festiwal Starych Ciągników i Maszyn Rolniczych w Wilkowicach
Oksygenazy hemowe –nowe funkcje starych...
Transcript of Oksygenazy hemowe –nowe funkcje starych...
Biochemia stresu oksydacyjnego
Literatura:Grzegorz Bartosz „Druga twarz tlenu”
Barry Halliwell & John Gutteridge „Free radicals in biology and medicine”
Oksygenazy hemowe – nowe funkcje starych enzymów
Wykład 5
Dulak et al. Circulation 2008
Functions of heme oxygenase
HO-1Fe2+
antioxidant anti-inflammatory
anti-apoptoticpro-angiogeniccytoprotection
ACTIVITYPRODUCT MECHANISM
ferritin synthesis
iron ATP-ase pump
ROSBVR
activation of sGC leadingto cGMP production
p38 MAPK regulation
BILIVERDIN
BILIRUBIN
CO
ROS scavenging
Inhibition of complement
anti-apoptoticanti-proliferative anti-thrombotic
anti-inflammatorypro-angiogeniccytoprotection
antioxidant anti-inflammatory
anti-apoptoticcytoprotection
HEME
others
Degradacja hemu
Grochot-Przeczek et al. Thromb haemost
Bilirubina reaguje z rodnikiem hydroksylowym, tlenem singletowym i anionorodnikiem ponadtlenkowym
Vascular lesion formation at 14 days after a wire-injury of femoralarteries in the wild-type and HO-1-/- mice
(Duckers et al. Nature Med 2001)
WT mice HO-1-/- mice
HO-1 deficiency augments neointima formation in mice
Białka hemowe są wszędzie…
mioglobina
cytochromy, peroksydazy, katalazy, syntazy tlenku azotu, oksydazy NADPH…..
hemoglobina
Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008
Mobilizacja EPC ze szpiku
- EPC: komórki progenitorowe śródbłonka- VEGF: vascular endothelial growth factor- MMP-9: matrix metalloproteinase-9- eNOS: endothelial nitric oxide synthase
SDF-1EPC
EPC
Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008
Regulacja mobilizacji EPC w hipoksji
- W cukrzycy zmniejszony jest poziom fosforylacji eNOS przez kinazy PI3K/Akt,przez co zmniejsza się produkcja NO.
- Nasilony stres oksydacyjny i zwiększona produkcja anionorodnikaponadtlenkowego prowadzi do nasilonej syntezy nadtlenoazotynu (ONOO-) izmniejszenia dostępności NO.
- W ranach cukrzycowych osłabiona jest synteza SDF-1, co zmniejsza napływkomórek progenitorowych do uszkodzonych tkanek. To przyczynia się doupośledzenia angiogenezy i opóźnia gojenie.
- Cukrzyca powoduje również zmniejszenie liczby EPC w szpiku.
WT db/db
Komórki progenitorowe śródbłonka (EPC)
WT
db/db
EPC
wt db0.0000
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
0.0005
0.0006
0.0007
*
% k
omór
ekPeripheral blood
CD45(-), Sca-1(+), KDR(+)
% o
f ce
lls
Kotlinowski et al. In preparation; Grochot-Przeczek et al. PLoS One 2009
db/db WT
Day 1
Day 3
Day 8
Day 17
Day 0
Wounded skin
Proangiogenne komórki progenitorowe% o
f ce
lls
Num
ber
of
cells
Num
ber
of
connect
ions
Tota
l le
ngth
of
spro
uts
proliferation migration tube formation
control diabetic
Num
ber
of
connect
ions
paracrine angiogenic activity
empty medium
growthy medium
WT db/db
spheroid outgrowthtube formationmigration
control db/dbdb/db
Kotlinowski et al., in preparation
spheroid outgrowth
control control db/db
Odtwarzanie krążenia w mięśniu myszy z cukrzycą
Ebrahimian et al. Am J Pathol 2006
diabetes diabetes + NAC
diabetes + NAC diabetes
NAC - N-acetylocysteina
Aktywność oksygenaz hemowych
oksygenaza hemowa
Ferritin
uszkodzenie tkanek
białkahemowe
Fe2+uszkodzenie tkanek
bilirubina ochronabiliwerdyna
CO
ochrona
rozpuszczalna cylaza guanylanowa
cGMPGTP
pompa żelazowa
ochrona
Hem
ochronap38
BvR
Skutki braku HO-1 u myszy
Na istotność HO-1 wskazuję skutki jej braku u myszy: zwiększonaperoksydacja lipidów, uszkodzenie śródbłonka i wątroby, niedorozwójgonad, niepłodność, przedwczesna śmierć.
- Fibroblasty myszy HO-1-/- są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny.
After Poss & Tonegawa, PNAS 1997.
0
100
200
300
400
HO-1+/+
Enhanced free radicals production by murine HO-1-/- fibroblasts
% F
luore
scene o
f untr
eate
d c
ells
cells treated with 50 µM hemin for 24 h
0
20
40
60
80
100
Reduced survival of murine HO-1-/- fibroblasts
cells treated with 100 µM hemin for 24 h
% S
urv
ival
HO-1-/- HO-1+/+ HO-1-/-
*
*
Yet et al. FASEB J. 2003.
Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych
lesion
lesion
lipid accumulations
Yet et al. FASEB J. 2003.
Brak HO-1 u człowieka
U dwóch znanych pacjentów pozbawionych HO-1:
* obecność wysoce oksydowanych lipoprotein niskiej gęstości (LDL)we krwi
* bardzo duża wrażliwość komórek śródbłonka na uszkodzenia
Nasilające się reakcje zapalne i ciągły stres oksydacyjnyprowadzą do:
* poważnych uszkodzeń śródbłonka
* tworzenie nacieków tłuszczowych i blaszek miażdżycowych wtętnicach
Nadekspresja HO-1 zwiększa syntezę VEGF poprzez aktywację promotora
(komórki HMEC-1 transfekowane przejściowo pcDNA-HO1)
Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003
VEG
F [
% o
f contr
ol]
0
50
100
150
200
250
300
*
VEGF protein
control b-gal HO-1
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
VEG
F/G
APD
H r
ati
o
*
VEGF mRNA
control b-gal HO-1
Lum
inesc
ence [
% o
f contr
ol]
0
100
200
300
400
b-gal HO-1
*
VEGF promoter activity
pGL2-VEGF
Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal 2003, 2007
HO-1
CO
cGMP
p38
PKG CREB
PKA
AP-1AP-1
PI3K Akt
VEGF HO-1 cDNA
ββββgal cDNA
VEGF +
VEGF + VEGF + CORM
Nadekspresja HO-1 lub podanie CO ułatwia tworzenie kapilar
Grochot-Przeczek et al., ARS 2013.
Wpływ braku HO-1 na proliferację EPC
[PCNA staining]
EPC WT EPC KOVEGF VEGFcontrol control
*
*
0
20
40
60
80
100
Control
% o
f posi
tive c
ells
WT
KO
VEGF30 ng/ml
*
*
Grochot-Przeczek, ARS 2013, Deshane et al. J Exp Med, 2007
WT
KO
WT
KO
0
10
20
30
40
50
num
ber
of
cells
control SDF-1 CM
*
**
control SDF-1 CM
HO-1 ułatwia migrację EPC
Control H2O2 50 uM
Annexin
V p
osi
tive c
ells
[% o
f contr
ol]
*
** #
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900HO-1 +/+
HO-1 -/-
Wpływ braku HO-1 na wrażliwość EPC na stres oksydacyjny
Grochot-Przeczek et al., ARS 2013.
Apoptosis[Annexin V staining]
HO-1+/+
Rh-agglutinin Merged PKH 67
Deshane et al. J Exp Med, 2007
HO-1-/-
Rh-agglutinin Merged PKH 67
Wpływ braku HO-1 na aktywność EPC
Taha et al. ATVB, 2010
HO-1 efficacy is variable in human population because of (GT)n promoter polymorphism
(GT)n
Exon 10
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
allele
fre
quency
number of GT repeats
S M L
Promoter polymorphism and HO-1 expression
Taha et al., ATVB 2010.
*
***
0
0.004
0.008
0.012
S M L
0
0.06
0.12
0.18
S M L
**
***
control
H2O2
0
0.2
0.4
0.6
S M L
CoPP
***
0
0.4
0.8
1.2
1.6
S MHem
e o
xygenase
-1 m
RN
A e
xpre
ssio
n (
HO
-1/E
F2)
15d-PGJ2
***
L
H2O2 [uM]
control 100 200 400 800
***
*** *** ***
*******
*
0
20
40
60
80
100
120
MT
T [
% o
f contr
ol]
S M L
*
0
5
10
15
20
25
S M L
GSH
: G
SSG
[nm
ol/
mg]
GSH : GSSG
viability
***
**
0
100
200
300
400Brd
U r
educti
on [
% o
f contr
ol]
S M Lcontrol
Wpływ polimorfizmu HO-1 na proliferację śródbłonka
VEGF
Taha et al. ATVB 2010.
[ELISA]
IL-1ββββ
#
#
*
*
0
50
100
150
200
250
S M L
IL-1
β[p
g/m
l]
Allele
#
#
Control
LPS
Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną
Taha et al. ATVB 2010.
cell proliferation
proinflammatory cytokines production
oxidative stress resistance
number of GT repeats
HO-1 expression and activity
Polimorfizm promotora HO-1
Grochot-Przeczek et al. Clinical Science
Rewaskularyzacja: HO-1 i cukrzyca
d0 d7 d280.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
WT ctr
WT STZ
HET ctr
HET STZ
day after surgery
bloo
d pe
rfus
ion
[isc
hem
ic:n
on-i
sche
mic
]
**
$
d0 d7 d28
WT ctr
WT STZ
HET ctr
HET STZ
day after surgery
WT ctr
WT STZ
HET ctr
HET STZ
*
**
* *
###
###
Oksygenaza hemowa-1
Skutki indukcji HO-1:
• Cytoprotekcja (oporność na stres oksydacyjny)
• Immunomodulacja(zahamowanie zapalenia, regulacja komórek Treg)
• Modulacja angiogenezy
heme
HGF
inflammatory cytokines
oxidants hypoxia
irradiation
chemo-
therapy
after Otterbein et al. 2003
heme
Red - PCNA Blue - DAPI Green - lectin
Waś et al. Free Radicals Biol Med. 2011
Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej
10 20 300
100100
125
150
* * ** * *
***
*** *
Time [weeks]
Weig
ht
incre
ase
[%
] +/++/--/-
HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-
10 20 300
25
50
75
100
w 4 w 6
w17 w 26 w 27
Time [weeks]
Mic
e w
ith t
um
ors
[%]
+/++/--/-
10 20 300
25
50
75
100
Time [weeks]
Surv
ival [%
]
+/++/--/-
Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej
Waś et al. Free Radicals Biol Med. 2011
papilloma
carcinoma
papilloma
carcinoma
HO-1 +/+
HO-1 -/+
HO-1 -/-
Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej
Waś et al. Free Radicals Biol Med. 2011
Was et al. Am J Pathol 2006, Was et al. in preparation
HO-1 overexpression in B16(F10) melanoma cells
mRNA
0
40
80
120
0 25 50 100 200 400 800
% o
f livin
g c
ells
H2O2 [µµµµM]
HO-1
control
β-gal
* **
*
viability
Endothelial cells incubated in conditioned media
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
control
Pro
life
rati
on [
OD
] proliferation*
H2O2
[50 µM]
*
#
0
20
40
60
80
0 1 2 3weeks after injection
num
ber
of m
etas
tase
s WT
HO-1
p=0.054
*
*
HO-1 zwiększa liczbę przerzutów w płucach
Waś et al. Am J Pathol, 2006.
*
*
Wpływ HO-1 na przerzutowanie czerniaka
Day of experiment
0
20
40
60
80
10 20 30 40 50
Surv
ival ra
te [
%]
WT
HO-1
100
P=0.017
Waś et al. Am J Pathol, 2006.
Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach czerniaka na przeżywalność myszy
HO-1 increases metastatic potential of melanomas
Was et al. in preparation
0
100
200
Mig
rati
on [
% o
f contr
ol]
control
*
HO-1
Migration
0
100
200
Invasi
on [
% o
f contr
ol]
*
control HO-1
Invasion
control HO-1
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
control HO-1
mela
nin
[m
g/1
x106
cells]
melanin content
ROS and melanogenesis
0
10
20
30
40
50
60
control controlNAC
HO-1 HO-1NAC
RLU
/ µµ µµg p
rote
in
*
Effect of HO-1 on ROS production Effect of H2O2 on melanin content
Mela
nin
[m
g/1
06
cells]
0
0.002
0.004
0.006
0.008
control 0.5 5.0
H2O2 [µM]
*
*
Effect of NAC on melanin content
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
control 1.0 5.0
NAC [mM]
Mela
nin
[m
g/1
06
cells]
ctrlNAC-1
NAC-5
*
*
0
20
40
60
80
100
control 1 5
NAC [mM]
Tyr/
EF2
Effect of NAC on tyrosinase expression
*
Was et al. in preparation
HO-1 may promote progression of melanoma throughincreased cell survival and proliferation under oxidativestress, increased angiogenesis, and by formation of lessmature and more invasive cells, what can be associated withreduced production of ROS.
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
Effect of HO-1 on viability and proliferation of C2C12 cells
HO
-1/E
F2
*
Tubulin
HO-1
0
3
6
9
12
WT Luc-GFP Luc-GFP-HO1
Luc-GFP Luc-GFP-HO1WT
HO-1DAPI
NCHO-1
Luc-GFP-HO1
*
0
300
600
900
1200
HO
-1 a
cti
vit
y
[% o
f contr
ol]
Luc-GFPWT Luc-GFP-HO1
*
+NAC
*
0
40000
80000
120000
**
Luc-GFP Luc-GFPHO-1
fluore
scence [
AU
]
+NAC
LD
H r
ele
ase
[% o
f contr
ol]
* #
#
0
200
400
600
800
0.5 1.0 2.0
Luc-GFP
Luc-GFP-HO1
H2O2 [mmol/L]
0
40
80
120
PC
NA p
osi
tive c
ells
[%]
Luc-GFP Luc-GFP-HO1
*
ROS
mortality
proliferation
HO-1 overexpression and survival of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice
C2C12-Luc-GFP
day 2
day 11
day 22
C2C12-Luc-GFP-HO1
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
HO-1 overexpression and survival of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice
*
*
0
4000000
8000000
12000000
16000000
20000000
0 2 11 22
tota
l lu
cif
era
se a
cti
vit
y[R
LU
]
Luc-GFP
Luc-GFP-HO1
days after transplantation
Muscles *
0
1000000
2000000
3000000
4000000
Luc-GFP
Lucif
era
se a
cti
vit
y[R
LU
/mg o
f pro
tein
]
Luc-GFP-HO1
Lungs
0
4
8
12
16
20
Luc-GFP
*
Luc-GFP-HO1
Lucif
era
se a
cti
vit
y[R
LU
/mg o
f pro
tein
]
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
HO-1 overexpression and growth of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice
**
0
2
4
6
8
10
GFP-Luc
Num
ber
of
mit
ose
s/fi
eld day 11
day 22
GFP-Luc-HO1
Luc-GFP-HO1
Luc-GFP day 22
day 11 day 22
day 11
mitotic index
PCNA staining
H&E staining
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
GFP staining
Luc-GFP
HO-1 overexpression and growth of C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice
negative control
Luc-GFP-HO1
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
Expression of HO-1, SDF-1, MyoD and myogenin in C2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice
HO-1 *
0
0.04
0.08
0.12
0.16
0.2
GFP-Luc
HO
-1/E
F2
GFP-Luc-HO1
*
0
0.01
0.02
0.03
0.04
SD
F-1
/EF2
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
*
0
0.01
0.02
0.03
0.04
MyoD
/EF2
GFP-Luc GFP-Luc-HO10
0.01
0.02
Myogenin
/EF2
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
SDF-1
MyoD Myogenin
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
HO-1 overexpression reduces formation of myotubes by C2C12 cells
Confluent C2C12 cells, cultured for 5 days in 10% FBS (control medium)
Confluent C2C12 cells, cultured for 5 days in 2% Horse Serum (differentation medium)
C2C12 WT
C2C12 WT
C2C12-Luc-GFP
C2C12-Luc-GFP
C2C12-Luc-GFP-HO1
C2C12-Luc-GFP-HO1
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
HO-1 inhibits myoblast differentiation
#
0
0.02
0.04
0.06
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
Mef2
/EF2
Mef2 #
0
0.01
0.02
0.03
0.04
Myf5
/EF2
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
Myf5
#
0
0.02
0.04
0.06
MyoD
/EF2
*#
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
*
MyoD
*
0
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
Myf6
/EF2
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
Myf6
#
*#0
0.1
0.2
0.3
Myogenin
/EF2
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
myogenin
0
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
MH
C/E
F2
0.0005 #
* *#
GFP-Luc GFP-Luc-HO1
MHC
Growthmedium
Differentiationmedium
MyoD myogenin Myf6
Myf5Myf6
CPK, MHCMef2
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
Effect of HO-1 can be reversed by siRNA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
HO-1 Luc-GFP HO-1 sc HO-1siRNA
mio
geni
na/E
F2
Miogenina
FBS
HS
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
HO-1 Luc-GFP HO-1 sc HO-1siRNA
Myo
D/E
F2
MyoD
FBS
HS
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
Effect of HO-1 on myomirs
0
2
4
6
Luc-GFP Luc-GFP-HO1
#
* *
miR
-1/U
6
#
* *0
0.002
0.004
0.006
Luc-GFP Luc-GFP-HO1
miR
-133a/U
6
0
2
4
6
miR
-133b/U
6
#
* *
Luc-GFP Luc-GFP-HO10
10
20
30
miR
-206/U
6
Luc-GFP Luc-GFP-HO1
#
* *
miR-1 miR-133a
miR-133b miR-206
Growth medium
Differentiation medium
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012
Myoblast differentation is inhibited by HO-1 products
#
##
0
0.02
0.04
0.06
0.08
Luc-GFP CoPP bilirubin biliverdin FeCl3 iCORM CORM
MyoD
/EF2
# #
0
0.04
0.08
0.12
0.16
myogenin
/EF2
Luc-GFP CoPP bilirubin biliverdin FeCl3 iCORM CORM
Luc-GFP CoPP bilirubin biliverdin FeCl3 iCORM CORM
#
#
#
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
MH
C/E
F2
Growthmedium
Differentiationmedium
MyoD
myogenin
MHC
Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012