1

OKSIDACIJSKI STRES I KARCINOGENEZA

Kolegij: SLOBODNI RADIKALI I ANTIOKSIDANSI U ZDRAVLJU I BOLESTI

LADA RUMORAZavod za medicinsku biokemiju i hematologiju

Reaktivne kisikove vrste, ROS(engl. reactive oxygen species)

� slobodni radikal – molekula ili atom s jednim ili više nesparenih elektrona u vanjskoj orbitali

� biološki značajne ROS:– superoksidni radikal (O2.-)– vodikov peroksid (H2O2, nije radikal)– hidroksilni radikal (HO., jako reaktivan)

2

NADH-Q-

oksidoreduktaza

I

Q-citokrom c-

oksidoreduktaza

III

sukcinat-Q-

reduktaza

II

citokrom-c-

oksidaza

IV

sukcinat fumaratNADH NAD+

citokrom c

O2.-

1/2O2+

2H+

H2O

O2 O2

MnSODH2O2

katalaza / GSH peroksidazaH2O + O2

unutrašnjamembrana

mitohondrija

Drugi izvori ROS u stanici

� enzimska aktivnost– NADPH oksidaza, ksantinska oksidaza, citokrom P450, lipooksigenaza, ciklooksigenaza

� samo-oksidacija malih molekula– katekolamini, flavini

� redoks-ciklus ksenobiotika– parakvat, nitrofurantoin, adriamicin

3

Djelovanja ROS-a

� oštećenje različitih makromolekula u stanici(nukleinske kiseline, proteini, lipidi, ugljikohidrati)

� poticanje ili inhibicija različitih signalnih putova (djelovanje na proteinske kinaze, fosfataze, proteaze, transkripcijske faktore)

� ekspresija gena (različiti biološki odgovori stanice)

� poticanje ili inhibicija proliferacije stanica

� umiranje stanica (nekroza, apoptoza)

Biološki odgovor stanice ovisi o:

� vrsti stanice

� vrsti ROS-a

� redoks-statusu stanice

� dužini vremena izlaganja ROS-u

� koncentraciji ROS-a

� sposobnosti stanice da ukloni i detoksicira ROS (antioksidacijski sustav)

4

Antioksidacijski sustav(unutarstanične, membranske i izvanstanične molekule)

enzimi i proteinisuperoksidna dismutaza

katalaza

glutationska peroksidaza

glutationska S-transferaza

feritin

transferin

laktoferin

ceruloplazmin

albumin

haptoglobin

hemopeksin

glutationska reduktaza

male molekule

ubikinon (koenzim Q)

vitamin E

karotenoidi

vitamin C

glutation

mokraćna kiselina (urati)bilirubin

tioredoksin

glutaredoksin

liponska kiselina

flavonoidi

Ključne značajke karcinogeneze(Douglas Hanahan & Robert A. Weinberg)

1. sinteza faktora rasta i poticanje proliferacije stanica

2. neosjetljivost na signale koji sprječavaju rast stanica

3. izbjegavanje umiranja stanica procesom apoptoze

4. neograničen replikacijski potencijal

5. poticanje i održavanje angiogeneze> 24 faktora koji potiču angiogenezu (VEGF, FGF1/2) te sličan

broj endogenih inhibicijskih proteina (trombospondin-1, ββββ-interferon)

6. invazija tkiva i metastaziranje

VEGF = vascular endothelial growth factor

FGF = fibroblast growth factor

5

HOMEOSTAZA

umiranje stanicaproliferacija stanica

RAZVOJ TUMORA

Oksidacijski stres i karcinogenezapotaknuti metalima

� ŽELJEZO– Fe →→→→ ROS →→→→ oštećenja DNA– istraživanja ukazuju na povezanost između ↑↑↑↑ konc. Fe i ↑↑↑↑ rizika za razvoj različitih bolesti (tumori);manji rizik u djece i žena u premenopauzi

– konzumiranje mesa →→→→ kolorektalni karcinom– genska hemokromatoza →→→→ hepatocelularni karcinom– profesionalna izloženost azbestu (maseni udio Fe oko 30%) →→→→ azbestoza →→→→ mezoteliom pleure, karcinom pluća, karcinom kolona

6

� BAKAR– Cu1+ (Fe2+) + H2O2 →→→→ Cu2+ (Fe3+) + OH. + OH- (Fentonova reakcija)Cu2+ (Fe3+) + O2.- →→→→ Cu1+ (Fe2+) + O2∑∑∑∑: H2O2 + O2.- →→→→ O2 + OH. + OH- (Haber-Weissova reakcija)

– RSH + Cu2+ →→→→ RS. + Cu1+ + H+

– pro-oksidans →→→→ lipidna peroksidacija

– ↑↑↑↑ konc. Cu →→→→ ↑↑↑↑ proliferacija tumorskih stanica

– tetratiomolibdat (TM) →→→→ veže Cu unesen hranom prije apsorpcije u tijelu;spriječen rast postojećih tumora i nastanak novih tumora

KROM

1. GSH i Cr(VI) → redukcija Cr(VI) u Cr(V)2. osim GSH, Cr(VI) mogu reducirati i askorbat, NAD(P)H, cistein,liponska kiselina, fruktoza, riboza i dr.

3. Cr(V) reagira s H2O2 → ·OH → oštećenja DNA, aktivacija gena

4. i 5. GS· može oštetiti stanične strukture, ali može i reagirati s drugim

tiolnim molekulama u oksigeniranim tkivima → O2·-

6. O2·- reducira Cr(VI) → Cr(V)

7. Cr(V) reagira s H2O2 → ·OH → oštećenja DNA, aktivacija gena8. redukcija Cr(V) u Cr(IV) staničnim reduktantima (askorbat, GSH i dr.)

9. Cr(IV) reagira s H2O2 → ·OH → oštećenja DNA, aktivacija gena

7

� KROM

– Cr(VI) u stanici oštećuje DNA (Cr-DNA adukti, stvaranje unakrsnih veza između DNA i proteina te između 2 DNA molekule, oksidacijska oštećenja)

– Cr-DNA adukti →→→→ mutagenost i genotoksičnost Cr(VI)

– Cr(VI) →→→→ karcinom pluća, karcinom dojke, tumori respiracijskog sustava

� KADMIJ

– neizravno stvara slobodne radikale:može zamijeniti Fe i Cu u proteinima

– jako toksičan, snažan karcinogen

– kategorija broj 1 humanih karcinogena →→→→karcinom pluća, prostate, gušterače, bubrega

- inhibicija apoptoze (kaspaza-3) →→→→preživljava veći broj genski oštećenih stanica

8

Oksidacijska oštećenja biomolekula

� OKSIDACIJSKO OŠTEĆENJE DNA

– ROS →→→→ lom jednog ili oba lanca DNA, modifikacija purinskih i pirimidinskih baza (poremećaj specifičnog sparivanja baza, krivo očitavanje baza), modifikacija deoksiriboze, stvaranje unakrsnih veza između DNA molekula te DNA i proteina, stvaranje DNA-MDA (malondialdehid) adukta

– oštećenje DNA →→→→ ↑↑↑↑ ili ↓↓↓↓ transkripcije,↑↑↑↑ putova prijenosa signala, replikacijske pogreške, nestabilnost genoma →→→→karcinogeneza

- važnost sustava popravka baza!

-8-okso-7,8-dihidrogvanin (8-oksoG, 8-oksoGva) →produkt oksidacije DNA (8-oksogvanin; 8-hidroksigvanin)

-mutagen i karcinogen

-dobar biomarker oksidacijskog stresa (HPLC, MS, ELISA)

-potencijalni biomarker karcinogeneze

-↑ 8-oksoG u mokraći i u leukocitima → pušenje, težakfizički rad, rad u smjenama

-↓ 8-oksoG → umjerena fizička aktivnost (sport)

Chem Res Toxicol. 2010 Apr 19;23(4):705-7.

Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning

oxidatively damaged nucleobases in DNA.Cooke MS, Loft S, Olinski R, Evans MD, Bialkowski K, Wagner JR, Dedon PC, Møller P, Greenberg MM, Cadet J.

9

� OKSIDACIJSKO OŠTEĆENJE PROTEINA

� tiolni spojevi imaju antioksidacijski kapacitet zbog atoma sumpora (S), koji se lako može prilagoditi gubitku jednog elektrona

� oksidacijska modifikacija Cys – samo ukoliko okoliš određuje ↓↓↓↓ pKa →→→→ deprotoniranje sulfhidrilnog tj. tiolnog oblika (-SH) u tiolatni oblik tj. tiolatni anion (-S-);pKa ciljnog Cys mora biti <7,0

� pKa vrijednost tipičnog cisteina u proteinima je >8,0 tj. iznosi oko 8,5

� redoks-osjetljivi proteini:– promjena enzimske aktivnosti (Cys u katalitičkoj domeni) ili vezanja transkripcijskog faktora na DNA (Cys u DNA-vezujućoj domeni)

– stvaranjem disulfidnih veza proteini ili postaju funkcionalni ili gube funkciju:• stvaranje intramolekulskih disulfidnih veza →→→→ promjena strukture i konformacije tog proteina

• stvaranje intermolekulskih disulfidnih veza →→→→ HOMO- ili HETERO-dimeri i/ili multimeri

-oksidacija proteinskih sulfhidrilnih tj. tiolnih skupina:- S-hidroksilacija tj. oksidacija: R-SH + ROS → derivati sulfenske kiseline (R-SOH)= djelomično oksidirani produkti → redukcija u R-SH- R-SOH + GSH → S-glutatiolirani proteini (R-SSG) → redukcija u R-SH-S-glutatiolacija: R-SH + GSSG → R-SSG + GSH-S-nitrozilacija: R-SH + NO. →R-SNO- daljnja oksidacija derivata sulfenske kiseline → ireverzibilni oksidacijski oblici:

- derivati sulfinske kiseline (R-SO2H)- derivati sulfonske kiseline (R-SO3H)

10

Oksidacijski stres, GSH i karcinogeneza

� glutation - glavni neproteinski tiolni antioksidans u stanici

� 1-10 mM koncentracije glutationa u gotovo svim vrstama stanica;u jezgri i u mitohondrijima oko 20 mM (četiri puta više nego u citoplazmi)

� glutation (GSH) – reducirani oblik;glutation disulfid (GSSG) – oksidirani oblik

Važan za reaktivacijuenzima / proteina

čije su –SH skupine oksidirane!

DJELOVANJE GLUTATIONA

oksidirani oblik proteinskog lanca

reducirani oblik proteinskog lanca

reducirani glutation oksidirani glutation

ROS - reaktivni kisikovi spojevi

11

2GSH GS–SG

glutationska reduktaza

NADP+ NADPH + H+

glukoza 6-fosfat6-fosfoglukono-

δδδδ-lakton

oksidacijsko oštećenje lipida, proteina, DNA

˙OHhidroksilni radikal

H2O2

˙O2–superoksidni radikal

mitohondrijska respiracija, ionozirajuće zračenje,

sulfo-lijekovi, herbicidi ...

glutationska peroksidaza (Se) 2H2O

ULOGA NADH i GLUTATIONAU ZAŠTITI OD VISOKO REAKTIVNIH

KISIKOVIH SPOJEVA

glukoza 6-fosfat dehidrogenaza

vodikov peroksid (H2O2)ILI organski

peroksidi (R-OOH)

GEN LOKUS ENZIMGPX1 Chr. 3 p21.3 GPx1

GPX2 Chr. 14 q24.1 GPx2 (gastrointestinal)

GPX3 Chr. 5 q23 GPx3 (plasma)

GPX4 Chr. 19 p13.3 GPx4 (phospholipid hydroperoxidase)

GPX5 Chr. 6 p21.32 GPx5 (epididymal androgen-related protein)

GPX6 Chr. 6 p21 GPx6 (olfactory)

GPX7 Chr. 1 p32 GPx7

GPX8 Chr. 5 q11.2 GPx8 (putative)

Glutationska peroksidaza, GPx (Se)

Katalizira reakciju: RSeH + H2O2 → RSeOH + H2ORSeOH + GSH → GS-SeR + H2OGS-SeR + GSH → GS-SG + RSeH

odnosno: 2GSH + H2O2 → GS–SG + 2H2OZatim glutationska reduktaza (GR) reducira GSSG, čime završava ciklus:GS–SG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+

12

GLUTATIONSKA REDUKTAZA, GR (dimer)

FAD i NADPH se vežuu ispruženom obliku

GR

2 e- iz: NADPH FADCys63−−−−S

Cys58−−−−SI

G−−−−S

G−−−−SI NADP+ + 2 GSH

1. O2·- → H2O2

2. glutation peroksidaza (GSH jedonor elektrona) uklanja H2O2

3. glutation reduktaza (NADPH jedonor elektrona) reducira GSSG u GSH4. neki prijelazni metali (Fe2+, Cu+ i dr.)

potiču prijelaz H2O2 u ·OH

5. ·OH može ukloniti elektron izpolinezasićenih MK (LH) →

nastaje lipidni radikal (L·)6. L· stupa u interakciju s O2 i nastaje

lipidni peroksilni radikal (LOO·)7. red. oblik vit. E (T-OH) reducira

LOO· u membrani → lipidni hidroperoksid

(LOOH) i radikal vitamina E (T-O·)8. regeneracija vitamina E vitaminom C

→ askorbilni radikal (Asc·-) = dehidroaskorbat9. regeneracija vitamina E pomoću GSH

10. redukcija GSSG i Asc·- s dihidroliponskom kiselinom (DHLA) → α-liponska kiselina (ALA)11. regeneracija DHLA pomoću NADPH12. LOOH → aldehidi (npr. 4-hidroksinonenal, 4-HNE)13. 4-HNE (snažan oksidans) → glutatiilni adukt (nije štetan) ⇒ glutation S-transferaza (GST)14. glutation peroksidaza (GSH je donor elektrona) reducira LOOH u odgovarajući alkohol i O2

13

GPx = glutathione peroxidase

GR = glutathione reductase

GST = glutathione S-transferase

GGT = γ-glutamyl transpeptidase

GCL = glutamate-cysteine ligase

GS = glutathione synthetase

γγγγ-glutamyl

cyclotransferase

5-oxoprolinase

� sinteza glutationa:– glutamat-cistein ligaza, GCL (prije: γγγγ-glutamilcistein sintetaza, γγγγ-GCS)

– glutation sintetaza, GS– cistein, GSH (inhibicija GCL)

� u fiziološkim uvjetima:konc. GSH puno veća od konc. GSSG (~ 10-100 puta veća);omjer GSH/GSSG = 10-100 tj. >100omjer ovisi o staničnom odjeljku:od 2:1 u ER do više od 60:1 u drugim odjeljcima

� kod oksidacijskog stresa:naglo ↓↓↓↓ konc. GSH, a ↑↑↑↑ konc. GSSG;omjer GSH/GSSH = 1-10 (omjer se pomiče u korist GSSG)

� omjer GSH/GSSG je dobar pokazatelj oksidacijskog stresa u organizmu

14

� zaštitna uloga GSH:– antioksidacijska zaštita (DNA, proteini / enzimi)– interakcija s pro- i anti-apoptoznim signalnim molekulama (proteinske kinaze, fosfataze, proteaze)

– modulacija redoks-stanja u stanici– modulacija redoks-osjetljivih transkripcijskih faktora– detoksikacija toksina i kancerogena →→→→ tumori i mutacije uglutationskoj S-transferazi (GST)

� značajno ↓↓↓↓ omjer GSH/GSSG →→→→ karcinom kolona, karcinom dojke;konc. GSSG osobito ↑↑↑↑ u uznapredovalim stadijima razvoja tumora

� ↑↑↑↑ GSH →→→→ zaštita tumorskih stanica i rezistencija na različite kemoterapeutike

� p53 - redoks-osjetljiv transkripcijski faktor

– uloga u zaštiti stanica od karcinogeneze:zaustavlja stanični ciklus (uklanjanje oštećenja) ili potiče apoptozu (oštećenje stanice preveliko) →→→→ tumor supresor tj. potiskivač tumora

– inaktivacija p53 →→→→ nekontrolirana dioba stanica (uloga u kontrolnim točkama: G1, S, G2)

Oksidacijski stres, transkripcijski faktori i karcinogeneza

15

Mutacije (karcinogeni metali, RONS) u p53 dovode do njegoveinaktivacije → u >50% tumora u ljudi!

Funkcionalni tetramerni oblik proteina stabiliziran je fosforilacijom, acetilacijom i atomom cinka!

p53 - karakteristike

16

17

– djelovanje karcinogenih metala na p53:• Cr(VI) →→→→ fosforilacija Ser15 i acetilacija Lys383 u p53 →→→→ izravna aktivacija p53;

• Cr(VI) →→→→ neizravno induciranje p53-posredovane apoptoze: uzrokuje oštećenja DNA, aktivira MAPK koje djeluju na p53;npr.: c-Jun (transkripcijski faktor kojeg fosforilira tj. aktivira JNK tj. MAPK →→→→ negativan regulator i ekspresije p53 i sposobnosti p53 da aktivira transkripciju ciljnih gena (izravno djelovanje: AP-1 mjesta u promotorskoj regiji p53 gena)

• istiskivanje cinka (koji je neophodan za vezanje p53 na DNA) nekim metalom →→→→ inaktivacija p53 (ne uzrokuje mutacije niti oksidaciju u p53)

– regulira proces angiogeneze tako što aktivira gene koji inhibiraju, a potiskuje gene koji potpomažu rast novih krvnih žila

� agensi koji induciraju oksidacijski stres (neki metali i dr.) →→→→translokacija aktiviranih transkripcijskih faktora u jezgru

� oksidacijske modifikacije specifičnih Cys mogu inhibirati vezanje transkripcijskih faktora na DNA– nekoliko Cys-ostataka u središnjoj domeni p53 je bitno za vezanje p53 na specifične slijedove DNA →→→→npr. oksidirani Cys182 →→→→ inhibirana pravilna interakcija s DNA-vezujućom domenom →→→→ disocijacija tetramera

� regulacija aktivnosti transkripcijskih faktora u 2 koraka:oksidacija u citoplazmi i redukcija u jezgri;jezgra – vrlo visoke konc. GSH, tioredoksina (Trx), glutaredoksina (Grx) i Ref-1; isto za mitohondrije

Ref-1 = regulator of fusion

18

-transkripcija gena se aktivira tek nakon reverzibilne oksidacije te kasnije redukcije Cys-ostatka

-samo se reducirani oblik (Cys-SH) transkripcijskog faktoraveže na DNA →→→→ ključan je reducirajući okoliš u jezgri

METALI

upalapopravak DNA

oštećenje DNARONS

mutacijesignalni putovi

promijenjena ekspresija gena

razvoj tumora RONS = reaktivne kisikovei dušikove vrste

19

ROS sudjeluje u svim fazama procesa karcinogeneze

� inicijacija – mutacija u DNA molekuli koja nije smrtonosna, popravljaju se oštećenja DNA

� promocija – poticanje proliferacije stanica i/ili inhibicija apoptoze →→→→ klonalna ekspanzija stanica;kontinuirana prisutnost stimulansa koji potiču stvaranje tumora te ovisi o njihovoj koncentraciji

� progresija – ireverzibilna faza;nakupljanje dodatnih genskih oštećenja;prelazak u maligno stanje