ПРОЕКТ

Институт по молекулярна биология „Акад. Румен Цанев” - БАН

Лаборатория по Медико-биологични изследвания

Катя Мирославова Мокретар

Микроструктурни геномни аберации при

пациенти със сърдечно-съдови

заболявания

На дисертационен труд за присъждане на образователна и научна степен

„ДОКТОР” Област на висше образование: 4. Природни науки, математика и информатика

Професионално направление: 4.3. Биологически науки Научна специалност: Молекулярна биология

Научен ръководител:

Доц. Маргарита Апостолова, дб

Научен консултант:

Проф. д-р Елисавета Начева, дмн, FRCPath UK

София

2015

2

Дисертационният труд съдържа 275 страници и е онагледен

със 23 таблици и 73 фигури.Библиографията обхваща 272

литературни източника.

Дисертационният труд е обсъден и насочен за защита от

Научен съвет на Института по Молекулярна биология „Академик

Румен Цанев“ – София от дата .....10.2015 год.

Работата по дисертационния труд е финансирана от Проект

Г2/2004: „Показатели за темпа на прогресия на

атеросклеротичните промени в съдовете“

Включените в дисертацията изследвания са извършени в:

Лабораторията по медик-биологични изследвания, ИМБ-БАН и в

Molecular Cytogenetics Laboratory, UCL Medical School, Royal Free

Campus, London, UK

Публичната защита на дисертационния труд ще се състои на

..................2015 год. от ..................... часа в ........................ на

открито заседание на научно жури в състав:

Председател:

1.

Членове:

2.

3.

4.

5.

Материалите по защитата са на разположение в

Библитеката на Институт по молекулярна биология -БАН

3

Съдържание Съкращения ........................................................................................................... 4

I Въведение ............................................................................................. 5

II Цел и Задачи ................................................................................... 7

III Материали и Методи .................................................................. 8 III.1 Участници в проучването ...................................................... 8 III.2 Полимеразна верижна реакция – скъсване по

дължината на полиморфния фрагмент, чрез директна рестрикция (PCR–RFLP) .......................................................................................... 10

III.3 Сравнителна геномна хибридизация (aCGH) върху олиго ДНК- микрочипове ......................................................................................... 11

III.4 Количествен PCR (qPCR) ........................................................ 14 III.5 Флуорецентна in sito хибридизация (Fluorescent in

situ hybridization, FISH) ............................................................................................. 15 III.6 Статистическа обработка на резултатите ......... 16

IV Резултати ....................................................................................... 18 IV.1 Аналализ на резултатите получени от Аналализ

на резултатите получени от сравнителната геномна хибридизация върху арей чипове (аCGH) ........................................................ 18

IV.2 Валидиране на резултатите от арей сравнителната геномна хибридизация ........................................................ 22

IV.3 Диагностично валидиране на откритите CNV райони 25

IV.4 Изследване на влиянието на полиморфизми в гените за eNOS, ACE, AGT и AT1R при пациенти със коронарна болест на сърцето в българската популация .......................................... 28

IV.5 MDR анализ за епистатичните взаймодействия между изследваните микроструктурни аберации за развитие на КБС 33

IV.6 Вариации в броя на копията при пациенти с Хронична миелогенна левкемия. ........................................................................ 35

V Обсъждане ..................................................................................... 37

VI Изводи и Приноси ...................................................................... 45

VII Литературна Справка .............................................................. 46

VIII ПУБЛИКАЦИИ И НАУЧНИ ПРОЯВИ ВЪВ ВРЪЗКА С ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД: ............................................................................. 49

IX Благодарности ............................................................................ 51

4

Съкращения

ACE Ангиотензин конвертиращ ензим

AGT Aнгиотензиноген

AT1R Ангиотензин II рецетор тип 1

BAC Бактериална изкуствена хромозома

CNVs Вариации в броя на копията на ДНК

CTNND1 Катенин делта 1

eNOS Ендотелна азотен оксид синтаза

FISH Флоурсецентна in situ хибридизация

GWAS Широкогеномни асоциатиативни проучвания

HDL Липопротеини с висока плътност

IGH Тежката верига на имуноглобулин G

KCl Калиев хлорид

LDL Липопротеини с ниска плътност

LPA Липопротеин А

MDR Многофакторната дименсионална редукция

NGS Следващо поколение секвениране

NO Азотен оксид

PCR Полимеразна верижна реакция

TCR T клетъчен рецептор

TNFSF15 Суперсемейство на тумрни некротични фактори (лиганди), член 15

TNF- Тумор некротичен фактор алфа

ГМК Гладко-мускулни клетки

ДНК Дезоксирибонуклеиновата киселина

КБС Коронарна болест на сърцето

МИ Инфаркт на миокарда

ОКС Остър коронарен синдром

СГХ Сравнителна геномна хибридизация

Т2ЗД Тип 2 захарен диабет

ТГ Триглицериди

ХМЛ Хронична миелоидна левкемия

5

I Въведение

Водещо място за смъртността в нашето съвремие

заемат усложненията от атеросклероза - тя надвишава

почти два пъти тази от всички форми на рак взети заедно.

Прогнозата е тази смъртност да продължи да нараства,

независимо от големия напредък в диагностиката,

терапията и профилактиката [1].

Атеросклерозата е многофакторно заболяване, което е

многостъпален процес, включващ взаимодействие на

редица ключови пътища и механизми - ендотелна функция,

метаболизъм на липопротеини, кръвосъсирване,

възпаление и др. Мутации в гени, чиито продукти участват

в тези пътища, могат да променят деликатното равновесие,

поддържащо хомеостазата [2]. Всеки един от тези фактори

е в значителна степен генетично детерминиран. От друга

страна, бидейки регулатори на много съществени страни от

хомеостазното равновесие, тези фактори реагират

чувствително на промените в околната среда.

Съвременната човешка генетика има значителен

потенциал да постигне по-добро здраве за всички. Тя има

възможност да диагностицира заболяванията преди

клиничната им изява, като може да даде по-точна

информация за риска и честотата им, както и съвет за

намаляването им чрез промяна в начина на живот или

подходяща профилактика. При полигенните заболявания,

като атересклерозата, всяка от наличните мутации, взета

отделно, променя риска слабо или умерено, но при

съчетаване с други мутации и определени фактори на

средата, този ефект може да се увеличи или намали. През

2007 г. излизат първите широко геномни изследвания

показващи асоциация на различни нуклеотидни

полиморфизми с развитие на заболяването. До този

момент са описани 50 SNPs асоциирани с КБС или инфаркт

на миокарда.

6

SNPs се приемат за предоминаннтна форма на

аберации в човешкия геном и се смята, че са отговорни за

по-голямата част от вариациите в генома. Описаните през

2004 г. обаче вариации в броя на копията на ДНК (copy

number variations, CNVs) [3], които са дефинирани като

промени в генома по-големи от 1 Kbр са широко

разпространени и се смятат, че съставляват около 12-15%

от човешкия геном. CNVs са както характерни за

„фенотипно нормални“ индивиди, така също се допуска, че

те са свързани с предиспозиция към множество комплексни

заболявания, невро-психиатрични заболявания, сърдечно-

съдови заболявания и др. [4].

По отншение на сърдечно-съдовите заболявания до

момента са публиквани само няколко публикации свързани

с изследване на CNVs при пациенти с хиперлепидемия

и/или инфаркт на миокарда [5, 6], коронарна блест на

сърцето [7], хипертрофия на лява камера при наличие на

хипертония [3].

Въпреки, че CNVs са значителен източник на

генетично разнообразие тяхното влияние върху

фенотипната вариабилност, включително чувствителност

към развитие на определени заболявания не е изучена

добре. За това ние си поставихме за цел да изследваме

вариациите в броя на копията при български пациенти с

КБС.

7

II Цел и Задачи

Цел:

Да се изследват микроструктурни геномни аберации

при пациенти със сърдечно-съдови заболявания и да се

анализират фенотип-генотипните корелации.

Задачи:

1. Да се оптимизират и въведат методи за ДНК-типизиране

на геномни вариации в гените еNOS G894T, ACE I/D, AGT

T702C и AT1R A1166C, и да се определи

разпределението и честотата им при пациенти със

сърдечно-съдови заболявания.

2. Да се извърши анализ на връзката между носителството

на полиморфните варианти и развитието на коронарна

болест на сърцето.

3. Да се установи типа и честотата на патологичните

микроструктурни геномни изменения като фактори в

етиопатогенезата на коронарна болест на сърцето.

4. Да се определи специфичността на откритите

микроструктурни геномни аберации при пациенти със

сърдечно-съдови заболявания.

5. Да се валидират избрани вариации в броя на копията на

ДНК с други методи.

6. Да се валидират диагностично откритите микроструктурни

геномни аберации при пациенти със сърдечно-съдови

заболявания сравнени с други заболявания.

7. Да се извърши анализ на епистатичните взаимодействия

между изследваните SNPs и CNVs, и да се определи

връзката им с риска от развитие на КБС.

8

III Материали и Методи

III.1 Участници в проучването

В дисертационния труд са включени изследвания

върху 419 неродствени индивида от български (n=245),

австрийски (n=96) и английски произход (n=78). То обхваща

групи лица с коронарна болест на сърцето (КБС, n= 171),

контроли (n=170) и хронична миелогенна левкемия (n=78)

(фигура 19).

Фигура 1. Групи изследвани лица

Клинична характеристика на пациенти

Пациентите със стабилна ангина пекторис (САП) и

остър коронарен синдром (ОКС), включващ пациенти с

остър инфаркт на миокарда (ОМИ) и нестабилна ангина

пекторис (НАП) са подбрани в Клиника по Кардиология на

УМБАЛ „Св. Анна” - София, под ръководството на доц. д-р

Арман Постаджиян.

Проучването е разрешено с протокол No

54/28.02.2005 на Етичната комисия на УМБАЛ“ Св.

Анна“ - София и е съобразено с принципите, посочени

в Декларацията от Хелзинки [8].

На базата на клиничните характеристики и

електрокардиографските промени (ЕКГ) за миокардна

9

исхемия, в групата на болните са включени пациенти с

ОКС, протичащ без елевация на ST сегмента.

Отдиференцирането на пациентите с остри коронарни

синдроми в зависимост от диагнозата на пациенти с ОМИ и

НАП (фигура 1) е осъществена, чрез серийно проследяване

на ензимите за миокардна некроза и времето за задържане

на исхемичните ЕКГ промени.

Основните характеристики на пациентите с КБС и

контролите, подложени на генетичен анализ в настоящия

дисертационен труд са обобщени в таблица 1.

Таблица 1. Клинични и демографски характеристика на

изследваните лица

Характеристики Контроли (n=170)

Пациенти със САП (n=54)

Пациенти с ОКС (n=117)

Години, (mean±SD) 55.7 ± 13.7 60 ± 9.8 60.3 ± 9.3

Пол, мъж (%) 79 (46.5%) 40 (74.1%) 69 (59%)

Пушачи, (%) 79 (46.5%) 36 (66.7%) 72 (61.5%)

Нива на холестерола, (mean±SD) 5.29 ± 1.3 5.32 ± 1.1 6.04 ± 1.6

Нива на триглицериди, (mean±SD) 1.98 ± 1.36 1.89 ± 1.07 1.9 ± 1.05

Хипертония, (%) 91 (53.5%) 44 (81.5%) 92 (78.6%)

Затлъстяване, (%) 24 (14.1%) 31 (57.4%) 64 (54.7%)

Фамилна обремененост, (%) 13 (7.6%) 14 (25.9%) 44 (37.6%)

Пациенти с хронична миелогенна левкемия (ХМЛ)

Данните за ХМЛ са от анонимни пациенти в хронична

фаза или бластна криза (миелоидна и лимфоидна) на

заболяването. Те са охарактеризирани и кариотипизирани

в Лабораторията по Молекулярна Цитогенетика (UCL

10

Medical School, Лондон) и присъствието на патологичния

фузионния ген BCR-ABL в тях е доказано с qPCR и/или

FISH (D-FISH, Abbоt Molecular Diagnostic, САЩ).

Разрешение на етична комисия при NRES, Royal Free

Hospital и UCL Medical School, Ref 09/Ho720/97.

Контролни групи

За контролна група при проведеното асоциативно

проучване са използвани две популационни извадки:

1. Индивиди с български произход (74 броя).

2. Индивиди с австрийски произход (96 броя),

предоставени от Проф. Ludwig Wagner

(Department of Medicine III, Medical University of

Vienna, Austria).

Всички лица, са дали съгласие за участие в

проучването и са отговаряли на въпроси, касаещи начина

им на живот, вредните навици, фамилна обремененост със

сърдечносъдови заболявания (ССЗ) и провежданото

лечение.

Биологични проби

За провеждане на генетичния анализ беше използвана

високомолекулна ДНК, изолирана от ядрени клетки от

периферна кръв или костен мозък. Пробата е взета в

пластмасова епруветка с К3EDTA като антикоагулант.

III.2 Полимеразна верижна реакция – скъсване по

дължината на полиморфния фрагмент, чрез

директна рестрикция (PCR–RFLP)

В настоящата работа посредством PCR-RFLP бяха

изследвани 4 полиморфни варианта в гени свързани с

регулация на кръвното налягане.

11

Нуклеотидните последователности на праймерите,

температурата на анийлинг, рестриктазата и дължината на

получените фрагмент са предсатвени в таблица 2.

Таблица 2. Условия за PCR-RFLP анализа, използвани в настоящата

дисертация

Полиморфизъм

Секвенция на праймерите

Рестр

икта

зен

ен

зи

м /

те

мп

ер

атур

а н

а

ан

ий

ли

нг

Големина

на

получени

те

продукти,

[bp]

eNOS G894T (rs1799983)

F:5’AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA3’ R:5’CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA3’

MboI / 65

oC

G = 248 T = 158; 90

ACE I/D (rs4646994)

F:5’CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT3’ R:5’GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT3’

няма/ 65

oC

I = 490 D = 190

AGT Т704С (rs699)

F:5’CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC3’ R:5’CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT3’

Tth111I / 67

oC

M = 165 T = 141; 24

AT1R A1166C (rs5186)

F:5’AGAAGCCTGCACCATGTTTTGAG3’ R:5’CCTGTTGCTCCTCTAACGATTTA3’

Dde I / 69

oC

A = 410 C = 292; 118

III.3 Сравнителна геномна хибридизация (aCGH)

върху олиго ДНК- микрочипове

Сравнителната геномна хибридизация (array

comparative genomic hybridization, aCGH) е молекулярно-

генетична техника за откриване на небалансирани

генетични промени [9]. Този анализ се базира на

конкурентна хибридизация между ДНК от изследваната

проба (т.нар. тест ДНК) и ДНК от нормални,

цитогенетично и физически здрави индивиди (референтна

12

ДНК), при което се идентифицират хромозомни региони с

допълнителен или липсващ генетичен материал в тестовия

геном в сравнение с референтния. Предимство на метода е

възможността да изследват едновременно промени в

целия геном при изискване за сравнително ниска

концентрация на стартовия материал.

Сравнителна геномна хибридизация (aCGH) върху

олиго ДНК- микрочипове – етапи

Използвани са олигонуклеотидни микрочипове на 105А

(2х105 K), като в използваният дизайн имат две отделни

полета за хибридизация, даващи възможност за

едновременен анализ на две проби върху чип.

Извършва се конкурентна хибридизация на тестова и

референтна ДНК, белязани с различни флуоресцентни

багрила (Cy3 - цианин 3 и Cy5 - цианин 5). Процеса се

осъществява върху предметни стъкла, на които са

фиксирани специфични ДНК олигонуклеотидни секвенции

(сонди).

В настоящето изследване ние използвахме двете

полета за анализ на една проба, като на едното поле

пробата беше белязана със Су3, а на другото с другия

флуорохром – Су5. Използваната в експериментите

референтната ДНК (male и female) е свободно достъпна от

Prоmega (UK) и представлява комбинация от ДНКи на

цитогенетично и физически здрави индивиди от същия пол

(минимум 6 броя). Срещу всяка тестова ДНК е

хибридизирана референтна ДНК от срещуположния пол, т

нар. Sex-missmach.

Етапи: Техниката включва няколко основни етапа на

изпълнение (фигура 2):

1) Рестрикция;

2) Белязване;

13

3) Пречистване и комбиниране на белязаните проби;

4) Хибридизация;

5) Измиване;

6) Сканиране на микрочиповете;

7) Софтуерен анализ на данните.

Фигура 2. Схема на експерименталната процедура при микроарей

анализ (гДНК – геномна ДНК)

Извършването на сравнителна геномна хибридизация

и отчитането на микрочиповете е извършено в Cytogenetics

Laboratory (UCL Medical School, Лондон).

III.3.1.1 Софтуерен анализ на данните

Анализ с приложение на circular binary

segmentation (CBS) алгоритъм

CytoSure Interpret Software е мощен и лесен за

използване пакет за анализ на aCGH данни. Статистически

инструмент за анализ на CNV профили при използване на

14

“miss mach” е прилагането на CBS (circular binary

segmentation) алгоритъм с определяне на Х-сепарация.

Multi Experiment Viewer - MeV

Средния интензитет на фона на всяка точка e

екстрахиран от *.gpr файловете, процесирани с TIGR

“Express converter” софтуер. MIDAS (The Institute for

Genomic Research, www.tigr.org) софтуер беше използван

за корекция на фона, определяне на средна интензивност

на всяка точка, размяна на бойте (dye swap) и

нормализация.

Относителното количество на тест и референтната

ДНК, хибридизирали към даден локус (хибиридизационна

точка) e определено чрез измерване на тяхното

флуоресцентното съотношение (FR). Това съотношение е

1.0 за локусите, които присъстват в тест ДНК в 2 копия.

Стойности на флуоресцентното съотношение над 3SD са

отчитани като амплификации и под 3SD – делеции.

Сравнение на резултатите между пациентите със

сърдечно съдови заболявания, контролната група и групата

на пациентите с хронична миелогенна левкемия беше

извършено с помоща на софтуерен продукт Multi

Experiment Viewer - MeV (http://www.tm4.org/). Извършени са

две сравнение:1. Анализ на данните от сравнителната

геномна хибридизация при изследваните от нас пациенти и

контролната група; 2. Пациентите с ОКС, контролите и

пациенти с малигнено заболяване – хронична миелогенна

левкемия за верифициране по специфичност на откритите

геномни аберации при пациентите с ОКС.

III.4 Количествен PCR (qPCR)

Real-time qPCR е вариация на стандартния PCR, който

е широко използван за околичествяванена ДНК и РНК

проби. Използвайки специфични праймери, броя копия на

определена ДНК или РНК последователност може да се

15

детерминира чрез измерване на количеството

амплифициран продукт на всяка стъпка по време на PCR

циклите.

Таблица 3. Праймери използвани при qPCR реакциите.

Ген Секвенция на прайемрите

Анийлин

г

температ

ура

Големина

на

фрагмента

Тест гени

9q32 (near

TNFSF15)

5‘ CAGGGAGTAGTGGTTAATGTTCT 3‘

5‘ AGTTCTAAATCACGGCTTGGA 3‘ 62

оС 156 bp

CTNND1 5‘ TTGGCAAGTGGTACAAAGAATAGT 3‘

5‘ CAGTCTGGAGGGCAGTGGC 3‘ 58

оС 230 bp

LPA 5‘ ATCTCCTGGTGCCTGGTATG 3‘

5‘ GGAAGTGAAAAGCGAGCAAG 3‘ 61

оС 201 bp

Референтни гени

PSAT1 5‘ GGAAAAATGGGATGACGGTGG 3‘

5‘ TGGGAAGAAAGAGCAAGAGTGG 3‘ 64

оС 251 bp

YWHAZ 5‘ GTGAGGTTGCAAGGCAGAGT 3‘

5‘ GAGATTTCCTGGCATTGGAA 3‘ 64

оС 191 bp

Секвенциите на праймерите използвани за qPCR

реакциите в настоящата работа са конструирани по

собствен дизайн с помощта на свободно достъпна

програма Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/).

Така определените секвенции на праймерите,

дължината на PCR продукта и анийлинг температура са

представени в таблица 3.

III.5 Флуорецентна in sito хибридизация (Fluorescent in

situ hybridization, FISH)

В настоящата работа ние използвахме сонди от

бактериални изкуствени хромозоми (ВАС). С помощата на

FISH ние проведохме експерименти на 7 контроли (3

контролни индивида и 4 клетъчни линии, от пациенти с

хематологични нарушения) и 27 пациенти с КБС, за

16

потвърждаване на аберации в гена за LPA. Недостатък на

FISH анализът е фактът, че е неприложим за по-малки

региони (по-малки от 110 kB), това е и причината другите

два региона от интерес да не са потвърдени с FISH, а само

с qPCR. Контролната сонда използвана при анализа е

избрана така, че да е със същата големина както тест

сондата, да се намира на същата хромозома (по

възможност на същото рамо) и да не е показала делеции

или амлификации при направените от нас арей

експерименти или да има изменения в базата данни.

В настящата работа е използван BAC клон RP11-

831F8, покриващ гена за LPA (6q25.3-26) (фигура 29).

Сондата получена от него е белязана в зелено (FITC). За

контролна проба беше избран BAC клон RP11-1078E12,

който се намира на същата хромозома 6q15 и отговаря на

поставените от нас условия за контролна сонда (фигура

30). Сондата получена от този клон е белязана в червено

(Су3). Сондата покриваща CTNND1 генът (11q12.1)

използвана за FISH анализът е RP11-104M10 (белязана в

зелено), а за контролна точка (11q25) е използвана сонда

от клон RP11-609М15 (белязана в червено).

III.6 Статистическа обработка на резултатите

За статистическа обрабтка на резултатите в

настоящата работа изплзвахме следните статистически

подходи:

Анализ на равновесието по закона на Харди-

Вайнберг

Точен тест на Фишер (Fisher's exact test)

Т-тест

Съотношение на шансовете (Odds ratio)

Бинарана стъпкова регресия

17

Многофакторната дименсионална редукция и

епистаза (MDR)

MDR е непараметричен статистически и генетичен

метод, алтернатива на логистичната регресия, с цел

откриване и характеризиране на нелинейни

взаимодействия между отделни генетични променливи

(SNPs, CNV) и рискови фактори (тютюнопушене, пол и т.н.)

или фактори на околната среда, за предсказване на даден

изход, в нашия конкретен случай развитие на коронарна

болест на сърцето. MDR софтуерът съчетава получените

данни, с надграждане, класификация с кръстосано

валидиране и пермутационни тестове, за да се осигури

мощен подход за откриване епистаза. MDR анализът е

извършен с помощта на статистически програми - MDR

3.0.2. [10] и MDR Permutation Testing Software 1.0.β2 със

свободен достъп.

18

IV Резултати

IV.1 Анализ на резултатите получени от Аналализ на

резултатите получени от сравнителната геномна

хибридизация върху арей чипове (аCGH)

Системен ход на проведените изследвания

Включените в изследването пациенти и системния ход

на проведения анализ са представени на фигура 3.

Фигура 3. Системен ход на проведените изследванияпри пациенти с

коронарна болест на сърцето (КБС), хрoнична миелогенна левкимия

(ХМЛ) и контроли.

n: брой изследвани пациенти; qPCR- полимеразна верижна реакция в реално време; FISH:

флуоресцентна in situ хибридизасия; Sanger Sequensing: Секвениране по Сангер; CBS:

кръгова двоична сегментация; MeV:софтуерен пакет за анализ на множество данни; nEASE:

метод за класифициране на генната онтология;MADAM TIGR MIDAS

19

Специфични геномни аберации открити при

пациенти с КБС

При анализ на проведената арей-СГХ са установени

1948 аберантни района при пациентите с КБС.

Предствителна извадка за хромозома 1 е показана на

Фигура 4. В установените аберантни региони са

наблюдавнани 850 делеции и 1098 са амплификации.

,

Фигура 4. Представителна извадка за аберации наблюдавани в късото

рамо на хромзома 1

От наблюдаваните 1948 вариации, при пациентите с

КБС, 71 аберации (3.6%) не са описани в световната база

данни (DGV, www.dgv.tcag.ca). От новооткритите аберантни

региони 24 са делеции, а 47 – амплификации.

20

Сравнение на аберантите региони установени при

пациентите с КБС и резултатите от контролните

индивиди

За да докажем специфичността на аберантните

региони открити при пациентите с КБС ние ги сравнихме с

резултатите от арей СГХ на ДНК от здрави индивиди. При

този анализ доказахме 334 аберантни региона, специфични

за пациентите с КБС. Тези 334 аберантни района бяха

подложени на Сигнификантен анализ на микроарей – SAM.

След SAM анализът, за гените показали достоверни

разлики (потенциално патологични находки с неясно

клинично значение) е направена подробна справка в DGV,

което позволява финното им картиране.

От получените резултати 8те

локуса, които показаха

най-силна асоциация (>92.11%) с развитие на КБС са LPA

(р=0.003), CTNND1 (p=0.001), TNFSF15 (p=0.001), RNF38

(p=0.001), RPS6KB (p=0.023), MT1X (p=0.001) и SPHK2

(p=0.001), а също и област, която се намира в негенен

район на хромозомна лента 10q21

Генно онтологичен (GO) анализ

За да оценим как специфичните CNVs в пациентите с

КБС повлияват биологичните процеси ние проведохме

генно онтологичен анализ. Резултатите показаха, че най-

голям брой аберанти региони са локализирани в гени,

чийто протеини се експресират в мозъка – 72.5%, следвани

от 51% в сърцето.

Установихме и съществени промени в 2 категории:

1. Молекулярна функция (Фигура 5);

2. Роля в различни биологични процеси (Фигура 6).

21

Фигура 5. Представителна графика на молекулярни функции, при

които се срещат най-голям брой гени, в които са открити нови CNVs

при пациенти с КБС, в настоящото изследване

В зависимост от молекулната им функция, описаните в

настоящото изследване гени могат да се разделят на

няколко различни групи: свързване на йони,

транскрипционна регулация, протеиново свързване,

нуклеотидно свързване и др. Белтъците, попадащи в

групата „свързване на йони“ участват при свързването на

калций, калий, магнезий, цинк и мед.

Фигура 6. Представителна графика на 8

те биологични процеса при

които се срещат най-голям брой гени, в които са открити нови CNV

при пациентите с КБС, в настоящото изследване

0

10

20

30

40

Св

ър

зв

ан

е н

а к

атй

он

и

Св

ър

зв

ан

е н

а м

ета

лн

и

йо

ни

ДН

К с

вр

зв

ан

е

Св

ър

зв

ан

е н

а п

ур

ин

ов

и

нукл

ео

ти

ди

Ра

це

пто

рн

о с

въ

рзв

ан

е

Пеп

ти

да

зн

а а

кти

вн

ост

Тр

ан

сф

ер

азн

а а

кти

вн

ост,

тр

ан

сф

ер

на

фо

сф

ор

с

ъд

ър

жащ

и г

руп

и

Аки

вн

ос

т н

а

тр

ан

см

ем

бр

ан

ни

р

ец

еп

то

ри

Акти

вн

ост н

а а

лф

а т

ип

ка

на

ли

Акти

вн

ост н

а к

ати

он

ни

тр

ан

сп

ор

те

ри

Акти

вн

ос

т н

а й

он

ни

ка

на

ли

Бр

ой

ге

ни

Молекулярна функция

0

10

20

30

40

50

60

Си

гна

л-

тр

ан

сд

укц

ио

нн

и

пъ

ти

ща

Кл

етъ

че

н

ме

та

бо

ли

зъ

м

Ре

гул

ац

ия

на

кл

етъ

чн

и

фи

зи

ол

оги

чн

и

пр

оц

еси

Тр

ан

сп

ор

т

Уч

асти

е в

л

окал

иза

ци

ята

Ме

таб

ол

изъ

м н

а

ма

кр

ом

ол

екул

и

Пъ

рв

ич

ен

м

етаб

ол

изъ

м

Ре

гул

ац

я н

а

ме

та

бо

ли

зм

ът

Бр

ой

ге

ни

Биологични процеси

22

По отношение на ролята им в различни биологични

процеси най-много аберантни региони са регистрирани в

гени, чийто протеини участват в първичен клетъчен

метаболизъм, следвани от участници в сигнал-

трансдукционни пътища и регулация на клетъчни

физиологични процеси (Фигура 6).

IV.2 Валидиране на резултатите от арей

сравнителната геномна хибридизация

Класически подход за верификация на резултати от

арей сравнителна геномна хибридизация е използването

на методи като qPCR, FISH, MLPA и др. Ние валидирахме

трите аберантни локуса, показали най-силна асоциация с

развитие на КБС - LPA, CTNND1 и TNFSF15. Валидирането

беше извършено, използвайки qPCR за LPA, CTNND1 и

TNFSF15, както и FISH за LPA и CTNND1.

Резултати от qPCR експериментите

Резултатите от qPCR са предсатвени на фигура 7.

Фигура 7. Графично представяне на резултатите от проведения qPCR

за пробите в гените за LPA, CTNND1 и 9q32 регионът.

23

От наблюдаваните резултати се установи, че по

отношение на разпределението на вариациите в броя на

копията при генът за LPA aмплификациите бяха в най-

висок процент при пациентие с ОКС (51%) следвани от

пациентите със САП (39%). Това показа, че амлификации

на гена за LPA са асоциирани с развитие на КБС.

При другите два локуса (CTNND1 и 9q32) са отчетени

значителни разлики, като при локусът в промоторния

регион на гена за TNFSF15 са установени по-висок брой на

делеции при пациентите с ОКС (73%) и САП (63%) в

сравнение с контролите (40%). Този резултат потвърди

резултатът от арей СГХ.

Провеждане на FISH за верификация

FISH е широко използвана техника за потвърждение на

резултатите от арей сравнителната хибридизация.

В нашето изследване конструирахме FISH сонда

(RP11-831F8) покриваща гена за LPA (135 kb). LPA е

локализиран на цитобанд 6q25.3-q26. Резултатите са

показани в таблица 4.

Таблица 4. Резултатите от проведения FISH анализ на RP11-831F8

(LPA)

Изследвани лица Норма Амплификация Делеция

Контроли (n=7) 3 (42.9%) 1 (14.2%) 3 (42.9%)

Пациенти с ОКС (n=27) 8 (29.6%) 13 (48.2%) 6 (22.2%)

За наличните проби потвърдихме наличието на

делеции или дупликации в LPA и валидирахме

резултатите от qPCR експериментите.

24

Фигура 8. Представителна снимка на делеция и амплификация при LPA

генът. В зелено са представени сигналите от сонда покриваща LPA

генът, в червено контролната проба.

Размерът на втория изследван от нас ген CTNND1 е 58

Kbp. Въпреки малкия му размер, решихме да използваме

ВАС сонда, при която генът за CTNND1 покрива почти

половината от дължината на сондата – RP11-104M10.

Фигура 9. Представителна картинка на норма и амплификация при LPA

генът. В зелено са представени сигналите от CTNND1,в червено

контролната проба

Резултатите показаха амплификации при 55% от

пациентите с ОКС и при 45% от контролите.

За наличните проби потвърдихме наличието на

делеции или амплификации в CTNND1 и валидирахме

резултатите от qPCR експериментите.

25

IV.3 Диагностично валидиране на откритите CNV

райони

Както вече беше споменато, за да се установи дали

намерените от нас вариации в броя на копията на ДНК при

пациентите с КБС могат да бъдат използвани като

диагностични маркери за предразположеност към

развитието на заболяването ние сравнихме откритите

специфични аберации с такива намерени при пациенти с

ХМЛ.

За оценка на разликите между узследваните груги

билни (КБС, ХМЛ) и контроли е приложен тест на Kruskal–

Wallis. Резултатите показаха общо 37905 аберантни локуси,

показващи достоверни разлики. Тези локуси са разделени

на две групи:

1) При първата се наблюдават делеции при

пациентите с КБС, докато пациентите с ХМЛ и контролите

показват амплификации или не показват изменения

(Фигура 10);

2) Във втората група са регионите, показващи

амплификации при пациентите с КБС и делеции или

нормални нива на броя на копията при контролите и

пациентите с ХМЛ (Фигура 11).

На фигура 10 е представено цветно кодиране на 30те

сонди с най-силно изявени делеции, при пациентите с КБС,

която не се наблюдава при другите 2 групи. Между тези 30

локуса наред с делеции локализирани в негенни райони,

чиято функция все още не е ясна, се наблюдават вариации

при гени, чиято функция не може да бъде пряко свързана с

предиспозиция към развитие на сърдечно-съдови

заболявания. Функцията на гена за нерецпеторната

тирозин-киназа Src family tyrosine kinase (FYN), е участие в

много биологични процеси, включително регулация на

клетъчния растеж и адхезия, интегрин медиирана

26

сигнализация, цитоскелетно ремоделиране, имунен отговор

и др.

Фигура 10. Цветно кодиране (heat map) на 30

те най-ясно изразени

райони с положително сигнификантни разлики между трите групи

изследвани лица (NCBI36/hg18)

Неактивираната форма на FYN е фосфорилирана в

карбоксилния край, където се намира каталитичния домен.

След активация от PKA, белтъка се асоциира с PTK2/FAK1,

индуцирайки активация и фокална адхезия на комплекса.

Така се осъществява регулация на клетъчната адхезия,

чрез фосфорилиране на CTNNB1 (beta-catenin) и CTNND1

(delta- catenin).

При втората група, където са представени сонди, при

които са отчетни амплификации при пациентите с КБС и

нормални стойности или делеции при пациетните с ХМЛ и

контролите, също се наблюдават некодиращи междугенни

райони или се намират в кодиращия район на гени с все

още неизяснена функция.

27

Фигура 11. Цветно кодиране (heat map) на 30

те най-ясно изразени райони

с негативно сигнификантни разлики между трите групи изследвани

лица (NCBI36/hg18)

При преглед на 30те

региона с най-силно изразени

разлики се отличават гени кодиращи белтъци участващи

при поддържане на нормалната функция на калциевите

канали – волт-зависим калциев канал, субеденица бета 1

(CACNB1), серин-треонин киназа (MELK), дрозофилен

хомолог на голям тумр-суперсор 2 (LATS2), тирозин (не

рецепторна тирозин-киназа (TNK2)) кинази и тирозин

фосфатаза (SSH2). Протеинът кодиран от гена BMPR2

също има положителна асоциация с пулмонарна

хипертония. Десатуразата на мастните киселини- 2 (FADS2)

участва в липидния метаболизъм, като катализира био-

синтезата на високо ненаситени мастни киселини.

K-means clustering (KMS)

За да получим информация относно разликите в броя

на копията при достоверно различаващите се ДНК региони

28

използвахме KMS-FOM алгоритъм за клъстериране. Фигура

12 показва центроидни графики за всеки един от 5те

клъстера

Фигура 12. Разпредление на вариациите при гените във всеки от KMS

клъстерите.

(КБС-коронарна блест на съцето; ХМЛ – хронична миелогенна левкемия)

IV.4 Изследване на влиянието на полиморфизми в

гените за eNOS, ACE, AGT и AT1R при пациенти

със коронарна болест на сърцето в българската

популация

Определяне на честотата на SNPs при ОКС и САП

при български пациенти

С помоща на статистически софтуер PASW (SPSS Inc,

Chicago, USA) на всички включени в проучването

полиморфизми е направен тест за разпределение за да се

провери дали отговарят на закона на Харди-Вайнберг.

(таблица 5).

29

Таблица 5. Генотипно и алелно разпределение на полиморфизми в

гените за eNOS, ACE, AGT и AT1R при изследваните групи лица

Диагноза

eNOS - n (%)

rs1799983

ACE – n (%)

rs4646994

AGT – n (%)

rs699

AT1R – n (%)

rs5186

GG GT TT II ID DD ТТ ТС СС AA AC CC

Контроли (n=123)

74

(60.1)

37

(30.1)

12

(9.8)

26

(21.1)

59

(48)

38

(30.9)

56

(45.5)

53

(43.0)

14

(11.6)

67

(54.4)

52

(42.3)

4

(3.3)

G – 185 (75.2%)

T – 61 (24.8%)

I – 111 (45.1%)

D – 135 (54.9%)

Т – 165 (67.1%)

С – 81 (32.9%)

A – 186 (75.6%)

C – 60 (24.4%)

HWE χ² 1.883 0.066 0.051 1.385

Пациенти със САП

(n=54)

33

(61.1)

19

(35.2)

2

(3.7)

15

(27.8)

18

(33.3)

21

(38.9)

25

(46.3)

24

(44.4)

5

(9.3)

29

(53.7)

24

(44.4)

1

(1.9)

G – 85 (78.7%)

T – 23 (21.3%)

I – 48 (44.4%)

D – 60 (55.6%)

Т – 74 (68.5%)

С – 34 (31.5%)

A – 82 (75.9%)

C – 26 (24.1%)

HWE χ² 0.018 2.828 0.094 1.430

Пациенти с ОКС

(n=117)

43

(36.8)

63

(53.7)

11

(9.4)

16

(13.7)

56

(47.9)

45

(38.4)

44

(37.6)

59

(50.4)

14

(12.0)

69

(59.0)

40

(34.2)

8

(6.8)

G – 149 (63.7%)

T – 85 (36.3%)

I – 88 (37.6%)

D – 146 (62.4%)

Т – 147 (62.8%)

С – 87 (37.2%)

A – 178 (76.0%)

C – 56 (24.0%)

HWE χ² 1.481 0.046 0.318 0.178

HWE – Харди-Вайнберг (Hardy-Weinberg equilibrium)

Разпределението на генотипните и алелни честоти в

изследваните групи пациенти и контроли е представено в

таблица 5.

Разпределението на всеки един от изследваните

полиморфизми беше проверено и сравнено между

контролите от българската и австрийската популации

(фигура 13). Резултатите показаха, че генотипното

разпределение при двете групи не се различава

достоверно и това ни позволи да използваме пробите на

индивидите от австрийски произход, като контролни в

настоящото изследване.

30

Фигура 13. Сравнение на разпредлениет на генотипните честоти на

изследваните полимрфизми в българската популация с други етносни

групи.

(BG-българска популация; AU–австрийска популация; EUR–европвйска популация;

AFR–африканска популация; BRZ-бразиласка популация; COL–колумбийска

популация)

За да се установи какво е влиянието на носителството

на полиморфните алели: Т за eNOS (rs1799983); D за ACE

(rs4646994); C за AGT (rs699) и С за вариантът в AT1R

(rs5186), за развитието на КБС е използван доминантен

модел. При него разпределението на полиморфните

варианти се разделя в 2 групи: 1) Дивия тип алел в

хомозиготен генотип и 2) Носители на полиморфния алел,

представени като сума от хетерозиготен генотип и

хомозиготен по полиморфния алел. С помощта на SPSS

направихме сравнение на разпределението на

изследваните полиморфизми в групите на пациентите (САП

и ОКС) при отчитане влиянието на класическите рискови

фактори за развитие на заболяването (тютюнопушене,

хипертония, високи нива на холестерол и др.).

Следваща стъпка от нашия анализ са изследвания,

целящи установяването на връзката на изследваните

полиморфизми с риска за развитието на САП и ОКС. При

сравнение на пациентите със САП и контроли, където като

0

20

40

60

80

100

120

BG AU EUR Asian AFR AfroAmerican

Процен

т

eNOS (rs1799983)

GG GT TT

0

20

40

60

80

100

120

BG AU EUR Asian BRZ NorthAmericans

Процен

т

ACE (rs4646994)

II ID DD

0

20

40

60

80

100

120

BG AU EUR Asian COL AfroAmerican

Пр

oцен

т

AT1R (rs5186)

AA AC CC

0

20

40

60

80

100

120

BG AU EUR Asian AFR AfroAmerican

Процен

т

AGT (rs699)

CC CT TT

31

референтна е използвана групата на контролите, не е

наблюдавано влияние на изследваните полиморфизми

самостоятелно или в комбинация с други рискови фактори

за развитие на заболяването, докато при сравнение на

контролните индивиди с пациентите с ОКС се наблюдаваха

множество значителни асоциации (таблици 6).

Резултатите показват, че рисковите фактори

затлъстяване, години, пол (мъжки), тютюнопушене,

фамилна обремененост и нива на холестерол (по-виски от

5 mmol/L), заедно с полиморфизмите в eNOS и ACE гените

допринасят за развитие на ОКС в сравнение с контролите

(Таблица 22А). Затлъстяването (БМИ>25) и фамилната

обремененост показват най-висок риск (OR = 9.45 и 6.02,

съответно), следващите по значимост са пол и присъствие

на полиморфния алел на изследваните в гените за eNOS и

ACE генни варианти (OR = 2.59 и 3.59, съответно).

Таблица 6. Резултати от бинарен регресионен модел – коригирано отношение на риска (OR*) сравнение на пациентите с ОКС и контролите (използвани за референтна величина

Фактор

Контроли vs. ОКС

OR* CI 95% p

eNOS G894T (GT + TT)

*

2.585 1.133 – 5.897 0.024

ACE I/D (ID + DD)** 3.585 1.018 – 9.159 0.046

Затлъстяване 9.450 3.741 – 23.873 <0.001

Години 1.077 1.035 – 1.120 <0.001

Пол (мъж) 4.120 1.676 – 10.125 0.002

32

Тютюнопушене 2.470 1.053 – 5.790 0.038

Семейна обремененост

6.020 1.947 – 18.612 0.002

Нива на холестерол

1.560 1.063 – 2.289 0.023

Нива на триглицериди

0.719 0.513 – 1.007 0.055

Тези резултати още показват и влияние на

полиморфните варианти в гените eNOS (rs1799983) и ACE

(rs4646994), които допринасят за развитие на остър

коронарен синдром, самостоятелно и в комбинация с

класическите рискови фактори.

За да установим дали има връзка между комбинации

от носителството на полиморфизмите и развитието на КБС

ние проведохме експлоаторен анализ. За да улесним

анализа генотиповете бяха изследвани в контекста на

доминантен модел (Таблица 7) .

Таблица 7. Разпредление на биалелни комбинации от

изследваните плимрфизми под доминантен генетичен модел

в отделните групи изследвани лица.

Комбинация от различни генотипи

Контроли,

%

Пациенти със

САП, % P1

Пациенти с ОКС,

%

P2 P3

eNOS (GT / TT) ACE (ID / DD)

33.6 27.8 0.406 54.9 0.006 0.027

eNOS (GT / TT) AGT (TC / CC)

43.3 39.3 0.697 56.3 0.109 0.233

33

eNOS (GT / TT) AT1R (AC / CC)

35.0 39.3 0.124 36.8 0.090 0.429

ACE (ID / DD) AGT (TC/ CC)

43.3 39.3 0.697 56.3 0.109 0.233

ACE (ID / DD) AT1R (AC / CC)

35.0 39.3 0.124 36.8 0.090 0.429

AGT (TC / CC) AT1R (AC / CC)

23.3 28.6 0.581 23 0.303 0.701

Единствената комбинация, която показа достоверно

значима разлика е тази между Т894G в гена за eNOS (GT +

TT) и D-алел – ACE (ID + DD), която е по-висока при

пациентите с ОКС - 54.9% сравнен с контролите (р=0.003,

OR=2.401, 95%CI:1.343-4.293) и пациентите със САП

(p=0.001, OR 3.475, 95% CI 1.645 – 7.342).

IV.5 MDR анализ за епистатичните взаймодействия

между изследваните микроструктурни аберации

за развитие на КБС

За да установим влиянието всички изследвани в

нашето проучване SNPs и CNVs при взети предвид

различни конвенционални рискови фактори, ние

проведохме MDR анализ за определяне на епистатичните

взаимодействия. Конвенционалните рискови фактори

включени в анализа са години (>55), пол (мъжки),

затлъстяване (БМИ>25), повишени нива на холестерол,

триглицериди и глюкоза, както и оценка на дебелина на

интима/медия на лява и дясна каротидна и феморална

артерия. Резултатите са представени на (фигура 14)

На фигура 14 е представена в проценти тежестта на

всеки един от изследваните фактори (процента означен

под всеки ген или фактор), както и силата на предсказаните

връзки (процента означен над всяка линия) за развитието

34

на КБС. Като най-силен самостоятелен фактор, оказващ

влияние за развитие на КБС е полиморфизмът е гена за

eNOS с 8.09%, следван от полиморфизма в гена за

ангиотензиноген – 5.63%. Промяна в броя на копията на

ДНК в гените за LPA и TNFSF15 също показват

самостоятелна тежест в рамките до 2%. От

взаимодействията, най-силно влияние за развитие на КБС

показва връзката между полиморфизмите в гените за eNOS

и ACE, с 14.4%, което потвърждава и резултатите получени

от изследване на биалелните взаимодействия.

Фигура 14. Епистатични взаймодействия между излседваните в

настоящата работа SNPs и CNVs в присъствие на конвенциални

рискови фактори

Връзката на този полиморфизъм и увеличаване на

отношението интима/медиа на каротидните артерии също е

много силна, както и връзката между нуклеотидната замяна

в гена за AGT и вариацията в броя на копията при гена за

LPA (11.06%). Последният показва и силна връзка с

присъствие на CNVs в 9q32 районът, който се намира в

близост до гена за TNFSF15.

В обобщение, тези резултати потвърждават

твърдението, че развитието на КБС е мултифакторен

процес и единичното или комбинирано носителството на

35

различни геномни аберации може да бъде използвано като

диагностичен маркер за развитие на сърдечно-съдови

заболявания .

IV.6 Вариации в броя на копията при пациенти с

Хронична миелогенна левкемия.

В настоящото изследване са използвани проби от

пациенти с хронична миелогенна левкемия, за

верифициране на откритите от нас вариации при

пациентите с коронарна болест на сърцето (КБС). При този

процес, са потвърдени както вариациите при пациетнтие

със сърдечно-съдови заблявания, така също са открити и

региони с вариации в броя на копията, специфични за

пациентите с ХМЛ.

Пациентите с ХМЛ включени в проучването са в

различна фаза на заболяването (хронична фаза и

миелоидна или лимфоидна бластна криза). При нашето

изследване са описани геномни разлики между пациентите

в миелоидна бластна криза и тези в лимфоидна.

Установени са делеции при лимфоидна бластна криза,

които не са наблюдавани при пациентите в миелоидна

бластна криза или хронична фаза, контролите или при

пациентите с КБС. Първите 22 локуса с най-ясно изразени

разлики са ограничени до хромозомни райони 7p12-14

(фигура 15), 9p21-24, 14q11.2 и 14q32.33 (фигура 16).

Делеции в immunoglobulin heavy chain (IGH) и T cell receptor

regions (TCR), които често са съпътствани с едновременна

загуба на последователнсти в късите рамена на хромозми

7 (фигура 15) и 9, включващи гените IKZF1, HOXA7,

CDKN2A/2B, MLLT3, IFNA/B, RNF38, PAX5, JMJD2C и

PDCD1LG2.

36

Едновременната им поява насочва към

предположението, че тези гени са свързани с касакда от

аберации, които настъпват при пациентите в лимфоидна

бластна криза. Имайки предвид високата честота на

делециите в локусите за IGH и TCR, които предхождат

делеции на IKZF1 и p16. Това може да предположи, че

лимфоидната бластна криза при ХМЛ пациенти се

инициира от RAG медийрана NHEJ. Аберации при

пациентите с ХМЛ не бяха фокус на настоящата

дисертация, затова и намерените аберации не са

дискутирани в детайли.

Фигура 15. Едновременна делеция при пациенти в лимфоидна бластна

криза в късото рамо на хрмозома 7

37

Фигура 16. Едновременна делеция при пациенти в лимфоидна бластна

криза в дългто рамо на хрмозома 14

V Обсъждане

Обсъждане на резултатите от цялостното геномно

проучване на пациентите с КБС

Развитие на технологиите за арей хибридизационните

микрочипове показва неочаквано голям брой делеции и

дупликации в човешкия геном. Това налага и детайлно

изследване на CNVs в здрави индивиди и на индивиди

страдащи от различни комплексни и менделови

заболявания. Днес е добре известно, че рискът от развитие

на сърдечно-съдови заболявания е комбинация от

генетична предразположеност, фактори на околната среда

и начина на живот.

От описаните специфични аберантни региони в

настоящата работа значителен брой бяха гени, кодиращи

белтъци участващи в йонния транспорт в клетката. CNVs в

гени, чиито белтъци участват в йонния транспорт са

описани при пациенти с аутизъм [11], където авторите

показват връзка на заболяването с аберации на гени

38

участващи в йонния транспорт и в частност с калциевия

йонен транспорт.

До колкото ни е известно кък момента в литература

съществуват само 3 публикации, изследващи CNVs при

пациенти с ССЗ [5, 12, 13]. Например, в публикацията на

Sleptsov и колектив [12], авторите описват амплификации в

хромозомни области: 3p21.31 (CACNA2D2), 7q32.1 (FLNC),

19p13.3 (C19orf29, PIP5K1C), и 21q22.3 (COL6A1), които не

бяха установени в нашето изследване.

От описаните 7 аберантни региона при тайвански

пациенти, с инфракт на миокарда, 3 бяха установени и в

нашето проучване [5]. Това бяха аберации включващи

гените за cub-домен съдържащ протеин 1 (CDCP1),

фофатидилинозитол 3-киназа- клас 2 гама (PIK3C2G) и

кадхерин 13 (CDH13). CDCP1 играе роля при адхезията на

клетките, а CDH13 e кадхерин, опосредстващ клетка-клетка

взаимодействията. Функцията на третия ген, PIK3C2G и

неговата роля в процеса на атеросклероза не са ясни [5].

Публикации свързани със CNVs в гена за CDCP1 освен в

настоящото и гореспонантото проучване не бяха намерени.

Не е ясно как амплификация в този ген засяга функцията

на протеина, но е показано, че същата аберация увеличава

експресията на CDCP1 при пациенти с рак на гърдата, рак

на белия дроб и дебелото черво.

При проведените експерименти установихме повишен

процент на амплификациите в гена за LPA при пациентите

с коронарна болест на сърцето в сравнение с контролните

индивиди и пациентите с ХМЛ. Този резултат е в

съответсвие с публикация на Wu и колеги [13], които

показват че три копия на гена са свързани с повишен риск

от развитие на КБС

Другият локус, в който CNVs бяха валидирани с

помощта на qPCR и FISH е локализиран в CTNND1 генът.

Протеинът на този ген е част от междуклетъчния

39

адхезионен комплекс, който съдържа Е-кадхерин, алфа-

катенин, бета-катенин и др. O’Donnell и колеги [14], че

експресията на CTNND1 в ендотелните клетки действа като

потенциален стимул за повишена транскрипция на голям

брой адхезионни молекули. В нашето изследване ние

наблюдавахме амплификации в в района в който е

локализиран CTNND1 (chr11:57736667-57836122) при 90%

от изследваните пациенти с КБС и при нито една от

контролите или пациентите с ХМЛ. В DGV вариации в броя

на копията на ДНК при този ген не са описани. Данни за

асоциация на CNVs в този ген с други заболявания също не

бяха открити.

TNFSF15 е другия ген показал най-силна асоциация с

развитие на заболяването. В DGV са описани

амплификации в този ген, открити при здрави лица. За

разлика от тях обаче в настоящата работа установихме

делеции, които бяха потвърдени от qPCR експериментите.

Публикации, асоцииращи вариации в броя на копията на

ДНК в този ген със сърдечно-съдови заболявания не бяха

открити. Не бяха намерени и CNVs при гена описани при

други заболявания.

Публикации, изследващи експресията на този ген

показват, че TNFSF15 се експресира в яйчници на здрави

жени. При рак на яйчниците, обаче експресията му

намалява с напредване на заболяването [15]. Липсата на

данни за този ген ни дава повод да спекулираме за пътя, по

който той осъществява своето участие в патогенезата на

атеросклерозата. Това което знаем за ролята на TNFSF15,

като участник в атеросклерозата, се осъществява чрез

индукция на анти-възпалителни цитокини и хемокини като

TNFα, MCP-1, и IL-8. Цитокините (TNFα и IL-1) водят до

експресия на клетъчни адхезионни молекули, а хемокините

МСР-1 и IL-8 подпомагат задържането и проникването на

моно- и лимфоцитите в интимата [16]. Така CNVs в генът за

40

TNFSF15, могат да окажат влияние върху неговата

функция и да стимулират или подтиснат експресията на

молекулите, чиято транскрипция се регулира от него, като

по този начин индуцират атерогенза.

В литературата няма описани вариации в копията на

този ген, но повишена екпресия на гена е свързана с

редукция на триглицериди в черния дроб [17].

При нашето проучване аберации при най-голяма част

oт пациентите с КБС, коитo не бяха установени при

oстаналите две групи изследвани лица, са локализирани в

следните райони: 1p36, 2q33, 3p21.31, 6q25.2-q25.3, 9p13,

13q32.2-q32.3, 14q24, 15q21, 20q13.31. Тези аберации са

уникални и до този момент не са съобщени в литературата.

Необходими са допълнителни изследвания за

установяване ролята на тези аберантни региони в

патогенезата на ССЗ.

Обсъждане на резултатите от проведените PCR-

RFLP експерименти за SNPs в гени свързани с

регулация на кръвното налягане

Във втората част от настоящата работа е проведено

асоциативно проучване анализиращо полиморфизми в гени

участващи в регулацията на кръвното налягане в

Българската популация.

В нашите изследвания наблюдавахме 2.133 пъти по-

висок риск от развитие на ОКС при лица носители на Т-

алелът под доминантен модел. Тези резултати са в

съвпадение с метанализ на 26 изследвания целящи оценка

на разпространението на G894T полиморфизмът, които

показват, че той е рисков фактор за развитие на исхемичен

инфаркт при лица от бялата и азиатската раси [18].

Нашите изследвания показаха асоциация на

носителството на Т-алел в комбинация с рискови фактори

като тютюнопушене, затлъстяване и фамилна анамнеза с

41

повишаване риска от развитие на ОКС. G894T

полиморфизмът може да е асоцииран с коронарна болест

на сърцето самостоятелно и в комбинация с различни

рискови фактори за развитие на атеросклероза.

Установения полиморфизъм е свързан с намалена полу-

живот на NO.

От гените в РААС един от най-често изследваните

полиморфизми е ACE I/D В нашето изследване ние не

установихме достоверна разлика в разпределението на I/D

генотипа сред пациентти със САП, НАП и контролната

група. Нашите резултати показват значителна асоциация

на D алела (в хетерозигоетен или хомозиготен генотип) при

появата на ОКС в сравнение със САП. Това може да бъде

обяснено вероятно с фактът, че носителството на D-алел

се свързва с високи нива на плазмения АСЕ [19], което

повишава кръвното налягане и съответно рискът от ОКС.

Този полиморфизъм е свързан още и с развитие на

коронарна болест на сърцето при пациенти Саудитска

Арабия [20], при пациенти с диабет тип 2 от Иран [21].

В нашите изследвания връзка между другите два

изследвани полимрфизма и развитие на ОКС или САП не

беше наблюдавана.

При анализ на биалелните комбинациите на

изследваните полиморфизми, процента на eNOS Т894- и

ACE D-локусите е статистически по-високо в ОКС

пациентите в сравнение с контролите и пациентите със

САП. Това показва, че комбинацията от eNOS и ACE

полиморфизмите има наслагващ се ефект и може да е

свързана с по-висок риск от развитие на ОКС. При ECTIM

изследването е показано, че обекти, които са хомозиготни

за ACE D-алел и AT1R C полиморфния алел са

статистически значими за развитие на коронарна болест на

сърцето [22]. При нашето изследванение не е открита

42

връзка с биалелната комбинация от тези два гена и САП

или ОКС.

Обсъждане на резултатите от епистатичните

взаимодействия

При епистазния анализ показващ се оценяват

генетични взаймодействия при които мутации в един ген

маскират фенотипа на мутации в друг локус и как това се

асоциира със развитие на заболяването. При проведения

епистазен анализ в настоящата работа изследвахме

връзката между намерените в първата част на нашето

проучване CNVs, еденичните нуклеотидни замени

изследвани във втората част и конвенционални рискови

фактори. Най-силна беше връзката между изследваните

SNPs при гените за еNOS и АСЕ. Това потвърди

направените до този момент анализи с биалелните

комбинации между изследваните полиморфизми.

В литературата са публикувани данни за асоциация

между D-алела на полиморфизма I/D в генът за АСЕ и

повишените нива на циркулиращия LPA с риск от развитие

на КБС. Дали има връзка между двата фактора или те са

независими един от друг, авторите не не коментират [23,

24]. В нашето изследване връзка между CNVs в гена за

LPA и I/D ACE полиморфизмът съществува и въпреки, че е

сигнификантна, тя е значително по-слаба от връзката на

LPA с изследваната нуклеотидна замяна в

ангиотензиногеновия ген, която е втората по-сила

корелация получена в нашия кохорт. AGT и ACE са част от

РААС системата, за която съществуват данни, че участва в

процеса на атеросклероза, при формирането на пенестите

клетки чрез генерирания ангиотензин II, който играе важна

роля в процеса на акомулиране на холестеролови естери в

макрофаги изложени на присъствието на модифицирани

липопротеинови частици [25]. Носителството на С алела на

43

полиморфизмът (Т704С) в ангиотензиновия ген е свързано

с повишените плазмените нива на белтъка, което заедно с

повишени нива на LPA, може да доведе до ускорение на

атеросклеротичния процес чрез стимулация на

образуването на пенести клетки. В процеса на образуване

на пенестите клетки участва също и белтъкът на генът

TNFSF15, който стимулира тяхното образуване [26].

Вариации в броя на копията на ДНК при този ген също

показаха силна асоциация със CNVs в гена за LPA.

Друга силна връзка беше тази между CNVs в гена за

LPA и SNPs при генът за eNOS. В литературата има данни

че LPA повишава синтезата на еNOS [27], как обаче тези

две генетични аберации се допълват и допринасят за

развитие на КБС не е ясно. От литературата се знае, че

повишените нива на LPL са свързани със стимулация на

процеса на локализация на еNOS към мебранните кавеоли

чрез повишаване на стрес фибрите [28].

Вариации в броя на копията на LPA генът водят до

повишение на нивата на липопротеин (а), което се свързва

с повишен риск от развитие на сърдечно-съдови

заболявания. Фактът че връзките на LPA с вариации в

други гени, които също са доказани с ролята им в

атеросклерозата води до подкрепа на предложения от

последните няколко годни за отчитане на нивата на LPA

като рисков фактор, който би дал по-обективна оценка за

риска от развитие на атеросклероза.

Обсъждане на резултатите от прведент

широкогеномно проучване на пациенти с ХМЛ

При пациентите с ХМЛ са идентифицирани 435 локуса

които се различаваха сигнификантно между пациентите в

милеоидна и лимфоидна бластна криза. Всички тези локуси

бяха локализирани на късото рамо на хромозми 7 и 9.

44

Ние показахме че делеции на определени региони в

TCR и IGH са установени при почти всички пациенти,

делелции в гена IKZF1 и няколко други гени на късото рамо

на хромозоми 7 и 9, се появяват едновременно с тях, макар

и по-рядко. Тези делеции не бяха установени при нито един

от пациентите в хронична и акселерираща фаза и

пациентите в милеоидна бластна криза, както и при

контролите или пациентите с КБС.

Голямo геномнo изследване използвайки SNP арей за

проби от пациенти с остра лимфоидна левкемия, които са

положителни за присъствие на филаделфийска хромозома

(Ph+ ОЛЛ) [29] и 23 ХМЛ пациенти показва присътвие на

три делеции засягащи IKZF1, PAX5 и CDKN2A локуси.

Механизмът, по който намалената активност на IKZF1 и

PAX5 гените оказват роля върху регулация на В-линията

при филаделфия позитивни ОЛЛ, остава неясно [29, 30].

Откритията на Мulligan и колеги [29] съответстват на

резулатите от нашето изследване. Те обаче не описват

делеции в регионите на ТCR и IGH. В нашите изследвания

обаче ние показахме, че района на специфичните

аберации е близо до описани в DGV, но не се припокрива с

тях. Съществуват две възможни обяснения за поризхода на

тези делеции. 1) Те представляват загуби на генетичен

материал асоциирани с аберации осъществени между

различнии клетъчни лини (миелоидна и лимфоидна), които

се срещат при ОЛЛ и остра миелоидна левкемия, или 2) те

са bona fide делеция с онкогенен потенциал.

45

VI Изводи и Приноси

Изводи

1. Разпределението на алелните и генотипните честоти за

генетичните полиморфизми в гените за eNOS и AGT в

групата на контролите се различават със средно

европейската популация, но са близки до Австрийската

популациуя;

2. Носителството на eдин алел със загуба на функция в

гените за eNOS и АСЕ предразполага към развитие на

КБС

3. Установена е статистически значима асоциация с

повишен 2.4 пъти риск от развитие на ОКС при

носителство на полиморфните варианти в гените за eNOS

и АСЕ;

4. Идентифицирани са 289 сигнификантно различаващи се

аберантни региона между пациенти с КБС и контроли;

5. Открити са 71 нови не описани в DGV CNVs при пациенти

с КБС, от които 24 делеции и 47 амплификации;

6. Установени са 2 специфични неописани аберантни

региона при пациенти с ХМЛ, разположени на 7р14.1 и

14q32.33 хромозомни ленти;

7. Установени са 60 достоврно различаващи се аберантни

региона между пациентите с КБС и ХМЛ, които могат да

бъдат използвани като потенциални маркери за

диагностика на съответните заболявания;

8. Валидирани са 3 специфични аберантни региона

разположени в гените за LPA, CTNND1 и 9q32 при

пациентите с КБС, които могат да бъдат използвани като

диагностични маркери за развитие на КБС;

46

Приноси

1. За първи път са установени 71 нови аберантни

региони, асоциирани с развитие на КБС

2. Устновено е че промените в броя копия при

гените LPA, CTNND1 и 9q32 (TNFSF15) се

асоциират със развитие на КБС

3. Установени са два специфични аберантни

региона в за развитие на ХМЛ в 7р14.1 и

14q32.33 хромозомни ленти

VII Литературна Справка

1. ; WHO press release]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/releases/en/. 2. Stephens, J.W. and S.E. Humphries, The molecular genetics of cardiovascular disease:

clinical implications. Journal of Internal Medicine, 2003. 253(2): p. 120-127.

3. Boonpeng, H. and K. Yusoff, The utility of copy number variation (CNV) in studies of hypertension-related left ventricular hypertrophy (LVH): rationale, potential and challenges. Mol Cytogenet, 2013. 6(1): p. 8.

4. Peden, J.F. and M. Farrall, Thirty-five common variants for coronary artery disease: the fruits of much collaborative labour. Hum Mol Genet, 2011. 20(R2): p. R198-205.

5. Shia, W.C., et al., Genetic copy number variants in myocardial infarction patients with hyperlipidemia. BMC Genomics, 2011. 12 Suppl 3: p. S23.

6. Knouff, C.W., et al., Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants (vol 41, pg 334, 2009). Nature Genetics, 2009. 41(6): p. 762-762.

7. Costelloe, S.J., et al., Gene-Targeted Analysis of Copy Number Variants Identifies 3 Novel Associations With Coronary Heart Disease Traits. Circulation-Cardiovascular Genetics, 2012. 5(5): p. 555-560.

8. Carlson, R.V., K.M. Boyd, and D.J. Webb, The revision of the Declaration of Helsinki: past, present and future. British Journal of Clinical Pharmacology, 2004. 57(6): p. 695-713.

9. Kallioniemi, A., et al., Comparative Genomic Hybridization for Molecular Cytogenetic Analysis of Solid Tumors. Science, 1992. 258(5083): p. 818-821.

10. Cordell, H.J., Detecting gene-gene interactions that underlie human diseases. Nature Reviews Genetics, 2009. 10(6): p. 392-404.

11. Smith, M., et al., Mitochondrial and ion channel gene alterations in autism. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics, 2012. 1817(10): p. 1796-1802.

12. Sleptsov, A.A., et al., Somatic genome variations in vascular tissues and peripheral blood leukocytes in patients with atherosclerosis. Russian Journal of Genetics, 2014. 50(8): p. 870-

878.

47

13. Wu, Z.J., et al., Copy number variation of the Lipoprotein(a) (LPA) gene is associated with coronary artery disease in a southern Han Chinese population. International Journal of Clinical and Experimental Medicine, 2014. 7(10): p. 3669-3677.

14. O'Donnell, J.J., 3rd, et al., Loss of p120 catenin upregulates transcription of pro-inflammatory adhesion molecules in human endothelial cells. Microvasc Res, 2011. 82(2): p. 105-12.

15. Deng, W.M., et al., Down-modulation of TNFSF15 in ovarian cancer by VEGF and MCP-1 is a pre-requisite for tumor neovascularization. Angiogenesis, 2012. 15(1): p. 71-85.

16. Д-р Данаил Аврамов, д.Н.Г., Възпалителни биомаркери: роля в развитието на атеросклерозата. Патогенеза, 2007. 5.

17. Kowalski, G.M., et al., Overexpression of sphingosine kinase 1 in liver reduces triglyceride content in mice fed a low but not high-fat diet. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2015. 1851(2): p. 210-219.

18. Yao, Y.S., et al., An updated meta-analysis of endothelial nitric oxide synthase gene: Three well-characterized polymorphisms with ischemic stroke. Gene, 2013. 528(2): p. 84-92.

19. Huang, Z.K., et al., Association between Angiotensin I-Converting Enzyme Insertion/Deletion Polymorphism and Prognosis of Kidney Transplantation: A Meta-Analysis. Plos One, 2015. 10(5).

20. Al-Hazzani, A., et al., Renin-angiotensin system gene polymorphisms among Saudi patients with coronary artery disease. Journal of Biological Research-Thessaloniki, 2014. 21.

21. Moradzadegan, A., et al., Angiotensin converting enzyme insertion/deletion (I/D) (rs4646994) and Vegf polymorphism (+405G/C; rs2010963) in type II diabetic patients: Association with the risk of coronary artery disease. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System, 2015. 16(3): p. 672-680.

22. Yamada, Y., et al., Association of genetic variants with hypertension in a longitudinal population-based genetic epidemiological study. International Journal of Molecular Medicine, 2015. 35(5): p. 1189-1198.

23. Tewari, S. and P.K. Goel, Role of Lipoprotein(a) Apolipoprotein B100 and Angiotensin Converting Enzyme Gene Polymorphism in Coronary Artery Disease in Indians. Journal of the American College of Cardiology, 2013. 61(10): p. E1356-E1356.

24. Badenhop, R.F., X.L. Wang, and D.E.L. Wilcken, Angiotensin-Converting Enzyme Genotype in Children and Coronary Events in Their Grandparents. Circulation, 1995. 91(6): p. 1655-

1658. 25. Rafatian, N., et al., Role of renin-angiotensin system in activation of macrophages by

modified lipoproteins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2013. 305(9): p. H1309-H1320.

26. McLaren, J.E., et al., The TNF-Like Protein 1A-Death Receptor 3 Pathway Promotes Macrophage Foam Cell Formation In Vitro. Journal of Immunology, 2010. 184(10): p. 5827-5834.

27. Kratzer, A., H. Giral, and U. Landmesser, High-density lipoproteins as modulators of endothelial cell functions: alterations in patients with coronary artery disease. Cardiovasc Res, 2014. 103(3): p. 350-61.

28. Zhu, Y., et al., Low density lipoprotein induces eNOS translocation to membrane caveolae: the role of RhoA activation and stress fiber formation. Biochim Biophys Acta, 2003. 1635(2-3): p. 117-26.

29. Mullighan, C.G., et al., BCR-ABL1 lymphoblastic leukaemia is characterized by the deletion of Ikaros. Nature, 2008. 453(7191): p. 110-+.

30. Mullighan, C.G. and J.R. Downing, Genome-wide profiling of genetic alterations in acute lymphoblastic leukemia: recent insights and future directions. Leukemia, 2009. 23(7): p.

1209-1218.

48

49

VIII ПУБЛИКАЦИИ И НАУЧНИ ПРОЯВИ ВЪВ ВРЪЗКА С

ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД:

Списък на научните публикации по темата на

дисертацията

1. K. Gancheva, A. Postadjian, D. Brazma, C. Grace, A.

Chanalaris, E. Nacheva, M.D. Apostolova; Copy number

variation: Distribution in patients with coronary atherosclerosis;

Biotechnol. Biotechnol. Equip. (2009); 23 (1); 1095-1100

IF=0.291

(Цитирана 1, Scopus)

2. Nacheva EP, Brazma D, Virgili A, Howard-Reeves J,

Chanalaris A, Gancheva K, Apostolova M, Valganon M,

Mazzullo H, Grace C.; Deletions Of Immunoglobulin Heavy

Chain And T Cell Receptor Gene Regions Are Uniquely

Associated With Lymphoid Blast Transformation Of Chronic

Myeloid Leukemia. BMC Genomics. 2010 Jan 18;11(1):41.

IF=4.206

(Цитирана 18, Scopus)

3. Mokretar K., Velinov H., Postadjiyan A., Apostolova M. ;

Association of polymorphisms in eNOS and RAAS with

developing of CAD in Bulgarian patients,. Association of

polymorphisms in eNOS and RAAS with developing of CAD in

Bulgarian patients – accepted; Genetic Testing and Molecular

Biomarkers IF=1.464

50

Списък с Участие в Научни Конференции

1. Рахила Козарова, Арман Постаджиян, Катя Ганчева, Colin

Grace, Elisabeth Nacheva, Божидар Финков, Маргарита

Апостолова. Вариации в броя на копията в човешките гени за

металотионеини и вероятната им роля в развитието на

сърдечносъдови заболявания. XII национален конгрес ко

кардиология с международно участие, 07-10 Октомври 2010,

Албена, България.

2. A. Постаджиян, В. Велчев, K. Ганчева, Н. Иванова, M.

Апостолова, Б. Финков „Мултифокална атеросклероза –

анализ на връзката с полиморфизмите на няколко кандидат

гени” XII национален конгрес ко кардиология с международно

участие, Албена 07-10 Октомври 2010.

3. K. Ганчева, А. Постаджиян, Б. Черкелова, В. Ганев, М.

Апосотолова. Връзка между полиморфизми в гените за

eNOS и ACE и остър коронарен синдром в Българската

популация. XI Национален кардиологичен конгрес, Пловдив

20-22 ноември 2008.

4. К. Ганчева, А. Постаджян, Д. Бразма, К. Грейс, Е. Начева, М.

Апостолова. Вариации в броя на ДНК последователности,

разпространени при пациенти с Атеросклероза. Научна

Сесия по Молекулярна биология в памет на Академик Румен

Цанев, 6-7. 10. 2008, София, България.

5. К. Ганчева, Г. Рачева, А. Постаджиян, Й. Генова, В. Ганев,

М. Апостолова. Връзка между полиморфизми в гените за

eNOS, AT1R II и ACE и Остър коронарен синдром в

българската популация. Първа Научна Конференция за

Студенти и Докторанти с Международно участие „Студентско

научно творчество и Евроинтеграция, 11.11.2006.

6. K. Gancheva, A. Postadjian, J. Genova, V. Ganev, M. D.

Apostolova. Association of eNOS gene polymorphism

(Glu298Asp) with Unstable Angina Pectoris in Bulgarian

population. 29th Balkan Medical Week, 28-30.09.2006, Golden

Sands

51

IX Благодарности

Благодаря сърдечно:

На научния ми ръководител доц. Маргарита

Апостолова, за помоща при изработването, написването и

оформянето на настоящата дисертация, за възможността

да работя в лаборатория и инсититут с най-съвременни

технологии в областта на геномиката и молекулярната

биология, за безрезервната подкрепа и доверието в мен

през последните години и за всичко на което ме е научила;

На научния ми консултант проф. Д-р Елисавета

Начева и на целия колектив на лабораторията по

Молекулярна Цитогентика към Хематологичното отделение

на Royal Free Hospital, Лондон за подкрепата и помоща при

изработване на част от експриментите;

На колегите от Института по Молекулярна

биология, БАН за моралната подкрепа, приятелската

атмосфера и помощта при лабораторните експерименти.

Специално искам да изкажа благоадрност на Владимира

Василиева.

На съпругът и семейството ми за вярата, за

подкрепата и за любовта.