최종보고서[기관고유연구사업]

2016 년 3 월 11 일

과제책임자 : 최 용 두 (인)

국 립 암 센 터 원 장 귀 하

과제고유번호 1310160연 구 분 야

( 코 드 )LC0318

지 원

프 로 그

램

창의 과제공개가능여부

(공개, 비공개)공개

연 구 사 업 명 국 립 암 센 터 기 관 고 유 연 구 사 업

연 구 과 제 명 전이 난소암의 영상-유도 시술을 위한 엽산 수용체 표적 활성화 형광프루브 개발

과 제 책 임 자 성명 최용두 소속 분자영상치료연구과 직위 과장

세 부 과 제

구분 과제명과제책임자

성명 소속(직위) 전공

(1세부)

전이 난소암의 영상-유도 시술을 위한

엽산 수용체 표적 활성화 형광프루브

개발

최용두

분자영상치료

연구과

(과장)

분자영상/

약물전달

총 연 구 기 간

2013년1월~ 2015년

12월

(총 3 년)

해당단계

참 여

연구원 수

총: 13명

내부: 13명

외부: 명

해당단계

연 구 개 발 비

연구비: 300,000

천원

민간: 천원

계: 천원

총 연구기간

참 여

연구원 수

총: 13명

내부: 13명

외부: 명

총 연구개발비

연구비: 천원

민간: 천원

계: 천원

연 구 기 간 및

연 구 비

(단 위 :천 원 )

구분 연구기간 계 국립암센터기업부담금

소계 현금 현물

계 2013.1~2015.12 330,000

제1차 2013.1~2013.12 130,000

제2차 2014.1~2014.12 100,000

제3차 2015.1~2015.12 100,000

참여기업 참여기업명 :

국제공동연구상대국명: 상대국 연구기관명:

위 탁 연 구연구기관명: 연구책임자:

요약(연구개발성과를 중심으로 개조식으로 작성하되, 500자 이내로 작성합니다)

< 국문 요약문 >

연구의

목적 및 내용

<최종목표>

복막 파종 난소암의 위치를 실시간으로 영상화 할 수 있게 하여 보다 직관적인

수술적 치료를 가능하게 하며, 수술적 암 제거율을 높여서 재발을 줄이고 생존

향상을 가능하게 하기위한 엽산 수용체 표적 근적외선 형광 활성화 프루부 개발

연구개발성과

<정량적 성과1)>

구분 달성치/목표치1) 달성도(%)

SCI 논문 편수 4/4 100

IF 합 25.063/20 125

기타 성과국내 및 PCT 특허출원

1건/0건200

1) 총연구기간 내 목표연구성과로 기 제출한 값

- 학회발표: 국제학회 3회, 국내학회 5회 발표

- International videoconference 2회 주최

<정성적 성과>

-엽산 수용체 표적형 형광 억제 및 활성화 기술 구현

-엽산수용체 표적 형광 프루브 기반 기술 구축

-In vitro 난소암 표적 성능 평가모델 확립

연구개발성과의

활용계획

(기대효과)

- 복막 파종 난소암의 위치를 실시간으로 영상화 할 수 있어서 보다 직관적인 수

술적 치료를 가능하게 하며, ２）현재 육안 및 촉진으로 종양을 정상조직으로

부터 구별하여 수술적으로 제거하여 통상 진행성 난소암에서 수술 후 12-20개

월이 경과하면 약 절반의 환자에서 복강 내 재발을 보이게 되는데, 현미경적

인 종양 확인이 가능하여 수술적 제거율을 높여서 재발을 줄이고 생존 향상을

가능하게 함, 3)잔류암의 광역학 치료를 통하여 암환자의 생존율 향상 기대.

- 나노 및 저분자의약품을 이용한 광학특성 조절 원천기술 및 관련 원천특허 확

보

- 개발된 전이 난소암 및 림프절 분자영상 기술을 다른 암종에서도 적용 가능함.

중심어

(5개 이내)전이난소암 엽산수용체 근적외선 형광 암 표적 활성화

< 영문 요약문 >

〈 SUMMARY 〉

Purpose&

Contents

<Final objective>

To develop activatable and folate receptor-targeted nearinfrared fluorescent

probes which enables real-time visualization and direct surgical operation of

metastatic peritoneal ovarian cancers, thereby improving overal survival rate

of cancer patients

Results

<Quantitative Measure1)>

Achievement/Goal1) Achievement(%)

SCI paper 4/4 100IF 25.063/20 125

etc

Application of

domestic and PCT

patent 1/0

200

- Conference presentation: International 3 times, Domestic 5 times- Openting of International videoconference: 2 times

Expected

Contribution

- Enable visualization of locations and margins of metastatic peritoneal

ovarian cancers.

- Significantly enhance overal survival rate of ovarian cancer petients by

enhancing results of surfical operation

- Enhance treatment outcome by using activatable photodynamic therapy

- Secure original patent and technology with regard to the controlling of

optical properties of nano and low molecular weight medicines

- applicable to visualization and treatment of the other cancers and lymph

nodes

Keywordsadvanced

ovarian cancerfolate receptor

near-infrared

fluorescence

cancer

targetingactivatable

〈 목 차 〉

1. 연구개발과제의개요 ······················································································· 1

2. 국내외 기술개발 현황 ··················································································· 3

3. 연구수행 내용 및 결과 ················································································· 4

4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ······················································· 28

5. 연구결과의 활용계획 등··············································································· 28

6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보··················································· 29

7. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ····························································· 31

8. 참여연구원 현황 ··························································································· 32

9. 기타사항 ········································································································· 32

10. 참고문헌 ······································································································· 32

<별첨> 자체평가의견서

- 1 -

1. 연구개발과제의 개요

1-1. 연구개발 목적

○ 복막 파종 난소암의 위치를 실시간으로 영상화 할 수 있게 하여 보다 직관적인 수술적 치료를 가

능하게 하며, 수술적 암 제거율을 높여서 재발을 줄이고 생존 향상을 가능하게 하기위한 엽산 수

용체 표적 근적외선 형광 활성화 프루브 개발

1-2. 연구개발의 필요성

○ “Silent Lady Killer”로 알려진 난소암(epithelial ovarian cancer)은 미국, 유럽 등을 통틀어

서 부인암 중 가장 사망율이 높은 질환임. 난소는 배속에 있어서 종양이 생겨도 초기에는 거의

아무런 자각증상이 없기 때문에, 환자의 2/3 이상은 복강내 전체에 걸쳐서 암의 전이가 일어난

상태에서 병원을 방문하게 됨. 난소암은 마치 씨를 뿌리듯이 복막으로 퍼져나가 전이되며 림프절

전이도 잘 일어남 (그림 1). 또한 일차 치료 후에도 상당 부분은 재발하기 때문에 치료 부담

(treatment burden) 이 큰 암 종으로 알려져 있어서 발생율 대비 국가적 치료 부담 및 사망률이

매우 높은 질환으로 효과적 진단 및 치료법 개발이 필요함.

그림 1. 복강내 전체에 걸쳐서 난소암이 마치 씨를 뿌리듯이 전이되어 있는 모습. 수술소견: 복

막암의 복강내 전이 소견, 간, 위, 대장, 소장 비장 등 전이소견을 보이지만 약 10시간에 걸친

수술 후에 상당부분의 종양을 감축하여 생존율의 향상을 보일 수 있음.

○ 복막 내 전체에 퍼진 암의 위치를 육안으로 확인하면서 약 10시간에 걸쳐 수술에 의해서 제거하는

데, 최근의 연구보고에 의하면 수술 후에도 제거되지 않고 복강 내에 남는 잔류 종양의 크기가 환

자의 생존율에 결정적 영향을 미치는 것으로 알려져 있음 (그림 2).

○ 현재에는 육안으로 보이거나 만져지는 종양을 절제하고 있으나, 향후 이보다 미세한 종양을 절제

하고, 나노 수준에서 치료할 수 있다면, 난소암의 치료 결과는 비약적으로 향상될 것으로 예상됨.

○ 따라서, 본 연구에서는 복강내 퍼져있는 전이된 난소암세포의 존재 유/무 및 위치를 근적외선 형

광영상을 통하여 빠르게 실시간으로 영상화 할 수 있고, 또한 빛을 이용하여 작은 크기의 난소암

들을 비침습적으로 제거할 수 있는 엽산 수용체 표적 형광 프루브를 개발 하고자 하였음.

- 2 -

그림 2. 수술 후 복강 내 남는 잔류 종양의 크기에 따라서 생존율이 결정된다는 생존곡선, 현재

는 육안으로 보이는 종양을 제거하고 있지만, 이론적으로 현미경적 상태의 종양을 수술장에서 발

견하여 수술적으로 제거하거나, 항암치료 등의 방법으로 제거할 수 있다면 난소암의 완치가 가능

하다고 할 수 있음. 현재는 이러한 진단 방법이 없기 때문에 여기에 대한 기초 연구가 절실히 필

요함.

○ 개발하고자 하는 전이난소암 표적 형광 프루브는 정상조직에서는 형광을 내지 않거나 낮은 광독성

을 보이지 않다가, 표적으로 하는 난소암세포에 의해서만 근적외선 형광 신호가 선택적으로 증가

되어, 높은 신호-대-잡음비로 표적 암세포의 존재 유/무 및 위치를 실시간으로 영상화 할 수 있는

프루브임. 개발 나노 프루브를 이용하면 1) 복막 전이 난소암의 위치를 실시간으로 영상화 할 수

있어서 보다 직관적인 수술적 치료를 가능하게 하고 수술 시간을 획기적으로 단축 시킬 수 있을

것임. 또한, 2) 현재는 육안 및 촉진으로 종양을 정상조직으로부터 구별하여 수술적으로 제거하여

통상 진행성 난소암에서 수술 후 12~20개월이 경과하면 약 절반의 환자에서 복강 내 재발을 보이

게 되는데, 현미경적인 종양 확인이 가능하여 수술적 제거율을 높여서 재발을 줄이고 생존 향상을

가능하게 할 것임. 또한 수술적 제거에 병용하여 형광 프루브를 이용한 광역학/광열 치료를 시행

시 종양 선택적으로 반응성 산소를 생성함으로써 치료효과의 향상을 얻을 수 있는 것임.

1-3. 연구개발 범위

○ 본 연구에서는 형광염료가 형광 신호를 내지 못하다가 표적으로 하는 암세포에 반응할 때만 선택

적으로 강한 형광신호를 생성해 내는 프루브를 개발하고자 하였으며, 이것을 이용하면 시간에 구

애없이 높은 종양-대-배경 신호비로 암 병소의 영상 검출이 가능할 것으로 기대하였음. 기존의

folate-FITC 결합체와 다르게 근적외선 형광 염료를 사용함으로써, 조직 투과성을 높이고 자가 형

광의 문제점도 해결하고자 하였음.

그림 3. 본 연구에서 개발한 엽산 수용체 표적 활성화 프루브의 개념도. 본 연구의 가설은, 세포내에서 분

- 3 -

2. 국내외 기술개발 현황

해될 수 있는 linker를 통하여 결합된 엽산-형광염료 또는 광감각제의 결합체를 합성함으로써, 표적으로

하는 세포 밖에서는 형광 신호 또는 반응성 산소를 생성해 내지 못하다가, 엽산수용체를 매개로 하여 암

세포 내로 들어갔을 때에만 강한 형광 신호를 발생하고 또한 반응성 산소를 생성해 내기 시작하는 모식도.

○ 본 연구에서는 저분자 또는 나노의약품 형태의 엽산표적 활성화 프루브를 개발하고, 광학 특성 분

석, in vitro 세포 실험 및 in vivo 동물 실험에서의 성능 평가를 진행하였음.

○ 난소암의 90-95%는 folate receptor-alpha를 과발현 하는 것으로 알려져 있음. 따라서, 네델란드

Dam박사와 독일 Ntziachristos 박사팀은 세계 최초로 전이 난소암 환자에게 folate-fluorescein

isothicyanate (FITC) 결합체를 투여하고 복강내 퍼진 난소의의 형광영상을 촬영하는 시도를 하였

음. 그림 4에서 보이는 것처럼 육안으로 관찰하는 경우에 비해서 형광영상을 통하여 난소암의 위

치를 명확하게 식별할 수 있는 것을 알 수 있음.

그림 4. 형광영상에 의해서 복강내 전이암을 더 정확히 검출 할 수 있음을 보여주는 연구 결과.

(a) 전이 난소암의 형광영상을 얻기 위해 사용된 multispectral fluorescence camera image

system. (b)-(g) 환자의 복강내 전이된 암을 형광영상 (Excitation: 495nm, Emission: 520 nm)을

통하여 관찰한 모습. (h)육안으로 보이는 암 병소 확대사진과 (i)형광영상으로 보이는 암병소의

확대된 형광영상 모습. 형광 영상을 통하여 더 쉽게 그리고 명확하게 암의 위치를 파악할 수 있

다. (Dam et al., Nature Med, 17(10):1315-1320)

○ folate-FITC 결합체의 경우에는 가시 광선영역에서 빛을 흡수하고 형광을 내는 FITC를 사용하였기

때문에 autofluorescence에 의한 종양-대-배경 신호비의 저하의 문제가 있고, 또한 검출 가능한

종양 조직의 깊이가 수 mm도 안 된다는 문제점을 여전히 갖고 있음.

○ 기존의 난소암의 형광영상 검출에 사용된 형광염료는 빛을 쪼여 주는 동안은 항상 형광 신호를 발

생하는 always turn-on 타입의 형광염료들이기 때문에, 높은 대조도의 영상을 얻기 위해서는 종양

내 염료의 축적양은 최대가 되면서도 혈액 및 정상조직에 존재하는 형광염료의 농도는 최소가 되

는 시간에 영상을 얻어야 함. 그러나, 환자에 따라서 pharmacokinetic property가 다르므로, 최적

- 4 -

3. 연구수행 내용 및 결과

영상을 위한 시간을 알기가 힘들다는 문제가 있고, 특히, 항체 결합체의 경우에는 혈액내 체류시

간이 길어서 영상을 얻기 위하여 수일을 기다려야 되었음.

○ 정상조직에 대한 비특이적 축적은 최소화 하면서 종양내 molecular beacon의 농도는 최대가 되게

하기위해서는 activatable 저분자 또는 나노 프루브 형태가 유리함. 고분자 또는 나노프루브의 경

우에는 저분자 프루브에 비하여 낮은 용량에서도 높은 종양 축적율을 얻을 수 있으나, always

turn on 프루브의 경우에는 배경 잡신호 비율이 오랜 시간동안 유지된다는 문제가 있음.

○ 따라서, 근적외선 파장 영역에서 형광신호를 낼 수 있으면서, 형광 및 반응성 산소 생성이 조절이

되는 프루브를 개발 할 수 있다면, 지금까지 개발된 프루브 중에서 가장 효율적이면서도 원천 기

술이 되는 프루브를 구현할 수 있을 것임.

3-1. 난소암 조직에 과발현된 엽산수용체(folate receptor, FAR)를 표적으로 하여 난소암 세포에서

특이적으로 형광을 나타내는 프루브 개발

○ FAR이 과발현되는 것으로 알려져 있는 난소암 세포를 형광영상으로 통하여 높은 신호-대-잡음 비

로 구별할 수 있는 용도의 FSA(folate-receptor specific activatable) probe를 개발하고자 하였

음.

○ 엽산(Folate) 과 근적외선 형광염료인 ATTO 염료가 cathepsin B에 의해 분해되는 peptide

substrate인 아르기닌(di-arginine)으로 연결된 프루브를 합성함(그림 5).

그림 5. 암세포 표적 리간드인 엽산에 결합된 ATTO655 염료가 세포 내로 흡수되어 소광되는 모식

도와, FSA probe의 구조.

○ FSA probe에 cathepsin B를 처리하였을 때는 형광이 3.5배 증가함을 확인. 또한, cathepsin B의

억제제인 E64를 전처리한 cathepsin B를 FSA에 처리하였을 때는 형광이 증가되지 않음을 확인.

따라서 cathepsin B에 의해 FSA probe의 형광 증가가 특이적으로 일어나는 것을 확인함(그림 6).

- 5 -

그림 6. (a) 제조된 FSA probe에 PBS, cathepsin B 또는 E64-pretreated cathepsin B를 처리한

후 측정한 FSA의 형광스펙트럼 데이터. (b) FSA probe에 각각 cathepsin B와 cathepsin B의 억제

제를 처리한 후 고정된 파장으로 찍은 형광 스펙트럼 값 (n=3).

○ FSA probe를 DMSO에 녹였을 때와 PBS 수용액에 녹였을 때 형광 스펙트럼을 측정함으로써, 수용액

상에서는 FSA의 형광이 억제됨을 확인함(그림 5a). 한편, 생체 내 조건에서 probe의 안정성을 확

인하기 위하여 20%의 HSA(human serum albumin) 및 100% FBS(fetal bovine serum)에서 형광 스펙

트럼을 분석한 결과, 혈청 단백질들은 프루브의 형광에 영향을 미치지 않음을 확인함(그림 7b).

그림 7. (a) FSA를 DMSO 및 PBS로 각각 녹였을 때의 형광스펙트럼 측정 결과. (b) FSA를 PBS,

20% HSA가 함유된 PBS, 및 100% FBS에 녹였을 때 FSA probe의 형광스펙트럼 측정 결과.

○ 각 세포주 별로 FAR의 basal level을 flow cytometry로 분석하여, FAR이 많이 발현된 난소암 세포

주와 거의 발현되지 않은 세포주를 선택. 많이 발현된 난소암 세포주로는 SKOV3, 거의 발현되지

않은 대조군 세포주로는 MDA-MB-231이 선택됨(그림 8).

- 6 -

그림 8. MDA-MB-231과 SKOV3 세포주에서의 FAR 발현 측정.

○ FSA probe의 FAR에 의한 선택적 세포내 흡수 관찰

- FAR 발현량이 높은 SKOV3 세포주와 FAR 발현량이 낮은 MDA-MB-231 세포주를 1×105개/well의 농도

로 4 well Lab-tek chamber에 seeding하고, overnight 동안 배양하였음. 세포 배양액을 사용하여

FSA probe의 최종농도를 1 μM로 희석시키고, 두 종류의 세포주에 첨가 후 37℃에서 2시간 동안

두었음. 그리고 또 다른 대조그룹으로 SKOV3 세포에 free folate를 먼저 처리해주고 FSA probe를

같은 조건으로 첨가하였음. 이후, 세포 내로 흡수되지 않은 FSA probe를 제거하기 위하여 세포배

양액을 이용하여 2번 세정하고, 새로운 세포배양액을 첨가하였음. 그 후 공초점 현미경을 이용하

여 영상을 분석하였음.

- FSA probe를 MDA-MB-231 세포주에 처리한 경우 세포내로 흡수가 잘 되지 않는 것에 비하여, FAR 발

현량이 높은 SKOV3 세포주에 처리한 경우에는 세포내로 잘 흡수되어 형광 강도가 크게 증가한 것

을 확인할 수 있음. 또한, free folate를 FSA probe와 같이 처리해준 경우에는 그렇지 않은 경우

에 비하여 확연히 세포 내로 흡수가 줄어든 것을 확인하였음(그림 9). 이 결과는 FSA가 FAR에

binding한 후에 세포내로 특이적으로 섭취됨을 말해줌.

그림 9. FAR에 의한 FSA probe의 세포 내 섭취 효과 실험. FSA probe를 각 세포주에 1μM의 농도

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로 37℃에서 2시간 동안 처리해 준 후 confocal 현미경을 이용하여 영상을 분석함. 왼쪽은 FAR

negative 세포주인 MDA-MB-231에 FSA probe를 처리한 경우이고, 가운데는 FAR positive 세포주인

SKOV3에 FSA probe를 처리하였으며, 오른쪽은 FAR에 대한 경쟁제로써 free folate (1 mM)을 FSA

probe와 동시에 처리해준 경우임.

○ FSA probe의 cathepsin B에 의한 세포 내 소광 효과 관찰

- SKOV3 세포주를 1×105개/well의 농도로 4 well Lab-tek chamber에 seeding하고, overnight 동안

배양하였음. 1μM 농도의 FSA probe를 SKOV3 세포에 37℃에서 2시간 동안 처리하였으며, 대조군으

로 SKOV3 세포에 cathepsin B의 활성 억제제인 E64d를 처리해주고 FSA probe를 같은 조건으로 첨가

하였음.

- FSA probe를 SKOV3 세포주에 단독으로 처리하였을 때는 세포 내로 흡수된 probe의 강한 형광을 나

타내지만, cathepsin B의 억제제인 E64d를 처리하였을 경우에는 현저히 낮은 형광 강도를 나타내었

음. 이것은 세포내에 존재하는 cathepsin B에 의해서 FSA probe의 형광이 증가하였음을 보여주는

결과임.

그림 10. 난소암 세포주인 SKOV3내의 cathepsin B 활성에 의한 FSA의 형광 증가 확인. FSA probe

를 SKOV3 세포주에 1μM의 농도로 37℃에서 2시간 동안 처리해 준 후 confocal 현미경을 이용하

여 영상을 분석함. 왼쪽은 FSA probe 단독으로 세포에 처리해 준 경우이고, 오른쪽은 cathepsin

B의 억제제인 E64d를 미리 처리해준 경우임.

○ FSA probe의 형광 억제 효과 관찰

- FSA가 표적으로 하는 세포 밖에 있을 때에는 형광 생성이 억제되는 것을 증명하기 위하여, FSA 처

리후 세척 과정 없이 형광 신호의 변화를 관찰하였음. SKOV3 세포주를 1×105개/well의 농도로

4-well Lab-tek chamber에 seeding하고, overnight 동안 배양하였음. 1 μM 농도의 FSA probe 및

- 8 -

free ATTO655 염료를 SKOV3 세포에 15분, 1시간, 2시간 동안 처리하였으며, 앞선 실험과는 달리

세포 배양액을 이용한 세척을 하지 않고 공초점 현미경으로 영상을 얻었음(그림 11).

- 그림 11에서 보는 것처럼, FSA를 처리한 세포의 경우에는 세포 밖에서는 형광신호가 매우 약하게

나왔으며, 세포 안에서는 강한 형광 신호가 발생되었음. 반면에 free ATTO655 염료를 처리한 세포

의 경우에는 세포 밖에서 강한 형광 신호가 지속적으로 관찰되었음.

- 2시간 처리한 후, 세포배양액을 이용하여 2번 세정하고 새로운 세포배양액을 첨가한 후 다시 한

번 공초점 현미경으로 영상을 획득하였을 때, Free dye를 처리한 세포에서는 염료의 세포내 섭취

가 없었으므로 형광 신호가 사라진 반면에, FAR을 매개로한 세포내 섭취가 있는 FSA 프루브 처리

군의 경우에는 여전히 강한 형광 신호가 세포 내에서 관찰되었음.

그림 11. FSA probe와 free ATTO655 염료를 SKOV3 세포주에 처리하고 각 시간별로 공초점 현미경

으로 촬영한 형광영상. 위쪽은 FSA probe를 처리한 것이고, 아래쪽은 free ATTO655 염료를 처리해

준 경우임. 2시간 후에는 세척 후에 다시 공초점 형광 영상을 얻음.

○ FSA probe의 형광 소광 효과를 동물에서 관찰.

- 9 -

그림 12. FSA 형광 프루브의 형광 소광 효과를 관찰하기 위하여, L-form의 아르기닌(R)을 연결자

로 사용한 FSA 프루브, D-form의 아르기닌(r)을 연결자로 사용한 FSA 프루브, free ATTO 염료를

각각 무흉선 누드 마우스에 피하로 주사하고 촬영한 근적외선 형광영상 (λex. 660 nm, λem. 710

nm). 왼쪽: RR 연결자를 갖는 FSA 프루브. 중간: rr 연결자를 갖는 FSA 프루브, 오른쪽: Free

ATTO655 투여.

- FSA 결합체의 경우가 free dye에 비하여 형광신호 발생이 현저히 억제되어 있음을 다시 한 번 확인

함.

○ 합성 및 in vitro cell study가 완료된 효소 활성형 근적외선 형광 프루브를 계속하여 암 실험 동

물 모델에서 성능평가를 진행하였음.

- 10 -

그림 13. (a) SKOV3 tumor-bearing mouse에 인산완충 수용액 (PBS), free ATTO655 염료 및 FSA를

정맥 투여 후 3시간째에 촬영 한 근적외선 형광영상 (λex. 660 nm, λem. 690~730 nm). 화살표는

종양의 위치를 가리킴. (b) 형광 신호로부터 계산된 종양-대-배경 신호 비율 (n = 3). (c)

각각의 시료를 투여 후 3시간째에 채취한 장기 및 종양조직에 대한 대표적인 ex vivo 형광영상

자료 (λex. 660 nm,λem. 690~730 nm).

- Female 무흉선 누드 마우스 (Balb-c/nude)의 피하에 SKOV3 세포 (1x107 cells/50 μL of cell

media)를 이식한 후에, 종양의 크기가 약 60 mm3이 되었을 때, 영상 효능 평가를 실시함. 인산완

충 수용액 (PBS, 100 μL/mouse), free ATTO655 염료, 및 FSA(15 nmol / 20 g 체중)를 정맥 투여

후, 3시간 및 6시간째에 각각 근적외선 형광 영상을 실시하였음(λex. 660 nm, λem. 690~730 nm).

3시간째에 형광 신호가 높게 나오고 6시간째에는 종양에서의 형광 신호가 더 줄어들었음. 3시간째

에 분석된 종양-대-배경 신호비는 7.76+0.88 로 매우 높게 나온 것을 확인함.

- 프루브 투여 후 3시간째에 각 장기를 적출하고 형광영상을 촬영한 결과, 종양 선택적으로 프루브가

축적이 되었음을 알 수 있었음.

- 11 -

3-2. Folate receptor(FAR)를 과발현 하는 암세포를 targeting하여 특이적으로 형광 및 반응성 산소

를 생성해내는 theranostics 개발

○ 엽산 수용체가 과발현된 암 병소를 형광 영상으로 진단하고, 동시에 광감각제로 광역학 치료를 하

기 위한 ON-OFF 복합기능 광의약품을 개발하고자 하였음.

그림 14. 엽산-광증감제 결합체의 (a) 특성 모식도 및 (b) 화학 구조.

○ 엽산을 표적 리간드와 소광제로, 광증감제를 형광체와 치료제로 사용하였으며, 엽산과 광감각제를

암세포에서 많이 발현되는 cathepsin B 효소의 기질을 연결기로 사용하여 folate-RRK-Ce4(FRC) 연

결체를 합성하였음.

○ 합성된 FRC는 질량 분석 스펙트럼으로 확인했을 때 몰질량이 1,416 g/mol로 확인되었고 UV/vis.

흡수 스펙트럼을 통해서 잘 합성된 것을 알 수 있었음.

그림 15. 합성된 FRC의 질량 분석 스펙트럼.

○ 합성된 FRC를 UV/vis. 흡수 스펙트럼을 통해 확인하였음. FRC만 존재할 때는 OFF 상태로 형광이

나오지 않다가 cathepsin B 효소와 만나면 연결기로 사용된 기질이 잘려서 광감각제 고유의 형광

을 나타내어 ON 상태로 되는 것을 확인하였음. OFF 상태에 비해 ON 상태는 형광 세기가 6배로 매

우 증가함. 또한 OFF 상태에서는 일항 산소의 생성이 억제되다가 cathepsin B 효소와 만나면 ON

상태가 되어 일항 산소가 OFF 상태에 비해 6.67배로 급격히 증가하는 것을 확인하였음. cathepsin

B 효소의 억제제를 처리했을 때, 형광 세기와 일항 산소의 생성이 모두 억제된다는 결과를 보아서

형광과 일항 산소의 생성은 cathepsin B 효소의 작용에 따른 것임을 알 수 있었음.

- 12 -

그림 16. (a) 합성된 FRC의 UV/vis 흡수스펙트럼. (b) FRC에 Cathepsin B 효소를 처리하기 전후

와 억제제인 E64를 처리했을 때의 형광 스펙트럼. (c) 665 nm에서의 형광 세기. (d) FRC에

Cathepsin B 효소를 처리하기 전후와 억제제(E64)를 처리했을 때의 일항 산소 생성 거동.

그림 17. (a) FRC에 Cathepsin B,S,L 효소를 처리하기 전후의 형광 스펙트럼. (b) 665 nm에서의

형광 세기 비교. (c) FRC에 Cathepsin B,S,L 효소를 처리하기 전후의 일항 산소 생성 여부. (d)

상대적인 일항 산소의 생성능력 비교.

- 13 -

○ cathepsin S와 L 효소를 이용해서 위와 동일한 실험을 진행해 보았음. 그 결과 FRC는 cathepsin B

효소에 특이적으로만 형광 및 반응성 산소인 일항 산소가 증가된다는 것을 확인할 수 있었음.

○ 혈청 조건하에서 FRC의 분산 안정성을 시험한 결과, 4시간이 지날 때까지도 그 형광이 유지되는

것을 알 수 있었음. 따라서 FRC는 혈청 조건하에서도 안정하며, 혈청 단백질과의 결합이 형광의

활성화에 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였음.

그림 18. FRC를 10% FBS가 들어있는 PBS 용액에서 두고 시간에 따라서 형광변화를 측정함.

○ 암세포 표적 효능 분석 : 암세포 표적 효능 분석을 위하여 KB(엽산 수용체 양성 암세포) 세포에서

의 섭취 실험을 시행하였음. FRC만 KB 세포에 처리해준 경우에는 세포 안으로 섭취되어서 강한 형

광 신호를 나타내는 것을 확인하였음. free folic acid를 경쟁제로 함께 FRC와 처리해 준 경우에

는 형광 신호가 거의 나타나지 않는 것으로 보아 세포 내부로 거의 들어가지 않았다는 것을 확인

하였음. 이것은 FRC의 세포 섭취가 엽산 수용체 매개 엔도사이토시스에 의한 것이라는 것을 증명

하는 결과임. 또한 FRC와 cathepsin B 효소의 억제제인 E64d를 함께 처리해 준 경우에도 동일하게

형광 신호가 거의 나타나지 않는 것을 확인하였음. 이를 통해 세포 내부에서 FRC의 형광이 나타나

는 것은 cathepsin B 효소의 작용에 의한 것임을 확인하였음. 반면에 같은 양의 free chlorin e4

를 처리했을 때는 경쟁제나 효소 억제제의 여부에 상관없이 비특이적으로 소량만 세포 안으로 들

어가는 것을 확인하였음. 따라서 FRC는 엽산 수용체를 매개로 효과적으로 세포에 섭취될 수 있으

며 cathepsin B 효소에 의해 ON/OFF 상태를 야기할 수 있다는 것을 확인하였음.

○ 위의 결과를 토대로 시간에 따라 FRC가 세포 안으로 섭취되는 것을 live cell imaging system을

통해 관찰하였음. 처음 15분에는 약한 형광이 관찰되었는데 시간이 지나 2시간이 되었을 때는 매

우 밝은 형광이 세포내에서만 관찰되었음. 반면에 같은 양의 free chlorin e4를 처리했을 때는 항

상 신호가 ON이므로, 처음 15분에도 강한 형광 신호가 포화되어 나타나는 것을 확인하였음. 따라

서 FRC는 우수한 신호 대 잡음비(signal to ratio)로 효율적인 형광 영상화를 할 수 있을 것으로

기대됨.

- 14 -

그림 19. 같은 양의 FRC와 free Chlorin e4를 경쟁제, 효소 저해제와 함께 KB 세포에 처리하고 2

시간 동안 실시간으로 세포 uptake를 관찰한 형광 사진(λex. 640 ± 15 nm, λem. 690 ± 25 nm).

그림 20. 같은 양의 FRC와 free Chlorin e4를 경쟁제, 효소 저해제와 함께 KB 세포에 처리하고 4

시간 동안 배양했을 때의 공초점 레이저 현미경 사진(λex. 405 nm, λem. 625–754 nm).

그림 21. FRC를 lysotracker와 함께 KB 세포에 처리하고 4시간동안 배양한 뒤 촬영한 공초점 레

이저 현미경 사진.

○ 세포 내의 리소좀을 특이적으로 염색하는 lysotracker와 FRC를 함께 4시간 동안 배양했을 때,

costaining되는 부위가 존재함을 확인하였고, 형광 사진을 겹쳐서 보았을 때도 그 위치가 정확히

겹치는 것을 확인하였음. 따라서 FRC는 세포 내부의 리소좀 안에서 활성화 된 것으로 여겨짐.

- 15 -

○ 세포 독성 시험 : 빛이 없는 어두운 상태에서 KB 세포를 이용하여 실험했을 때, FRC는 0-10 μM

범위에서 세포 독성을 나타내지 않았음.

○ FRC의 광역학 치료 효능 관찰 : KB 세포를 1x104개/well만큼 96-well plate에 넣고, 세포가 잘 부

착되도록 24시간 동안 배양하였음. FRC를 각각 2 μM, 5 μM 농도로 준비하여 세포에 처리한 후 4

시간 동안 배양하였음. 그 후 세포에 uptake되지 않은 FRC를 제거해 준 후에 670 nm 레이저를 이

용하여 조사 선량밀도 50 mW/cm2로 6분 40초 동안 조사해 주었음. 그 후 안정화를 위해 overnight

동안 인큐베이터에서 배양한 후, CCK-8 assay로 세포 독성 여부를 판단하였음. 그 결과 FRC를 단

독으로 5 μM 처리해 준 경우 62%의 세포가 사멸한 것을 확인하였고 경쟁제와 효소 억제제를 처리

한 경우에는 독성이 미미한 것을 확인하였음.

그림 22. (a) 0-10 μM의 농도로 24시간 동안 어둠 속에서 FRC를 배양했을 때의 세포 독성. (b)

4시간동안 KB 세포와 2 μM, 5 μM의 FRC를 배양한 뒤 670 nm 레이저를 조사한 후의 세포 독성.

그림 23. 무흉선 누드 마우스의 피하에 free Ce4, FRC with D-form di-arginine, FRC with

L-form di-arginine을 각각 피하로 (화살표 부위에) 투여하고 근적외선 형광 영상을 촬영한 자

료. free Ce4는 밝은 형광 신호를 내지만 FRC 결합체의 경우에는 매우 약한 형광 신호를 내는 것

을 확인함으로써, FRC에서는 광감각제의 형광이 억제되어있음을 in vivo 에서 확인함.

- 16 -

○ 합성된 FRC가 in vitro에서 활성화 프루브로 우수하게 사용될 수 있을 것으로 확인되어 동물 실험

을 진행하였음.

○ 무흉선 누드 마우스의 피하에 FRC와 free Ce4를 1 μM Ce4 eq./kg로 주사하고 주사한 후 즉시와 3

시간 이후에 NIR 형광 이미지를 촬영함. FRC는 3시간이 지난 후에도 그 형광이 활성화되지 않고

소광 상태가 유지된 반면에, free Ce4는 주사된 직후에는 강한 형광을 내다가 3시간 이내에 그 형

광이 빠르게 사라지는 것을 확인함.

○ 무흉선 누드 마우스에서 FRC의 표적 영상화 : KB 세포를 마리당 5x106개/50 μL RPMI 만큼 누드

마우스의 피하에 주입하고, 종양이 50 mm3가 될 때까지 이틀 간격으로 크기를 측정함(열흘 정도

소요). 종양의 크기가 비슷한 것을 모아 대조군, FRC 투여군, free Ce4 투여군으로 나눔. 각 군마

다 대조군에는 인산 완충 식염수 100 μL/mouse를, FRC 투여군에는 FRC(1 mg Ce4 eq./kg)를, 그리

고 free Ce4 투여군에는 free Ce4를 1 mg/kg를 꼬리 정맥에 주사하였음. 주사한 후 30분, 3시간,

5시간, 24시간 간격으로 NIR 형광 이미지를 촬영하였음. FRC 투여군의 마우스에서는 종양 부위에

특이적인 강한 형광 영상을 얻을 수 있었음. 이것은 FRC가 FAR 양성 종양 부위에 특이적으로 축적

되며, 또한 축적된 후에 그 형광을 효과적으로 활성화한다는 것을 의미함. 강한 형광이 주사한 후

24시간까지 유지되는데, 특히 24시간 후에는 주변의 정상 조직과 종양이 확연하게 구분되는 것을

알 수 있음. 종양-대-배경 신호의 비율은 5.2±0.9를 나타냄. 반면에, 대조군과 free Ce4 투여군

의 마우스에서는 유의미한 형광이 나타나지 않았으며, 꼬리 정맥에 주사한지 30분 후에 free Ce4

투여군의 마우스의 간과 창자에서 강한 형광이 나타남.

그림 24. (a) NIR 형광 이미지 (λex. 660 ± 10 nm, λem. 710 ± 20 nm). 왼쪽부터 인산 완충 식

염수, FRC, free Ce4 투여군. 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고 30분, 3시간, 5시간, 24시간 후 각

각 촬영. 화살표는 종양 부위를 가리킴. (b) 종양-대-배경 신호비. 꼬리 정맥 주사한 후 24시간

이 지난 영상을 토대로 계산함.

- 17 -

그림 25. 인산 완충 식염수와 free Ce4를 꼬리 정맥에 주사하고 30분 후에 찍은 NIR 형광 영상.

(T:종양, H:심장, L:간, S:비장, K:신장, I:창자, B:방광)

○ 무흉선 누드 마우스에서 FRC의 광역학 치료 효능 관찰 : KB 세포를 마리당 5x106개/50 μL RPMI

만큼 누드 마우스의 피하에 주입하고, 종양이 50 mm3가 될 때까지 이틀 간격으로 크기를 측정함

(열흘 정도 소요). 종양의 크기가 비슷한 것을 모아 대조군, FRC 투여군, free Ce4 투여군으로 나

눔. 각 군마다 대조군에는 인산 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS) 100 μL/mouse를,

FRC 투여군에는 FRC(1 mg Ce4 eq./kg)를, 그리고 free Ce4 투여군에는 free Ce4를 1 mg/kg를 꼬리

정맥에 주사하였음. 주사한지 24시간이 지난 후에 670 nm 레이저를 이용하여 조사 선량밀도 100

mW/cm2, 30 J/cm2로 조사해 주었음. 그 후 이틀 간격으로 종양의 크기를 측정함. 종양의 크기가

800 mm3을 초과한 시점에서 실험을 종료하였음. 8일이 지난 후에 FRC 투여군의 종양 크기는 대조

군의 53%를 나타냄. 또한 실험 기간 중 눈에 띄는 마우스의 체중 변화는 나타나지 않았음.

그림 26. (a) 꼬리 정맥 주사한지 24시간 후의 NIR 형광 영상. (b) 인산 완충 식염수, free Ce4,

FRC 투여 후 PDT를 시행하여 8일간 종양 크기의 변화 관찰.

- 18 -

그림 27. 종양 크기의 변화를 관찰하는 동안 마우스의 체중 변화.

- 19 -

3-3. 엽산 수용체 표적 저분자 환원제 반응형 형광 프루브 개발

○ 형광 프루브의 화학적 특성: 엽산과 형광 염료 (ATTO655)의 사이에 이황화결합 (disulfide

chemical bond)을 포함하는 연결자를 통하여 결합체가 이루어짐.

○ FA-SS-ATTO655 프루브 합성

근적외선 형광 염료인 ATTO655는 ATTO-TEC에서 구매하였음. FA-SS-ATTO655 프루브는 ㈜펩트론에

서 제작되었으며, 프루브의 질량분석 (mass spectrometry) 데이터도 ㈜펩트론으로부터 제공되었음.

그림 28. FA-SS-ATTO655의 화학구조

○ FA-SS-ATTO655 프루브의 환원제 처리에 의한 형광 활성화 특성 분석

그림 29. (a) FA-SS-ATTO655결합체의 UV/Vis 스펙트럼. (b, c) 합성된 프루브를 PBS 수용액, 환

원제인 dithiothreitol (DTT)가 PBS에 2 μM 농도로 있는 경우, 환원제인 DTT가 PBS에 5 mM 농도

로 있는 경우의 각각의 시간에 따른 형광 변화 관찰 (n=3). FA-SS-ATTO655의 농도: 1 μM, 형광

측정 조건: λex. 610 nm, λem. 620–850 nm. 세포내 환원제의 농도와 유사한 DTT 5 mM 처리에 의해

서는 프루브의 형광 값이 9배 정도 증가함을 알 수 있었으며, 세포 밖 환경에서의 환원제 농도인

DTT 2 μM 농도에서는 프루브의 형광이 2시간 동안 변화가 없음을 알 수 있었음.

- 20 -

○ FA-SS-ATTO655 프루브 (probe)의 암 선택적 표적 효능 및 형광 활성화 특성 관찰

엽산 수용체 과발현 난소암 세포주인 SKOV3와 엽산 수용체 negative 유방암 세포주인 MDA-MB-231

을 각각 배양하고, 여기에 프루브를 처리해 주었음. 엽산 수용체 negative 세포주인 MDA-MB-231

세포주에서는 약한 형광만이 검출되었지만, 엽산 수용체 positive 세포주인 SKOV3 세포주에서는

강한 형광 신호가 관찰됨. 또한, SKOV3 세포주에 free folate (FA)를 1 mM 농도로 같이 처리해 줌

으로써, 엽산 수용체 결합을 방해 하였을 때는, 세포내 형광 프루브의 신호가 매우 감소하였음.

이것을 통하여, 형광 프루브가 엽산 수용체를 매개체로 하여 암세포 내로 섭취되었으며, 세포내에

서 형광이 활성화되었음을 알 수 있었음.

그림 30. 공초점 현미경 영상 사진 (λex. 630 nm, λem. 650–850 nm).

- 21 -

3-4. Folate receptor(FAR)를 과발현 하는 암세포를 targeting하여 특이적으로 형광 및 반응성 산소

를 생성해내는 theranostics 개발

○ 엽산 수용체가 과발현된 암병소를 형광 이미징으로 진단하고, 동시에 광감각제로 광역학 치료를

하기 위한 ON-OFF 복합기능 광의약품을 개발하고자 하였음.

그림 31. HA-mPEG-Ce6-folate(FA)의 합성 과정

○ 화합물의 골격으로 생체 내에서 분해 가능한 히알루론산 고분자(분자량 66,300 g/mol, HA)를 사용

하였고 혈액에서의 지속 시간을 높이기 위해 mPEG를 추가하였음. 타겟팅 물질로 엽산을, 진단과

치료를 동시에 가능하게 하기 위해 광감각제인 chlorin e6(Ce6)를 사용함.

○ 골격이 되는 HA에 mPEG-amine을 아미드 결합으로 연결하였음. 합성이 끝난 후에 NMR 분석을 통해

HA-mPEG가 제대로 합성이 되었으며, mPEG가 23.8% 붙은 것을 알 수 있었음. 이후 엽산과 Ce6의 연

결을 위해 cysteamine을 연결체로 사용하였음(44.2% 연결).

- 22 -

그림 32. HA-mPEG의 H-NMR 분석 결과

그림 33. HA-mPEG-cysteamine의 H-NMR 분석 결과

- 23 -

○ 합성된 HA-mPEG-cysteamine에 Ce6와 엽산을 각각 10%로 연결하여 합성된 나노 입자는 크기가

122.3 nm로 측정됨.

그림 34. HA-mPEG-Ce6-FA 나노입자의 크기 분포도.

○ HA-mPEG-Ce6와 HA-mPEG-Ce6-FA 나노 입자의 UV 스펙트럼을 확인해 본 결과, 280 nm의 FA peak과

400. 500, 665 nm의 Ce6 peak을 통해 합성이 잘 된 것을 확인하였음. 또한 형광 스펙트럼을 측정

해 본 결과, free Ce6에 비해 HA-mPEG-Ce6는 7.8배의 소광 효과를, HA-mPEG-Ce6-HA는 약 9.26배의

우수한 소광 효과를 나타냄.

그림 35. (왼쪽) HA-mPEG-Ce6(HAmC)와 HA-mPEG-Ce6-FA(HAmCF) 나노입자의 UV/vis 스펙트럼 (오른

쪽) HA-mPEG-Ce6(HAmC)와 HA-mPEG-Ce6-FA(HAmCF) 나노입자의 형광 스펙트럼 (λex. 400 nm, λem.

600-850 nm).

○ 합성된 HA-mPEG-Ce6-FA가 독자적으로 존재할 때는 OFF 상태로 형광이 나오지 않다가 이황화 결합

을 끊는 dithiothreitol(DTT)과 만나면 연결기가 잘려서 광감각제 고유의 형광을 나타내어 ON 상

태로 되는 것을 확인하였음. 2 μM은 세포 밖의 농도, 5 mM은 세포 내의 농도를 대표하여 나타냄.

OFF 상태에 비해 ON 상태는 형광 세기가 18배로 매우 증가함. 이를 통해 이황화 결합이 끊어지면

서 HA-mPEG-Ce6-FA는 효과적으로 형광을 나타내며, 이것이 세포 내에서 특이적으로 일어날 것을

예상할 수 있음. 반면에 HA-mPEG-Ce6는 4.98배의 형광 세기의 증가를 나타냄.

○ 또한 합성된 HA-mPEG-Ce6-FA의 형광이 ON 상태가 되면 일항 산소의 생성 능력도 ON 상태가 되어

OFF 상태에 비해 ON 상태에서는 일항 산소의 생성이 8.6배로 매우 증가함. 반면에 HA-mPEG-Ce6는

2.7배의 일항 산소 생성 증가를 나타냄.

- 24 -

그림 36. (a) HA-mPEG-Ce6-FA(HAmCF) 나노입자의 시간에 따른 형광 세기의 변화 (b)

HA-mPEG-Ce6(HAmC)의 시간에 따른 형광 세기의 변화 (a, b 모두 λex. 400 nm, λem. 665 nm)

그림 37. A. HA-mPEG-Ce6-FA(HAmCF) 나노입자의 시간에 따른 일항 산소 생성 정도의 변화 B.

HA-mPEG-Ce6(HAmC)의 시간에 따른 일항 산소 생성 정도의 변화

- 25 -

3-5. 개발된 전이 난소암 분자 영상 기술의 확대 적용.

○ 전이 난소암 세포주 모델에서 효능을 확인한 물질을 다른 암 종에서도 적용 가능한지에 대한 추가

실험을 진행하였음.

○ 유방암 모델에서의 적용.

난소암 모델에서 그 효과가 확인된 물질 FRC를 이용하여 유방암 세포주인 MCF-7과 MDA-MB-231 세

포에서 섭취 실험을 시행하였음. 두 세포주 모두에서 세포 안으로 섭취되어 강한 형광 신호를 나

타내는 것을 확인하였음. 따라서 난소암 모델에서와 동일하게 엽산 수용체를 매개로 효과적으로

세포에 섭취될 수 있으며 cathepsin B 효소에 의해 ON/OFF 상태를 야기할 수 있다는 것을 확인하

였음.

그림 38. 같은 양의 FRC를 각각 MCF-7, MDA-MB-231 세포에 처리하고 4시간 동안 배양했을 때의

공초점 레이저 현미경 사진(λex. 405 nm, λem. 625–754 nm).

○ 대장암 모델에서의 적용.

난소암 모델에서 그 효과가 확인된 물질 FRC를 이용하여 대장암 세포주인 HT29 세포에서 섭취 실

험을 시행하였음. 먼저, flow cytometry 실험을 통해 HT29 세포에 엽산 수용체가 충분히 발현되어

있음을 확인한 후 실험을 진행하였음(그림 39). 역시 대장암 세포주에서도 세포 안으로 섭취되어

강한 형광 신호를 나타내는 것을 확인하였음. free folic acid를 경쟁제로 함께 FRC와 처리해 준

경우에는 형광 신호의 유의미한 감소를 확인할 수 없었으므로 경쟁제에 의한 저해 효과는 거의 나

타나지 않음을 알 수 있었음. 그러나 FRC와 cathepsin B 효소의 억제제인 E64d를 함께 처리해 준

경우에는 형광 신호가 거의 나타나지 않는 것을 확인하였음. 이를 통해 세포 내부에서 FRC의 형광

이 나타나는 것은 cathepsin B 효소의 작용에 의한 것임을 확인하였음.

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그림 39. HT29 세포에서의 엽산 수용체 발현량.

그림 40. 같은 양의 FRC를 경쟁제, 효소 저해제와 함께 HT29 세포에 처리하고 4시간 동안 배양했

을 때의 공초점 레이저 현미경 사진(λex. 405 nm, λem. 625–754 nm).

○ 대식세포에서의 적용.

난소암 모델에서 그 효과가 확인된 물질 FRC와 FSA를 이용하여 여러 종류의 대식세포에서 섭취 실

험을 시행하였음(그림 41). THP-1 세포주에서는 FRC와 FSA 모두 별다른 형광 신호를 나타내지 않

았음. 그러나, Raw264.7 세포와 J774A.1/activated J774A.1 세포에서는 세포 안으로 섭취되어 강

한 형광 신호를 나타내는 것을 확인하였음. 추가로 flow cytometry 실험을 통해 각 세포주에 엽산

수용체가 발현되어 있는지를 확인한 결과, 현미경으로 관찰한 것과 같이 Raw264.7 세포에서보다

J774A.1 세포에서 엽산 수용체가 더 많이 발현되어 있음을 알 수 있었음(그림 39).

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그림 41. 같은 양의 FRC와 FSA를 대식세포인 activated THP-1, Raw264.7, J774A.a, activated

J774A.1 세포에 각각 처리하고 4시간 동안 배양했을 때의 공초점 레이저 현미경 사진(λex. 405

nm, λem. 625–754 nm).

그림 42. 대식세포주의 flow cytometry 결과.

- 28 -

4. 목표달성도 및 관련분야 기여도

4-1. 목표달성도

○ 엽산 수용체를 과발현 하는 난소암에서만 형광신호 생성이 활성화됨으로써, 난소암을 높은 종양-대-배경 신

호비율로서 실시간으로 검출할 수 있는 스마트 근적외선 형광프루브를 합성하고 그 성능을 세포 및 동물 실

험에서 검증 완료하였음.

4-2. 관련분야 기여도

○ 현재 개발된 엽산 수용체 표적 형광 및 광역학 치료제는, 엽산과 형광염료를 단순히 연결한 형태를 갖고 있거

나, 형광염료의 소광효과를 얻기위하여 소광제를 추가로 결합시키는 복잡한 구조를 띠고 있지만, 본 연구에서는

엽산수용체가 암표적 리간드 뿐 아니라 소광제로 작용하도록 함으로써 암세포에서만 광학특성이 활성화 될수 있

는 가장 간단하고 최적화된 구조의 스마트 프루브를 개발 하였기 때문에, 앞으로 이 특성을 이용한 다양한 연구

가 진행될 것으로 예상됨

○ 본 연구에서 개발된 난소암 표적 스마트 프루브는, 엽산 과발현 타암종의 진단/치료 뿐 아니라, 동맥경화를 포

함한 염증성 질환 병소의 진단/치료에도 획기적인 향상을 도출해 낼수 있을 것으로 기대됨.

5. 연구결과의 활용계획

○ 결합체 합성에 사용된 형광염료 및 광감각제의 친수성 및 전하특성에 따라서도 암표적 성능이 영향을 받는 것으

로 판단되므로, 앞으로 추가 연구를 통하여 친수성/양전하성 형광염료 및 광감각제 개발 연구도 수행할 필요성

이 있음.

○ 개발된 프루브를 염증성 질환인 동맥경화의 진단/치료 연구에 응용 가능성이 있는지에 대한 확장 연구를 수행할

필요성이 있음.

○ 기업에 기술이전을 추진하고, 임상진입을 위한 전임상 시험을 진행할 계획임.

- 29 -

6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보

○ 네델란드의 Vries 그룹에서는 근적외선 형광염료와 bevacizumab 항체의 결합체를 합성하고, 무흉

선 누드마우스를 이용한 난소암의 피하 종양모델에서 암의 형광영상을 얻기 위한 시도를 하였음

(Scheltinga et al., J. Nucl. Med. 2011, 52:1778-1785). 형광dye-항체 결합체 주사 후, 4일째에

형광영상을 얻었으며 종양에서 강한 형광 신호를 얻을 수 있었음.

그림 4. 동물실험에서 피하에 형성된 난소암을 형광영상으로 보여주는 사진.

○ 형광염료-항체 결합체를 이용한 난소암 검출의 경우에는, 난소암에 대한 항체의 결합 특이성이 높

다는 장점이 있으나, 항체의 특성상 blood circulation time이 길므로 혈액 및 정상조직에 존재하

는 항체가 제거되기 까지 몇일 간의 긴 시간을 기다린 후에 형광영상을 얻어야 되는 단점이 있음.

혈액내 항체의 농도가 높은 경우에 종양-대-배경 신호비가 낮기 때문에 좋은 contrast영상을 얻을

수 가 없음.

그림 5. 형광영상에 의해서 복강내 전이암을 더 정확히 검출 할 수 있음을 보여주는 연구 결과. (a)

전이 난소암의 형광영상을 얻기 위해 사용된 multispectral fluorescence camera image system.

(b)-(g) 환자의 복강내 전이된 암을 형광영상 (Excitation: 495nm, Emission: 520 nm)을 통하여 관찰

한 모습. (h)육안으로 보이는 암 병소 확대사진과 (i)형광영상으로 보이는 암병소의 확대된 형광영상

모습. 형광 영상을 통하여 더 쉽게 그리고 명확하게 암의 위치를 파악할 수 있다. (Dam et al.,

Nature Med, 17(10):1315-1320)

○ 난소암의 90-95%는 folate receptor-alpha를 과발현 하는 것으로 알려져 있음. 따라서, 네델란드

Dam박사와 독일 Ntziachristos 박사팀은 세계 최초로 전이 난소암 환자에게 folate-fluorescein

- 30 -

isothicyanate (FITC) 결합체를 투여하고 복강내 퍼진 난소의의 형광영상을 촬영하는 시도를 하였

음. 그림 5에서 보이는 것처럼 육안으로 관찰하는 경우에 비해서 형광영상을 통하여 난소암의 위

치를 명확하게 식별할 수 있는 것을 알 수 있음.

○ folate-FITC 결합체의 경우에는 가시 광선영역에서 빛을 흡수하고 형광을 내는 FITC를 사용하였기

때문에 autofluorescence에 의한 종양-대-배경 신호비의 저하의 문제가 있고, 또한 검출 가능한

종양 조직의 깊이가 수 mm도 안 된다는 문제점을 여전히 갖고 있음.

○ 캐나다의 Gang Zheng과 미국의 Klara Stefflova연구 그룹에서 염산-펩타이드-광감각제 결합체 관련 특허를 출원

함. (Patent No:US 2010/0075899)

- 엽산이 광감각제에 대한 소광제 역할을 한다는 점은 밝히지 못했으며, 엽산이 단순히 표적 리간드로 사용이 되

었으며, 펩타이드 연결자가 사용된 점이 특이점으로 보임.

그림 . 광감각제-펩타이드-엽산 결합체의 모식도

○ 미국의 Hansen 그룹에서 엽산 결합체 및 복합체 관련 특허를 출원하였음. (Patent NO.: US 2005/0261170)

- 여기에서도 엽산이 광감각제에 대한 소광제 역할을 한다는 점은 밝히지 못했으며, 엽산이 단순히 표적 리간드로

사용이 되었음.

- 31 -

7. 연구개발과제의 대표적 연구실적

번호

구분

(논문

/특허

/기타

논문명/특허명/기타소속

기관명역할

논문게재지/

특허등록국

가

Impact

Factor

논문게재일

/특허등록일

사사여부

(단독사사

또는

중복사사)

특기사항

(SCI여부/인

용횟수 등)

1 논문

ROS-responsive activatable photosensitizing agent for imaging and photodynamic therapy of activated macrophages

국립암센

터

교신

저자

Theranosti

cs7.827 2014.01.01 중복사사 SCI

2 논문

A folate receptor-specific activatable probe for near-infrared fluorescence imaging of ovarian cancer

국립암센

터

교신

저자

Chemical

Communicat

ions

6.718 2014.06.17 단독사사 SCI

3 논문

Smart dual-functional warhead for folate receptor-specific activatable imaging and photodynamic therapy

국립암센

터

교신

저자

Chemical

Communicat

ions

6.718 2014.09.21 중복사사 SCI

4 논문

Activatable fluorescence imaging and chemo/photothermal dual therapy for triple-negative breast cancer

국립암센

터

교신

저자

Quantitati

ve Imaging

in

Medicine

and

Surgery

0 2015.10.30 중복사사

PubMed

indexed저

널

(표지그림

선정)

5 특허

엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물

국립암센

터

주발명

자대한민국 2014.05.08 단독사사 출원

- 32 -

8. 참여연구원 현황

번호

소속기관명 직위 생년월일 전공 및 학위연구담당

분야

성명

과학

기술인등록

번호

성별취득

년도

학위

(전공)

과제참여

기간

9. 기타사항

○ 없음

- 33 -

[별첨]

자체평가의견서1. 과제현황

과제번호 1310160

사업구분 기관고유연구사업

연구분야 LC0318과제구분

단위

사 업 명 기관고유연구사업 주관

총괄과제 총괄책임자 최용두

과 제 명전이 난소암의 영상-유도 시술을 위한 엽산 수용체 표적 활성화 형광프루브 개발

과제유형 (기초,응용,개발)

연구기관 국립암센터 연구책임자 최용두

연구기간

연 구 비

(천원)

연차 기간 연구비 민간 계

1차년도 2013.1~2013.12 130,000 0 130,000

2차년도 2014.1~2014.12 100,000 0 100,000

3차년도 2015.1~2015.12 100,000 0 100,000

계 2013.1~2015.12 330,000 0 330,000

참여기업

상 대 국 상대국연구기관

※ 총 연구기간이 5차년도 이상인 경우 셀을 추가하여 작성 요망

2. 평가일 :

3. 평가자(과제책임자) : 최용두

소속 직위 성명

분자영상치료 연구과 책임연구원 최용두

4. 평가자(과제책임자) 확인 :

본인은 평가대상 과제에 대한 연구결과에 대하여 객관적으로 기술하였으며, 공정하게 평가하였음을 확약하며,

본 자료가 전문가 및 전문기관 평가 시에 기초자료로 활용되기를 바랍니다.

확 약

- 34 -

Ⅰ. 연구개발실적

1. 연구개발결과의 우수성/창의성

■ 등급 : (아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량)

부인암 가운데 사망률이 가장 높은 난소암은, 환자의 2/3은 복강내 전체에 걸쳐서 암전이가 일어난 상

태에서 병원을 방문하게 됨. 난소암의 생존율을 향상시킬 수 있는 가장 큰 요소는 수술시 복강내 퍼진

종양을 최대한 제가하는 것이지만, 현재까지는 종양의 위치를 눈으로 효과적으로 직관적으로 확인할

수 있는 방법이 없었음. 본 연구과제에서는 엽산 과발현 암의 위치 및 경계를 실시간으로 근적외선 형

광영상을 통하여 직관적으로 확인할 수 있게 해줄 뿐 아니라, 비침습적 방법에 의해서 광역학 치료도

할 수 있게 해주는 의약품을 개발하였음.

기존의 엽산-형광염료 결합체의 경우에는 엽산이 단순히 암표적 리간드로 사용되었으나, 본 연구에서

는 엽산이 형광염료 또는 광감각제에 대한 소광자로 작용한다는 사실을 발견하고 분해가능성 결합체를

사용함으로써, 표적으로 하는 암세포에서만 강한 형광신호를 발생하며 광역학 치료 효과도 내는 스마

트 의약품을 개발하였음.

2. 연구개발결과의 파급효과

■ 등급 : (아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량)

복막 전이 난소암의 위치를 실시간으로 영상화 할 수 있어서 보다 직관적인 수술적 치료를 가능하게

하고 수술 시간을 획기적으로 단출 시킬수 있을 것임.

현미경적인 종양 확인이 가능하여 수술적 제거율을 높여서 재발을 줄이고 생존향상을 가능하게 할것

임.

수술적 제거에 병용하여 형광 프루브를 이용한 광역학/광열 치료를 시행 시 종양 선택적으로 반응성

산소를 생성함으로써 치료효과의 향상을 기대할 수 있음.

3. 연구개발결과에 대한 활용가능성

■ 등급 : (아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량)

본 연구과제에서 개발된 소분자 프루브는 엽산을 과발현 하는 다양한 종류의 암종 뿐 아니라, 동맥경

화와 같은 염증성 질환의 진단/치료에도 응용 가능성이 높음.

4. 연구개발 수행노력의 성실도

■ 등급 : (아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량)

본 연구를 통하여 개발하고자 하는 엽산표적 스마트 프루브의 핵심 성능 및 특성을 동물 실험에서 증

명 하였음.

5. 공개발표된 연구개발성과(논문, 지적소유권, 발표회 개최 등)

■ 등급 : (아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량)

본 연구를 통하여 5편의 논문(IF합계 25점)을 출판하고, 관련 내용을 국내특허 및 PCT 출원 완료하였

음.

- 35 -

Ⅱ. 연구목표 달성도

세부연구목표

(연구계획서상의 목표)

비중

(%)

달성도

(%)자체평가

엽산 표지 나노 형광 프루브 합성 및 제조 30 100

Ÿ 효소 반응성 연결자를 갖는 엽산-형광염료

결합체 및 엽산-광감각제 결합체 합성 및

광학특성 분석 완료

Ÿ 암세포내 환원제 반응형 엽산-형광염료

결합체 합성 및 광학특성 분석 완료

Ÿ 나노입자형 암표적 프루브 합성 및 특성

분석 완료

세포 실험에서의 독성평가 및 형광영상 및 암치료 효능 평가 30 100

Ÿ 난소암을 포함한 엽산과발현

암세포주에서의 독성평가 및

영상/치료성능을 검증 완료함

암 동물모델에서 프루브의 효용성 평가 40 100

Ÿ 난소암을 포함한 엽산과발현

암세포주에서의 독성평가, 생체내 분포,

및 영상/치료성능을 검증 완료함.

Ÿ 현재 엽산과발현 암종들에 대한

응용확장에 대한 추가 동물실험을

진행중임

합계 100점

Ⅲ. 종합의견

1. 연구개발결과에 대한 종합의견

엽산수용체를 과발현하는 난소암에서만 형광신호 생성이 활성화 됨으로써, 난소암을 실시간으로 높은

종양-대-배경 신호비율로서 검출할 수 있는 스마트 근적외선 형광프루브를 합성하고 그 성능을 세포

및 동물 실험에서 검증 완료 하였음.

2. 평가시 고려할 사항 또는 요구사항

엽산 수용체를 표적으로 하면서도 표적 암세포에서만 선택적으로 형광신호가 활성화 되는 특성을 갖는

스마트 프루브를 합성 및 성능 검증을 하였는지가 체크 포인트입니다.

3. 연구결과의 활용방안 및 향후조치에 대한 의견

본 연구를 통하여 개발된 프루브를, 엽산을 과발현 하는 여러 암종과 동맥경화를 포함한 염증성 질환

에 응용하는 연구를 계속하여 진행할 필요가 있음.