外来医薬品を駆逐tkl.pc.uec.ac.jp/images/class2018/日大集中講義...外来医薬品を駆逐するための...
Transcript of 外来医薬品を駆逐tkl.pc.uec.ac.jp/images/class2018/日大集中講義...外来医薬品を駆逐するための...
BIG PICTURE
• 人間の尊厳がなくなる治らない病気(例: 癌、アルツ)
• 緊急時の即時・簡便診断(例: 救急車内、手術前)
• 日本の若い人の金銭的ツケ(医療赤字)
を何とかしたい。
3
新参の薬学者としてのありきたりな
創薬 = 必要悪
T7 phage
… and their hybrids ! Fluorescent
amino acids(CBC, 2008)
Keep-on-
fluorescent
pharmacophores(ABC, 2018)
Bio-compatible
secret project
Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering
Turn-on
fluorescent
sensors(Anal Chem, 2016)
Dumbbell-shaped
stable DNAs(ANIE, 2004)Aptamer-related
secret project
NEXT-A reactionPET-probe fused
target binders(CTMC, 2016)
Functional Fc
Covalent
binders(Bioconj Chem, 2018)
Macrocycles(Chem Comm, 2014)
Biologics
NonBiologicsCCarbon
Combinatorial Libraries
Rational Designings
Chemistry
Fullerene
bisadducts(JACS, 1998)
AI-related
secret project
… and their hybrids !
Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering
NEXT-A reactionPET-probe fused
target binders(CTMC, 2016)
Functional Fc
Biologics
CCarbon
Chemistry
tRNA
protein Modified protein
L/F-transferase
tRNA
Soffer et al., J. Biol. Chem., 246, 5207 (1972).
LysLeuLeu
Signal for protein degradation
Background:Role of L/F-transferase in nature
Unnecessary Unnecessary
Lys (or Arg)
9
tRNA
protein Modified protein
L/F-transferase
tRNA
Soffer et al., J. Biol. Chem., 246, 5207 (1972).
Lys (or Arg) LysPhePhe
Signal for protein degradation
Background:Role of L/F-transferase in nature
Unnecessary Unnecessary
10
tRNA
protein Modified protein
L/F-transferase
tRNA
Lys
Fundamental principle for ANY-probe labelingmediated by L/F-transferase
ANY-probe
11
Lys (or Arg)
e.g., Taki et al., Chem. Commun., 47, 9116 (2011).
tRNA
PET probe introduction via the NEXT-A reaction
F-protein
Engineered ARS
L/F-transferase
F
F
F
protein
tRNA
One-pot reaction
FMT FET
or
12Amino Acids, 47, 1279 (2015); FEBS Open Bio, 3, 252 (2013).
N-terminal EXtension by Transferase & Aminoacyl-tRNA synthetase
反応速度が命!
放射性の目印
Phe
FMT
FET
Kinetics of the enzymatic transfer
Amino acid
Km
(μM)1.1 2.6 18
kcat
(min-1)60 62 1.0×102
kcat/Km
(μM-1min-1) 55 24 5.7
Phe FMT FET
L/F-transferase
l
-
13Amino Acids, 47, 1279 (2015); FEBS Open Bio, 3, 252 (2013).
37 oC, 20 min
FMT : protein = 2 : 1
Mass (m/z)
NEXT-A
Protein labeling with a PET probe (FMT)
Edman:
> 99% !!
F
F
14Amino Acids, 47, 1279 (2015).
• [18F]FET-Lys-Kallidin
0 2 4 6 8 10
Time(min)
mV
• [18F]FET + Lys-Kallidin
NEXT-A
Radioactive 18F introduction into a peptide by the NEXT-A reaction
0 2 4 6 8 10
Time(min)
mV
[18F]FET
[18F]FET-Lys-Kallidin
15Curr. Top. Med. Chem., 16, 2703 (2016).
放射性の目印
In vivo Cancer Imaging
LOW
HIGH
PET/SPECT/CT: FX3300
Tumor
Dorsal
Ventral
Rostral
Caudal
Coronal Image Transverse Image[18F]FET-Lys-Kallidin-cycloRGD
T. Furukawa, H. Kimura, unpublished (2018).
分子標的型薬剤
放射性の目印
ここまでのまとめ:
NEXT-A reaction :蛋白質/ペプチド/抗体(バイオ分子)のアタマ(N末端NH2基)だけに異種分子を共有結合させる新規酵素反応
17
放射性目印または安定性向上蛋白質
分子標的型薬剤
癌イメージング薬剤または1回投与型薬剤
+
T7 phage
… and their hybrids ! Fluorescent
amino acids(CBC, 2008)
Keep-on-
fluorescent
pharmacophores(ABC, 2018)
Bio-compatible
secret project
Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering
Turn-on
fluorescent
sensors(Anal Chem, 2016)
Dumbbell-shaped
stable DNAs(ANIE, 2004)Aptamer-related
secret project
NEXT-A reactionPET-probe fused
target binders(CTMC, 2016)
Functional Fc
Covalent
binders(Bioconj Chem, 2018)
Macrocycles(Chem Comm, 2014)
Biologics
NonBiologicsCCarbon
Combinatorial Libraries
Rational Designings
Chemistry
Fullerene
bisadducts(JACS, 1998)
AI-related
secret project
T7 phage
Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering
Turn-on
fluorescent
sensors(Anal Chem, 2016)
Covalent
binders(Bioconj Chem, 2018)
Macrocycles(Chem Comm, 2014)
Biologics
CCarbon
Combinatorial Libraries
Chemistry
22
T7 phage
1種類の人工分子
10億種類のライブラリーペプチド(天然っぽい分子)
10億種類のネオバイオ分子候補
10BASEd-T (Gp10 based-thioetherification) reaction :ウィルスの表面で10億種類のネオバイオ分子候補を作る方法:
精密有機合成化学:ウィルスには反応しない。↓
ウィルスは活きたまま、増殖させられる。
単なる足し算以上のもの(ネオバイオ分子)が
たった1分子でもできればそれだけを増やすことができる
TMR-IA: ー +
10BASEd-T:単なる教科書反応(Williamson型エーテル合成; SN2)
1) reduction (TCEP)
2) alkylation (TMR-IA)
one-pot reaction
3 h. @ 4 ℃
-SH
HS- HS-
-SH
Gp10
SH SH S S
▲
S S
Fukunaga et al., Mol. BioSyst., 9, 2988 (2013).
O
O
NON
NH
O
10BASEd-T
40
50
100
10
kDa
Identified by LC-MS/MS
fluorescence imaging
SH SH
←まるで酵素反応!
23
複雑な生体分子を特異的に認識した時、
強度が上がりなおかつ
蛍光色がかわる
生体分子
応用例: 光る薬剤(蛍光診断薬)の作製 Part I
ニーズの具体例:① 救急車の中での血液内特定物質の簡易迅速測定② 手術時の微小癌の摘出③ 癌診断
M. Taki, K. Mochizuki et al., Anal. Chem., 88, 1096 (2016).
S. Uematsu et al., AIP Conf. Ser., 1807, 020028 (2017).
T7 phage
A fluorogenic coreLibrary = 1 billion different peptides
One-billion different fluorogenic molecules
Protein-specific indicator molecule(s)
10BASEd-Tによる環境応答性ネオバイオ分子候補ライブラリーの作製
26
T7 phage
Selection
環境応答性蛍光分子
T7 phage-displayed model peptide is
site-specifically modified via the 10BASEd-T
Gp10
SH SH S S
Like an enzymatic reaction
27
28
GST-binding 12 monoclones with strong ELISA signals:
Group 1: ---
----
-----
Group 2:
Group 3:
NXVSCXGZ
XXNPCXXZ
XPGPCG
Z: Hydrophobic amino acids
X: Any amino acids
29Z: Hydrophobic amino acids
X: Any amino acids
XZCXZDGZ
ZXZCZXDGZLNYCDGW
NXVSCXGZ
XXNPCXXZ
XPGPCG
CDZZ
(TMR)
(DMN)
(DBD)
(Prodan)
取得した蛍光性GST結合体:
Large
Small
Core
size
N = 1.2
KD = 2.4 ± 0.1 μM
ΔH = -4.2 ± 0.1 kcal/mol
-TΔS = -3.6 kcal/mol
ΔG = -7.8 kcal/mol
標的蛋白質(GST)
標的でない蛋白質(streptavidin)
標的蛋白質(GST)
蛍光コアのみ(進化前)
周辺構造のみ
O
x x x
進化後疎水性相互作用と分子間力とがバランス良く作用
熱測定
32
33
V
V
H
H
a
bcd
F
F a
T
T
bcd
e
fg
gfe
VHOD
どの疎水性基がどの程度標的蛋白質と接近しているか?飽和移動差スペクトル法(1H NMR)
蛍光コアも進化させた周辺構造もどちらも重要!
飽和時間=1s
飽和時間=2s
飽和時間=4s
GST蛋白質→ネオバイオ分子へのNOE
34
V
a
c
d
F
ef
0 1 2 3 4 5
0
2
4
6
D a ta 1
T im e (s )
ST
D I
nte
ns
ity
V (M e )
N M e2
F
c
d
e
1.90.78
0.50
weak (below 0.1)
0.24
0.62
0.55
0.24
0.29
必ずV↓ ↓ゆらぎ
V
a
cd
eF(meta)
STD = STDmax x (1-ekt)
k値:
GST蛋白質と接近している度合い
飽和時間
~0
38Z: Hydrophobic amino acids
X: Any amino acids
ZXZCZXDGZLNYCDGW
NXVSCXGZ
XXNPCXXZ
XPGPCG
CDZZ
(DMN)
(DBD)
(Prodan)
取得したGST結合体: 次世代シーケンサーを用いて再度解析
Large
Small
Core
size蛍光基の種類によらない共通配列
T7 phage-S
GST
Selection against
GST
T7 phage-S
T7 phage-S
T7 phage-S
T7 phage-S
GST
T7 phage-S
GST
Prodan
4-DMN
DBD
NGSでの共通配列:YCDGW
共通してソルバト蛍光を示す
40
T7 phage-S
GST
Selected peptide (seq: YCDGW)
GST特異的なソルバト蛍光性の確認:
500 600 700Wavelength (nm)
Flu
ore
scen
ce in
ten
sity
(a.
u.)
(A)
(B)
(C)
LNYCDGWGST
streptavidin
w/o
LNYCDGW
LNYCDGW
41
T7 phage-S
GST Fragmentalteration
-S
GST
Covalent binder
蛍光分子 → 反応点への変換
Solvatochromic bait fragments
Uematsu et al., Bioconjugate Chem., in press (2018).
1回投与型薬剤
42
YCDGW
血清中でも標的蛋白質だけにドンズバリ共有結合
YCDGW
標的の不可逆的阻害(共有結合型薬剤)
Uematsu et al., Bioconjugate Chem., in press (2018). Whole protein
FAM fluorescence
43
y4
1150.3y5
1313.3b5
1279.4
y2
262.1
b3
391.3
[M-H2O]2+
762.0y52+
657.5
b52+
640.4
y62+
714.5 b4
1164.3
m/z
Inte
nsity
b2
228.1
b6
1336.3
y3
377.1
L N Y C * D G W
y2y4y6 y5
b3 b4 b5b2 b6
y3
SO O
IAY*SK
12 13 14 15 Time (min)
Trypsinized fragments of
GST + covalent binder
GSH結合ポケットのチロシン
Newly appeared
44
Tyrosineat the GSH-binding pocket
↑Fluorine atom of the covalent binder
Best docking model of the binder with GST
Uematsu, Tabuchi et al., Bioconjugate Chem., in press (2018).
T7 phage-S
Consensus sequence
GST
T7 phage-S
T7 phage-S
T7 phage-S
T7 phage-S
GST
T7 phage-S
GST
alteration-S
Structure determination by LC-MS/MS
Covalent binder
Bait Warhead
Uematsu, Tabuchi et al., Bioconjugate Chem., in press (2018).
ちょっとまとめ:Covalent binderの取得(ライブラリーからの取得は世界初)
library
1回投与型薬剤
46
10BASEd-T
One-billionpeptide library
T7 phage
+One-billion
crown library
core
抗体医薬代替物の取得を目的とした
超分子型ライブラリーの作製
LC-MS/MS analysis of macrocycle on T7 phage (1)
47
本当にファージウィルス上でクラウンライブラリーができるの?
Fukunaga et al., Chem. Commun., 50, 3921 (2014).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
R0 R1 R2 R3 R4 R5 R6
Rounds
10/11 clones
Biopanning against Hsp90
RSWC*RKSRKNSGGGLVWC*F
ab
so
rba
nc
e a
t 4
50
nm
OEGunmodified
OEG
unmodified
Hsp90
BSA
Hsp90
NTD
MD
CTD
Inp
ut
GST-pull down
GST
GST
GSTBlot: α T7
ELISA
HSP90
49
OEG
10億種類中たった1種類!
The macrocycle binds to NTD of Hsp90
Hsp90 NTD-binding supramolecule
linear peptide
Isothermal titration calorimetry (ITC) measurement
HSP90
O
x
50
KD = 1.7 ± 0.5 μM
ΔH = -13.7 ± 1.6 kcal/mol
VS
51Fukunaga et al., Chem. Commun., 50, 3921 (2014).
クラウンの柔軟な水素結合の生体分子への応用:初めて(皆、金属を捕まえることにしか着目していなかった)
CDスペクトル:
←クラウン型
←直鎖ペプチド型
問題点:結合に伴うエントロピー損失→結合力が弱い(KD = μMオーダー)
Hsp90-NTD
52
Selected cryptand analog as the specific binder
VS
Hsp90-NTD
Improved crown analog with more hydrogen donor
54
Ox
GSTHsp90-NTD
Cryptand binds to NTD of Hsp90 with high affinity
N = 1.1
KD = 62 ± 10 nM
ΔH = -16.9 ± 0.3 kcal/mol
-TΔS = 7.0 kcal/mol
ΔG = -9.9 kcal/mol
Isothermal titration calorimetry (ITC) measurement
Enthalpy driven !
抗体並み!
クリプタンド化しないとHsp90に結合しない。(data not shown)
WA
IL
V
A
IL
V
RRS
AVR
Conventional 1H NMR
WQP
W LI
I
RL
W
azacrownHOD
ppm
DMSOW
W
A
V
V
I
L
55
STD-1H-NMR:Which hydrophobic moieties closely interact with Hsp90?
NOE from Hsp90 to the ligand
56
[θ], d
eg
ree
cm
2d
mo
l-1
Wavelength, nm
CDスペクトル測定:最初からβターン構造(クラウンの時とは異なる)
分子内環化(酸化)されづらい:S-S間は空間的に遠い
Hsp90結合性
Hsp90に結合せず
58
↑特徴的な動きと好ましいエンタルピー寄与(絶妙な角度での水素結合)
全体として:適度な剛直性による結合に伴うエントロピー損失の低減
→
→
→:疎水性相互作用
→
→βターン↓
クリプタンド型のまとめ:抗体並みの性能は何故達成されたか?
重要なW:欠損すると結合力落ち
59
Active Hsp90 refolds luciferase.Hsp90 was inhibited.
Tar
get
unre
late
d p
ept
ide
DM
SO
No
addit
ive
Geld
anam
ycin
Cryptand inhibits Hsp90 activity:
ATP結合サイト以外の場所にて阻害
60
ちょっとまとめ: Macrocycle evolution
10BASEd-T
Core
GST
Hsp90
Hsp90
Macrocycle precursor
Cryptand
or
Crown analog
Mochizuki et al., Manuscript in preparation (2018).
KD = 62 nM
ここまでのまとめ:
10BASEd-T reaction :T7ファージウィルス上に提示させたペプチドが持つシステイン(SH基)だけに人工物を共有結合させる化学反応
61
T7 phage
人工分子
ライブラリーペプチドセレクション
ネオバイオ分子
T7 phage
… and their hybrids ! Fluorescent
amino acids(CBC, 2008)
Keep-on-
fluorescent
pharmacophores(ABC, 2018)
Bio-compatible
secret project
Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering
Turn-on
fluorescent
sensors(Anal Chem, 2016)
Dumbbell-shaped
stable DNAs(ANIE, 2004)Aptamer-related
secret project
NEXT-A reactionPET-probe fused
target binders(CTMC, 2016)
Functional Fc
Covalent
binders(Bioconj Chem, 2018)
Macrocycles(Chem Comm, 2014)
Biologics
NonBiologicsCCarbon
Combinatorial Libraries
Rational Designings
Chemistry
Fullerene
bisadducts(JACS, 1998)
AI-related
secret project
Keep-on-
fluorescent
pharmacophores(ABC, 2018)
Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering
CCarbon
Combinatorial Libraries
Chemistry
Previous work:
target
A)
Always-on
target
B)
Turn-on
3
target
C)This work:
Keep-onH2O
Tabuchi & Taki, ABC, in press (2018).
光る薬剤(蛍光診断薬)の作製 Part II
さっきのやつ
Discovered keep-on pharmacophore
HSAno HSA
HSA
Keep-onfluorescence
Hydrolysis(no fluorescence)
Tabuchi & Taki, ABC, in press (2018).
T7 phage
… and their hybrids ! Fluorescent
amino acids(CBC, 2008)
Keep-on-
fluorescent
pharmacophores(ABC, 2018)
Bio-compatible
secret project
Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering
Turn-on
fluorescent
sensors(Anal Chem, 2016)
Dumbbell-shaped
stable DNAs(ANIE, 2004)Aptamer-related
secret project
NEXT-A reactionPET-probe fused
target binders(CTMC, 2016)
Functional Fc
Covalent
binders(Bioconj Chem, 2018)
Macrocycles(Chem Comm, 2014)
Biologics
NonBiologicsCCarbon
Combinatorial Libraries
Rational Designings
Chemistry
Fullerene
bisadducts(JACS, 1998)
AI-related
secret project
まとめにかえて: 実用化は?
◎
○
○
◎:市販
○:基幹特許取得+動物試験で好成績
私が本気で予想していること
• 20年後:(今で言う)文系出身のリベラルアーツを習熟したリーダーも、
情報科学を武器にして実験科学者を従えて、安価・迅速に創薬を行う時代。
• 創薬は医学者や薬学者だけが行うものではないことが常識となる。
72
誰でも創薬