ΗΟΜΕ · boea, το αφέψημα του οποίου (τσάι του βουνού της...

TPIMHNIAIA EKΔOΣH THΣ EΛΛHNIKHΣ ETAIPIAΣ

MEΛETHΣ METABOΛIΣMOY TΩN OΣTΩN

ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΣΥΝΤΑΞΗΣΓεώργιος Λυρίτης

ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣΠαναγιώτης Παπαγγελόπουλος

ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ ΕΚΔΟΣΗΣΑνδρέας Μαυρογένης

MEΛH EKΔOTIKHΣ EΠITPOΠHΣ Βοσκάκη Ειρήνη Πασπάτη Ιωάννα Γιαννίκου Παναγιώτα Ράπτου Παναγιώτα Ιωακειμίδης Δημήτριος Σάπκας Γεώργιος Καπετάνος Γεώργιος Τζάνος Γεώργιος Καραχάλιος Θεόφιλος Τροβάς Γεώργιος Μπάκας Ελευθέριος Χάλντη Λούμπνα Παπαϊωάννου Νικόλαος Χατζηδάκης Δημήτριος

ISSN 1106 109X

QUARTERLY PUBLICATION

OF THE HELLENIC SOCIETY

FOR THE STUDY OF BONE METABOLISM

EDITOR IN CHIEFGeorge Lyritis

ASSOCIATE EDITORP. Papagelopoulos

ASSISTANT EDITORA. Mavrogenis

EDITORIAL BOARD I. Voskaki I. Paspati P. Giannikou P. Raptou D. Ioakimidis G. Sapkas G. Kapetanos G. Tzanos Th. Karahalios G. Trovas E. Bakas L. Khaldi N. Papaioannou D. Hadjidakis

Συνδρομές/Διαφημίσεις: κα Φωτεινή Παχούλα, Τηλ. 210 6128606

DTP: YΛΟΝΟΜΗ, TΗΛ. 210 2846530, ΠΑΡΑΓΩΓΗ: PRESS LINE, TΗΛ. 210 5225479

EKΔOΣH THΣ EΛΛHNIKHΣ ETAIPIAΣ MEΛETHΣ METABOΛIΣMOY ΤΩΝ OΣTΩN ΔΙΟΙΚΗΤΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟΕΕΜΜΟ 2011–2012

ΠΡΟΕΔΡΟΣ

Ευαγγελία Καταξάκη

AΝΤΙΠΡΟΕΔΡΟΣ

Φωτεινή Παπαδοπούλου

ΓΕΝΙΚΟΣ ΓΡΑΜΜΑΤΕΑΣ

Χρήστος Κοσμίδης

TAMIAΣ

Αικατερίνη Σφυρόερα

MΕΛΗ

Γεώργιος Αντύπας

Σπύρος Ασλανίδης

Πολυζώης Μάκρας

Oστούν 7

ΠEPIEXOMENA

T ό μ ο ς 2 3 , T ε ύ χ ο ς 1 , I α ν ο υ ά ρ ι ο ς - Φ ε β ρ ο υ ά ρ ι ο ς - Μ ά ρ τ ι ο ς 2 0 1 2

Μελέτη in vitro και in vivo της δράσης του Ελληνικούφυτού Sideritis euboea (τσάϊ του βουνού) – διερεύ-νηση μηχανισμού δράσηςΙ.Α. Δοντά και συν ............................................................ 8

Διαφορική έκφραση των ισομορφών του IGF-1 στακύτταρα MG-63 ανθρώπινου οστεοσαρκώματος Α. Αρμακόλας και συν .................................................... 26

Το σηματοδοτικό μονοπάτι ΙΚΚ-ΜΑΡΚ-ΙκΒ/ ΝF-κΒ ωςστόχος μηχανικής διέγερσης οστεοβλαστικών κυττάρωνΓ. Νταλαγιώργου και συν .............................................. 38

Καλοήθεις όγκοι των οστών στα παιδιάΙ. Λυμπάρη ...................................................................... 49

Σχετιζόμενη με διφωσφονικά οστεονέκρωση της γνάθουΑ. Μητρόπουλος και συν ................................................ 60

Οδηγίες προς τους συγγραφείς ............................ 65

Προσεχείς επιστημονικές εκδηλώσεις ................ 66

In vitro and in vivo effect of the Greek plant Sideritiseuboea (mountain tea) – study of its mechanism ofactionΙ.Α. Dontas et al ................................................................ 8

IGF-1 isoform expression in MG-63 human osteoblast-like osteosarcoma cellsA. Armakolas et al ........................................................ 26

The signalling pathway ΙΚΚ-ΜΑΡΚ-ΙκΒ/ΝF-κΒ as atarget of mechanical loading in osteoblast-like cellsG. Dalagiorgou et al ...................................................... 38

Benign bone tumors in childrenJ. Lympari ...................................................................... 49

Bisphosphonates related osteonecrosis of the jawA. Mitropoulos et al ...................................................... 60

Instructions to authors ............................................ 65

Scientific meetings .................................................. 66

8 Oστούν

Eρευνητικά Πρωτόκολλα(2012) 23 (1): 8-25

Μελέτη in vitro και in vivo της δράσης τουΕλληνικού φυτού Sideritis euboea(τσάϊ του βουνού) – διερεύνηση μηχανισμούδράσηςΙ.Α. ΔΟΝΤΑ1,2, Π.Π. ΛΕΛΟΒΑΣ1, Π. ΜΟΥΤΣΑΤΣΟΥ3, Ε. ΚΑΣΣΗ3, Σ. ΚΟΥΡΚΟΥΛΗΣ4, Σ. ΜΗΤΑΚΟΥ5, Χ.Κ. ΓΙΑΝΝΑΚΟΠΟΥΛΟΣ1, Ν. ΑΛΙΓΙΑΝΝΗΣ5, Α. ΓΑΛΑΝΟΣ1, Γ.Π. ΛΥΡΙΤΗΣ1

1 Εργαστήριο Έρευνας Παθήσεων Μυοσκελετικού Συστήματος «Θ. Γαροφαλίδης», Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ2 Εργαστήριο Πειραματικής Χειρουργικής & Χειρουργικής Έρευνας «Ν.Σ. Χρηστέας», Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ3 Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ4 Μονάδα Εμβιομηχανικής, Εργαστήριο Αντοχής Υλικών ΕΜΠ5 Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Φαρμακευτικό Τμήμα ΕΚΠΑ

* Βραβείο 2006 της ΕΕΜΜΟ στην Πρόταση των: Ισμήνη Α. Δοντά, Παρασκευή Μουτσάτσου, Χρήστος Γιαννακόπουλος, Λούμπνα Χάλντη, Αντώνης Γαλανός,Γεώργιος Π. Λυρίτης

Περίληψη

Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν η διερεύνηση της δράσης του εκχυλίσματος του φυτού Sideritis euboea (SID), το οποίο καταναλώνεταιευρέως ως τσάϊ του βουνού, σε κυτταροκαλλιέργειες οστεοβλαστών και στην οστική πυκνότητα και αντοχή του πειραματικού προτύπουτης μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης, δηλαδή του ώριμου ωοθηκεκτομημένου (OVX) επίμυος. Υλικά και Μέθοδοι: Σε κυτταροκαλ-λιέργειες οστεοβλαστών προστέθηκε SID και οιστραδιόλη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Αντίστοιχα, 32 ώριμοι θηλυκοί επίμυες Wistarχωρίστηκαν σε 3 ομάδες: Ελέγχου, OVX, και OVX που λάμβαναν SID (OVX+SID) χορηγούμενο εντός του ποσίμου ύδατός τους (330mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα, αρχής γενομένης αμέσως μετά την OVX επί 6 μήνες. Μετρήθηκαν η οστική πυκνότητα (BMD) τηςκνήμης στην αρχή της μελέτης, 3 και 6 μήνες μετά την OVX, η μηχανική αντοχή του μηριαίου οστού και το βάρος σώματος και μήτρας στοτέλος της μελέτης. Αποτελέσματα: Το εκχύλισμα SID προκάλεσε σημαντική και δοσοεξαρτώμενη μείωση της οστεοβλαστικής έκκρισηςτης IL-6 καθώς και του RANKL. Η in vivo μελέτη έδειξε ότι η % αλλαγή της BMD της κνήμης ήταν παρόμοια στις Ομάδες Ελέγχου καιOVX+SID στους 3 μήνες, ενδεικτική ισχυρής οστεοπροστατευτικής δράσης. Στους 6 μήνες η δράση αυτή ήταν λιγότερο ισχυρή, όμως ηοστική απώλεια ήταν λιγότερη στα OVX+SID ζώα απ’ ότι στα OVX (-14.37% έναντι -20.46% αντίστοιχα, p<0.05). Στις περισσότερες παρα-μέτρους του pQCT, η Ομάδα OVX+SID είχε ενδιάμεσες τιμές από τις άλλες δύο ομάδες. Η δοκιμασία αντοχής του μηριαίου έδειξε αύξησητης αντοχής της Ομάδας OVX+SID σε σχέση με την OVX. Το βάρος σώματος και μήτρας ήταν παρόμοια στην Ομάδα OVX+SID και OVX.Συμπέρασμα: Η χορήγηση του εκχυλίσματος SID in vitro σε καλλιέργειες οστεοβλαστών φάνηκε να μειώνει την έκκριση της IL-6 καθώςκαι του RANKL. Η in vivo χορήγησή του είχε σημαντική προστατευτική δράση στην οστική ποσότητα και ποιότητα των OVX+SID επιμύωνσε σύγκριση με τους OVX, χωρίς να εμφανίζει ανεπιθύμητη επίδραση στη μήτρα. Οι δράσεις αυτές είναι παρόμοιες με των εκλεκτικώντροποποιητών των υποδοχέων οιστρογόνων και αξίζουν περαιτέρω κλινικής έρευνας για την επιβεβαίωση του ρόλου του συγκεκριμένουεκχυλίσματος στην πρόληψη της μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης.

Λέξεις κλειδιά: Ωοθηκεκτομή, Επίμυες, Οστεοπόρωση, Οστική Πυκνότητα, Απορροφησιομετρία Διπλής Ενεργειακής Δέσμης Ακτίνων Χ, Δοκιμή Κάμψης3 Σημείων

Sideritis euboea (τσάϊ του βουνού)

Oστούν 9

Εισαγωγή

Η σύγχρονη έρευνα υποστηρίζει ότι υπάρχει άμεσησυσχέτιση μεταξύ διατροφής και υγείας, δεδομένου ότιτα επί μέρους συστατικά πολλών φυτών της διατροφής,αλλά και τα φυτικά εκχυλίσματα, παίζουν σημαντικό ρόλοστην πρόληψη παθήσεων όπως είναι η οστεοπόρωση, οκαρκίνος και η στεφανιαία νόσος [1-3]. Η οστεοπόρωσηθεωρείται ως μία από τις κυριότερες αιτίες αναπηρίαςκαι θανάτου σε προχωρημένες ηλικίες, λόγω της αυξη-μένης νοσηρότητας και θνησιμότητας των οστεοπορω-τικών καταγμάτων, και η πιο διαδεδομένη μορφή της εί-

ναι η μετεμμηνοπαυσιακή. Υπάρχουν πολλές φαρμα-κευτικές αντιοστοπορωτικές θεραπείες οι οποίες εφαρ-μόζονται για την αντιμετώπιση του νοσήματος, όπως θε-ραπεία ορμονικής υποκατάστασης, η καλσιτονίνη, τα δι-φωσφονικά, οι εκλεκτικοί τροποποιητές των υποδοχέωνοιστρογόνων (SERMs), η παραθορμόνη και το ρανελικόστρόντιο [4,5]. Όμως, αρκετά συχνά παρατηρείται μει-ωμένη συμμόρφωση των ασθενών εξαιτίας ανεπιθύμη-των παρενεργειών, σοβαρών ή λιγότερο σοβαρών, πουπαρατηρούνται κατά τη μακροχρόνια χορήγηση των προ-αναφερθέντων παραγόντων [6-8].

In vitro and in vivo effect of the Greek plantSideritis euboea (mountain tea) – study ofits mechanism of actionΙ.Α. DONTAS1,2, P.P. LELOVAS1, P. MOUTSATSOU3, Ε. ΚASSI3, S. KOURKOULIS4, S. MITAKOU5, C.Κ. YIANNAKOPOULOS1, N. ALIGIANNIS5, A. GALANOS1, G.P. LYRITIS1

1 Laboratory for Research of the Musculoskeletal System “Th. Garofalides”, School of Medicine, University of Athens, Greece2 Laboratory of Experimental Surgery & Surgical Research “N.S. Christeas”, School of Medicine, University of Athens, Greece3 Laboratory of Biological Chemistry, School of Medicine, University of Athens, Greece4 Unit of Biomechanics, Laboratory of Testing and Materials, National Technical University of Athens, Greece5 Department of Pharmacognosy and Chemistry of Natural Products, School of Pharmacy, University of Athens, Greece

Summary

The aim of this study was to investigate the effect of Sideritis euboea extract (SID), commonly consumed as mountain tea, onosteoblast cultures and on bone mineral density and the strength of the ovariectomized (OVX) rat model of osteoporosis. Methods:Osteoblast cultures were treated with SID extract and estradiol at different concentrations. Additionally, 32 mature female Wistarrats were separated into Controls (sham-operated), OVX, and OVX plus SID in their drinking water (330 mg/kg body weight/day),starting immediately after OVX for 6 months. Tibial bone mineral density (BMD) at baseline and at 3 and 6 months post-OVX, 3-point-bending of the femur, and body and uterine weight at the study end were examined. Results: Osteoblast secretion of IL-6 andRANKL was significantly reduced by SID extract, with both effects being dose-dependent and more potent at the higher concen-trations. The in vivo study showed that BMD percentage change from baseline of the whole tibia was similar in Control andOVX+SID rats at 3 months, revealing a strong osteoprotective effect. At 6 months, the protective effect was weaker, but still sig-nificant (OVX vs OVX+SID, -20.46% vs -14.37%, p<0.05). The metaphyseal tibial BMD percentage change from baseline to 3 and6 months between the OVX and OVX+SID groups was statistically significant (-26.47% vs -15.57% and -31.22% vs -16.57%, re-spectively), demonstrating that SID administration preserved the proximal tibial BMD of the OVX+SID group significantly. In mostof the pQCT parameters examined, the OVX+SID group had intermediate values of the other two groups. Three-point-bendingshowed a significant increase in bone strength of the treated compared to the OVX group. Body and uterine weights were similarin the treated and OVX groups. Conclusions: SID extract administration demonstrated a significant bone quantity and qualityprotective effect in OVX+SID rats compared with OVX rats, without having an undesirable effect on their uteri. This mechanismof action is similar to selective estrogen receptor modulators’ and merits further clinical studies to ascertain its potential role inpostmenopausal osteoporosis prevention.

Keywords: Ovariectomy, Rat, Osteoporosis, Bone mineral density, Dual-energy x-ray absorptiometry, Three-point-bending

Ι.Α. Δοντά και συν.

10 Oστούν

Η επιθυμία για μια μη φαρμακολογική προστατευ-τική αγωγή καθώς και επιδημιολογικές ενδείξεις γιατην ευεργετική επίδραση διαφόρων φυτικών συστα-τικών στα οστά, έχει οδηγήσει στη μελέτη φυτικών εκ-χυλισμάτων που επιδεικνύουν φυτοοιστρογονικέςή/και αντιοξειδωτικές ιδιότητες [9-12]. Αρκετές μελέ-τες έχουν αποδείξει ότι ωρισμένα φυτά και οι συστα-τικές τους ενώσεις εμφανίζουν δράση ανάλογη τωνοιστρογόνων (ως φυσικοί SERMs ή φυτοοιστρογόνα),γεγονός που δίνει πολλές ελπίδες για τη μη φαρμα-κευτική δυνατότητα πρόληψης και αντιμετώπιση τηςοστεοπόρωσης, αποφεύγοντας την εμφάνιση παρε-νεργειών, που δεν εξασφαλίζεται απόλυτα με τη σύγ-χρονη θεραπεία υποκατάστασης [13-18].

Τα ολικά φυτικά εκχυλίσματα και οι φυτικές ενώσειςέχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τη λειτουργία τωνοστεοβλαστών και οστεοκλαστών, κατά τρόπο όμοιομε αυτό των οιστρογόνων, δηλαδή παρεμβαίνονταςστο μηχανισμό μετάδοσης μηνύματος. Αυτό το επι-τυγχάνουν τροποποιώντας την δράση σημαντικών πα-ραγόντων της μεταγραφής, όπως είναι οι υποδοχείςοιστρογόνων ERα/ERβ, οι υποδοχείς γλυκοκορτικοει-δών GRα/GRβ, οι μεταγραφικοί παράγοντες (AP-1,NF-kB) και οι MAPK κινάσες (ERKs) που αλληλεπι-δρούν και μεσολαβούν στην ενδοκυττάρια ροή πλη-ροφοριών, ελέγχοντας τη γονιδιακή έκφραση κυττα-ρικών μορίων που εμπλέκονται στη λειτουργία τωνοστεοβλαστών και των οστεοκλαστών [19-23].

Η Ελληνική χλωρίδα είναι ιδιαίτερα πλούσια σε αρω-ματικά φυτά, μεταξύ των οποίων και το Sideritis eu-boea, το αφέψημα του οποίου (τσάι του βουνού τηςΕύβοιας) παραδοσιακά καταναλώνεται ευρέως στηνΕλλάδα. Η διεθνής βιβλιογραφία αναφέρει ότι τα είδητου γένους Sideritis (οικογένεια Lamiaceae) υπάρ-χουν σε διάφορες περιοχές/χώρες της Μεσογείου[24] και είναι πλούσια σε φαινολικά, φλαβονοειδή καιτερπενοειδή συστατικά [25-27], τα οποία του προσδί-δουν τις αντιοξειδωτικές [28,29], αντιφλεγμονώδεις[30,31], αναλγητικές [31], αντιρρευματικές, αντιελκω-τικές [32], και αντιμικροβιακές [26,33] του ιδιότητες.

Ενώ μία in vitro μελέτη υποστηρίζει την αντιοιστρο-γονική του δράση στο μαστό και στη μήτρα, καθώς καιτην οιστρογονική του δράση στα οστά [34], εν τούτοις,δεν είναι γνωστή η in vivo δράση του S. euboea, καιούτε έχει διευκρινιστεί ο μηχανισμός δράσης του. Δε-δομένου ότι η ανεύρεση νέων φυτικών εκχυλισμάτωνμε ιδιότητες SERMs είναι ιδιαίτερα επιθυμητή, σκοπόςτης παρούσης μελέτης ήταν αφενός μεν η διερεύνηση

του μηχανισμού δράσης του υδατικού φυτικού εκχυ-λίσματος του S. euboea μέσω της ρύθμισης της ιντερ-λευκίνης 6 (IL-6), της οστεοπροτεγερίνης (OPG) καιτου ενεργοποιητή του υποδοχέα του NFkB προσδέ-ματος (Receptor activator of NFkB ligand - RANKL) invitro σε οστεοβλάστες, αφετέρου δε η in vivo επίδρασητου φυτικού εκχυλίσματος του S. euboea στα οστά τουθηλυκού ωοθηκεκτομημένου ώριμου επίμυος, ο οποί-ος είναι διεθνώς ανεγνωρισμένο πειραματικό πρότυποτης μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης [35].

Υλικά και μέθοδοι

Α) In vitro μελέτη

α) Κυτταρική Καλλιέργεια

Για τα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκε η κυτταρικήσειρά KS483 (προοστεοβλαστική σειρά από θόλο κρα-νίου εμβρύου επίμυος) που έχει την ικανότητα να σχη-ματίζει in vitro επιμεταλλωμένα οζίδια. Η κυτταρικήσειρά καλλιεργείται σε καλλιεργητικό υλικό α-ΜΕΜ(Gibco BRL) εμπλουτισμένο με 10% FBS (Fetal Bovi-ne Serum) (Gibco BRL) και πενικιλλίνη/ στρεπτομυκίνη(Gibco BRL), σε επωαστή CO2 i (5% CO2-95% air)στους 37oC και ανακαλλιεργείται κάθε 3-4 μέρες σεαραίωση 1:5 έως 1:6 χρησιμοποιώντας διάλυμα θρυ-ψίνης/ EDTA (trypsin 0.125%/EDTA 0.01%).

Για τα πειράματά μας τοποθετήθηκαν κύτταρα μεπυκνότητα 45.000 κύτταρα/πηγάδι (well) των 12-wellplates σε 1 ml/well α-MEM phenol red free (GibcoBRL) εμπλουτισμένο με 10% FBS DCC-treated (επώα-ση του ορού με άνθρακα για απoμάκρυνση των στε-ροειδών ενώσεων). Υπό τις ανωτέρω συνθήκες πα-ρέμειναν για 48 ώρες και ακολούθως έγινε αλλαγήκαλλιεργητικού υλικού χωρίς την προσθήκη (control)ή με την προσθήκη του υπό μελέτη υδατικού εκχυλί-σματος (S. euboea) σε τελικές συγκεντρώσεις 100,50, 20, 10, 5 μg/ml και οιστραδιόλης (17β-estradiol)σε τελικές συγκεντρώσεις 10-7, 10-8 Μ και επώαση για48 ώρες.

Προηγήθηκε πείραμα time-course προκειμένου νααποφασιστεί για πόσες ώρες θα γίνει η επώαση τωνκυττάρων με τις προαναφερθείσες ουσίες. Μετά τοτέλος της επώασης, τα υπερκείμενα των κυτταροκαλ-λιεργειών συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν στις 3000στροφές για 7 λεπτά και τα υπερκείμενα της φυγο-κέντρησης τοποθετήθηκαν στους -200oC μέχρι νααναλυθούν.


Oστούν 11

β) Προσδιορισμός των IL-6, OPG και RANKL

O προσδιορισμός των συγκεντρώσεων της IL-6, τηςOPG και του RANKL στα υπερκείμενα των κυτταροκαλ-λιεργειών που επωάστηκαν ή όχι με τις διάφορες συγ-κεντρώσεις του υδατικού εκχυλίσματος του S. euboeaκαι με την οιστραδιόλη, έγινε με ELISA μέθοδο (R & DSystems), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Β) In vivo μελέτη

α) Ζώα εργαστηρίου

Το πειραματικό πρωτόκολλο έλαβε έγκριση από τηΔιεύθυνση Κτηνιατρικής Νομαρχίας Αθηνών (Άδειαπειραματισμού Κ 5181/2006), σύμφωνα με την Ελλη-νική Νομοθεσία (Προεδρικό Διάταγμα 160/1991, σεσυμμόρφωση με την Οδηγία 86/609/ΕΟΚ, και του Nό-μου 2015/1992, σύμφωνα με την «Ευρωπαϊκή συνθή-κη για την προστασία των σπονδυλωτών ζώων πουχρησιμοποιούνται για πειραματικούς ή άλλους επιστη-μονικούς σκοπούς, 123/1986»). Τριάντα δύο ενήλικοι(10 μηνών) θηλυκοί επίμυες της φυλής Wistar απο-κτήθηκαν από την καταχωρημένη ΕγκατάστασηΕκτροφής του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνώντης Ακαδημίας Αθηνών. Τα ζώα στεγάστηκαν τέσσεραανά κλωβό, υπό τις συνήθεις εργαστηριακές συνθή-κες, με θερμοκρασία να κυμαίνεται μεταξύ 19oC και22oC, σχετική υγρασία 55% και 65%, 15 πλήρειςεναλλαγές αέρα/ώρα και με κύκλους ημέρας/νύκταςαπό 6ης πρωινής ως 6ης απογευματινής. Μετά από με-τρήσεις σωματικών βαρών, οι επίμυες διαιρέθηκανσε τρεις ομάδες: ομάδα ελέγχου (n=8), ομάδα ωοθη-κεκτομής χωρίς θεραπευτική παρέμβαση (OVX; n=8),ομάδα ωοθηκεκτομής με φυτικό εκχύλισμα S. euboea(OVX+SID; n=16) σύμφωνα με το σωματικό τους βά-ρος και κατανέμοντας ομοιόμορφα άτομα από ίδιεςτοκετοομάδες σε κάθε πειραματική ομάδα έτσι ώστενα αποφευχθεί τυχόν ανατομική ή γενετική ποικιλίαανάμεσά τους. Μετρήσεις των σωματικών τους βαρώνπραγματοποιήθηκαν κάθε δεύτερη εβδομάδα ενώ γι-νόταν καταμέτρηση της κατανάλωσης τροφής και νε-ρού δύο φορές την εβδομάδα.

β) Μετρήσεις οστικής πυκνότητας

Σε όλα τα ζώα εκτιμήθηκε η οστική τους πυκνότητα(BMD) πριν από οποιαδήποτε παρέμβαση και 3 και 6μήνες μετά την ωοθηκεκτομή. Η ακινητοποίηση τωνεπίμυων για τις μετρήσεις έγινε με την ενδομυϊκή χο-ρήγηση αναισθησίας 3 mg/Kg ξυλαζίνης και 80 mg/Kg

κεταμίνης. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε συ-σκευή απορροφησιομετρίας διπλής ενεργειακής δέ-σμης ακτίνων X (dual energy X-ray absorptiometry -DEXA) GE Lunar Prodigy Densitometer με το ειδικόλογισμικό για μικρά θηλαστικά. Στη συνέχεια εκτιμή-θηκε η οστική πυκνότητα όλης της κνήμης, συμπερι-λαμβανομένου του φλοιώδους και του σπογγώδουςοστού, με την τοποθέτηση περιοχής ενδιαφέροντος(region of interest - ROI) να περιλαμβάνει καθ’ ολο-κληρία την κνήμη. Για την εκτίμηση της οστικής πυ-κνότητας (BMD) του σπογγώδους οστού επιλέχθηκεη εγγύς μετάφυση της κνήμης (ως αντιπροσωπευτικόδείγμα του σκελετού του επίμυος ταχείας οστικήςεναλλαγής) με την τοποθέτηση της ROI 2 mm x 2 mm,3 mm περιφερικά της κνημιαίας αρθρικής επιφανείας.Η ακρίβεια της μεθόδου in vitro είναι 0.5%. Γινότανβαθμονόμηση του συστήματος πριν από τη μέτρησηκάθε ομάδας ζώων.

γ) Ωοθηκεκτομή

Η ομάδα ελέγχου υπέστη εικονική ωοθηκεκτομή. Ηπαρουσία αυτής της ομάδας είναι απαραίτητη για τονέλεγχο της οστικής πυκνότητας ηλικιακά συζευγμένωνμη ωοθηκεκτομημένων ζώων καθόλη τη διάρκεια τουπρωτοκόλλου έτσι ώστε να είναι συγκρίσιμες οι αλλα-γές της οστικής πυκνότητας που προκύπτουν στα λαμ-βάνοντα και μη λαμβάνοντα θεραπεία ωοθηκεκτομη-μένα ζωικά πρότυπα. Η χειρουργική αναισθησία τωνεπιμύων επιτεύχθηκε με την ενδομυϊκή χορήγηση 5mg/Kg ξυλαζίνης και 100 mg/Kg κεταμίνης, την οποίαακολούθησε αμφοτερόπλευρη ωοθηκεκτομή.

δ) Χορήγηση του εκχυλίσματος

Το εκχύλισμα S. euboea χορηγήθηκε στις φιάλεςτου ποσίμου νερού στην ομάδα των OVX+SID επιμύωνad libitum αμέσως μετά την πραγματοποίηση του χει-ρουργείου. Οι φιάλες ανακινούνταν δύο φορές τηνημέρα ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία ιζήματος. Ηανασύσταση του εκχυλίσματος γινόταν δύο φορέςεβδομαδιαία, σύμφωνα με την τελευταία καταγεγραμ-μένη κατανάλωση. Η κατανάλωση του υδατικού εκχυ-λίσματος από την OVX+SID ομάδα αλλά και οι κατα-ναλώσεις ύδατος από τις υπόλοιπες ομάδες υπολογί-ζονταν δύο φορές την εβδομάδα. Ο μέσος όρος πρόσ-ληψης ύδατος ήταν 18 mL και ο μέσος όρος πρόσλη-ψης του εκχυλίσματος ήταν 330 mg/kg ζώντος βάρουςανά ημέρα στην ομάδα των OVX+SID επιμύων.


12 Oστούν

ε) Προετοιμασία του εκχυλίσματος

Το εκχύλισμα προετοιμάσθηκε από τα υπέργεια μέ-ρη του φυτού S. euboea. Τα φυτά συλλέχθηκαν απότο όρος Δίρφυ της νήσου Εύβοιας. Στη συνέχεια απο-ξηράθηκαν στον αέρα, κονιορτοποιήθηκαν και κατερ-γάστηκαν με βρασμένο νερό (3.5 g φυτού/100 ml νε-ρού) για 15 min. Για τη λήψη ενός εκχυλίσματος εύ-κολου στη συντήρηση και με υψηλότερη συγκέντρωσηκαι σταθερότητα, επιλέχθηκε η χρήση της τεχνικής ξή-ρανσης δια ψεκασμού (Spray Drying Technique). Τουδατικό διάλυμα διηθούνταν και υπόκειντο στην μέ-θοδο ξήρανσης δια ψεκασμού. Η τεχνική αυτή περι-λαμβάνει την εξάτμιση της υγρασίας μέσω διόδου απόακροφύσιο, με την ανάμιξη του διαλύματος με το μέσοξήρανσης (άζωτο). Το εναιώρημα, μετά την ανάμιξήτου με χρήση μαγνητικού αναδευτήρα, υπεισερχότανστη συσκευή ξήρανσης (B-290 minispray dryer; BUCHILabortechnik) με θερμοκρασία εισόδου 139oC, θερ-μοκρασία εξόδου 60-65oC, λειτουργία αναρρόφησης100%, ροή ψεκασμού 600 Nl/h και απόδοση αντλίας22%. Αμέσως μετά το πέρας της διαδικασίας η σκόνηφυλάχθηκε και αποθηκεύθηκε σε κλειστές φιάλες.

στ) Ανάλυση του εκχυλίσματος

Η αρχική ανάλυση του S. euboea πραγματοποιήθη-κε με τη χρήση χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδαςκαι με τη μέθοδο υγρής χρωματογραφίας υψηλής από-δοσης (HPLC) και αποκάλυψε την παρουσία φλαβο-νοειδών και φαινυλοπροπανοειδών γλυκοσιδών, ιρι-δοειδών και σακχάρων. Στη συνέχεια το υδατικό διά-λυμα αναλύθηκε και με ανιχνευτή συστοιχίας διόδωνHPLC έτσι ώστε να ανιχνευθούν τα κοινά φαινολικάτου συστατικά. Το σύστημα υγρής χρωματογραφίαςυψηλής απόδοσης (ThermoFinnigan, San Jose, CA)που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του διαλύματοςαποτελούνταν από μια αντλία SpectralSystem P4000,έναν απαερωτή SpectralSystem 1000, έναν αυτόματοδειγματολήπτη SpectralSystem AS3000, και έναν ανι-χνευτή SpectralSystem UV2000 PDA. Το λογισμικόπου χρησιμοποιήθηκε για την διαχείριση των αποτελε-σμάτων ήταν το ChromQuest 2.1. Η εκτίμηση του βιο-χημικού προφίλ του υδατικού διαλύματος του S. eu-boea πραγματοποιήθηκε σε στήλη Lichrosorb RP18(250x4.0 mm, 5.0 μm). Τα φασματογράμματα μετρή-θηκαν στα 220, 280 και 365 nm, με τα υπό παρακο-λούθηση φάσματα να εκτιμώνται σε ένα εύρος μηκώνκύματος από 190 με 900 nm. Συγκρίνοντας τους χρό-νους απορρόφησης (retention time) και τα απορρο-

φούμενα φάσματα κατέστη δυνατόν να ταυτοποιηθούντέσσερα διαφορετικά μόρια, που ανήκαν στην οικογέ-νεια των φλαβονοειδών γλυκοσιδών: ισοσκουτελαρεΐνη 7-Ο-[6΄΄΄-Ο-ακέτυλο-β- D-αλλοπυρα-νοσύλ-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδη], 4΄-Ο- μεθυλισο-σκουτελαρεΐνη 7-Ο-[6΄΄΄-Ο-ακέτυλο-β-D- αλλοπυρανο-σύλ-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδη], 4΄-Ο- μεθυλυπολαε-τίνη 7-Ο-[6΄΄΄-Ο-ακέτυλο-β-D- αλλοπυρανοσύλ-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδη], υπολαετίνη 7-Ο-[6΄΄΄-Ο-ακέτυλο-β-D-αλλοπυρανοσύλ-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδη], μαζίμε ακτεοσίδη, μαρτυνοσίδη και χλωρογενικό οξύ.

ζ) Ευθανασία, νεκροψία, και συλλογή οστών

Μετά από ευθανασία με πτητικό αναισθητικό, ταζώα εξετάστηκαν για τυχόν κακοήθειες ή άλλες πα-θολογικές καταστάσεις. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκεστον έλεγχο των ωοθηκών έτσι ώστε να επιβεβαιωθείή όχι η επιτυχία της ωοθηκεκτομής με την απουσίαωοθηκικού ιστού και την παρατήρηση σημαντικήςατροφίας των κεράτων της μήτρας. Στην συνέχειασυλλέχθηκαν οι μήτρες και ζυγίσθηκαν άμεσα σε μι-κροζυγό ακριβείας (Sartorius handy microbalance).Επίσης συλλέχθηκαν τα αριστερά μηριαία και οι αρι-στερές κνήμες και αμέσως μετά τη συλλογή τα παρα-σκευάσματα τοποθετήθηκαν σε πλαστικούς σωλήνεςκαι πληρώθηκαν με φυσιολογικό ορό και μετρήθηκανμε τη μέθοδο της περιφερικής ποσοτικής υπολογιστι-κής τομογραφίας.

η) Μετρήσεις περιφερικής Ποσοτικής ΥπολογιστικήςΤομογραφίας (pQCT)

Οι αξιολογήσεις των κνημών και των μηριαίωνπραγματοποιήθηκαν αμέσως μετά τη συλλογή τωνοστών σε συσκευή περιφερικής ποσοτικής υπολογι-στικής τομογραφίας (Norland-Stratec XCT 2000) πουβρίσκεται στο Εργαστήριο Έρευνας Παθήσεων τουΜυοσκελετικού Συστήματος. Οι ex vivo μετρήσεις τωνοστικών δοκιμίων έγιναν ως εξής: τα παρασκευάσμα-τα τοποθετήθηκαν σε πλαστικούς σωλήνες και πλη-ρώθηκαν με φυσιολογικό ορό, για προσομοίωση τωνγύρω μαλακών μορίων. Στη συνέχεια τοποθετήθηκανένας-ένας στο κέντρο του τοπογραφικού πεδίου τουμηχανήματος pQCT. Οι μετρήσεις της κνήμης πραγ-ματοποιήθηκαν στις αποστάσεις 4, 10 και 14 mm απότην εγγύς αρθρική επιφάνεια της κνήμης, ενώ οι με-τρήσεις των μηριαίων πραγματοποιήθηκαν στις τομές40%, 50% και 60% από την κεφαλή του μηριαίου. Η


Oστούν 13

θέσεις των τομών έγιναν μετά από σάρωση ολόκλη-ρου του μήκους του οστικού δοκιμίου.

θ) Δοκιμές μηχανικής αντοχής των οστών

Η εμβιομηχανική των οστών εκτιμήθηκε ex vivo μετο πέρας της πειραματικής μελέτης. Επιλέχθηκε η μη-χανική δοκιμή κάμψης τριών σημείων (three-point-bending). Μετά τη συλλογή τους, τα αριστερά μηριαίακαθαρίστηκαν από τους παρακείμενους ιστούς, καιαμέσως μετά την εκτίμησή τους στη συσκευή pQCT,τυλίχθηκαν σε γάζες ποτισμένες με φυσιολογικό ορόκαι φυλάχθηκαν στους -20oC μέχρι τη στιγμή της εκτέ-λεσης των εμβιομηχανικών δοκιμών μία εβδομάδαμετά. Η μέθοδος αυτή σύμφωνα με τη βιβλιογραφία[36] είναι η καλύτερη για τη μακρά συντήρηση τωνοστικών δειγμάτων πριν από την εκτέλεση των δοκι-μών μηχανικής αντοχής. Η μέθοδος κάμψης τριώνσημείων επιλέχθηκε για την αξιοπιστία της, την ευκο-λία εκτέλεσής της, και για το μικρό χρόνο κατά τονοποίο τα οστικά δοκίμια είναι εκτεθειμένα (και για τιςελάχιστες αλλοιώσεις που προκαλούνται στις μηχανι-κές ιδιότητες των δοκιμίων). Οι δοκιμές πραγματοποι-ήθηκαν με τη συσκευή MTS 858 Mini Bionix.

Τα μηριαία τοποθετήθηκαν οριζόντια σε στρογγυ-λευμένες αρπάγες που βρίσκονταν σε απόσταση 22mm μεταξύ τους. Δόθηκε προσοχή έτσι ώστε όλα ταδοκίμια να τοποθετηθούν με τον ίδιο ακριβώς τρόποόσον αφορά στην κατεύθυνσή τους, έτσι ώστε να ελα-χιστοποιηθούν τα λάθη εξαιτίας εσφαλμένης θέσηςτων δειγμάτων. Σε περίπτωση εσφαλμένης τοποθέτη-σης, εξαιτίας ανατομικών παραλλαγών των δοκιμίων,μπορούσε να παρατηρηθεί στροφή κατά τη διάρκειατης φόρτισης. Τα δοκίμια αυτά αποκλείονταν από τηστατιστική ανάλυση. Η φόρτιση εφαρμόσθηκε στη με-σότητα της διάφυσης του μηριαίου με τη χρήση εμ-βόλου με στρογγυλεμένη άκρη. Ο ρυθμός φόρτισηςπου επιλέχθηκε ήταν 1 mm/min έτσι ώστε να προσο-μοιωθούν όσον το δυνατόν πιστότερα οι in vivo στα-τικές συνθήκες. Η φόρτιση εφαρμοζόταν σταθερά μέ-χρις ότου επέλθει η θραύση (κάταγμα) του δοκιμίου.Κατά τη διάρκεια του πειράματος κατεγράφοντο συ-νεχώς συναρτήσει του χρόνου οι τιμές του επιβαλλο-μένου φορτίου (σε Newtons) και της επαγόμενης πα-ραμόρφωσης (βέλους κάμψεως) (σε mm). Μετά τοπείραμα με επεξεργασία των δεδομένων αυτών ελή-φθησαν οι καμπύλες φορτίου–παραμόρφωσης μέχρικαι τη στιγμή της αστοχίας (κατάγματος) του οστού.

Στατιστική ανάλυση


Όλες οι τιμές εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± σταθεράαπόκλιση (mean ± standard deviation) τριών πειρα-μάτων. Η στατιστική ανάλυση έγινε με την εφαρμογήt-test, two-tailed distribution, assuming two-sampleunequal variance.

Κάθε τιμή p<0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).


Ο έλεγχος της κανονικής κατανομής των δεδομέ-νων έγινε χρησιμοποιώντας το Kolmogorov-Smirnovtest και P-P plots. Οι συγκρίσεις των απολύτων τιμώντων μεταβλητών μεταξύ των τριών ομάδων πραγμα-τοποιήθηκαν με τη χρήση ανάλυσης διασποράς μιαςκατεύθυνσης (one-way analysis of variance / ANOVA).Πολλαπλές συγκρίσεις κατά ζεύγη πραγματοποιήθη-καν με τη δοκιμή Bonferroni. Για τη σύγκριση των με-τρήσεων που πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικούςχρόνους για όλες τις παραμέτρους της κάθε ομάδαςχρησιμοποιήθηκε η ανάλυση διασποράς μιας κατεύ-θυνσης για επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (one-fac-tor repeated measures analysis of variance). Πολλα-πλές συγκρίσεις ανά ζεύγη πραγματοποιήθηκαν μετη μέθοδο Tukey critical difference. Για να αναδειχθείη πορεία της οστικής πυκνότητας κατά τους έξι μήνεςτου πειραματισμού και για τις τρεις ομάδες, υπολογί-στηκε η διάμεση τιμή της ποσοστιαίας μεταβολής απότις αρχικές μετρήσεις μετά από τρεις και έξι μήνεςαντίστοιχα. Οι συγκρίσεις των ποσοστιαίων μεταβολώναπό τις αρχικές μετρήσεις κατά την περίοδο της πα-ρατήρησης εκτιμήθηκαν με τη μέθοδο Kruskal-Wallis.Οι πολλαπλές συγκρίσεις ανά ζεύγη πραγματοποιήθη-καν με τη χρήση της μεθόδου Mann-Whitney U test.Ως στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε το p<0.05.Όλες οι αναλύσεις εκτελέσθηκαν με το λογισμικόSPSS version 16.00 (SPSS Inc. Chicago, IL).

Αποτελέσματα


Στην Εικόνα 1 φαίνεται η επίδραση του υδατικούεκχυλίσματος του Sideritis euboea σε τελικές συγκεν-τρώσεις 100, 50, 20, 10, 5 μg/ml και της οιστραδιόλης(Ε2) σε τελικές συγκεντρώσεις 10-7, 10-8 Μ στην έκ-κριση της IL-6 (σε pg/ml) από τους οστεοβλάστες.


14 Oστούν

Η οιστραδιόλη μειώνει σημαντικά την έκκριση τηςΙL-6 από τους οστεοβλάστες επίμυος τόσο σε συγκέν-τρωση 10-7 (p<0.01), όσο και σε συγκέντρωση 10-8

(p<0.05) σε σχέση με το μάρτυρα (control).To εκχύλισμα S. euboea φαίνεται να μειώνει επίσης

την έκκριση της IL-6 από τους οστεοβλάστες επίμυοςσε όλες τις συγκεντρώσεις, με στατιστική σημαντικότητα

όμως στις υψηλότερες συγκεντρώσεις 100 μg/ml (67%του μάρτυρα), 50 μg/ml (79% του μάρτυρα), 20 μg/ml(85% του μάρτυρα) (με p<0.01, p<0.01 και p<0.05 αν-τίστοιχα).

Στην Εικόνα 2 φαίνεται η επίδραση του υδατικούεκχυλίσματος του S. euboea σε τελικές συγκεντρώ-σεις 100, 50, 20, 10, 5 μg/ml και της οιστραδιόλης

Εικ. 1. Στην εικόνα φαίνεται η επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Sideritis euboea σε τελικές συγκεντρώσεις 100, 50, 20, 10, 5μg/ml και της οιστραδιόλης (Ε2) σε τελικές συγκεντρώσεις 10-7, 10-8 Μ στην έκκριση της IL-6 (σε pg/ml) από τους οστεοβλάστες.

Εικ. 2. Στην εικόνα φαίνεται η επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Sideritis euboea σε τελικές συγκεντρώσεις 100, 50, 20, 10, 5μg/ml και της οιστραδιόλης (Ε2) σε τελικές συγκεντρώσεις 10-7, 10-8 Μ στην έκκριση της ΟPG (σε pg/ml) από τους οστεοβλάστες.


Oστούν 15

Εικ. 3. Στην εικόνα φαίνεται η επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Sideritis euboea σε τελικές συγκεντρώσεις 100, 50, 20, 10, 5μg/ml και της οιστραδιόλης (Ε2) σε τελικές συγκεντρώσεις 10-7, 10-8 Μ στην έκκριση του RANKL (σε pg/ml) από τους οστεοβλάστες.

Πίν. 2. Ποσοστιαία μεταβολή της οστικής πυκνότητας όλης της κνήμης. (Ομάδες: Ελέγχου, OVX (ωοθηκεκτομής), OVX+Sid (ωοθηκεκτο-μής+Sideritis euboea). α p<0.005 σε σύγκριση με την Ομάδα Ελέγχου. β p<0.005 σε σύγκριση με την Ομάδα OVX).

Ποσοστιαία μεταβολή για όλη την κνήμη

Ομάδα % μεταβολή Τιμή p μεταξύ % μεταβολή Τιμή p μεταξύ 0-3 μήνες των ομάδων 0-6 μήνες των ομάδων

Διάμεσος Διάμεσος

Ελέγχου -3.02% -6.02%

OVX -11.38% α 0.016 -20.46% α 0.005

OVX+Sid -4.67% β -14.37% α β

Πίν. 1. Βάρος μητρών των επιμύων σε γραμμάρια. [Ομάδες: Ελέγχου, OVX (ωοθηκεκτομής), OVX+Sid (ωοθηκεκτομής+Sideritis euboea) * p<0.05 σε σύγκριση με την Ομάδα Ελέγχου].

Βάρος μητρών

Ομάδα N Μέση τιμή SD Τιμή p

Ελέγχου 8 0.629 0.19

OVX 8 0.136 * 0.03 <0.0005

OVX+Sid 16 0.135 * 0.01


16 Oστούν

(Ε2) σε τελικές συγκεντρώσεις 10-7, 10-8 Μ στην έκ-κριση της ΟPG (σε pg/ml) από τους οστεοβλάστες.

Η οιστραδιόλη αύξησε σημαντικά την έκκριση τηςOPG και στις δύο συγκεντρώσεις στις οποίες δοκιμά-στηκε με πιο έκδηλο το αποτέλεσμα της μικρότερηςσυγκέντρωσης (10-8 Μ).

To εκχύλισμα S. euboea φαίνεται να αυξάνει τηνέκκριση της OPG από τους οστεοβλάστες επίμυος μό-νο στη συγκέντρωση 50 μg/ml (18% του μάρτυρα,p<0.05).

Στην Εικόνα 3 φαίνεται η επίδραση του υδατικούεκχυλίσματος του S. euboea σε τελικές συγκεντρώ-σεις 100, 50, 20, 10, 5 μg/ml και της οιστραδιόλης(Ε2) σε τελικές συγκεντρώσεις 10-7, 10-8 Μ στην έκ-κριση του RANKL (σε pg/ml) από τους οστεοβλάστες.

To εκχύλισμα S. euboea μείωσε σημαντικά την έκ-κριση του RANKL από τους οστεοβλάστες επίμυος σεσυγκεντρώσεις 100, 50, 20 και 5 μg/ml (με p<0.01,p<0.01, p<0.05 και p<0.05 αντίστοιχα).

Αντιθέτως η οιστραδιόλη δεν επηρέασε την έκκρισητου RANKL σε καμία από τις δύο συγκεντρώσεις στιςοποίες δοκιμάστηκε.


α) Σωματικά βάρη επιμύων και βάρη μητρών

Η σύγκριση των ποσοστιαίων αλλαγών των σωμα-τικών βαρών των επιμύων στο τέλος της μελέτης ανέ-δειξε στατιστικά σημαντική αλλαγή μεταξύ των Ομά-δων Ελέγχου και Ωοθηκεκτομής (OVX) καθώς και με-ταξύ των Ομάδων Ελέγχου και παρέμβασης(OVX+SID), ενώ καμιά διαφορά δεν παρατηρήθηκεστις ποσοστιαίες αλλαγές των σωματικών βαρών με-ταξύ των Ομάδων OVX και OVX+SID.

Όσον αφορά στις μήτρες, κατά την επισκόπηση στηδιάρκεια της νεκροψίας, η εμφάνιση τους στις ΟμάδεςOVX και OVX+SID ήταν ατροφική, γεγονός που επι-βεβαιώθηκε και από τη στατιστική ανάλυση των βαρώντους. Πιο συγκεκριμένα, το μέσο βάρος των ΟμάδωνOVX και OVX+SID ήταν στατιστικά σημαντικά χαμη-λότερο από το μέσο βάρος των μητρών της ΟμάδαςΕλέγχου (Πίνακας 1). Αξίζει να αναφερθεί ότι το μέσοβάρος των μητρών των Ομάδων OVX και OVX+SIDήταν ουσιαστικά ταυτόσημο. Κατά τη νεκροψία δενπαρατηρήθηκε κανένα παθολογικό εύρημα.

β) Ποσοστιαίες αλλαγές της οστικής πυκνότητας

Οι ποσοστιαίες μεταβολές που προέκυψαν μετά τηνστατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων από τις με-τρήσεις DEXA φαίνονται στoν Πίνακα 2. Η σύγκρισητων ποσοστιαίων αλλαγών της οστικής πυκνότητας γιατην Ομάδα Ελέγχου και OVX για όλη την κνήμη απότην αρχική μέτρηση ως τους τρεις μήνες ανέδειξε στα-τιστικά σημαντική διαφορά (-3.02% έναντι -11.38%,p<0.05) ενώ μεταξύ της Ομάδας Ελέγχου και τηςOVX+SID δεν ήταν σημαντική (-3.02% έναντι -4.67%).Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν μια σημαντικήπροστατευτική δράση του εκχυλίσματος κατά τη διάρ-κεια των πρώτων μηνών. Οι συγκρίσεις των ποσοστι-αίων αλλαγών της οστικής πυκνότητας, όσον αφοράσε όλη την κνήμη, μεταξύ της αρχικής και της τελικήςμέτρησης (6 μήνες) διέφεραν στατιστικά σημαντικάμεταξύ όλων των ομάδων. Η σύγκριση της ποσοστι-αίας αλλαγής μεταξύ των OVX και OVX+SID ομάδων(-20.46% έναντι -14.37%, p<0.05) φανερώνει ότι τοφυτικό εκχύλισμα προστάτεψε σημαντικά την οστικήπυκνότητα της κνήμης των επιμύων αλλά όχι σε τόσο

Πίν. 3. Ποσοστιαία μεταβολή της οστικής πυκνότητας της εγγύς μετάφυσης της κνήμης. (Ομάδες: Ελέγχου, OVX (ωοθηκεκτομής), OVX+Sid(ωοθηκεκτομής+Sideritis euboea). α p<0.005 σε σύγκριση με την Ομάδα Ελέγχου. β p<0.005 σε σύγκριση με την Ομάδα OVX).

Ποσοστιαία μεταβολή για την εγγύς μετάφυση της κνήμης

Ομάδα % μεταβολή Τιμή p μεταξύ % μεταβολή Τιμή p μεταξύ 0-3 μήνες των ομάδων 0-6 μήνες των ομάδων

Διάμεσος Διάμεσος

Ελέγχου 0.24% -0.58%

OVX -26.47% α <0.0005 -31.22% α 0.002

OVX+Sid -15.57% α β -16.57% α β


Oστούν 17

σημαντικό βαθμό συγκριτικά με το πρώτο τρίμηνο.Για το σπογγώδες οστούν της εγγύς μετάφυσης της

κνήμης, οι ποσοστιαίες μεταβολές της οστικής πυκνό-τητας από την αρχική μέτρηση στους τρεις και έξι μή-νες αποκάλυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές με-ταξύ των ομάδων (Πίνακας 3). Συγκεκριμένα, οι συγ-κρίσεις των ποσοστιαίων μεταβολών από την αρχικήμέτρηση στους τρεις και έξι μήνες μεταξύ των Ομά-δων Ελέγχου και OVX+SID (0.24% έναντι -15.57%και -0.58% έναντι -16.57%, αντίστοιχα) ήταν στατιστι-κά σημαντικές, υποδεικνύοντας ότι η προστατευτική

δράση του φυτικού εκχυλίσματος δεν ήταν τόσο ισχυ-ρή ώστε να αντισταθμίσει πλήρως την οστική απώλειατου σπογγώδους οστού στην εγγύς μετάφυση της κνή-μης όπου παρατηρείται μετά από ωοθηκεκτομή στουςεπίμυες. Αξίζει όμως να αναφερθεί ότι υπήρξε ση-μαντική προστατευτική δράση του εκχυλίσματος καιη οποία φανερώνεται από τη σύγκριση της ποσοστι-αίας μεταβολής από την αρχική μέτρηση στους τρειςκαι έξι μήνες μεταξύ των Ομάδων OVX και OVX+SID(-26.47% έναντι -15.57% και -31.22% έναντι -16.57%,αντίστοιχα).

Εικ. 4. Μάζα του σπογγώδους (σε mg/mm) στα 10 mm της διάφυσης της κνήμης από την αρθρική της επιφάνεια. [Ομάδες: Control (ελέγχου),OVX (ωοθηκεκτομής), OVX+Sideritis (ωοθηκεκτομής+Sideritis euboea)].

Εικ. 5. Εμβαδόν του σπογγώδους (σε mm2) στα 10 mm της διάφυσης της κνήμης από την αρθρική της επιφάνεια. [Ομάδες: Control (ελέγ-χου), OVX (ωοθηκεκτομής), OVX+Sideritis (ωοθηκεκτομής+Sideritis euboea)].


18 Oστούν

γ) Μετρήσεις περιφερικής ποσοτικής υπολογιστικήςτομογραφίας

Σε όλες τις παραμέτρους, έτσι όπως προέκυψαναπό τις μετρήσεις της περιφερικής τομογραφίας, φά-νηκε ότι η ομάδα των ζώων στην οποία χορηγήθηκετο φυτικό εκχύλισμα είχε μια ενδιάμεση τιμή σε σχέσημε την Ομάδα Ελέγχου και την Ομάδα OVX. Η προ-στατευτική αυτή δράση του εκχυλίσματος δεν ήτανικανή να αποδώσει στατιστικά σημαντικές διαφορέςγια όλες τις παραμέτρους που εκτιμήθηκαν.

Αναλυτικότερα, στην πρώτη τομή που πραγματο-ποιήθηκε στην κνήμη, 4 mm άπω της κατά γόνυ αρ-θρικής επιφάνειας, η οστική μάζα ήταν για την ΟμάδαΕλέγχου 13.36±1.69 mg/mm, για την Ομάδα OVX9.42±1.26 mg/mm και για την Ομάδα του φυτικού εκ-χυλίσματος (OVX+SID) 11.17±1.82 mg/mm. Η οστικήπυκνότητα ήταν για την Ομάδα Ελέγχου 475.34±41.55mg/mm², για την Ομάδα OVX 350.91±19.67 mg/mm²και για την Ομάδα OVX+SID 392.57±44.12 mg/mm².Το εμβαδόν του φλοιώδους ήταν για την Ομάδα Ελέγ-

χου 12.11±2.95 mm², για την Ομάδα OVX 4.34±1.12mm² και για την Ομάδα OVX+SID 7.09±2.80 mm². Ησύγκριση αυτών των τιμών ανέδειξε μια ενδιάμεση τι-μή για την ομάδα του S. euboea, η οποία διέφερε στα-τιστικά σημαντικά σε σχέση και με τις δύο ομάδες.Συμπερασματικά, η δράση του S. euboea προστάτεψετη μετάφυση της κνήμης από την οστική απώλεια,όπως φαίνεται από τη σύγκριση με την Ομάδα OVX,αλλά όχι σε τέτοιο βαθμό που να μην διαφέρει στατι-στικά σημαντικά σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου.

Από τις παραμέτρους που εκτιμήθηκαν στη διάφυ-ση της κνήμης στα 10 mm από την αρθρική επιφάνεια,στατιστικά σημαντικές διαφορές ανέδειξαν η μάζα καιτο εμβαδόν του σπογγώδους (Εικόνες 4 και 5).

Από τις παραμέτρους που εκτιμήθηκαν στη διάφυσητης κνήμης στα 14 mm από την αρθρική επιφάνεια,στατιστικά σημαντικές διαφορές ανέδειξαν η ολική οστι-κή πυκνότητα, η μάζα του σπογγώδους, το εμβαδόντου σπογγώδους, η μάζα του φλοιώδους, το πάχος τουφλοιώδους και η ενδοοστική περίμετρος (Πίνακας 2).

Πίν. 4. Παράμετροι pQCT που μετρήθηκαν στην κνήμη και το μηριαίο οστούν. Οι έντονες τιμές εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφοράμεταξύ των Ομάδων. Οι μη έντονες τιμές δεν έχουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των Ομάδων. [Ομάδες: Control (ελέγχου), OVX(ωοθηκεκτομής), OVX+Sid (ωοθηκεκτομής+Sideritis euboea)].

Διάφυση κνήμης Διάφυση μηριαίου

Παράμετρος Ομάδες 10 mm 14 mm 40% 50% 60%

Μάζα σπογγώδους Control 0.35 0.14 0.57 0.60 0.53 (Trabcnt, mg/mm) OVX 0.64 0.49 0.98 1.11 1.01

OVX+Sid 0.44 0.30 0.76 0.78 0.76

Επιφάνεια σπογγώδους Control 1.32 0.50 2.19 2.38 2.19 (Traba, mm2) OVX 2.41 1.75 4.04 4.50 4.33

OVX+Sid 1.61 1.08 3.24 3.31 3.08

Ολική οστική πυκνότητα Control 611.63 666.63 736.08 681.10 673.64(Totden, mg/mm2) OVX 525.75 567.75 590.37 533.96 536.80

OVX+Sid 573.07 613.90 627.70 580.98 596.97

Μάζα φλοιώδους Control 4.70 5.64 8.80 7.42 7.07 (Crtcnt, mg/mm) OVX 2.86 2.79 6.46 4.95 4.86

OVX+Sid 3.09 3.25 6.86 5.51 5.54

Πάχος φλοιώδους Control 0.62 0.76 0.68 0.61 0.94 (Crtthkc, mm) OVX 0.36 0.35 0.53 0.43 0.62

OVX+Sid 0.42 0.43 0.56 0.48 0.43

Ενδοστική Control 7.34 6.37 9.83 9.90 9.48περίμετρος OVX 9.42 9.01 11.29 11.59 11.35

(Endoc, mm) OVX+Sid 8.65 8.11 10.72 10.88 10.41


Oστούν 19

Από τις παραμέτρους που εκτιμήθηκαν στο 40%της διάφυσης του μηριαίου, στατιστικά σημαντικές δια-φορές ανέδειξαν η μάζα του σπογγώδους και το εμ-βαδόν του σπογγώδους (Πίνακας 4).

Στη μεσότητα της διάφυσης του μηριαίου, οι παρά-μετροι που ανέδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορέςήταν η οστική μάζα του σπογγώδους, το εμβαδόν τουσπογγώδους και η ενδοοστική περίμετρος (Πίνακας 4).

Οι παράμετροι που ανέδειξαν στατιστικά σημαντι-κές διαφορές στο 60% της διάφυσης του μηριαίουήταν η ολική οστική πυκνότητα, η οστική μάζα τουσπογγώδους, το εμβαδόν του σπογγώδους και η εν-δοοστική περίμετρος (Πίνακας 4).

δ) Εμβιομηχανικές παράμετροι

Κατά τη διάρκεια της μηχανικής δοκιμής τριών ση-μείων κατεγράφοντο συνεχώς συναρτήσει του χρόνουοι τιμές του επιβαλλομένου φορτίου (σε Newtons) καιτης επαγόμενης παραμόρφωσης (βέλους κάμψεως)(σε mm) (Εικόνα 6). Η μέγιστη φόρτιση (Fmax σε Ne-wton) πριν το κάταγμα που υπέστησαν τα μηριαία οστάκατά την εκτέλεση της μηχανικής δοκιμής τριών ση-μείων ήταν για την Ομάδα Ελέγχου 146.44±28.43 N(μέση τιμή ± σταθερή απόκλιση), για την Ομάδα OVX88.70±20.73 N, ενώ για την Ομάδα OVX+SID ήταν

112.97±13.36 N. Αναδείχτηκε μια στατιστικά σημαν-τικά υψηλότερη τιμή στην ομάδα παρέμβασης σε σχέ-ση με την ομάδα της απλής ωοθηκεκτομής (OVX+SIDσυγκριτικά με OVX, p=0.02), μεταξύ Ομάδας Ελέγχουκαι OVX (p<0.000), και μεταξύ Ομάδας Ελέγχου καιOVX+SID (p=0.002) (Εικόνα 7).

Συζήτηση

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε για πρώτη φο-ρά η επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Side-ritis euboea σε καλλιέργειες οστεοβλαστών όσον αφο-ρά στην έκκριση μορίων που διαμεσολαβούν τη συ-νομιλία οστεοβλαστών-οστεοκλαστών, επάγοντας τηνοστεοκλαστογένεση. Σε προηγούμενη μελέτη μας είχεδειχθεί ότι το υδατικό εκχύλισμα του S. euboea οδηγείσε επαγωγή της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης καιεπιμετάλλωσης (καλλιέργειες οστεοβλαστικής σειράςεπίμυος KS483), σε συγκεντρώσεις 50 και 25 μg/ml[34]. Η ισορροπία ανάμεσα στην έκκριση της OPG καιτου RANKL, όπως επίσης και η έκκριση της ΙL-6 απότους οστεοβλάστες παίζουν πολύ σημαντικό ρόλοστην οστεοκλαστογένεση και κατ’ επέκταση στη ρύθ-μιση της οστικής ανακατασκευής [37].

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσης μελέτης,φαίνεται ότι το ίδιο εκχύλισμα έχει δυνατότητα να μειώνει

Εικ. 6. Τυπική καμπύλη επιβαλλόμενης δύναμης κάμψεως – βέλους κάμψεως από τις δοκιμές κάμψεως τριών σημείων (ένθετη φωτογραφία).


20 Oστούν

την επαγόμενη από τους οστεοβλάστες οστεοκλαστικήδραστηριότητα, μειώνοντας την έκκριση της IL-6 αλλάκαι το λόγο RANKL/OPG. Από τις διάφορες συγκεντρώ-σεις που δοκιμάστηκαν, τα 50 μg/ml φαίνεται να είχαντη θετικότερη επίδραση, τόσο στην αναστολή της έκκρι-σης IL-6, όσο και στη μείωση του λόγου RANKL/OPG.

Μαζί με το υπό μελέτη εκχύλισμα χορηγήθηκε καιοιστραδιόλη (17β-Ε2), μια ορμόνη με γνωστή αντιο-στεοκλαστική δραστηριότητα τόσο σε in vitro, όσο καισε in vivo μελέτες. Βρέθηκε ότι η οιστραδιόλη μειώνειτην απελευθέρωση της IL-6 από τους οστεοβλάστεςκαι στις δύο συγκεντρώσεις, αποτέλεσμα που συμφω-νεί με προγενέστερες μελέτες [38,39]. Οι Cheung καισυνεργάτες μάλιστα βρήκαν ότι η IL-6 μειώνεται μετην επίδραση της οιστραδιόλης τόσο σε πρωτογενείςανθρώπινες καλλιέργειες οστεοβλαστών (η βασική IL-6 αλλά και η μετά διέγερση με LPS), όσο και σε αν-θρώπινη κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος (SaOS).

Όσον αφορά στην επίδραση της οιστραδιόλης στηνέκκριση διαλυτής OPG, βρέθηκε ότι η οιστραδιόληεπάγει την έκκρισή της και στις δυο συγκεντρώσειςπου δοκιμάστηκαν, αποτέλεσμα που επίσης συμφωνείμε προγενέστερες μελέτες [40,41]. Θα πρέπει να ση-μειωθεί όμως ότι υπάρχουν in vitro μελέτες που έχουνδείξει μείωση της έκκρισης της OPG υπό την επίδρασηοιστραδιόλης σε αντίστοιχες συγκεντρώσεις, όπωςεπίσης και καμμία επίδραση· μια πιθανή εξήγηση των

διαφορετικών αποτελεσμάτων είναι η χρησιμοποίησηδιαφορετικής κυτταρικής σειράς ή/και πρωτογενώνκαλλιεργειών στις προαναφερθείσες εργασίες, γεγο-νός που συνεπάγεται και διαφορετική αναλογίαERa/ERβ, λαμβάνοντας υπ’ όψιν ότι κάθε υποδοχέαςεπιδρά διαφορετικά στην έκφραση της ΟPG [42].

H επίδραση της οιστραδιόλης στην έκφραση τουRANKL φάνηκε να μην είναι στατιστικά σημαντική. Σεπροηγούμενες μελέτες έχει βρεθεί ότι η οιστραδιόληδεν επηρέασε την έκφραση του RΑΝΚL, τόσο σε επί-πεδο mRNA, όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο [38-40],ενώ οι Lindberg και συνεργάτες παρατήρησαν αύξησητου RANKL mRNA [42].

Όσον αφορά στις πειραματικές μελέτες των δυνη-τικά ευεργετικών φυτικών εκχυλισμάτων που πραγ-ματοποιούνται in vivo σε επίμυες, υποστηρίζεται ότιτα εκχυλίσματα θα πρέπει να χορηγούνται αμέσωςμετά την ωοθηκεκτομή έτσι ώστε να αποτρέψουν τηναπώλεια οστού που παρατηρείται αμέσως μετά τη χει-ρουργική παρέμβαση στα συγκεκριμένα ζωικά πρό-τυπα. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό μια και τα φυτικάεκχυλίσματα έχουν συνήθως ένα ήπιο θεραπευτικόαποτέλεσμα. Για το λόγο αυτό και στην παρούσα με-λέτη το υδατικό διάλυμα του S. euboea χορηγήθηκεαμέσως μετά την ωοθηκεκτομή. Το συγκεκριμένο φυ-τό καταναλώνεται ευρέως ως αφέψημα στην Ελλάδαμε το όνομα «τσάι του βουνού».

Εικ. 7. Η μέγιστη φόρτιση (F max σε Newtons) που υπέστησαν τα οστικά δοκίμια πριν το κάταγμα. [Ομάδες: Control (ελέγχου), OVX (ωο-θηκεκτομής), OVX+Sideritis (ωοθηκεκτομής+Sideritis euboea)].


Oστούν 21

Ως καταλληλότερο ζωικό πρότυπο για την μελέτητης μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης, επιλέχθηκεο ώριμος θηλυκός ωοθηκεκτομημένος επίμυς. Τοσυγκεκριμένο πρότυπο συνδύαζε ιδανικότερα τα ζωο-τεχνικά και επιστημονικά κριτήρια καταλληλότητας γιατην εκτέλεση της μελέτης της χορήγησης φυτικού εκ-χυλίσματος στον οστικό μεταβολισμό υπό τις συνθή-κες που πραγματοποιήθηκε. Η εκτίμηση της οστικήςπυκνότητας και ποιότητας πραγματοποιήθηκε με τιςμετρήσεις DEXA, pQCT και με τις εμβιομηχανικές δο-κιμές. Η ηλικία των επιμύων κατά την οποία πραγμα-τοποιήθηκε η μελέτη ήταν 10 μηνών, η οποία είναι ηηλικία απόκτησης της κορυφαίας οστικής μάζας στοσυγκεκριμένο ζωικό είδος και θεωρείται η καταλλη-λότερη για την προσομοίωση της μετεμμηνοπαυσια-κής οστεοπόρωσης του ανθρώπου [35,43].

Στις μετρήσεις DEXA που πραγματοποιήθηκαν 3μήνες μετά την ωοθηκεκτομή, η ποσοστιαία μεταβολήτης οστικής πυκνότητας, από την αρχική μέτρηση,ήταν για τους ωοθηκεκτομημένους χωρίς παρέμβασηεπίμυες -11.38% για όλη την κνήμη και -26.47% γιατην εγγύς μετάφυση της κνήμης. Η κατά πολύ μικρό-τερη απώλεια για όλη την κνήμη οφείλεται στο άφθονοφλοιώδες οστούν που περικλείεται κατά την οριοθέ-τηση της περιοχής ενδιαφέροντος που περιελάμβανεόλη την κνήμη. Το φλοιώδες οστούν δεν υφίσταται τέ-τοια δραματική απώλεια, όπως το σπογγώδες, στηνπρώιμη μετά την ωοθηκεκτομή περίοδο. Το ισχυρόευεργετικό αποτέλεσμα της χορήγησης του φυτικούεκχυλίσματος του S. euboea στην οστική πυκνότηταόλης της κνήμης στους 3 μήνες σε σχέση με την αρ-χική μέτρηση ήταν οστική απώλεια μόνο -4.67%, πο-σοστό παρόμοιο και στατιστικά μη σημαντικά διαφο-ρετικό από την ομάδα ελέγχου όπου η οστική απώλειαήταν -3.02%. Αυτή η ευεργετική δράση ήταν λιγότεροδυναμική κατά το τέλος της μελέτης όπου οι ωοθηκε-κτομημένοι επίμυες που λάμβαναν το φυτικό εκχύλι-σμα είχαν απώλεια της οστικής τους πυκνότητας κατά-14.37% και οι ωοθηκεκτομημένοι χωρίς παρέμβαση-20.46% σε σχέση με την αρχική τους μέτρηση.

Στην εγγύς μετάφυση της κνήμης όπου υπάρχεισπογγώδες οστούν παρατηρήθηκε ταχεία οστική απώ-λεια αμέσως μετά την ωοθηκεκτομή και μέχρι τους 3μήνες. Ο ρυθμός της οστικής απώλειας μειώνεται κα-τά πολύ μετά την πάροδο των τριών μηνών, όταν ηοστική απώλεια αρχίζει να αντισταθμίζεται από τηνοστική παραγωγή και ο οστικός μεταβολισμός εισέρ-χεται σε σταθερή κατάσταση [35]. Τα αποτελέσματα

της μελέτης έρχονται σε συμφωνία με αυτές τις καλάμελετημένες οστικές μεταβολές. Η ποσοστιαία απώ-λεια της οστικής πυκνότητας στο πρώτο τρίμηνο γιατην εγγύς μετάφυση της κνήμης συγκριτικά με την αρ-χική μέτρηση για τους ωοθηκεκτομημένους χωρίς πα-ρέμβαση επίμυες ήταν -26.47% ενώ στους έξι μήνεςήταν -31.22%. Συγκριτικά, η χορήγηση του φυτικούεκχυλίσματος προστάτεψε από την δραστική απώλειατο σπογγώδες οστούν της εγγύς μετάφυσης της κνή-μης. Η ποσοστιαία μεταβολή στους πρώτους τρεις μή-νες ήταν -15.57%, επιδεικνύοντας μια σημαντική προ-στατευτική δράση στη φάση της ταχείας οστικής απώ-λειας. Η ευεργετική επίδραση συνεχίστηκε και στοεπόμενο τρίμηνο όπου η ποσοστιαία μεταβολή απότην αρχική μέτρηση ήταν -16.57%.

Τα δεδομένα που προέκυψαν από τις μετρήσεις μετη μέθοδο pQCT για την ολική οστική μάζα της εγγύςμετάφυσης της κνήμης, όπου κυριαρχεί το σπογγώδεςοστούν, ήταν για την ομάδα ελέγχου 13.36±1.69mg/mm, για την ομάδα της ωοθηκεκτομής 9.42±1.26mg/mm και για την ομάδα του φυτικού εκχυλίσματος11.17±1.82 mg/mm. Η ολική οστική πυκνότητα ήτανγια την ομάδα ελέγχου 475.34±41.55 mg/mm² γιατην ομάδα της ωοθηκεκτομής 350.91±19.67 mg/mm²και για την ομάδα του φυτικού εκχυλίσματος392.57±44.12 mg/mm². Το εμβαδόν του φλοιώδουςήταν για την ομάδα ελέγχου 12.11±2.95 mm² για τηνομάδα της ωοθηκεκτομής 4.34±1.12 mm² και για τηνομάδα του φυτικού εκχυλίσματος 7.09±2.80 mm².Στις τομές της κνήμης στα 10 mm και 14 mm όπωςκαι στις τομές 40%, 50% και 60% της διάφυσης τουμηριαίου, όπου κυριαρχεί το φλοιώδες οστούν, πα-ρατηρούνται στατιστικά σημαντικές διαφορές για τηνοστική μάζα του σπογγώδους και το εμβαδόν του μεέναν αμφιλεγόμενο τρόπο:

Η ομάδα ελέγχου φαίνεται να υφίσταται τη μεγα-λύτερη απώλεια οστικής μάζας του σπογγώδους καιτου εμβαδού του σε σχέση με την ομάδα της ωοθη-κεκτομής. Στους επίμυες το μεγαλύτερο μέρος τηςοστικής απώλειας μετά την ωοθηκεκτομή οφείλεταιστην ενδοοστική απορρόφηση [35]. Η απώλεια αυτήοστού έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση του πορώ-δους στην έσω επιφάνεια του φλοιού του οστού καιπιθανά στην εκτίμηση, από τη συσκευή pQCT, μέρουςτου φλοιώδους οστού ως σπογγώδες. Την άποψη αυ-τή επιβεβαιώνει και η εξαιρετικά αυξημένη ενδοοστικήπερίμετρος στις τομές 14 mm της κνήμης και στο 60%του μηριαίου, όπως επίσης και το αυξημένο εμβαδόν


22 Oστούν

του σπογγώδους σε όλες τις τομές για την ομάδα τηςωοθηκεκτομής. Συνυπολογίζοντας τις παρατηρήσειςτων Danielsen και συνεργατών [44] και του Burr [45]ότι η οστική απώλεια στο σπογγώδες θα πρέπει ναυπολογίζεται στο έσω δεύτερο ή τρίτο της συνολικήςτου επιφάνειας, τότε μπορεί να εξαχθεί το συμπέρα-σμα ότι το εκχύλισμα του S. euboea προστάτεψε, γιαόλες τις τομές, την οστική μάζα του φλοιώδους σεσύγκριση με την ομάδα της ωοθηκεκτομής και μάλιστασε τέτοιο βαθμό ώστε να μη διαφέρει στατιστικά ση-μαντικά με την ομάδα ελέγχου.

Παρόμοιες μελέτες, με από του στόματος χορή-γηση φυτικών εκχυλισμάτων έχουν πραγματοποιηθείκαι για φυτά Silybum marianum, Ulnus wallichianaκαι Butea monosperma, και έχει βρεθεί ότι έχουνευεργετική δράση στα οστά [46-48]. Οι περισσότερεςμελέτες αφορούσαν χρονικό διάστημα τριών μηνών,κατά το διάστημα δηλαδή που παρατηρείται ταχείαοστική απώλεια στο σπογγώδες οστούν στο σκελετότου επίμυος. Στη παρούσα μελέτη διερευνήθηκε πε-ραιτέρω η επίδραση του φυτικού εκχυλίσματος τουS. euboea και κατά το χρονικό διάστημα της σταθε-ρής κατάστασης για το σπογγώδες. Προηγούμενημελέτη που είχε πραγματοποιηθεί από την ομάδα μαςγια εκχύλισμα προερχόμενο από το φυτό Onobrychisebenoides κατέδειξε μια υψηλώς στατιστικά σημαν-τική προστατευτική δράση στην απώλεια οστικής πυ-κνότητας για όλη την κνήμη (-2.04%) και για την εγ-γύς μετάφυση της κνήμης (-12.75%) μετά από εξά-μηνη χορήγηση [10]. Παρόλο που στην παρούσα με-λέτη το προστατευτικό αποτέλεσμα ήταν λιγότεροθεαματικό σε σχέση με την προηγούμενη μελέτη (-14.37% και -16.57% για όλη και για την εγγύς μετά-φυση της κνήμης αντίστοιχα), η διαφορά της ποσο-στιαίας μεταβολής της οστικής πυκνότητας σε σχέσημε τους ωοθηκεκτομημένους επίμυες που δεν είχανυποστεί καμιά θεραπευτική παρέμβαση ήταν στατι-στικά σημαντική.

Η μέτρηση της οστικής πυκνότητας με τη μέθοδοDEXA είναι μια ποσοτική εκτίμηση, και βρίσκεται σεαντιστοιχία με την εμβιομηχανική δοκιμή κάμψηςτριών σημείων που επιλέχθηκε για να εκτιμηθεί η οστι-κή ποιότητα. Η δοκιμή κάμψης τριών σημείων πραγ-ματοποιήθηκε ex vivo στα μηριαία οστά των επιμύων.Τα αποτελέσματα των δοκιμών έδειξαν μια σημαντικήμείωση της μέγιστης φόρτισης που απαιτούνταν γιατην πρόκληση κατάγματος στα υπό δοκιμή μηριαίατων ωοθηκεκτομημένων ζώων, ενώ για την ομάδα που

λάμβανε το εκχύλισμα η τιμή της απαιτούμενης γιατην πρόκληση κατάγματος φόρτισης ήταν στατιστικάσημαντικά υψηλότερη.

Επιπλέον, κατά την επισκόπηση των μητρών κατά τηδιενέργεια της νεκροψίας, παρατηρήθηκε ότι ήτανατροφικές στις ομάδες της ωοθηκεκτομής και ωοθη-κεκτομής με παρέμβαση· η παρατήρηση αυτή αποδείχ-θηκε και από το ταυτόσημο βάρος των οργάνων έτσιόπως προέκυψε από τη ζύγισή τους σε μικροζυγό ακρι-βείας. Τα αποτελέσματα αυτά είναι μια σημαντική έν-δειξη ότι το φυτικό εκχύλισμα του S. euboea δρα μετρόπο αντίστοιχο των εκλεκτικών τροποποιητών τωνυποδοχέων οιστρογόνων, δηλαδή ενώ είχε σημαντικάευεργετική επίδραση στα οστά των ωοθηκεκτομημέ-νων επιμύων δεν επηρέασε το βάρος των μητρώντους. Σε παρόμοια αποτελέσματα εκλεκτικής ευεργε-τικής επίδρασης στα οστά από τη χορήγηση φυτοοι-στρογονικών εκχυλισμάτων έχουν καταλήξει και άλλεςμελέτες [47,49]. Παρόλα αυτά αξίζει να σημειωθεί ότιπρόσφατη έρευνα που πραγματοποιήθηκε μετά απόμακροχρόνια διαιτητική πρόσληψη ισοφλαβονών έδει-ξε ότι μια συνεχής έκθεση στις ουσίες αυτές μπορείνα οδηγήσει σε πιθανή ευαισθητοποίηση των μητρώνσε εξωγενή οιστρογονικά ερεθίσματα [50].

Συμπερασματικά, σύμφωνα με τα αποτελέσματατης παρούσας μελέτης, το φυτικό εκχύλισμα του S.euboea έχει τη δυνατότητα in vitro να μειώνει την επα-γόμενη από τους οστεοβλάστες οστεοκλαστική δρα-στηριότητα, μειώνοντας την έκκριση της IL-6 αλλά καιτου RANKL. Επιπρόσθετα, in vivo αναδείχθηκε μιαανάλογη δράση με αυτή των εκλεκτικών τροποποιητώντων υποδοχέων οιστρογόνων, όπως προέκυψε απότην ευεργετική επίδραση του εκχυλίσματος στα οστά,με όλες τις μεθόδους που επιλέχθηκαν για να εκτιμη-θεί η οστική τους πυκνότητα και ποιότητα, ενώ αντί-θετα καμιά δυσμενής επίδραση δεν παρατηρήθηκεστις μήτρες. Aπαιτούνται περαιτέρω μελέτες για ναδιαπιστωθεί σε ποιο από τα επιμέρους συστατικά οφεί-λεται η ευεργετική επίδραση του εκχυλίσματος, καθώςεπίσης και επιδημιολογικές ή κλινικές μελέτες σε με-τεμμηνοπαυσιακές γυναίκες οι οποίες καταναλώνουντο αφέψημα παραδοσιακά, προκειμένου να εξαχθούνασφαλή συμπεράσματα και συστάσεις για τη συστη-ματική του κατανάλωση.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς εκφράζουν τις θερμές ευχαριστίεςτους στην Ελληνική Εταιρεία Μελέτης Μεταβολισμού


Oστούν 23

των Οστών για τη χρηματοδότηση της ερευνητικήςπρότασης της παρούσης μελέτης το 2006, με τηνοποία κατέστη δυνατή η πραγματοποίησή της.

Ευχαριστούν επίσης για την πολύτιμη συνδρομήτους την κα Μαρία Κατσίρη κατά τις μετρήσεις και

αναλύσεις DEXA, την κα Χρυσαυγή Καψή κατά τις πα-ρεμβάσεις στα ζώα εργαστηρίου, τον κο Γεώργιο Κι-νικλή κατά τις μετρήσεις και αναλύσεις pQCT, την καΆννα Τσιαπάρα κατά τις νεκροψίες και τον φροντιστήπειραματοζώων κο Παναγιώτη Προκόπη.

Βιβλιογραφία

1. Atkinson AS, Ward EW. Clinical nutrition: 2. Therole of nutrition in the prevention and treatment ofadult osteoporosis. CMAJ 2001; 165(11):1511-4.

2. Ferrari CK, Torres EA. Biochemical pharmacolo-gy of functional foods and prevention of chronicdisease of aging. Biomed Pharmacother 2003;57(5-6):251-60.

3. Hegarty VM, May HM, Khaw KT. Tea drinkingand bone mineral density in older women. Am JClin Nutr 2000; 71:1003-7.

4. Bayly JR. Current therapies for osteoporosis. In:Pearson D, Miller CG, eds. Clinical Trials in Os-teoporosis. 2nd ed. London, UK: Springer-Verlag,2007:189-210.

5. Kanis J, Burlet N, Cooper C, Delmas PD, Regin-ster JY, Borgstrom F, Rizzoli R. European guid-ance for the diagnosis and management of os-teoporosis in postmenopausal women. Osteo-poros Int 2008;19:399-428.

6. Hamilton B, McKoy K, Taggart H. Tolerability andcompliance with risedronate in clinical practice.Osteoporos Int 2003; 14:259-262.

7. Imaz I, Zegarra P, Gonzalez-Enriquez J, Rubio B,Alcazar R, Amate JM. Poor bisphosphonate ad-herence for treatment of osteoporosis increasesfracture risk: systematic review and meta-analy-sis. Osteoporos Int 2010; 21:1943-1951.

8. Ringe JD, Christodoulakos GE, Mellström D, PettoH, Nickelsen T, Marin F, Pavo I. Patient compliancewith alendronate, risedronate and raloxifene for thetreatment of osteoporosis in postmenopausalwomen. Curr Med Res Opin 2007; 23:2677-2687.

9. Coxam V. Phyto-oestrogens and bone health.Proc Nutr Soc 2008; 67:184-195.

10. Dontas I, Halabalaki M, Moutsatsou P, MitakouS, Papoutsi Z, Khaldi L, Galanos A, Lyritis GP.Protective effect of plant extract from Onobrychisebenoides on ovariectomy-induced bone loss inrats. Maturitas 2006; 53:234-242.

11. Mundy GR. Nutritional modulators of bone re-modeling during aging. Am J Clin Nutr 2006;83:427S-430S.

12. Putnam SE, Scutt AM, Bicknell K, Priestley CM,Williamson EM. Natural products as alternativetreatments for metabolic bone disorders and formaintenance of bone health. Phytother Res 2007;21:99-112.

13. Papoutsi Z, Kassi E, Papaevangeliou D, PratsinisH, Zoumbourlis V, Halabalaki M, Mitakou S, Kalo-foutis A, Moutsatsou P. Plant 2-Arylobenzofuransdemonstrate a selective estrogen receptor mod-ulator profile. Steroids 2004;69:727-34.

14. Hidaka S. Natural products with potential for os-teoporosis examined in vivo and in vitro. J TraditMed 2009; 26:1-10.

15. Boue SM, Wiese TE, Nehls S, Burow ME, ElliottS, Carter-Wientjes CH, Shih BY, McLachlan JA,Cleveland TE. Evaluation of the estrogenic ef-fects of legume extracts containing phytoestro-gens. J Agric Food Chem 2003; 51(8):2193-9.

16. Compston JE. Sex steroids and bone. PhysiolRev 2001; 81(1):419-447.

17. Ju YH, Carlson KE, Sun J, Pathak D, Katzenel-lenbogen BS, Katzenellenbogen JA, HelferichWG. Estrogenic effects of extracts from cabbage,fermented cabbage, and acidified brussel sproutson growth and gene expression of estrogen-de-pendent human breast cancer (MCF-7) cells. J A-gric Food Chem 2000; 48(10):4628-34.

AλληλογραφίαΙσμήνη Δοντά,

Αθανασίου Διάκου 26,Κηφισιά 145 61

E-mail: [email protected]

CorrespondenceΙsmene Dontas,26 Athanasiou Diakou Str,145 61 Kifissia, GreeceE-mail: [email protected]


24 Oστούν

18. Writing Group for Women’s Health Initiative Inves-tigators. Risks and benefits of estrogen plus prog-estin in healthy postmenopausal women: principalresults from Women’s Health Initiative randomizedcontrolled trial. JAMA 2002; 288:321-33.

19. Quaedackers ME, Van Den Brink CE, Wissink S,Schreurs RH, Gustafsson Jk JA, Van Der SaagPT, Van Der Burg BB. 4-hydroxytamoxifen trans-represses nuclear factor-kappa B activity in hu-man osteoblastic U2-OS cells through estrogenreceptor (ER)alpha, and not through ER beta. En-docrinology 2001; 142(3):1156-66.

20. Virgili F, Acconcia F, Ambra R, Rinna A, Totta P,Marino M. Nutritional flavonoids modulate estro-gen receptor alpha signaling. IUBMB Life 2004;56(3):145-51.

21. Gupta S, Afaq F, Mukhtar H. Involvement of nu-clear factor-kappa B, Bax and Bcl-2 in inductionof cell cycle arrest and apoptosis by apigenin inhuman prostate carcinoma cells. Oncogene2002; 21(23):3727-38.

22. Kostelac D, Rechkemmer G, Briviba K. Phytoe-strogens modulate binding response of estrogenreceptors alpha and beta to the estrogen re-sponse element. J Agric Food Chem 2003;51(26):7632-5.

23. Campbell MJ, Hamilton B, Shoemaker M, Tagli-aferri M, Cohen I, Tripathy D. Antiproliferative ac-tivity of Chinese medicinal herbs on breast can-cer cell in vitro. Anticancer Res 2002;22(6C):3843-52.

24. Obon de Castro C, Rivera-Nunez D. A taxonomicrevision of the section Sideritis (Genus Sideritis) (Labi-atae). Lubrecht and Cramer Ltd, Berlin - Stuttgart,1994.

25. Charami MT, Lazari D, Karioti A, Skaltsa H, Had-jipavlou-Litina D, Souleles C. Antioxidant and an-tiinflammatory activities of Sideritis perfoliata sub-sp. perfoliata (Lamiaceae). Phytother Res 2008;22:450-454.

26. Diaz RM, Garcia-Granados A, Moreno E, et al. S-tudies on the relationship of structure to antimi-crobial properties of diterpenoid compoundsfrom Sideritis. Planta Med 1988; 54:301-304.

27. Kupeli E, Sahin FP, Calis I, Yesilada E, Ezer N.Phenolic compounds of Sideritis ozturkii and theirin vivo anti-inflammatory and antinociceptive ac-tivities. J Ethnopharmacol 2007; 112:356-360.

28. Ertas A, Ozturk M, Boga M, Topcu G. Antioxidantand anticholinesterase activity evaluation of ent-kaurane diterpenoids from Sideritis arguta. J NatProd 2009; 72:500-502.

29. Tsaknis J, Lalas S. Extraction and identificationof natural antioxidant from Sideritis euboea(mountain tea). J Agric Food Chem 2005;53:6375-6381.

30. Charami MT, Lazari D, Karioti A, Skaltsa H, Had-jipavlou-Litina D, Souleles C. Antioxidant and an-tiinflammatory activities of Sideritis perfoliata sub-sp. perfoliata (Lamiaceae). Phytother Res 2008;22:450-454.

31. Menghini L, Massarelli P, Bruni G, Menghini A.Preliminary evaluation on anti-inflammatory andanalgesic effects of Sideritis syriaca L. herba ex-tracts. J Med Food 2005; 8:227-231.

32. Gürbüz I, Ozkan AM, Yesilada E, Kutsal O. Anti-ulcerogenic activity of some plants used in folkmedicine of Pinarbasi (Kayseri, Turkey). JEthnopharmacol 2005; 101:313-318.

33. Aligiannis N, Kalpoutzakis E, Chinou IB, MitakouS, Gikas E, Tsarbopoulos A. Composition andantimicrobial activity of the essential oils of fivetaxa of Sideritis from Greece. J Agric Food Chem2001; 49(2):811-5.

34. Kassi E, Papoutsi Z, Fokialakis N, Messari I, Mi-takou S, Moutsatsou P. Greek plant extracts ex-hibit Selective Estrogen Receptor ModulatorSERM-like properties. J Agric Food Chem 2004;52:6956-61.

35. Jee WSS, Yao W. Overview: animals models ofosteopenia and osteoporosis. J MusculoskeletNeuronal Interact 2001; 1:193-207.

36. Δοντά Ι, Λελόβας Π. Πειραματικά πρότυπαοστεοπόρωσης. Εκδόσεις Υλονόμη, Αθήνα 2011.

37. Kassem M, Harris SA, Spelsberg TC, Riggs BL.Estrogen inhibits interleukin-6 production andgene expression in a human osteoblastic cell linewith high levels of estrogen receptors. J BoneMiner Res 1996; 11:193-199.

38. Cheung J, Mak Y, Papaioannou S, Evans B, Fo-gelman I, Hampson G. Interleukin-6 (IL-6), IL-1,receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL) and osteoprotegerin production by hu-man osteoblastic cells: comparison of the effectsof 17-β oestradiol and raloxifene. J Endocrinology2003; 177:423-433.


Oστούν 25

39. Hofbauer LC, Khosla S, Dunstand CR, Lacey DL,Spelsberg TC, Riggs BL. Estrogen stimulatesgene expression and protein production of os-teoprotegerin in human osteoblastic cells. En-docrinology 1999; 140:4367-4370.

40. Saika M, Inoue D, Kido S, Matsumoto T. 17β-Estradiol stimulates expression of osteoprotegerinby a mouse stromal cell line, ST-2, via estrogenreceptor-α. Endocrinology 2001; 142:2205-2212.

41. Taranta A, Brama M, Teti A, De Luca V, Seandur-ra R, Spera G, Agnusdei D, Termine JD, Migliac-cio S. The selective estrogen receptor modulatorraloxifene regulates osteoclast and osteoblastactivity in vitro. Bone 2002;30:368-376.

42. Lindberg MK, Erlandsson M, Alatalo SL, WindahlS, Andersson G, Halleen JM, Carlsten H, Gustafs-son J-A, Ohlsson C. Estrogen receptor α, but notestrogen receptor β, is involved in the regulationof the OPG/RANKL (osteoprotegerin/receptoractivator of NF-κB ligand) ratio and serum inter-leukin-6 in male mice. J Endocrinology 2001;171:425-433.

43. Lelovas PP, Xanthos TT, Thoma SE, Lyritis GP,Dontas IA. The laboratory rat as an animal modelfor osteoporosis research. Comp Med 2008;58:424-30.

44. Danielsen CC, Mosekilde L, Svenstrup B. Corticalbone mass, composition, and mechanical prop-erties in female rats in relation to age, long-termovariectomy, and estrogen substitution. CalcifTissue Int 1993; 52:26-33.

45. Burr DB. Muscle strength, bone mass and age-related bone loss. J Bone Miner Res 1997;12:1547-1551.

46. El-Shitany NA, Hegazy S, El-Desoky K. Evidencesfor antiosteoporotic and selective estrogen re-ceptor modulator activity of silymarin comparedwith ethinylestradiol in ovariectomized rats. Phy-tomedicine 2010; 17:116-125.

47. Sharan K, Siddiqui JA, Swarnkar G, Tyagi AM,Kumar A, Rawat P, Kumar M, Nagar GK, AryaKR, Manickavasagam L, Jain GK, Maurya R,Chattopadhyay N. Extract and fraction from Ul-mus wallichiana Planchon promote peak boneachievement and have a nonestrogenic osteo-protective effect. Menopause 2010; 17:393-402.

48. Pandey R, Gautam AK, Bhargavan B, Trivedi R,Swarnkar G, Nagar GK, Yadav DK, Kumar M,Rawat P, Manickavasagam L, Kumar A, MauryaR, Goel A, Jain GK, Chattopadhyay N, Singh D.Total extract and standardized fraction from thestem bark of Butea monosperma have osteopro-tective action: evidence for the nonestrogenicosteogenic effect of the standardized fraction.Menopause 2010; 17:602-610.

49. Siddiqui JA, Sharan K, Swarnkar G, Rawat P, Ku-mar M, Manickavasagam L, Maurya R, PierrozD, Chattopadhyay N. Quercetin-6-C-beta-d-glucopyranoside isolated from Ulmus wallichianaplanchon is more potent than quercetin in inhibit-ing osteoclastogenesis and mitigating ovariec-tomy-induced bone loss. Menopause 2011;18(2):198-207.

50. Möller FJ, Diel P, Zierau O, Hertrampf T, MaaQJ, Vollmer G. Long-term dietary isoflavone expo-sure enhances estrogen sensitivity of rat uterineresponsiveness mediated through estrogen re-ceptor. Toxicol Lett 2010; 196:142-153.

26 Oστούν


Διαφορική έκφραση των ισομορφών τουIGF-1 στα κύτταρα MG-63 ανθρώπινου οστεοσαρκώματος Α. ΑΡΜΑΚΟΛΑΣ1, Α. ΦΙΛΙΠΠΟΥ1, Σ. ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΟΣ2, Α. ΘΕΟΣ1, Μ. ΚΑΠΑΡΕΛΟΥ1, Ν. ΠΙΣΙΜΙΣΗΣ1, Α. ΝΕΖΟΣ1, Ζ. ΠΑΝΤΕΛΕΑΚΟΥ1, Π. ΠΑΠΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΣ3, Μ. ΚΟΥΤΣΙΛΙΕΡΗΣ1

1 Εργαστήριο Φυσιολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών, ΕΚΠΑ2 Πανεπιστημιακή Ορθοπαιδική Κλινική, Νοσοκομείο Κ.Α.Τ.3 Α’ Πανεπιστημιακή Ορθοπαιδική Κλινική, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο ATTIKON

Περίληψη

Το ανθρώπινο γονίδιο του ινσουλινομιμητικού αυξητικού παράγοντα 1 (IGF-1) κωδικοποιεί διαφορετικά μετάγραφα/ισομορφές, ονομαστικάτα IGF-1Ea, IGF-1Eb και IGF-1Ec, μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν: α) να εξετάσει την έκφραση τωνισομορφών του IGF-1 στα κύτταρα στα κύτταρα MG-63 ανθρώπινου οστεοσαρκώματος που εμφανίζουν οστεβλαστικό φαινότυπο μετά απόεπίδραση με διάφορους αυξητικούς παράγοντες και ορμόνες και β) να διερευνήσει το ρόλο του βιορυθμιστικού συστήματος του IGF-1στα κύτταρα MG-63. Η έκφραση των ισομορφών του IGF-1 χαρακτηρίστηκε σε επίπεδο mRNA μέσω ημιποσοτικής (RT-PCR) και ποσοτικής(qRT-PCR) ανάλυσης αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Τέλος, μέσω της μεθόδου αποκλεισμού μέσωχρώσης (trypan blue assay) διερευνήθηκε η μιτογόνος δράση του ώριμου πεπτιδίου του IGF-1 και ενός συνθετικού πεπτιδίου πουαντιστοιχεί στην περιοχή Ε της ισομορφής IGF-1Ec (συνθετικό πεπτίδιο Ε) στα κύτταρα MG-63, καθώς επίσης και σε κύτταρα MG-63 μετάαπό μοριακή τροποποίηση τους με τη χρήση siRNAs, η οποία ανέστειλε την έκφραση των υποδοχέων του IGF-1 (IGF-1R ΚΟ) και τηςινσουλίνης (IR ΚΟ). Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι στις παρούσες πειραματικές συνθήκες τα κύτταρα MG-63 εκφράζουν μόνοτα μετάγραφα IGF-1Ea και IGF-1Ec. Η εξωγενής χορήγηση μετατρεπτικού αυξητικού παράγοντα β1 (TGF-β1) και διϋδροτεστοστερόνης(DHT) αύξησε σημαντικά την έκφραση του IGF-1Ea mRNA και επήγαγε την προηγουμένως μη ανιχνεύσιμη έκφραση του IGF-1Eb στακύτταρα MG-63. Η χορήγηση IGF-1, ινσουλίνης και του συνθετικού πεπτιδίου Ε προκάλεσε την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρωνMG-63, ενώ μόνο το πεπτίδιο Ε επήγαγε τον πολλαπλασιασμού των κυττάρων IGF-1R KO and IR KO. Τα ερευνητικά μας ευρήματα ανέδειξανμια διαφορική έκφραση των ισομορφών του IGF-1 στα κύτταρα MG-63 η οποία φαίνεται ότι ρυθμίζεται από άλλους παράγοντες και ορμόνεςκαι ενδέχεται να διαδραματίζει έναν πολυδύναμο ρόλο στην παθοφυσιολογία του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος. Ειδικότερα η έκφρασητης ισομορφής IGF-1Ec πιθανώς να εμπλέκεται στη βιολογία του οστεοσαρκώματος μέσω της παραγωγής του πεπτιδίου Εc, του οποίου ηδράση διαμεσολαβείται από κάποιο μηχανισμό ανεξάρτητο από τον υποδοχέα του IGF-1 και της ινσουλίνης.

Λέξεις κλειδιά: Ινσουλινομιμητικός αυξητικός παράγοντας 1 (IGF-1), Iσομορφές IGF-1, Oστεοσάρκωμα, Kύτταρα MG-63

IGF-1 isoform expression in MG-63 human osteoblast-likeosteosarcoma cellsA. ARMAKOLAS1, A. PHILLIPOU1, S.G. PNEUMATICOS2, A. THEOS1, M. KAPARELOU1, N. PISSIMISSIS1,A. NEZOS1, Z. PANTELEAKOU1, P. PAPAGELOPOULOS3, M. KOUTSILIERIS1

1 Department of Experimental Physiology, Medical School, National & Kapodistrian University of Athens2 Third Department of Orthopaedics, Athens University Medical School, KAT Hospital3 First Department of Orthopaedics, Athens University Medical School, ATTIKON University Hospital

Summary

The insulin-like growth factor 1 (IGF-1) gene gives rise to multiple transcripts, the IGF-1Ea, IGF-1Eb and IGF-1Ec by an alternativesplicing mechanism. The aims of this study were: a) to study the expression levels of the IGF-1 isoforms to MG-63 human osteoblast-

Έκφραση των ισομορφών του IGF-1 στα κύτταρα MG-63

Oστούν 27

Εισαγωγή

Η έκφραση του γονιδίου του ινσουλινομιμητικού αυ-ξητικού παράγοντα 1 (IGF-1) ρυθμίζεται κύρια από τηναυξητική ορμόνη (GH) και τις στεροειδείς ορμόνες τουφύλου, ενώ το βιοδραστικό του παράγωγο, ο IGF-1, πουαρχικά έχει περιγραφεί ως σωματομεδίνη C, παράγεταικατά κύριο λόγο από το συκώτι, διαμεσολαβώντας έτσιτις δράσεις της GH στην ανάπτυξη του σκελετού. Συνε-πώς, ο άξονας GH/IGF-1 ελέγχει τη σκελετική ανάπτυξηκαθώς και την οστική διαμόρφωση και αναδιαμόρφωση[1]. Οι βιολογικές δράσεις του IGF-1 αποδίδονται στησύνδεσή του με τον τύπου Ι υποδοχέα του (IGF-1R). Ηενεργοποίηση του υποδοχέα του IGF-1 και η συνακό-λουθη σηματοδότησή του επηρεάζει τις διαδικασίες τηςκυτταρικής διαίρεσης, διαφοροποίησης, απόπτωσης καιεπισκευής του DNA ουσιαστικά σε όλους τους τύπουςκυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και των κυττάρων τουοστεοσαρκώματος [2]. Επιπλέον, ο IGF-1 μπορεί να συν-δέεται, με χαμηλότερη συγγένεια, με τον υποδοχέα τύ-που ΙΙ (IGF-2R) που διαμεσολαβεί κυρίως την εσωτερι-κοποίηση του IGF-1 καθώς και μεταβολικές διαδικασίες[1,2], και με τον υποδοχέα της ινσουλίνης (IR), ο οποίοςεπηρεάζει την κυτταρική διαίρεση και διαφοροποίηση[2]. Τέλος, ο IGF-1 συνδέεται και ενεργοποιεί τον υβρι-δικό υποδοχέα IGF-1R/IR ο οποίος συνίσταται από ένανημιυποδοχέα IR που συνδέεται με έναν ημι-υποδοχέαIGF-1R, προκαλώντας κυτταρικές αποκρίσεις που βρί-σκονται υπό εντατική διερεύνηση, ειδικότερα για το ρόλοτους στη βιολογία του καρκίνου [3].

Δεδομένου ότι το βιορυθμιστικό σύστημα του IGF-1εμπλέκεται στη βιολογία του καρκίνου συμπεριλαμ-βανομένου του οστεοσαρκώματος, οι υποδοχείς τουIGF-1 έχουν καταστεί ελκυστικοί υποψήφιοι για στο-

χευμένες θεραπείες και αποτελεσματικότητα της χρή-σης αντι-IGF-1R αντισωμάτων στην αναστολή της δρά-σης του IGF-1 έχουν διερευνηθεί σε διάφορες κλινι-κές δοκιμές [4-7].

Είναι ενδιαφέρον ότι το γονίδιο του IGF-1, το οποίοπεριλαμβάνει 6 εξώνια, δίδει γένεση σε πολλαπλά ετε-ρογενή μετάγραφα, μέσω του μηχανισμού εναλλακτι-κού ματίσματος [8-12]. Στον άνθρωπο, τα τρία μετά-γραφα/ισομορφές του IGF-1, δηλ., τα IGF-1Ea, IGF-1Eb και IGF-1Ec, παράγουν ένα κοινό βιοδραστικόμόριο, το ώριμο πεπτίδιο του IGF-1, ωστόσο, διαφέ-ρουν μεταξύ τους ως προς τη δομή του πεπτιδίου επέ-κτασης (πεπτίδιο Ε) στο καρβοξυλικό άκρο τους [13,14]. Το μετάγραφο που προέρχεται από την παραλ-λαγή ματίσματος του IGF-1Ec ονομάστηκε αρχικά‘‘μηχανοαυξητικός παράγοντας’’ (mechano growthfactor, MGF) λόγω της φερόμενης ως ειδικής έκφρα-σής του στο σκελετικό μυ μετά από μηχανική επιβά-ρυνση και βλάβη του [15,16]. Πρόσφατα, η ερευνητικήμας ομάδα έχει τεκμηριώσει την έκφραση του IGF-1Ec σε άλλους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου τουμυοκαρδίου μετά από έμφραγμα [17]. Επιπλέον, ηεξωγενής χορήγηση ενός συνθετικού πεπτιδίου Ε πουαντιστοιχεί στην περιοχή Ε του IGF-1Ec βρέθηκε ότιεπάγει τον πολλαπλασιασμό ποικίλων τύπων κυττάρων(μυοβλαστών, καρδιομυοκυττάρων, κυττάρων ενδο-μητρίου και καρκινικών προστατικών κυττάρων) μέσωενός μηχανισμού πιθανώς ανεξάρτητου από τον IGF-1R και τον IR [16-20]. Στην παρούσα μελέτη, χαρα-κτηρίστηκε η έκφραση των ισομορφών του IGF-1 σεεπίπεδο mRNA και διερευνήθηκε εάν υπάρχει διαφο-ρική ρύθμισή της στα κύτταρα MG-63 του ανθρώπινουοστεοσαρκώματος μετά από επίδρασή τους με διά-

like osteosarcoma cells before and after the administration of various growth factors and hormones and b) to determine the bioregulatoryrole of the IGF-1 system in the MG-63 cells. The expression of the IGF-1Ea, IGF-1Eb and IGF-1Ec. We also examined the mitogeniceffects of the IGF-1 and of a synthetic peptide related to the E domain of IGF-1Ec (the active part of IGF-1Ec isoform), in MG-63 cellsas well as in MG-63 cells which have been molecularly modified to restrain the expression of type I IGF receptor (IGF-1R) and ofinsulin receptor (IR) by siRNA techniques (IR or IGF-1R KO MG-63 cells), using trypan blue exclusion assay. The results of this studysuggest that under the present experimental conditions the MG-63 cells express only the IGF-1Ea and IGF-1Ec transcripts. Exogenousadministration of dihydrotestosterone (DHT) and of transformation Growth factor β1 (TGF-β1) significantly increased the expressionof IGF-1Ea and it induced the previously undetectable expression of IGF-1Eb transcript. Exogenous administration of the IGF-1, insulinand the synthetic E peptide stimulated the growth of MG-63 cells while only E peptide stimulated the growth of IGF-1R K.O and IR K.OMG-63 cells. These data suggest that the expression of all IGF-1 isoforms is hormonally regulated in MG-63 cells and that the expressionof IGF-1Ec may be involved in the osteosarcoma biοlogy and pathophysiology by generating the Ec peptide which is acting via an IGF-1R-independent and IR-independent mechanism.

Keywords: Insulin-like growth factor 1, MG-63 osteosarcoma cells, IGF-1 isoforms

Α. Αρμακόλας και συν.

28 Oστούν

φορους αυξητικούς παράγοντες και ορμόνες. Επιπλέ-ον, διερευνήθηκαν οι ενδεχόμενες αυτόνομες δρά-σεις του συνθετικού πεπτιδίου Ε της ισομορφής IGF-1Ec στα κύτταρα MG-63.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργειες. Η κυτταρική σειρά MG-63,που αποκτήθηκε από την American Type Cell Culture(ATCC, Bethesda, MD, USA), χρησιμοποιήθηκε ωςένα in vitro μοντέλο για τη διερεύνηση της παθοφυ-σιολογίας των οστεοβλαστών και της βιολογίας τουοστεοσαρκώματος [1,21,22]. Τα κύτταρα καλλιερ-γούνταν σε κλίβανο κυτταροκαλλιέργειας (37oC, 5%CO2) ως μη ‘‘κορεσμένη’’ μονή στοιβάδα κυττάρων(δηλ., σε πυκνότητα κυττάρων μικρότερη από το 80%του κορεσμού), χρησιμοποιώντας το θρεπτικό μέσοEagle‘s Minimum Essential Medium (EMEM, Cam-brex, Walkerville, MD, USA), συμπληρωμένο με 10%θερμο-αδρανοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS,Biochrom, Berlin, Germany) και με 100 U/ml πενικι-λίνης/στρεπτομυκίνης (Cambrex, Walkerville, MDΗΠΑ). Το θρεπτικό μέσο στην κυτταροκαλλιέργειαανανεώνονταν κάθε 2-3 ημέρες.

Η κυτταρική σειρά HLE-B3 του επιθηλίου του φακούτου ανθρώπινου ματιού, που αποκτήθηκε επίσης απότην ATCC, χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυραςγια τον έλεγχο της έκφρασης των ισομορφών του IGF-1, καθώς η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει ότι τακύτταρα αυτά δεν εκφράζουν, στις συγκεκριμένες πει-ραματικές συνθήκες, τις ισομορφές IGF-1Eb και IGF-1Eb [24]. Τα κύτταρα HLE-B3 διατηρούνταν επίσης σεσυνθήκες καλλιέργειας (37oC, 5% CO2) ως μονή στοι-βάδα κυττάρων χρησιμοποιώντας το θρεπτικό μέσοDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM/F-12;Cambrex, Walkerville, MD, USA) συμπληρωμένο με10% FBS και 100 U/ml πενικιλίνης/στρεπτομυκίνης.Το θρεπτικό μέσο στην κυτταροκαλλιέργεια ανανεώ-νονταν κάθε 2-3 ημέρες.

Κυτταρικές επιδράσεις με αυξητικούς παράγον-τες και ορμόνες. Για τη διερεύνηση του ενδεχόμενουδιαφορικής ρύθμισης της έκφρασης των ισομορφώντου IGF-1 στα κύτταρα MG-63 οστεοβλαστικού φαινό-τυπου μετά από επίδρασή τους με διάφορους αυξητι-κούς παράγοντες και ορμόνες, στην παρούσα μελέτηεξετάστηκε η δράση του IGF-1, του μετατρεπτικού αυ-ξητικού παράγοντα β1 (ΤGF-β1), του βασικού αυξητικούπαράγοντα των ινοβλαστών (b-FGF), της ιντερλευκίνης6 (IL-6) της διϋδροτεστοστερόνης (DHT), της οιστρα-

διόλης (17β-Ε2), της δεξαμεθαζόνης (DEXA), του ζο-λενδρονικού οξέος (ZOMETA) και του αιθυλενοδιαμι-νοτετραοξικού οξέος (EDTA) στην έκφραση των ισο-μορφών του IGF-1 στα κύτταρα MG-63.

Ειδικότερα, κύτταρα MG-63 καλλιεργούνταν σε πιά-τα των 6 κελιών με θρεπτικό μέσο ΕΜΕΜ εμπλουτι-σμένο με 10% FBS μέχρι τον κορεσμό της μονής στοι-βάδας τους. Στη συνέχεια, το θρεπτικό μέσο αντικα-θίστατο με θρεπτικό που περιείχε 0,5% FBS για 24 h,προκειμένου να αποκαλυφθεί η πλήρης επίδραση τωνπαραγόντων που θα χρησιμοποιούνταν ακολούθωςστις κυτταρικές επιδράσεις. Τα κύτταρα ακολούθωςεκτίθονταν για 48 ώρες σε IGF-1 (25 ng/ml), ή ΤGF-β1 (25 ng/ml), ή β-FGF (25 ng/ml), ή IL-6 (25 ng/ml),ή DHT (100 nM), ή 17β-Ε2 (100 nM), ή DEXA (100 nM),ή ΖΟΜΕΤΑ (100 μΜ), ή EDTA (100 μΜ). Κύτταρα MG-63 χωρίς επίδρασή τους με οποιοδήποτε παράγοντα(δηλ., καλλιεργούμενα σε θρεπτικό ΕΜΕΜ εμπλουτι-σμένο με 0,5% FBS) χρησιμοποιήθηκαν ως συνθήκεςελέγχου (control).

Μετρήσεις αποκλεισμού μέσω χρώσης με κυανούντου τρυπανίου (trypan blue assays). Για τον έλεγχοτης μιτογόνου δράσης των υπό διερεύνηση πεπτιδίων(δηλ., της ινσουλίνης, του ώριμου IGF-1 και του συν-θετικού πεπτιδίου Ε της ισομορφής IGF-1Ec) κατά δο-σοεξαρτώμενο τρόπο, πραγματοποιήθηκαν μετρήσειςαποκλεισμού (προσδιορισμός του αριθμού ζώντωνκυττάρων) μέσω χρώσης με κυανούν του τρυπανίουόπως περιγράφεται αλλού [19,20], με σκοπό να συγ-κριθούν οι φυσιολογικές δράσεις των διαφορετικώναυτών πεπτιδίων στα κύτταρα MG-63. Εν συντομία,κύτταρα MG-63 καλλιεργούνταν σε πιάτα των 6 κελιώνμε πυκνότητα 2,3 x 104 κύτταρα/κελί και σε θρεπτικόμέσο EMEM εμπλουτισμένο με 10% FBS. Μετά από24 h το θρεπτικό μέσο αντικαθίστατο με θρεπτικό πουπεριείχε 0,5% FBS για 24 h. Τα κύτταρα ακολούθωςεκτίθονταν για 24 h σε διαφορετικές συγκεντρώσεις,δηλ., 0,066 nM, 3,29 nM, ή 6,58 nM ανασυνδυασμέ-νου ανθρώπινου IGF-1 70 αμινοξέων (rhIGF-1, Che-micon international Inc., Temecula, CA, USA), πουαντιστοιχεί στο ώριμο πεπτίδιο του IGF-1, ή σε 0,086nM, 2,58 nM, ή 5,165 nM ινσουλίνης (Novo Nordisk,Denmark), ή σε 0,168 nM, 8,43 nM, ή 16,85 nM τουσυνθετικού πεπτιδίου Ε. Ειδικότερα, το συνθετικό αυ-τό πεπτίδιο αντιστοιχεί στα τελευταία 24 αμινοξέα τουκαρβοξυλικού άκρου της ισομορφής IGF-1Ec (τμήμα-τα των εξονίων 5 και 6) [23] με βάση την προβλεπό-μενη νουκλεοτιδική ακολουθία (cDNA) του ανθρώπι-


Oστούν 29

νου πεπτιδίου Ec [12]. Συντέθηκε από την EasternQuebec Proteomic Core Facility (Ste-Foy, Quebec,Canada), καθαρίστηκε σε ποσοστό >90% με υψηλήςαπόδοσης υγρή χρωματογραφία (HPLC) και η αμινο-ξική του αλληλουχία αναλύθηκε με φασματομετρίαμάζας και HPLC. Συγκεκριμένα, η αμινοξική ακολου-θία του συνθετικού πεπτιδίου Ε είναι: NH2-YQPP-STNKNTKSQRRKGSTFEERK-COOH και το προβλε-πόμενο μέγεθός του είναι 2.967 Da [23]. Για συνθήκεςελέγχου, κύτταρα MG-63 εκτέθηκαν σε ρυθμιστικόδιάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS). Ο αριθμός τωνζώντων κυττάρων MG-63 στις παραπάνω διαφορετι-κές κυτταροκαλλιέργειες μετρήθηκε 24 ώρες μετά,χρησιμοποιώντας μετρήσεις αποκλεισμού μέσω χρώ-σης με κυανού του τρυπανίου [19,20].

Αναστολή της έκφρασης (silencing) του υποδο-χέα της ινσουλίνης (IR) και του τύπου Ι υποδοχέατου IGF-1 (IGF-1R). Stealth siRNAs (Invitrogen Corp.,Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για την ανα-στολή της έκφρασης των υποδοχέων IR και IGF-1Rστα κύτταρα MG-63. Οι αλληλουχίες των siRNAs πουχρησιμοποιήθηκαν ήταν για τον IGF-1R: UCUUCA-AGGGCAAUUUGCUCAUUAA και για τον IR: ACA-AACUGCCCGUUGAUGACGGUGG. Ως αρνητικόςμάρτυρας χρησιμοποιήθηκε κατάλληλη αλληλουχίαsiRNA (universal negative control stealth siRNA, In-vitrogen) για τη διαμόλυνση των κυττάρων ελέγχου.Η διαμόλυνση των κυττάρων MG-63 με siRNAs πραγ-ματοποιήθηκε με τη μέθοδο της λιποφεκταμίνης (Li-pofectmine 2000, Invitrogen) σύμφωνα με το προτει-νόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως έχειπεριγραφεί αλλού [19,20]. Εν συντομία, 200 nM siRNAαφέθηκαν να αλληλεπιδράσουν με λιποφεκταμίνη για30 λεπτά και στη συνέχεια χορηγήθηκαν σε κύτταραMG-63 τα οποία καλλιεργούνταν σε πιάτα των 24 κε-λιών σε πυκνότητα 50-60% του κορεσμού μονής στοι-βάδας. Η αποτελεσματικότητα της διαμόλυνσηςελέγχθηκε 48 ώρες μετά την χορήγηση των siRNAsστα κύτταρα, όπως έχει περιγραφεί αλλού [19-20].

Απομόνωση RNA από κύτταρα MG-63 και HLE-B3. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα MG-63και HLE-B3 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TrizolReagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), σύμ-φωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το απομονω-θέν RNA διαλύονταν σε νερό κατεργασμένο με διαί-θυλο-πυροανθρακικό οξύ (DEPC Η2Ο) και η συγκέν-τρωση και καθαρότητά του προσδιορίστηκε φασματο-φωτομετρικά (Genova, Jenway, Essex, UK), με έλεγχο

της απορρόφησης στα 260 και 280 nm. Ο λόγος τηςαπορρόφησης 260:280 βρέθηκε να κυμαίνεται στο εύ-ρος του 1,8 έως 2,0. Η ποιότητα και η ακεραιότητα τουολικού RNA αξιολογήθηκαν περεταίρω με έλεγχο τουηλεκτροφορητικού προτύπου του 18S και 28S ριβο-σωματικού RNA σε πήκτωμα αγαρόζης 1%, μετά απόχρώση του με τη φθορίζουσα χρωστική βρωμιούχο αι-θίδιο και φωτογράφησή του υπό υπεριώδες φως (UV).Τα δείγματα RNA αποθηκεύονταν σε θερμοκρασία -80oC μέχρι την περαιτέρω ανάλυσή τους και τον προσ-διορισμό του ειδικού mRNA της κάθε ισομορφής τουIGF-1, σύμφωνα με τις διαδικασίες της αντίστροφηςμεταγραφής (Reverse Transcription, RT).

Ειδικότερα, το ολικό RNA μεταγράφονταν αντίστρο-φα σε cDNA μέσω της διαδικασίας της RT, χρησιμο-ποιώντας την αντίστροφη μεταγραφάση SuperScriptII (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Δύο (2) μgολικού RNA από κάθε δείγμα κυττάρων αναμιγνύοντανμε εξαμερή τυχαίας αλληλουχίας (300 ng/αντίδραση),oligo dT (200 ng/αντίδραση), 2 μl δεσοξυτριφωσφο-ρικά ριβονουκλεοτίδια (dNTPs, 0,5 mM από το καθέ-να), και DEPC-H2O σε συνολικό όγκο 12 μl, θερμαί-νονταν στους 65oC για 5 min και ακολούθως τοποθε-τούνταν σε πάγο. Στη συνέχεια, τα δείγματα αναμι-γνύονταν με 4 μl ρυθμιστικού διαλύματος της RT (FSB,Χ5), 2 μl διθειοθρεϊτόλη (DTT) (0.1 Μ), 1 μl αναστολέωνRNAασών (50 U/μl) και 1 μl SuperScript II (200 U/μl),σε συνολικό όγκο αντίδρασης 20 μl. Τα δείγματα ακο-λούθως επωάζονταν σε θερμοκρασία 45oC για 50 min,σύμφωνα με το προβλεπόμενο πρωτόκολλο. Στο τέλοςτης αντίδρασης της RT, τα δείγματα θερμαίνοντανστους 70oC για 20 min, προκειμένου να απενεργοποι-ηθεί η αντίδραση και αποθηκεύονταν στους -20oC μέ-χρι την περαιτέρω ανάλυσή τους ως προς την έκφρασητων ειδικών mRNAs του IGF-1, μέσω της διαδικασίαςτης αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής αντίδρασηςπολυμεράσης (RT-PCR).

Ημιποσοτική και ποσοτική RT-PCR. Στην παρού-σα μελέτη εφαρμόστηκε η μέθοδος της ποσοτικήςRT-PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR), γιατον έλεγχο της έκφρασης των ισομορφών του IGF-1στα κύτταρα MG-63, και της ημιποσοτικής RT-PCRγια τον έλεγχο της έκφρασής τους μετά από επίδρασητων κυττάρων με διάφορους αυξητικούς παράγοντεςκαι ορμόνες.

Ειδικότερα, στην ημιποσοτική RT-PCR το ριβοσω-ματικό RNA 18S (18S Universal, Ambion, Austin, TX,USA) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός μάρτυρας για


30 Oστούν

τη μελέτη της σχετικής έκφρασης των mRNAs τωνισομορφών του IGF-1. Οι εκκινητές του 18S αναμι-γνύονταν με ανταγωνιστές τους (competimers) σεβελτιστοποιημένη αναλογία ανάλογα με το βαθμό έκ-φρασης του κάθε ειδικού mRNA-στόχου (σύμφωναμε το προτεινόμενο πρωτόκολλο για τη σχετική RT-PCR, Ambion). Οι συνθήκες των αντιδράσεων τόσοτης RT όσο και της PCR για κάθε ειδικό mRNA τουIGF-1 κρατούνταν σταθερές για όλα τα δείγματα, μετη χρησιμοποίηση των ίδιων προαναμεμιγμένων αντι-δραστηρίων για όλα τα συγκρινόμενα δείγματα. Οισυνθήκες της PCR για κάθε ζεύγος εκκινητών (αραι-ώσεις του cDNA, μίγμα εκκινητών-ανταγωνιστών 18S,θερμοκρασία ιβριδισμού) βελτιστοποιήθηκαν και εξο-μαλύνθηκαν, έτσι ώστε για μια ορισμένη συνθήκη, ησυνενίσχυση των προϊόντων της PCR, τόσο του cDNA-στόχου όσο και του 18S, να είναι σε υψηλό βαθμόγραμμική (μετά από αναλύσεις παλινδρόμησης) σεένα ορισμένο εύρος κύκλων της PCR όταν τα προ-ϊόντα της PCR εκφράζονταν σε συνάρτηση με τοναριθμό των κύκλων. Tα ζεύγη των εκκινητών που χρη-σιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της έκφρασης των ισο-μορφών ΙGF-1Ea, ΙGF-1Eb και ΙGF-1Ec ήταν όμοια μεαυτά που έχουν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως [16].Το κάθε ζεύγος εκκινητών ήταν σχεδιασμένο να εν-τοπίζεται σε διαφορετικά εξώνια του γονιδίου του IGF-1, ώστε να αποφεύγεται η ενίσχυση γενομικού DNAκαι να ανιχνεύει μόνο μία συγκεκριμένη ισομορφή(μετάγραφο) του IGF-1. Όλοι οι εκκινητές παρασκευά-στηκαν από την Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad,CA, USA). Τα αναμενόμενα μεγέθη των ειδικών προ-ϊόντων της PCR επιβεβαιώθηκαν αρχικά με ηλεκτρο-φορητικό διαχωρισμό σε πήκτωμα αγαρόζης και, στησυνέχεια, οι ακολουθίες των cDNAs όλων των διαφο-ρετικών ισομορφών προσδιορίστηκαν με ανάλυση αλ-ληλούχισης (Sequencing), ταυτοποιώντας περαιτέρωτην διαφορική ανίχνευση του κάθε ειδικού μεταγρά-φου του IGF-1. Σε προκαταρκτικά πειράματα το κάθεζεύγος εκινητών για τα διαφορετικά μετάγραφα τουIGF-1 ελέγχθηκε επίσης για τη συμβατότητά του μετους εκκινητές του 18S Universal.

Για τη διαδικασία της ημιποσοτικής PCR, 2 μl απόκάθε προϊόν RT (cDNA) προστίθονταν σε 23 μl μίγμα-τος PCR που είχε παρασκευαστεί με 1,6 mM MgCl2,2,5 μl ρυθμιστικού διαλύματος PCR (Χ10), 0,2 mMdNTPs, 1μM από τον κάθε εκκινητή του ειδικού ζεύ-γους εκκινητών για την εκάστοτε ισομορφή του IGF-1, 0,5 μM μίγματος εκκινητή-ανταγωνιστή του 18S και

1,25 μονάδες DNA Taq πολυμεράση (InvitrogenCorp., Carlsbad, CA, USA), σε έναν συνολικό όγκο25 μl. Οι αντιδράσεις της PCR έγιναν σε θερμικό κυ-κλοποιητή PTC-200 Peltier Thermal Cycler, (MJ Re-search Inc., Waltham, MA, USA), με αρχικό στάδιοαποδιάταξης 3 min στους 95oC, 1 min υβριδισμούστους 58-60oC (ανάλογα με τους εκκινητές), 1 minεπέκτασης στους 72oC, και ενός τελικού σταδίου 3min στους 72oC. Τα περιγραφέντα στάδια αποδιάτα-ξης, υβριδισμού και επέκτασης επαναλαμβάνοντανγια 35-40 κύκλους (ανάλογα με τα αποτελέσματα τωνελέγχων γραμμικότητας για κάθε ειδικό μετάγραφοτου IGF-1 με το 18S). Οκτώ (8) μl από κάθε προϊόν τηςPCR αναμεμιγμένα με 2 μl ρυθμιστικού διαλύματος‘‘φόρτωσης’’ DNA ηλεκτροφορούνταν οριζόντια σεπήκτωμα αγαρόζης 2-2,5% (σε σταθερή τάση ηλεκτρι-κού πεδίου 80 V) για 45 έως 60 min [ανάλογα με τοδιαφορετικό βαθμό διαχωρισμό των ζωνών μεταξύτου ειδικού κάθε φορά cDNA (ισομορφής) του IGF-1και του 18S λόγω μεγέθους κάθε προϊόντος της PCR].Για τον έλεγχο του αναμενόμενου μεγέθους κάθε ει-δικού cDNA του IGF-1, στο πήκτωμα αγαρόζης ηλε-κτροφορούνταν ταυτόχρονα και δείκτες μοριακής μά-ζας με διαβάθμιση 100 ζευγών βάσεων (DNA ladder,Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Μετά την ηλε-κτροφόρηση, το πήκτωμα αγαρόζης βάφονταν μεβρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφίζονταν υπό φωτισμόUV με ψηφιακή μηχανή και ειδικό σύστημα απεικόνι-σης (Kodak Electrophoresis Documentation and Ana-lysis System 290, Carestream Health, Inc. Rochester,NY, USA). Οι απεικονισθείσες ζώνες ποσοτικοποιούν-ταν με μέτρηση της οπτικής πυκνότητάς τους (πυκνο-μετρία), χρησιμοποιώντας κατάλληλο λογισμικό(Scientific Imaging Systems, Kodak ID, New Haven,CT, USA). Ειδικότερα, μετρούνταν η πυκνότητα τηςκάθε ζώνης σε όλη την επιφάνειά της (εμβαδό) καιεξομαλύνονταν με την αντίστοιχη ζώνη του 18S. Οιπαράμετροι για την επεξεργασία της εικόνας κρατή-θηκαν σταθερές σε όλα τα πηκτώματα, χρησιμοποι-ώντας προκαθορισμένα κριτήρια κορεσμού για τηνψηφιακή κάμερα. Ο συνολικός χρόνος έκθεσης κα-θορίζονταν από το πρώτο σημείο κορεσμού στην ει-κόνα, χωριστά για το κάθε πήκτωμα. Σημειώνεται ότιη ηλεκτροφόρηση κάθε προϊόντος της PCR πραγμα-τοποιούνταν εις διπλούν, σε διαφορετικά πηκτώματα,και η μέση τιμή των δύο λαμβάνονταν ως τελική γιαπεραιτέρω ανάλυση. Επιπλέον, για να εξασφαλιστείαμερόληπτη ανάλυση, ο σχετικός ποσοτικός προσδιο-


Oστούν 31

ρισμός των προϊόντων της PCR πραγματοποιήθηκεαπό δύο ανεξάρτητους ερευνητές εν αγνοία των ερευ-νητικών υποθέσεων της μελέτης.

Για τη διαδικασία της ποσοτικής RT-PCR, κάθε αν-τίδραση RT πραγματοποιούνταν σε τελικό όγκο 20 μLκαι περιελάμβανε 2 μg RNA αναμεμιγμένο με 0,5 mMdNTPs (HT Biotechnology, Cambridge, UK), 3 μg/μlεξαμερή τυχαίας αλληλουχίας (Invitrogen Corp., Carl-sbad, CA, USA), 40 U αναστολέων RNAασών από αν-θρώπινο πλακούντα (HT Biotechnology), ρυθμιστικόδιάλυμα της RT [αποτελούμενο από τελικές συγκεν-

τρώσεις 10 mM DTT, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, και50 mM Tris-HCl; (Finnzymes, Espoo, Finland)], 200 Uαντίστροφης μεταγραφάσης (Murine Moloney Leuke-mia Virus Reverse Transcriptase, Finnzymes) και νερόκαθαρισμένο από νουκλεάσες (Qiagen, Valencia, CA,USA). Το παράγωγο cDNA ακολούθως ενισχύοντανμε qRT–PCR. Για την ανίχνευση των ισομορφών τουIGF-1 χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια ζεύγη εκκινητών πουχρησιμοποιήθηκαν στην ημιποσοτική RT-PCR, ενώ γιατον έλεγχο της έκφρασης των υποδοχέων IGF-1R καιIR στα κύτταρα MG-63 που διαμολύνθηκαν με siRNAs

Εικ. 1. Ανίχνευση της έκφρασης των ισομορφών του IGF-1 σε επίπεδο mRNA με τη χρήση ποσοτικής RT-PCR και ανάλυση της καμπύληςτήξης (melting curve) για κάθε ισομορφή (Α-Γ). Στις πειραματικές συνθήκες τις παρούσας μελέτης, η ισομορφή IGF-1Eb βρέθηκε ότι δενεκφράζεται (Β). Ως εσωτερικός αμετάβλητος μάρτυρας για όλες τις ισομορφές χρησιμοποιήθηκε η GAPDH (Δ), ενώ ως αρνητικός μάρτυραςχρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά HLE-B3 του επιθηλίου του φακού του ανθρώπινου ματιού, που έχει δειχθεί ότι δεν εκφράζει τις ισομορφέςIGF-1Eb και IGF-1Ec [24].


32 Oστούν

χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών: γιατον IGF-1R, sense 5′-ACCCGGAGTACTTCAGCGC-3′, antisense, 5′-CACAGAAGCTTCGTTGAGAA−3 καιγια τον IR sense 5′-ACTCTCAGATCCTGAAG-GAGCTGGA-3′, antisense 5′-AGTGTTGGGGA-AAGCTGCCAC-3′. Κάθε αντίδραση qRT-PCR πραγ-ματοποιούνταν σε τελικό όγκο 25 μl χρησιμοποιώντας12 μl SYBR green Supermix (Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA, USA), 0,5 μg/ml oligo dTs (Fermentas,GMBH, Germany), 2 μl cDNA, and 0.3 μM για κάθεεκκινητή. Ως εσωτερικός αμετάβλητος μάρτυρας σεόλες τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε η αφυδρογο-νάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεϋδης (GAPDH).Οι παράμετροι της qRT-PCR ήταν: 95oC για 30 sec,και ακολούθως 36 κύκλοι με το στάδιο αποδιάταξηςστους 94oC για 20 sec, υβριδισμού στους 60oC για 30sec και επέκτασης στους 72oC για 30 sec, με ένα τε-λικό στάδιο επέκτασης στους 72oC για 5 min. Η ταυ-τοποίηση το προϊόντος της PCR έγινε από την καμπύ-λη τήξης για την κάθε ισομορφή.

Στατιστική ανάλυση. Η μεταβολή του αριθμού τωνκυττάρων αξιολογήθηκε με ανάλυση διακύμανσης μο-νής κατεύθυνσης (one-way ANOVA) (SPSS v. 11 sta-tistical package, SPSS Inc. Headquarters, Chicago,USA). Tukey’s post hoc ανάλυση εφαρμόστηκε γιατην ανάδειξη σημαντικών διαφορών μεταξύ των μέ-σων τιμών. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέ-σες τιμές ± τυπικό σφάλμα του μέσου (S.E.M). Το επί-πεδο σημαντικότητας ορίσθηκε στο P<0,05, με δίπλευ-ρο έλεγχο.

Αποτελέσματα

Η ανάλυση της έκφρασης των ισομορφών του IGF-1 σε επίπεδο mRNA μέσω ποσοτικής RT-PCR έδειξεότι, υπό τις πειραματικές συνθήκες της παρούσας με-λέτης, τα κύτταρα MG-63 εκφράζουν μόνο τις ισομορ-φές IGF-1Ea και IGF-1Ec και όχι την ισομορφή IGF-1Eb (Εικόνα 1 Α-Γ).

Το διαφορικό πρότυπο έκφρασης των ισομορφώντου IGF-1 και η απουσία έκφρασης της ισομορφήςIGF-1Eb στα κύτταρα MG-63 επιβεβαιώθηκε περεταί-ρω μέσω της ανάλυσης ημιποσοτικής RT-PCR (Εικόνα2 Α-Γ). Επιπλέον, η έκθεση των κυττάρων MG-63 σεIGF-1, b-FGF, IL-6, DHT, 17β-Ε2, DEXA, ZOMETA καιEDTA δεν μετέβαλε σημαντικά (p>0.05) την έκφρασητων ισομορφών του IGF-1 (Εικόνα 2 Α-Γ). Ωστόσο, ηεπίδραση των κυττάρων με TGF-β1 αύξησε σημαντικάτα επίπεδα mRNA της ισομορφής IGF-IEa (p<0.01) και

επήγαγε, όπως και η DHΤ, την έκφραση της ισομορ-φής IGF-IEb (Εικόνα 2 Α,Β). Η mRNA έκφραση τηςισομορφής IGF-IEc δεν μεταβλήθηκε σημαντικά μετάαπό επίδραση των κυττάρων MG-63 με τους ανωτέρωπαράγοντες ή ορμόνες (Εικόνα 2 Γ).

Για τη διερεύνηση του ενδεχομένως αυτόνομουρόλου της ισομορφής IGF-1Ec στα κύτταρα MG-63,στην παρούσα μελέτη ελέγχθηκε η μιτογόνος δράσητης ινσουλίνης, του ώριμου IGF-1 και ενός συνθετικούπεπτιδίου (που σχεδιάστηκε να περιέχει τα τελευταία24 αμινοξέα της περιοχής Ε της ισομορφής IGF-1Ec)στα κύτταρα MG-63, in vitro. Τα αποτελέσματα της με-λέτης έδειξαν ότι τόσο η ινσουλίνη και ο IGF-1 όσοκαι το συνθετικό πεπτίδιο Ε επήγαγαν τον πολλαπλα-σιασμό των κυττάρων MG-63 (Εικόνα 3 Α-Γ). Προκει-μένου να ελεγχθεί περεταίρω εάν η δράση του συν-θετικού πεπτιδίου Ε διαμεσολαβείται μέσω του IGF-1R και/ή του IR, προχωρήσαμε στην αναστολή της έκ-φρασης (ΚΟ) των υποδοχέων IGF-1R και IR σε κύττα-ρα MG-63, δημιουργώντας κύτταρα MG-63 IGF-1RKO και MG-63 IR KO, αντίστοιχα. Η αποτελεσματικό-τητα της μεθοδολογίας που χρησιμοποιήθηκε για τηναναστολή της έκφρασης των ανωτέρω υποδοχέωνστα κύτταρα MG-63 επιβεβαιώθηκε μέσω qRT-PCR,όπως έχει προηγουμένως περιγραφεί [19,20]. Στηνπαρούσα μελέτη, επιτεύχθηκε αναστολή της έκφρα-σης των υποδοχέων IGF-1R και IR κατά 80% έως 90%της αντίστοιχης έκφρασης των γονικών κυττάρωνελέγχου, ή των κυττάρων που είχαν υποβληθεί σε δια-μόλυνση με siRNA αρνητικού μάρτυρα (τα αποτελέ-σματα δεν παρουσιάζονται). Βρέθηκε ότι, αν και η μι-τογόνος δράση του IGF-1 και της ινσουλίνης ανεστάληστα κύτταρα MG-63 IGF-1R KO και MG-63 IR KO αν-τίστοιχα (Εικόνα 3 Α,Β), η εξωγενής χορήγηση τουσυνθετικού πεπτιδίου Ε εξακολούθησε να επάγει τονπολλαπλασιασμό των κυττάρων MG-63 IGF-1R KO καιMG-63 IR KO (Εικόνα 3 Γ), υποδηλώνοντας ότι οι δρά-σεις του πεπτιδίου Ε στα κύτταρα MG-63 πιθανώς δενδιαμεσολαβούνται από τους υποδοχείς IGF-1R, IR ήτον υβριδικό υποδοχέα IGF-1R/IR.

Συζήτηση

Το οστεοσάρκωμα είναι ο συνηθέστερος μη-αιμα-τολογικός, πρωτοπαθής, κακοήθης όγκος των οστώνστην παιδική ηλικία και την εφηβεία. Εμφανίζεται συ-νήθως στη περιοχή της μετάφυσης των μακρώνοστών, η οποία αποτελεί την ανατομική περιοχή πουανταποκρίνεται στα αυξανόμενα επίπεδα αυξητικής


Oστούν 33

Εικ. 2. Έλεγχος της έκφρασης των ισομορφών IGF-1Ea (Α), IGF-1Eb (B) και IGF-1Ec (Γ) σε επίπεδο mRNA με τη χρήση ημιποσοτικής RT-PCR στα κύτταρα MG-63 ύστερα από επίδρασή τους με διάφορους παράγοντες ή ορμόνες. Ο TGF-β1 προκάλεσε σημαντική αύξηση τηςισομορφής IGF-ΙEa και επήγαγε, όπως και η DΗΤ, την έκφραση της ισομορφής IGF-IEb συγκριτικά με τις συνθήκες ελέγχου (control, CON).Το ριβοσωματικό RNA 18S χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός μάρτυρας για όλες τις ισομορφές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσεςτιμές ± τυπικό σφάλμα του μέσου τριών επαναληπτικών πειραμάτων (mean±SEΜ). IGF-1: Ινσουλινομιμητικός αυξητικός παράγοντας 1,ΤGF-β1: μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας β1, b-FGF: βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών, IL-6: ιντερλευκίνη 6, DHT: διϋ-δροτεστοστερόνη, 17β-Ε2: οιστραδιόλη, DEXA: δεξαμεθαζόνη, ZOMETA: ζολενδρονικό οξύ, EDTA: αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ.*: σημαντικά διαφορετικό από τις συνθήκες ελέγχου, p<0.01).


34 Oστούν

ορμόνης (GH)/IGF-1 στον ορό του αίματος (δηλ. στοπεριφερικό άκρο του μηρού και στο κεντρικό άκροτης κνήμης). Το προσδόκιμο επιβίωσης των ασθενώνμε οστεοσάρκωμα είναι φτωχό παρά την εφαρμογήτης συνδυαστικής θεραπείας χειρουργικής επέμβα-σης και χημειοθεραπείας [25]. Δεδομένου ότι η μέγι-στη επίπτωση του οστεοσαρκώματος συμπίπτει με τοαυξητικό τίναγμα της εφηβείας, το οποίο με τη σειράτου αντιστοιχεί στις κορυφαίες συγκεντρώσεις τωνεπιπέδων του IGF-1 στην κυκλοφορία, ο υποδοχέαςτου (IGF-1R) έχει καταστεί ένας προφανής στόχος στηδιερεύνηση της παθοφυσιολογίας του οστεοσαρκώ-ματος [4-7,25-28].

Οι θεραπείες με στόχο τον IGF-1R, όπως με χρήσητου μονοκλωνικού αντι-IGF-1R αντισώματος R1507,ανέστειλαν αποτελεσματικά την ανάπτυξη όγκων αν-θρώπινου οστεοσαρκώματος που μεταμοσχεύθηκανσε πειραματικά ποντίκια [29]. Ωστόσο, ενώ ορισμένοιαπό αυτούς τους όγκους αλλομοσχευμάτων ανταπο-κρίνονται στη θεραπεία, άλλοι παρουσιάζουν περιορι-σμένη ή καθόλου αναστολή της ανάπτυξής τους [30-34]. Με φάση αυτά τα ευρήματα, θα μπορούσε να υπο-τεθεί ότι ενδεχομένως άλλοι μιτογόνοι παράγοντες πέ-ρα από τον IGF-1 εμπλέκονται στη βιολογία του οστε-οσαρκώματος. Στην παρούσα μελέτη τεκμηριώθηκε ότιτο συνθετικό πεπτίδιο Ε, που αποτελεί προϊόν μετάφρα-σης της περιοχής Ε της ισομορφής IGF-1Ec, παρου-σίασε μιτογόνο δραστηριότητα στα κύτταρα MG-63 μέ-σω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου από τους υποδοχείςIGF-1R και IR. To γεγονός αυτό θα μπορούσε να εξη-γήσει γιατί ένα αντι-IGF-1R αντίσωμα δεν μπορεί να πα-ρεμποδίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων οστε-οσαρκώματος in vitro [29]. Ωστόσο, δεν μπορεί να απο-κλειστεί η πιθανότητα άλλοι αυξητικοί παράγοντες ναέχουν αυτή την ανεξάρτητη από τον IGF-1R δράση στηναύξηση των κυττάρων του οστεοσαρκώματος.

Εξάλλου, ο TGF-β1 ενίσχυσε την έκφραση της ισο-μορφής IGF-1Ea σε επίπεδο mRNA και, όπως και ηDHT, επήγαγε την έκφραση της ισομορφής IGF-1Ebστα κύτταρα MG-63, η οποία ήταν μη ανιχνεύσιμη στα

Eικ. 3. Η μιτογόνος δράση του ώριμου πεπτιδίου IGF-1, της ινσουλίνης και του συνθετικού πεπτιδίου Ε της ισομορφής IGF-1Ec μετά από 24ώρες επίδρασης στα κύτταρα MG-63, όπως αξιολογήθηκε με τη μέτρηση αριθμού κυττάρων με χρώση κυανού του τρυπανίου (trypan blueassay). Τόσο ο IGF-1 και η ινσουλίνη όσο και το συνθετικό πεπτίδιο Ε επήγαγαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MG-63. Ωστόσο, ενώστα κύτταρα στα οποία είχε ανασταλεί η έκφραση των υποδοχέων του IGF-1 (MG-63 IGF-1R ΚΟ) και της ινσουλίνης (MG-63 IR ΚΟ), ο IGF-1 (6,58 nM) (Α) και η ινσουλίνη (5,165 nM) (Β) αντίστοιχα δεν επήγαγαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, το συνθετικό πεπτίδιο E(16,85 nM) αύξησε σημαντικά των αριθμό των κυττάρων σε σύγκριση με τις συνθήκες ελέγχου (Γ). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ωςμέσες τιμές ± τυπικό σφάλμα του μέσου (mean±SEΜ) τριών επαναληπτικών πειραμάτων. *: σημαντικά μεγαλύτερο (p<0.05) από τις συν-θήκες ελέγχου (δηλ. από κύτταρα μετά από επίδρασή τους με αρνητικό μάρτυρα των stealth siRNAs).


Oστούν 35

κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουνότι η έκφραση των ισομορφών του IGF-1 φαίνεται ναείναι ορμονοεξαρτώμενη στα κύτταρα του ανθρώπι-νου οστεοσαρκώματος και θα μπορούσαν να ερμη-νεύσουν το γεγονός ότι το οστεοσάρκωμα έχει μεγα-λύτερη συχνότητα στους άντρες παρά στις γυναίκεςκατά την εφηβεία [35]. Επιπλέον, η έκφραση των ισο-μορφών του IGF-1 σε αυτά τα κύτταρα οστεοβλαστι-κού φαινότυπου ρυθμίζεται διαφορικά από άλλουςαυξητικούς παράγοντες, όπως ο TGF-β1, υποδηλώ-νοντας περεταίρω ότι πιθανώς να διαδραματίσουνέναν πολυσχιδή ρόλο σε διάφορες παθοφυσιολογικέςδιαδικασίες του οστικού μεταβολισμού [10].

Ωστόσο ένα από τα ερωτήματα που παρέμενε προςδιερεύνηση σχετικά με το ρόλο του συστήματος τουIGF-1 στη βιολογία του οστεοσαρκώματος ήταν γιατίεκφράζονται διαφορετικές ισομορφές του IGF-1 γιατην παραγωγή του ίδιου βιοδραστικού μορίου, δηλαδήτου ώριμου IGF-1. Για την περεταίρω διερεύνηση αυ-τού του ερωτήματος εξετάσαμε τις δράσεις του πε-πτιδίου Ε (που αποτελεί προϊόν μετάφρασης της πε-ριοχής Ε της ισομορφής IGF-1Ec) στα κύτταρα MG-63. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι το συνθετικό πεπτίδιοΕ επήγαγε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MG-63 κατά παρόμοιο τρόπο με αυτόν του IGF-1 και τηςινσουλίνης, υποδηλώνοντας ότι οι ισομορφές του IGF-1 ενδεχομένως να παράγουν και άλλα δραστικά μόριαπέρα από το ώριμο πεπτίδιο του IGF-1 τα οποία εμ-πλέκονται στη βιολογία του οστεοσαρκώματος.

Η βιολογική δράση του IGF-1 διαμεσολαβείται μέσωτου IGF-1R, σε μικρότερο βαθμό μέσω του IR και εν-δεχομένως μέσω των υβριδικών υποδοχέων IGF-1R/IR. Έτσι, στην παρούσα μελέτη προχωρήσαμε στην

αναστολή της έκφρασης των υποδοχέων IGF-1R καιIR. στα κύτταρα MG-63 (MG-63 IGF-1R KO και MG-63 IR KO), παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο επί-σης το σχηματισμό του υβριδικού υποδοχέα IGF-1R/IR. Η αναστολή της έκφρασης των υποδοχέωνIGF-1R και IR στα κύτταρα MG-63 είχε ως αποτέλεσματην αναστολή του διαμεσολαβούμενου από τον IGF-1R και τον IR πολλαπλασιασμού των κυττάρων MG-63 IGF-1R KO και MG-63 IR KO, αντίστοιχα. Παρ’ όλααυτά, είναι ενδιαφέρον ότι η εξωγενής χορήγηση τουσυνθετικού πεπτιδίου Ε επήγαγε τον πολλαπλασιασμότων κυττάρων IGF-1R KO and IR KO, υποδηλώνονταςότι η μιτογόνος δράση του στα κύτταρα MG-63 πιθα-νώς να διαμεσολαβείται μέσω ενός μηχανισμού ανε-ξάρτητου από τους υποδοχείς IGF-1R, IR και IGF-1R/IR. Έτσι, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν περαιτέ-ρω ότι οι ισομορφές του IGF-1 ενδεχομένως να πα-ράγουν βιοδραστικά παράγωγα πέρα από τον ώριμοIGF-1. Ωστόσο, ο πειραματικός σχεδιασμός και τα δε-δομένα της παρούσας μελέτης δεν μας επιτρέπουννα επιβεβαιώσουμε την υπόθεσή μας ότι η περιοχή Ετης ισομορφής IGF-1Ec είναι βιολογικά σταθερή καιπαράγεται σε επαρκή ποσά από τα κύτταρα MG-63ώστε να έχει ισχυρή μιτογόνο δράση σε αυτά. Παρα-μένει προς διερεύνηση εάν το πεπτίδιο Εc είναι βιο-λογικά σταθερότερο στη μορφή του προ-πεπτιδίουIGF-1Ec και εάν ενδεχομένως υφίσταται πρωτεολυτι-κό διαχωρισμό όταν πρόκειται να δράσει άμεσα στοστόχο του. Έτσι, περαιτέρω μελέτες απαιτούνται γιανα αποσαφηνίσουν τους παράγοντες που ρυθμίζουντον διαχωρισμό και την έκκριση του πεπτιδίου Ec τηςισομορφής IGF-1Ec καθώς και το μηχανισμό δράσηςτου στα κύτταρα του ανθρώπινου οστεοσαρκώματος.

AλληλογραφίαΜιχάλης Κουτσιλιέρης,

Εργαστήριο Φυσιολογίας,Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών,

Μικράς Ασίας 75, ΤΚ 115 27, Γουδή-Αθήνα E-mail: [email protected]

CorrespondenceMichael Koutsilieris,Department of Experimental Physiology, Medical School, National & Kapodistrian University of Athens,75 Micras Asias, PC 11527 Goudi-Athens, GreeceE-mail: [email protected]

Bιβλιογραφία

1. Canalis E, McCarthy T and Centrella M. Growthfactors and the regulation of bone remodeling. JClin Invest 1988; 81:277-281.

2. Burrow S, Andrulis IL, Pollak M and Bell RS. Ex-pression of insulin-like growth factor receptor,

IGF-1, and IGF-2 in primary and metastatic os-teosarcoma. J Surg Oncol 1998; 69: 21-27.

3. Belfiore A, Frasca F, Pandini G, Sciacca L andVigneri R. Insulin receptor isoforms and insulinreceptor/insulin-like growth factor receptor hy-brids in physiology and disease. Endocr Rev


36 Oστούν

2009; 30:586-623.4. Kurzrock R, Patnaik A, Aisner J, Warren T, Leong

S, Benjamin R, Eckhardt SG, Eid JE, Greig G,Habben K, McCarthy CD and Gore L. A phase Istudy of weekly r1507, a human monoclonal an-tibody insulin-like growth factor-i receptor antag-onist, in patients with advanced solid tumors.Clin Cancer Res 2010; 16:2458-2465.

5. Haluska P, Shaw HM, Batzel GN, Yin D, MolinaJR, Molife LR, Yap TA, Roberts ML, Sharma A,Gualberto A, Adjei AA and de Bono JS. Phase Idose escalation study of the anti insulin-likegrowth factor-i receptor monoclonal antibody cp-751,871 in patients with refractory solid tumors.Clin Cancer Res 2007; 13:5834-5840.

6. Tolcher AW, Mita M, Meropol NJ, von MehrenM, Patnaik A, Padavic K, Hill M, Mays T, McCoyT, Fox NL, Halpern W, Corey A and Cohen RB.Phase I pharmacokinetic and biologic correlativestudy of mapatumumab, a fully human mono-clonal antibody with agonist activity to tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligandreceptor-1. J Clin Oncol 2007; 25:1390-1395.

7. Rowinsky EK, Youssoufian H, Tonra JR, SolomonP, Burtrum D and Ludwig DL. Imc-a12, a humanigg1 monoclonal antibody to the insulin-likegrowth factor I receptor. Clin Cancer Res 2007;13:5549-5555.

8. Hill M and Goldspink G. Expression and splicingof the insulin-like growth factor gene in rodentmuscle is associated with muscle satellite (stem)cell activation following local tissue damage. JPhysiol 2003; 549:409-418.

9. Li-ling T, Yuan-liang W and Cai-Xin S. The stressreaction and its molecular events:splicing vari-ants. Biochem Biophy Res Comm 2004;320(2):287-291.

10. Okazaki R, Durham SK, Riggs BL and ConverCA. Transforming growth factor and forskolin in-crease all classes of insulin-like growth factor-1transcripts in normal and human osteoblast-likecells. Biochem Biophys Res Commun 1995;207:963-970.

11. Bloor CA, Knight RA, Kedia, RK, Spiteri MA andAllen JT. Differential mRNA expression of insulin-like growth factor-1 splice variants in patientswith idiopathic pulmonary fibrosis and pulmonarysarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med 2001;

164(2):265-272.12. Chew SL, Lavender P, Clark AJL and Ross RJM.

An alternatively spliced human IGF-I transcript(IGF-IEc) with hepatic tissue expression that di-verts away from the mitogenic IBE1 peptide. En-docrinology 1995; 136:1939-1944.

13. Sandberg-Nordqvist AC, Stahlbom PA and Rei-necke M. Characterization of insulin-like growthfactor-I in human primary brain tumors. CancerRes 1993; 53:2475-2478.

14. Shavlakadze T, Rosenthal NA, Wynn N andGrounds MD. Reconciling data from transgenicmice that over-express IGF-1 specifically in skele-tal muscle. Growth Horm IGF Res 2005; 15:4-18.

15. Cheema U, Brown R, Mudera V, Yang SY, Mc-Grouther G and Goldspink G: Mechanical signalsand IGF-I gene splicing in vitro in relation to de-velopment of skeletal muscle. J Cell Physiol2005; 202(1):67-75.

16. Philippou A, Papageorgiou E, Bogdanis G, Hala-pas A, Sourla A, Maridaki M, Pissimissis N andKoutsilieris M. Expression of IGF-1 isoforms afterexercise-induced muscle damage in humans:Characterization of the MGF E peptide actionsin vitro. In Vivo 2009; 23(4):567-575.

17. Stavropoulou A, Halapas A, Sourla A, PhilippouA, Papageorgiou E, Papalois A and KoutsilierisM. IGF-1 expression in infarcted myocardium andMGF E peptide actions in rat cardiomyocytes invitro. Mol Med 2009; 15(5-6):127-135.

18. Stavropoulou A, Philippou A, Halapas A, SourlaA, Pissimissis N, Koutsilieris M. uPA, uPAR andTGFβ1 Expression during Early and Late Post My-ocardial Infarction Period in Rat Myocardium. InVivo 2010; 24(5):647-652.

19. Milingos DS, Philippou A, Armakolas A, Papa-georgiou E, Sourla A, Protopapas A, Liapi A,Antsaklis A, Mastrominas M and Koutsilieris M.Insulin-like growth factor-1Ec (MGF) expressionin eutopic and ectopic endometrium: character-ization of the MGF E peptide actions in vitro. MolMed 2011; 17(1-2):21-28.

20. Armakolas A, Philippou A, Panteleakou Z, NezosA, Sourla A, Petraki C, Koutsilieris M. Preferentialexpression of IGF-1Ec (MGF) transcript in can-cerous tissues of human prostate: evidence fora novel and autonomous growth factor activityof MGF E peptide in human prostate cancer cells.


Oστούν 37

Prostate 2010; 70(11):1233-1242.21. Koutsilieris M, Rabbani SA, Bennett HP and

Goltzman D. Characteristics of prostate-derivedgrowth factors for cells of the osteoblast pheno-type. J Clin Invest 1987; 80:941-946.

22. Boulanger J, Reyes-Moreno C and KoutsilierisM. Mediation of glucocorticoid receptor functionby the activation of latent transforming growthfactor beta 1 in MG-63 human osteosarcomacells. Int J Cancer 1995; 61(5):692-697.

23. Philippou A, Stavropoulou A, Sourla A, Pissimis-sis N, Halapas A, Maridaki M and Koutsilieris M.Characterization of a rabbit antihuman mechanogrowth factor (MGF) polyclonal antibody againstthe last 24 amino acids of the E domain. In Vivo2008; 22:27-35.

24. Moschos MM, Armakolas A, Philippou A, Pis-simissis N, Panteleakou Z, Nezos A, KaparelouM and Koutsilieris M. Expression of the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and type I IGF recep-tor mRNAs in human HLE-B3 lens epithelial cells.In Vivo 2011; 25(2):179-184.

25. Hingorani P and Kolb EA. Past, present and fu-ture of therapies in pediatric sarcomas. FutureOncol 2010; 6:605-618.

26. Osborne R. Commercial interest waxes for igf-1blockers. Nat Biotechnol 2008; 26:719-720.

27. Kappel CC, Velez-Yanguas MC, Hirschfeld S andHelman LJ: Human osteosarcoma cell lines aredependent on insulin-like growth factor i for invitro growth. Cancer Res 1994; 54:2803-2807.

28. Sekyi-Otu A, Bell RS, Ohashi C, Pollak M and An-drulis IL. Insulin-like growth factor 1 (igf-1) recep-tors, IGF-1, and IGF-2 are expressed in primary

human sarcomas. Cancer Res 1995; 55:129-134.29. Kolb EA, Kamara D, Zhang W, Lin J, Hingorani P,

Baker L, Houghton P and Gorlick R. R1507, a fullyhuman monoclonal antibody targeting IGF-1R, iseffective alone and in combination with rapamycinin inhibiting growth of osteosarcoma xenografts.Pediatr Blood Cancer 2010; 55(1):67-75.

30. Janeway KA and Grier HE. Sequelae of osteosar-coma medical therapy: a review of rare acute tox-icities and late effects. Lancet Oncol 2010;11(7):670-678.

31. Longhi A, Errani C, De Paolis M, Mercuri M andBacci G. Primary bone osteosarcoma in the pe-diatric age: State of the art. Cancer Treat Rev2006; 32:423-436.

32. Dong J, Demarest SJ, Sereno A, Tamraz S, Lan-gley E, Doern A, Snipas T, Perron K, Joseph I,Glaser SM, Ho SN, Reff ME and Hariharan K.Combination of two insulin-like growth factor-Ireceptor inhibitory antibodies targeting distinctepitopes leads to an enhanced antitumor re-sponse. Mol Cancer Ther 2010; 9:2593-2604.

33. Kurmasheva RT, Dudkin L, Billups C, DebelenkoLV, Morton CL and Houghton PJ. The insulin-likegrowth factor-1 receptor-targeting antibody, CP-751,871, suppresses tumor-derived VEGF andsynergizes with rapamycin in models of childhoodsarcoma.Cancer Res 2009; 69(19):7662-7671.

34. Dorfman HD and Czerniak B. Bone cancers. Can-cer 1995; 75:203-210.

35. Levi N. Incidence of osteosarcoma, chondrosar-coma and Ewing’s sarcoma in east Denmark: Re-verse male to female ratio in osteosarcoma. EurJ Orthop Surg Traumatol 1998; 8:147-148.

38 Oστούν


Το σηματοδοτικό μονοπάτι ΙΚΚ-ΜΑΡΚ-ΙκΒ/ΝF-κΒ ως στόχος μηχανικής διέγερσηςοστεοβλαστικών κυττάρωνΓ. ΝΤΑΛΑΓΙΩΡΓΟΥ, Δ. ΚΑΡΑΤΖΑΣ, Χ. ΠΙΠΕΡΗ, Ε. ΜΠΑΣΔΡΑ, Α.Γ. ΠΑΠΑΒΑΣΙΛΕΊΟΥΕργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Αθηνών

Περίληψη

Η οστεοπόρωση αποτελεί την πιο συχνή μεταβολική νόσο των οστών με σοβαρές κοινωνικές και οικονομικές επιπτώσεις και υψηλάποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας. Χαρακτηρίζεται από ελάττωση της οστικής μάζας, διαταραχή της μικροαρχιτεκτονικής του οστού,μειωμένη αντοχή και αυξημένη συχνότητα καταγμάτων. Η οστική απώλεια οφείλεται σε υπερβολική δραστηριότητα των οστεοκλαστών(κύτταρα αποδόμησης του οστού) και μειωμένη δραστηριότητα των οστεοβλαστών (κύτταρα παραγωγής οστού). Η οστεοβλαστική δραστη-ριότητα μπορεί να προαχθεί με τη μηχανική διέγερση των οστεοβλαστών. Το αντικείμενο της παρούσας μελέτης ήταν ο σχεδιασμός ενόςin vitro μοντέλου μηχανοδιέγερσης οστεοβλαστών για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην οστεοπόρωση. Ταευρήματα υποδεικνύουν ότι, με την εφαρμογή μηχανικής δύναμης για 6 και 12 ώρες στα προ-οστεοβλαστικά κύτταρα, ενεργοποιείται ομεταγραφικός παράγοντας NF-κB/cRel και η πρόσδεσή του στο κυτταρικό DNA. Κάτι τέτοιο υποδεικνύει ότι ο NF-κB πιθανό να ρυθμίζειτην έκφραση οστεοειδικών γονιδίων (όπως ο Runx2) έπειτα από μηχανική διέγερση. Η εμπλοκή του φλεγμονώδους παράγοντα NF-κBστη ρύθμιση της έκφρασης οστεοειδικών γονιδίων και ο μοριακός μηχανισμός αυτής της επίδρασης ανοίγουν νέες προοπτικές για τηνκατανόηση του φαινομένου της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης –και, συνεπώς, της οστικής αναδόμησης- μετά από φυσικά ερεθίσματα,όπως αυτό του μηχανικού στρες, η δυσλειτουργία του οποίου ευθύνεται για πολλές οστικές παθοφυσιολογίες.

Λέξεις κλειδιά: Κύτταρα περιοδοντικού συνδέσμου (PDL cells), Mηχανική διέγερση, NF-κΒ, Runx2

The signalling pathway ΙΚΚ-ΜΑΡΚ-ΙκΒ/ΝF-κΒ as a targetof mechanical loading in osteoblast-like cellsG. DALAGIORGOU, D. KARATZAS, C. PIPERI, E. BASDRA, A.G. PAPAVASSILIOUDepartment of Biological Chemistry, Medical School, University of Athens

Summary

Osteoporosis is the most common metabolic bone disease with severe social and economic implications and high rates of morbidityand mortality. It is characterized by reduction of the bone mass, disruption of bone microarchitecture, decreased tolerance andincreased fracture frequency. Bone loss is due to excessive activity of osteoclasts (bone reduction cells) and reduced activity of os-teoblasts (bone production cells). Osteoblastic activity can be promoted by osteoblast mechanical stimulation. The aim of this studywas to design an in vitro osteoblast mechanotransduction model in order to investigate the molecular mechanisms implicated in os-teoporosis. The findings indicate that, under the application of mechanical force for 6 and 12 hours in pro-osteoblastic cells, theactivation of transcriptional factor NF-κB/cRel and its binding to cellular DNA become apparent, indicating that NF-κB is possible toregulate the expression of osteospecific genes (such as Runx2) after mechanical stimulation. The involvement of the inflammatoryfactor NF-κB in the regulation of osteospecific genes’ expression and the molecular mechanism underlying this relationship opensnew perspectives for understanding the physiology of osteoblastic differentiation and, consequently, of bone reconstruction afterphysical stimulation such as mechanical stress, the dysfunction of which is responsible for a number of bone pathologies.

Keywords: PerioDontal Ligament cells (PDL cells), Mechanotransduction, NF-κB, Runx2

Μηχανοδιέγερση οστεοβλαστικών κυττάρων

Oστούν 39

Εισαγωγή

Τα οστά σχηματίζονται από τον οστίτη ιστό, ένα εξει-δικευμένο συνδετικό ιστό, που αποτελείται από ασβε-στοποιημένη μεσοκυττάρια ουσία, την οστική μητρικήή θεμέλια ουσία, και πέντε διαφορετικά είδη κυττά-ρων. Αυτά περιλαμβάνουν τα οστεοπρογονικά κύττα-ρα, τους οστεοβλάστες, τα οστεοκύτταρα, τους οστε-οκλάστες και τα επενδυτικά οστικά κύτταρα (liningcells) ή οστεοβλάστες εν ηρεμία ή επιφανείας. Ταοστεοπρογονικά κύτταρα αποτελούν πολυδύναμα με-σεγχυματικά κύτταρα (stem cells) κι εντοπίζονται στιςοστικές επιφάνειες.

Οι οστεοβλάστες, οι οποίοι εντοπίζονται στις οστικέςεπιφάνειες, είναι τα αρμόδια κύτταρα για τη σύνθεσητων πρωτεϊνών της μητρικής ουσίας και την ασβεστο-ποίησή της [1]. Τα οστεοκύτταρα, τα πιο πολυάριθμακύτταρα του οστίτη ιστού βρίσκονται σε κοιλότητες (la-cunae) μέσα στην ασβεστοποιημένη μητρική ουσία,ενώ επικοινωνούν μεταξύ τους μέσω οστικών σωλη-ναρίων, χασματοσυνδέσεων, καθώς και με τις απο-φυάδες που διαθέτουν. Τα οστεοκύτταρα είναι ανε-νεργοί οστεοβλάστες που έχουν παγιδευτεί στη θεμέ-λια ουσία. Οι οστεοκλάστες προέρχονται από προγο-νικά κύτταρα του αιμοποιητικού ιστού, ενώ διαφορο-ποιούνται και ωριμάζουν σε πολυπύρηνα γιγαντοκύτ-ταρα, εντοπισμένα στα βοθρία οστικής απορρόφησης(βοθρία του Howship) με λειτουργικό ρόλο την απορ-ρόφηση του οστού, εκκρίνοντας ιόντα υδρογόνου, ταοποία διαλύουν τους κρυστάλλους καθώς και υδρο-λυτικά ένζυμα τα οποία πέπτουν τον οστίτη ιστό [1].

Τα πιο ενεργά κύτταρα του οστίτη ιστού είναι οιοστεοβλάστες και οι οστεοκλάστες, υπεύθυνοι για τηνπαραγωγή και την απορρόφηση του οστού, αντίστοιχα.Ο απώτερος πρόγονος του οστεοβλάστη είναι το πο-λυδύναμο, αρχέγονο μεσεγχυματικό κύτταρο (stemcell), που εκτός από τη μεγάλη αναγεννητική του ικα-νότητα, μπορεί εν δυνάμει να διαφοροποιηθεί προςτην κατεύθυνση άλλων κυτταρικών σειρών. Το πρώτοστάδιο στη διαφοροποίηση του αρχέγονου μεσεγχυ-ματικού κυττάρου προς τη σειρά των οστεοπαραγω-γών κυττάρων είναι το επαγώγιμο οστεοπρογονικόκύτταρο (osteoprogenitor), δηλαδή το κύτταρο πουδεν έχει ακόμα λάβει το τελικό καθοριστικό μήνυμαδιαφοροποίησης του προς οστεοβλάστη, αλλά πουυπό κατάλληλες συνθήκες, όπως κατά την επαφή τουμε μη τιτανωμένο οστό, θα ακολουθήσει αυτή την οδόδιαφοροποίησης.

Η ύπαρξη τέτοιων επαγώγιμων οστεοπρογονικών

κυττάρων πιστεύεται ότι εξηγεί την έκτοπη παραγωγήοστίτη ιστού σε εξωσκελετικούς ιστούς. Το επόμενοστάδιο διαφοροποίησης είναι ο προ-οστεοβλάστης, οοποίος είναι προκαθορισμένος να εξελιχθεί σε οστε-οβλάστη. Οι προ-οστεοβλάστες έχουν ικανότητα κυτ-ταρικής διαίρεσης, η οποία όμως μειώνεται καθώς τακύτταρα διαφοροποιούνται περαιτέρω. Οι οστεοβλά-στες δεν έχουν δυνατότητα διαίρεσης. Μικρό ποσο-στό οστεοβλαστών εγκλωβίζεται σε τιτανωμένη μητρι-κή ουσία και μετατρέπεται σε οστεοκύτταρα. Θεωρεί-ται πως πολλοί οστεοβλάστες παραμένουν ανενεργοίστις οστικές επιφάνειες ως επενδυτικά κύτταρα [2].

Σε γενετικό επίπεδο, η διαφοροποίηση των οστεο-βλαστών είναι μια διαδικασία που γίνεται βαθμιαία [3].Κατά τον κύκλο της ζωής του, ο οστεοβλάστης εκφράζειόλα τα γονίδια που είναι απαραίτητα για την παραγωγήοστίτη ιστού, αλλά όχι ταυτόχρονα. Αρχικά, εκφράζονταιγονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασια-σμό (Runx2, Osterix), καθώς και γονίδια που αφορούνστη σύνθεση πρωτεϊνών της μητρικής ουσίας (κολλα-γόνο και μη κολλαγόνες πρωτεΐνες). Ακολουθεί η έκ-φραση γονιδίων που σχετίζεται με την ωρίμανση τουοστεοειδούς και, τέλος, εκφράζονται γονίδια υπεύθυναγια την τιτάνωση (π.χ. οστεοκαλσίνη, σιαλοπρωτεΐνηοστού, αλκαλική φωσφατάση και οστεοποντίνη).

Στην κατεύθυνση αυτή, τα κύτταρα του περιοδον-τικού συνδέσμου (PerioDontal Ligament cells, PDLcells) αποτελούν κύτταρα τύπου οστεοβλάστη (πρό-δρομοι οστεοβλάστες) που είναι ικανοί να διαφορο-ποιηθούν πλήρως σε απόκριση ποικίλων εξωκυττά-ριων ερεθισμάτων και τα οποία μπορούν να συνθέ-τουν φατνιακό οστό για τη σκελετική υποστήριξη τουδοντιού. Τα PDL κύτταρα συνιστούν ένα χρήσιμο ερ-γαλείο στην έρευνα των οστών λόγω του οστεοβλα-στικού τους χαρακτήρα, αλλά και λόγω της σχετικάεύκολης εξαγωγής και απομόνωσής τους από τηνοδοντική ρίζα. Τα συγκεκριμένα κύτταρα αποκρίνονταιστην άσκηση μηχανικών δυνάμεων διαμέσου κυττα-ρικών γεγονότων όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, ηδιαφοροποίηση, ο καταβολισμός και η σύνθεση τηςθεμέλιας ουσίας. Όλες αυτές οι διαδικασίες ελέγχον-ται από τους προαναφερθέντες παράγοντες [4-7].

Ένας κομβικός ρυθμιστής της οστεοβλαστικής δια-φοροποίησης είναι ο μεταγραφικός παράγονταςRunx2, ο οποίος προσδένεται στις περιοχές των υπο-κινητών όλων των σημαντικών οστεοβλαστοειδικώνγονιδίων (οστεοκαλσίνης, κολλαγόνου τύπου Ι α3, σια-λοπρωτεΐνης οστού, αλκαλικής φωσφατάσης, οστεο-

Γ. Νταλαγιώργου και συν.

40 Oστούν

ποντίνης και κολλαγενάσης ΙΙΙ), ελέγχοντας την έκ-φρασή τους [8-10]. Έχει επίσης καταδειχθεί από με-λέτες της ομάδας μας ότι χαμηλής έντασης μηχανικήδιάταση σε ανθρώπινα οστεοβλαστικά κύτταρα (PDL)οδηγεί σε απευθείας αύξηση της έκφρασης και τηςπροσδετικής στο DNA ικανότητας του Runx2 [11]. Ηιδιότητα του μεταγραφικού παράγοντα Runx2 να απο-τελεί μόριο κεντρικής σημασίας στην μηχανοεπαγω-γική διαδικασία, προάγει την αντίληψη πως η εμβιο-μηχανική παρέμβαση θα μπορούσε να βοηθήσει στηνενδυνάμωση των οστών σε οστεοεκφυλιστικές ασθέ-νειες, χωρίς τη δημιουργία παρενεργειών σχετιζόμε-νων με φαρμακολογικές αγωγές.

O Runx2 αποτελεί ένα θεμελιώδη οστεοειδικό με-ταγραφικό παράγοντα. Είναι επίσης σημαντικός κατάτην δημιουργία του υπερτροφικού χόνδρου, ο οποίοςαποτελεί υπόστρωμα για τη δημιουργία του οστεοβλα-στικού οστού. Η έκφρασή του είναι απαραίτητη καιεπαρκής για την διαφοροποίηση των μεσεγχυματικώνκυττάρων σε οστεοβλαστικά κύτταρα. Ο Runx2 απο-τελεί μέλος της οικογένειας runx, η οποία συνιστά τρίαγονίδια, runx1, runx2 και runx3 (cbfa2, pebp2aB,AML1-3, αντίστοιχα). Και τα τρία αυτά γονίδια κωδικο-ποιούν για πρωτεΐνες που περιέχουν μια περιοχή πρόσ-δεσης στο DNA και δημιουργούν ετεροδιμερή με τονμεταγραφικό συνενεργοποιητή πυρηνικό παράγονταπρόσδεσης b (Core-binding factor b, Cbfb), επίσηςγνωστό και σαν ενισχυτή του πολυώματος-πρωτεΐνηπρόσδεσης 2b (polyomavirus enhancer binding pro-tein 2b, Pebp2b). Ο Cbfb δεν προσδένεται απευθείαςστο DNA, αλλά προάγει αλλοστερικά την ικανότηταπρόσδεσης των πρωτεϊνών Runx στο DNA και αυξάνειτο χρόνο ημίσειας ζωής τους προσφέροντας σταθε-ρότητα ενάντια στην πρωτεολυτική διάσπασή τους απότο σύστημα ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος [12].

Ο Runx2 ανακαλύφθηκε ερευνώντας οστεοειδι-κούς μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν τηνέκφραση της οστεοκαλσίνης, του μόνου γονιδίου πουεκφράζεται αποκλειστικά στους οστεοβλάστες και σεκανέναν άλλο τύπο κυττάρου που παράγει εξωκυττά-ρια θεμέλια ουσία. Ο Runx2 δρα ως βασικός ρυθμι-στής, ο οποίος προσδένεται στο οστεοβλαστοειδικόcis-στοιχείο 2 (osteoblast specific element 2, OSE2)που βρίσκεται στον υποκινητή όλων των γονιδίων πουσχετίζονται με τον οστεοβλάστη. Εκφράζεται πολύ νω-ρίς κατά την σκελετική ανάπτυξη, εμφανιζόμενος πρω-ταρχικά στα αναπτυσσόμενα μεσεγχυματικά κύτταρατων περιοχών που προσδιορίζονται να δημιουργήσουν

οστό και συνεχίζει κατά την μετ-εμβρυική ζωή, κατάτη διάρκεια των σταδίων της οστικής δημιουργίας [12].

Η σημαντικότητα του μεταγραφικού παράγονταRunx2 στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση και ωρί-μανση, μελετήθηκε και κατά την άσκηση μηχανικήςδύναμης σε προγονικά οστεοβλαστικά κύτταρα. Συγ-κεκριμένα, μηχανική διάταση σε ανθρώπινα οστεο-βλαστικά κύτταρα (PDL) οδηγεί σε απευθείας αύξησητης έκφρασης και της προσδετικής στο DNA ικανό-τητας του Runx2. Η επαγωγή αυτή ξεκινά από την κυτ-ταρική μεμβράνη μέσω των ιντεγκρινών, οι οποίεςαποτελούν τις πρωτεΐνες έναρξης του σήματος, τοοποίο διαπερνά το κυτταρόπλασμα μέσω των μονο-πατιών των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούντο μιτογόνο (Mitogen-activated protein kinasesMAPKs). Συγκεκριμένα η κινάση ρύθμισης των εξω-κυττάριων σημάτων (extracellular signal-regulated ki-nase, ERK1/2) ενεργοποιείται με τρόπο χρονικά εξαρ-τώμενο και παράλληλο με την αύξηση της προσδετι-κής στο DNA ικανότητας του Runx2. Η φωσφορυλιω-μένη πλέον ΕRK1/2 ενεργοποιεί τον παράγονταRunx2 στον πυρήνα, ο οποίος επάγει την οστεοβλα-στική διαφοροποίηση [11].

Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB (Nuclear Fac-tor-κΒ) που σχετίζεται με τη διαδικασία της φλεγμονής,φαίνεται να επάγεται κατά τη διάρκεια της ανακατα-σκευής του οστού και να προωθεί το σχηματισμό τωνοστεοκλαστών (μέσω του μονοπατιού RANK-RANKL),διεγείροντας όλες τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις, αλ-λά, πιθανά, και την οστεοβλαστική διαφοροποίηση με-τά από την επίδραση μηχανικής διέγερσης. Κατά γε-νική ομολογία, ο NF-κΒ συμμετέχει στη ρύθμιση γο-νιδίων που έχουν κυρίως στόχο την ανοσοδιέγερση[13]. Διάφοροι παράγοντες όπως κυτταροκίνες, λιπο-πολυσακχαρίτες (LPS), υπεριώδης ακτινοβολία (Ul-traviolet, U.V.), αυξητικοί παράγοντες, ιοί, μηχανικόστρες κ.ά., μπορούν να αποτελέσουν σήματα για τηνενεργοποίηση του NF-κΒ [14].

Ο NF-κΒ δεν είναι μία μοναδική πρωτεΐνη. Στον άν-θρωπο 5 μέλη της οικογένειας των NF-κΒ/Rel πρω-τεϊνών έχουν ταυτοποιηθεί. Αυτές είναι οι εξής: c-Rel,NF-κΒ1 (p50/p105), NF-κΒ (p52/p100), RelA (p65) καιη RelB [14]. Είναι γνωστό, ότι ο NF-κΒ δεν παράγεταικατά τη διάρκεια μιας ανοσολογικής απόκρισης ή κά-ποιου βαθμού ενεργοποίησης του κυττάρου, αλλάπροϋπάρχει στο κυτταρόπλασμα ανενεργός. Υπό κα-νονικές συνθήκες, τα διμερή του NF-κB εντοπίζονταικαθηλωμένα στο κυτταρόπλασμα με την δράση των


Oστούν 41

ανασταλτικών πρωτεϊνών IκB (IκBα, IκBβ και IκBε).Μετά την επίδραση κάποιου ερεθίσματος, οι ανα-

στολείς αυτοί φωσφορυλιώνονται και οδηγούνται σεπρωτεολυτική αποδόμηση – η διαδικασία εξαρτάταιαπό το σύμπλοκο των ΙκΒ κινασών (ΙΚΚ) και το μονο-πάτι ουβικιτίνης/πρωτεασώματος. Η απομάκρυνσητων αναστολέων μέσω της ουβικιτινυλίωσης οδηγείστην ενεργοποίηση και μετατόπιση των διμερών τουNF-κB στον πυρήνα, όπου αναγνωρίζουν θέσεις δέ-σμευσης πάνω στην αλληλουχία του DNA (κΒ sites)και επάγουν την έκφραση των γονιδίων-στόχων πουρυθμίζουν την σύμφυτη και την προσαρμοστική ανο-σία, τη φλεγμονή, την αύξηση και την επιβίωση τωνκυττάρων [15-17].

Μέχρι στιγμής υπάρχουν ενδείξεις ότι ο NF-κBενεργοποιείται και μετατοπίζεται στον πυρήνα τουοστεοβλαστικού κυττάρου μετά από μηχανικό ερέθι-σμα [18,19]. Κατ’ επέκταση, υπάρχουν ισχυρές πιθα-νότητες να επάγει και την έκφραση του οστεοειδικούγονιδίου runx2.

O στόχος του ερευνητικού αυτού έργου περιλαμ-βάνει την διερεύνηση και ταυτοποίηση των πιθανώνθέσεων πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ στον υποκινητή του οστεοειδικού γονιδίου runx2έπειτα από μηχανική διέγερση. Τα δεδομένα που προ-κύπτουν από αυτή την ερευνητική εργασία, σκοπόέχουν να βοηθήσουν στην αποκωδικοποίηση της λει-τουργίας και ρύθμισης της οστικής ανακατασκευήςκαι να θέσουν νέα δεδομένα στη θεραπευτική στρα-τηγική πολλών οστεοεκφυλιστκών ασθενειών.

Υλικά και μέθοδοι

Απομόνωση και καλλιέργεια κυττάρων του περιοδον-τικού συνδέσμου (PDL)

Τα PDL κύτταρα απομονώθηκαν από ιστούς τουπεριοδοντικού συνδέσμου οι οποίοι εξήχθησαν απότη ρίζα υγειών δοντιών από δότες ηλικίας μεταξύ 20και 30 χρονών για λόγους ορθοδοντικής θεραπείας.

Η απομόνωση πραγματοποιήθηκε με απόξεση τωνυπολειμμάτων του περιοδοντικού ιστού και τοποθέτη-ση τους σε τρυβλία με την προσθήκη 5 ml θρεπτικούυλικού Dulbecco’s Modified Eagle στο οποίο προστέ-θηκε ορός FBS (10%), μη βασικά αμινοξέα και αντι-βιοτικά (1% πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη). Τα ανθρώ-πινα κύτταρα συνεχίστηκε να καλλιεργούνται στο ίδιοθρεπτικό υλικό και μετά την πάροδο περίπου δυοεβδομάδων και ενδιάμεσες αλλαγές σε θρεπτικό υλι-κό παρατηρήθηκε ανάπτυξη ινοβλαστών περιοδοντι-

κής μεμβράνης (PDL) στις περιφέρειες των υπολειμ-μάτων του περιοδοντικού ιστού. Η διαδικασία αυτήσυνεχίστηκε και κύτταρα μεταξύ του 5ου και 8ου σταδί-ου ζωής χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα της μη-χανικής διέγερσης. Οι καλλιέργειες συντηρούντανστους 37οC σε υγρή ατμόσφαιρα με 5%CO2.

Εφαρμογή μηχανικής δύναμης στα κύτταρα του περιοδοντικού συνδέσμου

Τα PDL καλλιεργήθηκαν σε ειδικά καλλιεργητικάτριβλία Lumox Dish σε αναλογία 1:4. Όλα τα πειράματαπραγματοποιήθηκαν με κύτταρα μεταξύ του 5 και του8 σταδίου ζωής (passage) αφού είχε πρώτα επιβεβαι-ωθεί ο οστεοβλαστικός τους χαρακτήρας. Μετά από24 ώρες οι καλλιέργειες των hPDL κυττάρων υπέστη-σαν μια διαρκή τάση (stretching) με τη χρήση εδικήςσυσκευής. Η βάση των ειδικών αυτών τριβλίων απο-τελείται από μια ελαστική, υδρόφιλη και διαπερατή απόαέρια μεμβράνη πολυτετραφθοροαιθυλενίου, η οποίαμπορεί να υποστεί ομοιόμορφη τάση όταν τοποθετείταιεπάνω σε μια σφαιροειδή κυρτή επιφάνεια από πλε-ξιγκλάς [20-23]. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε γιατέσσερις διαφορετικές χρονικές περιόδους των 6, 12,24 και 48 ωρών. Ταυτόχρονα επωάστηκαν καλλιέργει-ες με κύτταρα τα οποία δεν υπέστησαν τάση (unstret-ched) σαν μάρτυρες (control).

Χρώση με αλκαλική φωσφατάση στα κύτταρα του περιοδοντικού συνδέσμου και με τη μέθοδο VonKossa ως ένδειξη επιμετάλλωσης

Η χρώση με αλκαλική φωσφατάση χρησιμοποιείταιγια επιβεβαίωση του οστεοβλαστικού χαρακτήρα τωνκυττάρων του περιοδοντικού συνδέσμου. H χρώσηεπιτεύχθηκε με το kit ανίχνευσης της Αλκαλικής φω-σφατάσης (Αlkaline Phosphatase Detection Kit-Milli-pore). Προκειμένου να ανιχνεύσουμε τις αποτιτανώ-σεις που δημιουργούν τα κύτταρα του περιοδοντικούσυνδέσμου, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο Von Kossa.

Απομόνωση κυτοσολικού περιεχομένου

Η απομόνωση του κυτοσολικού και πυρηνικού πε-ριεχομένου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον Sch-reiber [24,25]. Για τον υπολογισμό της ποσότητας τουκυτοσολικού και πυρηνικού περιεχομένου των κυττά-ρων του περιοδοντικού συνδέσμου χρησιμοποιήθηκεη υπολογιστική μέθοδος Bradford.


42 Oστούν

Αναγνώριση των θέσεων πρόσδεσης του NF-κB στονυποκινητή του γονιδίου Runx2

Η ύπαρξη των θέσεων πρόσδεσης του NF-κB έχειδιερευνηθεί με τη χρήση του αναλυτικού λογισμικούGenomatix-sequence analysis software (GenomatixSoftware GmbH 1998-2008) το οποίο βρίσκεται δια-θέσιμο στο διαδίκτυο (http://www.genomatix.de/pro-ducts/index.html).

Οι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες που χρησιμο-ποιήθηκαν ως διερευνητές είναι οι εξής:

Η αλληλουχία του NF-κB/c-Rel (wild-type), 5’-gag-caagggggaaaagccacagtggtaggc-3’ (κορυφαίος κλώ-νος), η οποία προέρχεται από την περιοχή -131 έως -119 του υποκινητή του ανθρώπινου γονιδίου runx2 καιπεριέχει το μοτίβο gggaaaagccaca του NF-κB/c-Rel.

Η αλληλουχία που περιέχει το δεύτερο NF-κB/c-Rel μοτίβο 5-tggatgccaggaaaggccttaccacaagcc-3 (-189…-177) και η τρίτη νουκλεοτιδική αλληλουχία πουπεριέχει το τρίτο NF-κB/c-Rel μοτίβο 5-gagtagaaag-gaaagccctaactgcagag-3 (-324…-312) ανάμεσα στηναλληλουχία του υποκινητή του Runx2 γονιδίου.

Επιβεβαίωση της πυρηνικής μετατόπισης του μετα-γραφικού παράγοντα NF-κB/c-Rel

H επιβεβαίωση της πυρηνικής μετατόπισης του μετα-γραφικού παράγοντα πραγματοποιήθηκε με την τεχνικήτου ανoσοστυπώματος κατά Western [26]. Μετά τον ηλε-κτροφορητικό διαχωρισμό των πρωτεϊνών με την SDS-PAGE ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά αυτών (transfer)από το πήγμα διαχωρισμού σε μεμβράνη απλής νιτρικήςκυτταρίνης. Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για τηνανίχνευση του μεταγραφικού παράγοντα c-Rel/NFkBήταν το c-Rel sc-71 και η αραίωση ήταν 1/200. Το ειδικόαντίσωμα για την ανίχνευση της ακτίνης ήταν το sc-6895,goat anti-mouse monoclonal, σε αραίωση 1/200.

Ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης του NF-κB στονυποκινητή του γονιδίου runx2

Η προσδετική ικανότητα του NF-κB υπολογίστηκεμε ανάλυση της μετατόπισης της ηλεκτροφορητικήςκινητικότητας χρησιμοποιώντας την παρακάτω μέθο-δο Electrophoretic Mobility Shift Assay Kit, EMSA,PIERCE Biotechnology.

Επίσης, σημάναμε με βιοτίνη στο 3’ άκρο το τμήματου DNA που αντιστοιχεί στη θέση δέσμευσης του υπόμελέτη μεταγραφικού παράγοντα (π.χ. ΝF-κΒ) ακο-λουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, Biotin 3’End DNA Labeling Kit, PIERCE Biotechnology.

Ποσοτικοποίηση και εκτίμηση των αποτελεσμάτων

H ποσοτικοποίηση και η ανάλυση των αποτελεσμά-των μας, πραγματοποιήθηκε με το υπολογιστικό πρό-γραμμα Adobe Photoshop CS2.

Aποτελέσματα

Επιβεβαίωση οστεοβλαστικού χαρακτήρα των κυττάρωνμε τη μέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) καιεπιβεβαίωση του φαινομένου της επιμετάλλωσης (mineralization)

Το οστεογενετικό δυναμικό των συγκεκριμένωνκυττάρων χαρακτηρίζεται και από τα επίπεδα της αλ-καλικής φωσφατάσης. Στα κύτταρα του περιοδοντικούσυνδέσμου η δραστηριότητα της αλκαλικής φωσφα-

Εικ. 1. A. Χρώση των PDL κυττάρων με ALP. B. Χρώση Von Kossaσε κύτταρα PDL μετά από 3 εβδομάδες καλλιέργειας.


Oστούν 43

τάσης εντοπίστηκε έπειτα από 5 ημέρες καλλιέργειας.Στην παρακάτω εικόνα εμφανίζεται η ισχυρή χρώσητης αλκαλικής φωσφατάσης με τη διαδικασία που προ-αναφέρθηκε. Παρατηρείται χρώση σε ποσοστό κυτ-τάρων άνω του 85% (Εικόνα 1Α).

Ένα ακόμα χαρακτηριστικό των κυττάρων του περιο-δοντικού συνδέσμου, είναι και η ικανότητά τους να δημι-ουργούν οζίδια επιμετάλλωσης (mineralization nodules).Στα συγκεκριμένα κύτταρα της μελέτης μας εμφανίστη-καν περιοχές εναπόθεσης μετάλλων έπειτα από καλλιέρ-γεια 3 εβδομάδων. Μετά την ακόλουθη χρώση με VonKossa, αυτές οι εναποθέσεις μετάλλων ήταν ορατές σανάμορφα καφέ-μαύρα ιζήματα (Εικόνα 1Β). Τα ιζήματααυτά διακρίνονταν σε περιοχές με μεγάλη συγκέντρωσηκυττάρων και εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας.

Ανοσοαποτύπωση κατά Western της πρωτεΐνης NF-κB/c-Rel

Η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κBδιερευνήθηκε με τις μεθόδους της ηλεκτροφόρησης,

ανοσοαποτύπωσης κατά Western. Με τoν ίδιο τρόπο,ανιχνεύτηκε και η έκφραση της πρωτεΐνης ακτίνης σταπειραματικά δείγματα, η οποία χρησιμοποιήθηκε προ-κειμένου να ποσοτικοποιηθούν τα ευρήματα. Στις Ει-κόνες 2Α και 2Β παρουσιάζονται οι ζώνες αμαύρωσηςπου εμφανίστηκαν στο φωτογραφικό film κατά τηνECL, οι οποίες αντιστοιχούν στον c-Rel, αφού η προ-κείμενη μεμβράνη είχε επωασθεί με αντίσωμα ειδικόγια τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη.

Στην Εικόνα 2Α παρουσιάζεται η επαγωγή του δι-μερούς συμπλόκου cRel/p65 σε PDL κύτταρα πουέχουν υποστεί τάση. Η ανάλυση των πυρηνικών καικυτταρικών εκχυλισμάτων έδειξε μια αύξηση στην έκ-φραση των επιπέδων της p65, σε συμφωνία με τηδιάρκεια της εφαρμογής του μηχανικού ερεθίσματος.Παρατηρήθηκε επίσης, αύξηση των επιπέδων του c-Rel στις 6 και στις 12 ώρες σε μηχανικής διέγερσηςσε ολικά εκχυλίσματα. Στις 24 ώρες η ζώνη του c-Relφθάνει στα μικρότερα επίπεδα ανίχνευσης της ανο-σοανάλυσης. Ταυτόχρονα εξετάστηκε και η ενεργο-ποίηση του c-Rel έπειτα από μηχανική διέγερση σε

Εικ. 2. Α. Ανοσοαποτύπωση της μηχανικής διέγερσης των κυττάρων του περιοδοντικού συνδέσμου για 6, 12 και 24 ώρες. Β. Ανοσοαπο-τύπωση κατά Western με χρήση αντισωμάτων έναντι της πρωτεΐνης NFκB/c-Rel σε δείγματα κυττάρων μαρτύρων (unstretched) και κυττάρωνπου έχουν υποστεί μηχανική διέγερση για 6, 12, 24 και 48 ώρες. Β. Έκφραση της πρωτεΐνης ακτίνης στα ίδια δείγματα.


44 Oστούν

κυτταροπλασματικό εκχύλισμα των PDL κυττάρων σανεπιβεβαίωση του παραπάνω πειράματος (Εικόνα 2Β).

Με την εφαρμογή μηχανικής δύναμης γίνεται εμ-φανής η ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγονταNF-κB/cRel και η μετατόπισή του στον πυρήνα. Στηνεικόνα φαίνεται η μείωση στην ποσότητα της κυττα-ροπλασματικής πρωτεΐνης c-Rel (75kD) 6 και 12 ώρεςεφαρμογής μηχανικής τάσης με την τεχνική Westernblot. To αποτέλεσμα ενισχύει την πιθανότητα μετατό-πισης της πρωτεΐνης στον πυρήνα, γεγονός που επι-βεβαιώνεται στα επόμενα αποτελέσματα.

Μέθοδος μετατόπισης της ηλεκτροφορητικής κινητι-κότητας της πρωτεΐνης NF-κB/c-Rel

Στην Εικόνα 3, ανθρώπινα κύτταρα περιοδοντικούσυνδέσμου διεγέρθηκαν μηχανικά για 6, 12, 24, 48ώρες. Κύτταρα που δεν υπέστησαν μηχανική διέγερσηχρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες της ενεργο-ποίησης του NF-κΒ. Η ένταση των επαρμάτων στοφιλμ της αυτοραδιογραφίας υπολογίστηκε με ειδικό

πρόγραμμα ποσοτικοποίησης για τη σύγκριση της επα-γωγής μεταξύ των διαφορετικών τρόπων διέγερσης.Η πυρηνική μετατόπιση του μεταγραφικού παράγονταc-Rel επιβεβαιώνεται και κατά την απομόνωση κυτο-πλασματικών πρωτεϊνών, στις οποίες φαίνεται το αν-τίστροφο αποτέλεσμα με την δοκιμασία αλλαγής τηςηλεκτροφορητικής κινητικότητας.

Η σύγκριση αυτή έδειξε ότι η άσκηση μηχανικήςδύναμης ενεργοποιεί τη μετανάστευση του NF-κΒ απότο κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και την επακόλουθηδέσμευσή του στην αλληλουχία του DNA που αναγνω-ρίζει. Η ενεργοποίηση του NF-κΒ έπειτα από μηχανικήδιέγερση 6 ωρών είναι περίπου 65% μεγαλύτερη απότην απουσία μηχανικής διέγερσης. Μετά το πέρας των6 ωρών, η επαγωγή του NF-κB επανέρχεται σταδιακάστα επίπεδα των μαρτύρων. Η ειδικότητα της δέσμευ-σης του NF-κΒ στην αλληλουχία DNA που αναγνωρίζειμελετήθηκε όπως έχει προηγουμένως περιγραφεί.Για την επιβεβαίωση της ειδικότητας της αντίδρασηςπραγματοποιήθηκε ανταγωνιστική αντίδραση με μησημασμένο και μη ειδικό ανιχνευτή. Τα αποτελέσματα

Εικ. 3. Η εφαρμογή μηχανικής τάσης στα hPDL κύτταρα επάγει την προσδετική ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα c-Rel (υπομονάδατου NF-κB) στο DNA. Η μηχανική τάση εφαρμόστηκε στα PDL κύτταρα στις ενδεικνυόμενες χρονικές στιγμές. Απομονώθηκαν τα πυρηνικάεκχυλίσματα, από τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ίσες ποσότητες (10 μg) στις οποίες αναλύθηκε η προσδετική στο DNA δραστηριότητα τουΝF-κB/c-rel με την τεχνική της EMSA, χρησιμοποιώντας μια βιοτινιλυομένη αλληλουχία που περιέχει την ανθρώπινη c-rel αλληλουχία ωςανιχνευτή. Η στήλη 0 αναφέρεται σε κύτταρα που δεν έχουν υποστεί τάση αλλά έχουν καλλιεργηθεί υπό τις ίδιες συνθήκες με τα κύτταραπου έχουν υποστεί τάση για το μέγιστο της εφαρμογής (48 ώρες).


Oστούν 45

φαίνονται στην Εικόνα 4. Τέλος, στην Εικόνα 5 φαί-νεται το πείραμα υπερμετατόπισης (supershift) τηςEMSA που πραγματοποιήθηκε με πυρηνικά εκχυλί-σματα hPDL κυττάρων που έχουν υποστεί τάση για 6ώρες και στα οποία έχει προστεθεί αντι-c-Rel και αν-τι-Sp1 αντίσωμα (στήλες 2-6).

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε ευρήματασύμφωνα με τα οποία ο βασικός ρυθμιστής της διαδι-κασίας της φλεγμονής, ο NF-κB, αποτελεί μόριο κλειδίτης μηχανικής διέγερσης σε hPDL-οστεοβλαστικά κύτ-ταρα. Τα κύτταρα αυτά είναι διαρκώς εκτεθειμένα σεμηχανικές πιέσεις στο φυσικό τους περιβάλλον καιμπορούν να διαφοροποιηθούν, με σκοπό να συμμε-τάσχουν ενεργά στην αποκατάσταση του περιοδοντι-κού συνδέσμου (PDL) και την ανάπλαση του περιβάλ-λοντος οστού. Δείξαμε ότι από ένα φυσικό σήμα όπωςη άσκηση μηχανικής διέγερσης, παρατηρείται μετατό-

πιση του NF-κB στον πυρήνα που συνοδεύεται και απόαύξηση της ικανότητας πρόσδεσής του στο DNA-στόχοτου (τον υποκινητή του γονιδίου Runx2). Τα πειράματαμας επιβεβαίωσαν καταρχήν την πυρηνική αυτή μετα-τόπιση του NF-κB έπειτα από μηχανική διέγερση αλλάεπιπλέον και τη χρονική σύμπτωση της επαγωγής τουπαράγοντα αυτού με τον Runx2. Πράγματι ο NF-κBαλλά και ο Runx2 επάγονται στις 6 ώρες της άσκησηςμηχανικής δύναμης, και στη συνέχεια επανέρχονταιστα φυσιολογικά επίπεδα των μαρτύρων.

Η επαγωγή αυτή του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB μετά από μηχανική διέγερση επιβάλλει τη διερεύ-νηση του σηματοδοτικού μονοπατιού μέσω του οποίουπραγματοποιήθηκε αυτή η επαγωγή. Ωστόσο η ενερ-γοποίηση του NF-κΒ έπειτα από μηχανική διέγερσηδεν έχει διερευνηθεί εκτενώς και άρα το ποσοστόεπιρροής των κινασών και των μεμβρανικών καναλιώνείναι άγνωστο μέχρι στιγμής.

Η οστεοπόρωση, η πιο κοινή ασθένεια των οστών

Εικ. 4. Πείραμα ανταγωνιστικής δραστηριότητας με την παρουσία 10, 25 και 50 φορές μεγαλύτερη συγκέντρωση μη σημασμένου c-Relανιχνευτή (στήλες 3-5) και πυρηνικά εκχυλίσματα από hPDL κύτταρα που έχουν υποστεί τάση για 48 ώρες. Στις στήλες 6-8 έχει χρησιμο-ποιηθεί μη σημασμένος ανιχνευτής της πρωτεΐνης EBNA με 10, 25 και 50 φορές μεγαλύτερη συγκέντρωση καθώς και πυρηνικά εκχυλίσματαhPDL κυττάρων που έχουν υποστεί τάση για 48 ώρες. Η στήλη 1 και 9 περιέχουν ελεύθερο DNA ανιχνευτή.


46 Oστούν

έχει σαν αποτέλεσμα την παρέκκλιση της μηχανομετα-γωγής μεταξύ οστεοβλαστών και οστεοκλαστών και ηκλινική εικόνα περιλαμβάνει μείωση της οστικής πυ-κνότητας, λέπτυνση του οστικού ιστού και αυξημένηευαισθησία στα κατάγματα. Ανάλογη οστική απώλειαείναι δυνατό να προκαλείται από μείωση μηχανικούφορτίου λόγω παρατεταμένης ανάπαυσης ή λόγω έκ-θεσης σε μικροβαρύτητα. Σήμερα, η φαρμακολογικήθεραπεία της οστεοπόρωσης περιλαμβάνει τη χορή-

γηση διφωσφωνικών, επιλεγμένους τροποποιητές τωνυποδοχέων των οιστρογόνων, καλσιτονίνης και ανάλο-γα της παραθυρεοειδούς ορμόνης. Η οστική απώλειασε αυτή την κατάσταση μπορεί να μειωθεί ή να ανα-τραπεί με τη μηχανική διέγερση των οστεοβλαστών.Επιπρόσθετα, η φυσική άσκηση μπορεί να εμποδίσειτη μείωση της οστικής πυκνότητας κατά την περίοδομετά την εμμηνόπαυση ή κατά τη γήρανση [28].

Η στρατηγικές εφαρμογής της μηχανοδιέγερσηςστους οστεοβλάστες αποδεικνύονται ωφέλιμες καιστην επούλωση των οστικών καταγμάτων. Τα αποτε-λέσματα της άσκησης φορτίου εξαρτώνται σημαντικάαπό τον ρυθμό, τον τρόπο και το μέγεθος του φορτίου,καθώς επίσης και από το μέγεθος του χάσματος τουκατάγματος. Οι οστεοβλάστες και τα οστεοκύτταρααποκρίνονται διαφορετικά στα ποικίλα μηχανικά πε-ριβάλλοντα και συνεπώς, η άκαμπτη μονιμοποίησητων καταγμάτων συνεπάγεται στην άμεση οστική κα-τασκευή και την οστική γεφύρωση του χάσματος τουκατάγματος, ενώ η εύκαμπτη μονιμοποίηση μπορεί νασυνεπάγεται σε έμμεση επούλωση που χαρακτηρίζε-ται από τη δημιουργία περιοστεϊκών όζων και ενδο-χόνδρινη οστική κατασκευή. Η εφαρμογή κυκλικώνσυμπιεστικών μετατοπίσεων είναι δυνατό να ενδυνα-μώνει την επούλωση μέσω αυξημένης κατασκευήςόζων και γρηγορότερης οστεοποίησης.

Όμως, η περιπλοκότητα των μηχανισμών για τηνοστεοβλαστική διαφοροποίηση και τις αλληλεπιδρά-σεις με τα οστεοκύτταρα και τους οστεοκλάστες, υπο-δεικνύουν και την ανολοκλήρωτη αποκωδικοποίησητων σηματοδοτικών μονοπατιών. Συνεπώς, υπάρχειπληθώρα μορίων των οποίων η δράση πρέπει να ταυ-τοποιηθεί και να ερμηνευτεί. Οι μηχανισμοί με τουςοποίους τα οστεοκύτταρα αισθάνονται τα διαφορετικάχαρακτηριστικά του μηχανικού ερεθίσματος και τα με-ταβιβάζουν στους οστεοβλάστες παραμένουν άγνω-στοι, όπως και οι μηχανισμοί με τους οποίους οι οστε-οβλάστες συντονίζουν την ενεργοποίηση συγκεκρι-μένων σηματοδοτικών μονοπατιών. Για το λόγο αυτόαπαιτείται περαιτέρω διερεύνηση της μοριακής βάσηςτης μηχανομεταγωγής στη φυσιολογία του οστού ώστενα εκτιμηθεί η θεραπευτική στρατηγική που πρέπει ναακολουθηθεί και να αποφευχθούν οι τυχόν παρενέρ-γειες που παρουσιάζονται με τη χρήση των φαρμα-κευτικών σκευασμάτων.

Εικ. 5. Υπερμετατόπιση (supershift) της EMSA που πραγματοποι-ήθηκε με πυρηνικά εκχυλίσματα hPDL κυττάρων που έχουν υποστείτάση για 6 ώρες και στα οποία έχει προστεθεί αντι-c-Rel και αντι-Sp1αντίσωμα (στήλες 2-6). Το σύμπλοκο πρωτεΐνης-αντισώματος-ανιχνευτή (στήλη 3, 5) προέρχεται από την επώαση του πυρηνικούεκχυλίσματος και του αντισώματος c-Rel (1) και Sp-1 αντίστοιχα καιτην έπειτα προσθήκη του ανιχνευτή ενώ στις στήλες 4 και 6 έχειεπωαστεί πρώτα το σύμπλοκο πυρηνικού εκχυλίσματος-ανιχνευτήκαι έπειτα προστέθηκε το αντίσωμα c-Rel (2) και Sp-1.


Oστούν 47


1. Junqueira CL, Carneiro J, Kelley RO (1991). BasicHistology, 6th Edition, (Greek Translation byPaschalidis Publishing Company), pp 186-205.

2. Goltzman D (2002). Discoveries, Drugs andSkeletal Disorders. Nature 1:784-796.

3. Ducy P, Karsenty G (1998). Genetic Control ofCell Differentiation in the Skeleton. Curr Opin CellBiol 10:614-619.

4. Chiba M, Komatsu K (1993). Mechanical re-sponses of the periodontal ligament in the trans-verse section of the rat mandibular incisor at var-ious velocities of loading in vitro. J Biomech26:561-570.

5. McCulloch CA, Lekic P, McKee MD (2000). Roleof physical forces in regulating the form and func-tion of the periodontal ligament. Periodontology24:56-72.

6. Saito M, Saito S, Ngan PW, Shanfeld J, Davi-dovitch Z (1991). Interleukin 1 beta andprostaglandin E are involved in the response ofperiodontal cells to mechanical stress in vivo andin vitro. Am J Orthodont Dentofac Orthoped99:226-240.

7. Shimizu N, Yamaguchi M, Goseki T, Ozawa Y,Saito K, Takiguchi H, Iwasawa T, Abiko Y (1994).Cyclic-tension force stimulates interleukin-1β pro-duction by human periodontal ligament cells, JPeriodont Res 29:328-333.

8. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL, KarsentyG (1997). Osf2/Cbfa1: a transcriptional activatorof osteoblast differentiation. Cell 89:747-754.

9. Harada H, Tagashira S, Fujiwara M, Ogawa S,Katsumata T, Yamaguchi A, Komori T, NakatsukaM (1999). Cbfa1 isoforms exert functional differ-ences in osteoblast differentiation. J Biol Chem274:6972-6978.

10. Jimenez MJ, Balbin M, Lopez JM, Alvarez J, Ko-mori T, Lopez-Otin C (1999). Collagenase 3 is atarget of Cbfa1, a transcription factor of the runt

gene family involved in bone formation, Mol CellBiol 19:4431-4442.

11. Ziros PG, Gil APR, Georgakopoulos T, HabeosI, Kletsas D, Basdra EK, Athanasios G. Papavas-siliou AG (2002). The Bone-specific Transcrip-tional Regulator Cbfa1 Is a Target of MechanicalSignals in Osteoblastic Cells. J Biol Chem277:23934-23941.

12. Ziros PG, Basdra EK, Papavassiliou AG (2008).Runx2: of bone and stretch. Int J Biochem CellBiol 40:1659-1663.

13. Naumann M (2000). Nuclear factor-kappa B ac-tivation and innate immune response in microbialpathogen infection. Biochem Pharmacol60:1109-1114.

14. Ghosh S, May MJ, Kopp E (1998). NF-kB and Relproteins: evolutionary conserved mediators of im-mune responses. Ann Rev Immunol 16:225-260.

15. Papa S, Zazzeroni F, Pham CG, Bubici C, Fran-zoso G (2004). Linking JNK signalling to NF-kB:a key to survival. J Cell Sci 117:5197-5208.

16. Ghosh S, Karin M (2002). Missing pieces in theNF-kappaB puzzle. Cell 109:S81-S96.

17. Karin M and Lin A (2002). NF-κB at the cross-roads of life and death. Nat Immunol 3:221-227.

18. Agarwal S, Long P, Seyedain A, Piesco N, ShreeA, Gassner R (2003). A central role for nuclearfactor-kB pathway in the anti-inflammatory andpro-inflammatory actions of mechanical strain,FASEB J 17:899-901.

19. Liu J, Zou L, Zheng Y, Zhao Z, Li Y, Yang P, LuoS (2007). NF-kB responds to mechanical strainsin osteoblast-like cells, and lighter strains createan NF-kB response more readily. Cell Biol Int31:1220-1224.

20. Basdra ΕΚ, Papavassiliou ΑG, Huber LA (1995).Rab and rho GTPases are involved in specific re-sponse of periodontal ligament fibroblasts to me-chanical stretching. Biochimica et Biophysica Ac-ta 1268:209-213.

21. Kletsas D, Basdra EK, Papavassiliou AG (1998).

AλληλογραφίαΑθανάσιος Γ. Παπαβασιλείου,

Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας,Ιατρική Σχολή Παν/μίου Αθηνών,

Μικράς Ασίας 75, ΤΚ 11527, ΓουδήEmail: [email protected]

CorrespondenceAthanasios G. Papavassiliou,Department of Biological Chemistry,Medical School, University of Athens,Mikras Asias 75, PC 11527 Goudi, GreeceEmail: [email protected]


48 Oστούν

Mechanical stress induces DNA synthesis in PDLfibroblasts by a mechanism unrelated to autocrinegrowth factor action. FEBS Lett 430:358-362.

22. Basdra EK, Komposch G (1997). Osteoblast-likeproperties of human periodontal ligament cells:an in vitro analysis. Eur J Orthod 19:615-621.

23. Peverali FA, Basdra EK, Papavassiliou AG (2001).Stretch-mediated activation of selective MAPKsubtypes and potentiation of AP-1 binding in hu-man osteoblastic cells. Mol Med 7:68-78.

24. Schreiber E, Matthias P, Muller MM, SchaffnerW (1989). Rapid detection, of octamer bindingproteins with ‘mini-extracts’ prepared from a s-mall number of cells. Nucleic Acids Res 17:6419.

25. Chomczynski P, Sacchi N (1987). Single-StepMethod of RNA Isolation by Acid GuanidiniumThiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction. AnalBiochem 162:156-159.

26. Laemmli KU (1970). Cleavage of structural pro-teins during the assembly of the head of bacte-riophage T4. Nature 227:680-685.

27. Papachroni KK, Karatzas DN, Papavassiliou KA,Basdra EK, Papavassiliou AG (2009). Mechan-otransduction in osteoblast regulation and bonedisease, Trends Mol Med 15:208-216.

28. Krane SM (2005). Identifying genes that regulatebone remodelling as potential therapeutic tar-gets. JEM 201:841-843.

Oστούν 49

Ανασκόπηση(2012) 23 (1): 49-59

Καλοήθεις όγκοι των οστών στα παιδιάΙ. ΛΥΜΠΑΡΗΑ’ Παιδιατρική Κλινική, Νοσοκομείου Παίδων «Αγία Σοφία», Αθήνα, Ελλάδα

Εισαγωγή

Η πραγματική επίπτωση των καλοηθών όγκων τωνοστών στα παιδιά είναι άγνωστη. Τα περισσότερα απότα δεδομένα που αφορούν στην επίπτωση των κα-λοηθών όγκων των οστών βασίζονται σε υλικό σειρώναπό βιοψίες ή θεραπευμένων βλαβών. Επιπλέον πολ-λοί καλοήθεις όγκοι των οστών στη συγκεκριμένη ηλι-κιακή ομάδα διαγιγνώσκονται ακτινογραφικά και ποτέδεν απαιτούν επιπρόσθετη θεραπεία. Ο Codman, οοποίος πρώτος αναγνώρισε την σπανιότητα των όγ-κων των οστών δημοσίευσε αντίστοιχη καταγραφήκαι μελέτη αυτών [1]. Παρόμοιες σειρές που ακολού-

θησαν δημιούργησαν τη βάση με την οποία εκτιμάταιη επίπτωση των όγκων [2].

Σαν ομάδα οι καλοήθεις όγκοι των οστών στα παι-διά αντιπροσωπεύουν ένα ετερογενές μείγμα βλα-βών. Εντούτοις οι περισσότερες καλοήθεις βλάβεςέχουν ειδική και χαρακτηριστική κλινική και ακτινο-λογική εικόνα. Τα ινώδη ελλείμματα του φλοιού καιτα εγχονδρώματα είναι συνήθως ασυμπτωματικά καιανακαλύπτονται μόνο ως τυχαίο εύρημα. Σε αντίθεση,το οστεοειδές οστέωμα και οι ανευρυσματικές κύ-στεις των οστών συνήθως συνοδεύονται από συμ-πτώματα άλγους τα οποία ωθούν τον ασθενή να ανα-ζητήσει ιατρική βοήθεια. Άλλοι όγκοι μπορεί να προ-

Περίληψη

Η διάγνωση ενός όγκου των οστών σε ένα παιδί μπορεί να αποτελέσει πηγή μεγάλου άγχους τόσο για τους γονείς όσο και για τον θεράπονταιατρό. Ευτυχώς οι περισσότεροι όγκοι των οστών στα παιδιά είναι καλοήθεις. Αν και υπάρχει μια ποικιλία καλοηθών όγκων των οστών πουεπηρεάζουν τους ανώριμους σκελετικά ασθενείς, οι περισσότεροι έχουν τόσο χαρακτηριστική κλινική και ακτινολογική εικόνα που η διά-γνωση μπορεί να τεθεί με λογική ακρίβεια χωρίς βιοψία. Εντούτοις, ορισμένοι καλοήθεις όγκοι των οστών μπορούν να χαρακτηρίζονταιαπό δυνητική κακοήθεια και είναι φρονιμότερο να γίνει επιπρόσθετη εκτίμηση από κάποιον ειδικευμένο στην Ορθοπαιδική Ογκολογία.Οι εναλλακτικές επιλογές στη θεραπεία εν μέρει σχετίζονται με το στάδιο της βλάβης. Υποτροπές συγκεκριμένων βλαβών μπορεί να είναιπροβληματικές. Με την εξοικείωση με την κλινική εικόνα των πιο συχνών καλοηθών όγκων στα παιδιά, οι ιατροί θα μπορούν να περιορίζουνφόβους και ανησυχίες, να θέτουν διάγνωση και να κάνουν θεραπευτικές συστάσεις με περισσότερο αποτελεσματικό τρόπο.

Λέξεις κλειδιά: Kαλοήθεις όγκοι, Παιδική ηλικία

Benign bone tumors in childrenJ. LYMPARI First Pediatric Department, “Aghia Sophia” Children’s Hospital, Athens, Greece

Summary

The diagnosis of a bone tumor in a child can be a source of great anxiety for the patient, the parents, and the treating physician. For-tunately, most bone tumors in children are benign. Although there are a variety of benign bone tumors that affect skeletally immaturepatients, most have such characteristic clinical and radiographic presentations that the diagnosis can be made with reasonableaccuracy without a biopsy. However, some benign bone tumors can simulate a malignant process and may be best handled byreferral to a person trained in orthopaedic oncology for additional evaluation. Treatment alternatives are in part related to the stageof the lesion. Recurrences of certain lesions, such as aneurysmal bone cysts and osteoblastomas, can be problematic. By becomingfamiliar with the presentation of the more common benign bone tumors in children, physicians will be able to alleviate fears, establisha diagnosis, and make treatment recommendations in the most effective manner.

Keywords: Benign bone tumors, Childhood

Ι. Λυμπάρη

βάλλουν ως μάζα (π.χ. οστεοχόνδρωμα) ή ως παθο-λογικό κάταγμα (π.χ. μονόχωρη οστική κύστη) [3,4].

Η φυσική πορεία αυτών των όγκων της παιδικήςηλικίας καθώς και οι ανάγκες για θεραπεία ποικίλουν.Κάποιες βλάβες, όπως τα ινώδη ελλείμματα του φλοι-ού συνήθως δεν απαιτούν θεραπεία, ενώ άλλες βλά-βες όπως η ανευρυσματική κύστη, το χονδροβλάστω-μα και το οστεοβλάστωμα συνήθως απαιτούν χειρουρ-γική αντιμετώπιση και μπορεί να είναι επιρρεπείς σετοπική υποτροπή. Επιπλέον άλλες (π.χ. ιστιοκύττωσηLangerhans και οστεοειδές οστέωμα) παρουσιάζουνμια πιο απρόβλεπτη πορεία και μπορεί είτε να λυθούναυτόματα είτε να χρειαστούν θεραπεία.

Εκτός από τις εμφανείς διαφορές των διαφόρωνκαλοηθών όγκων των οστών που προσβάλλουν τα παι-διά, η διάγνωση καθενός από αυτούς τους όγκουςμπορεί συχνά να τεθεί με βάση τη χαρακτηριστική κλι-νική και ακτινολογική εικόνα. Είναι σημαντικό ο Ορ-θοπαιδικός να μπορεί να αναγνωρίσει τους πιο κοι-νούς καλοήθεις όγκους των οστών στα παιδιά ώστενα αποφεύγεται άσκοπη βιοψία, να μπορούν να ανα-κουφιστούν οι φόβοι και να μπορούν να γίνονται οικατάλληλες συστάσεις για θεραπεία.

Ταξινόμηση

Η σταδιοποίηση των καλοηθών όγκων γίνεται σύμ-φωνα με την ακτινολογική τους εικόνα και την εμφανήκλινική συμπεριφορά. Το σύστημα σταδιοποίησης τηςΕταιρίας Μυοσκελετικών Όγκων (Musculoskeletal Tu-mor Society - MSTS) για τις συγκεκριμένες βλάβες,περιλαμβάνει τρία στάδια. Στο στάδιο 1 οι βλάβες είναιστατικές, μη εμφανείς οι οποίες τυπικά αυτοιώνται.Στο στάδιο 2 οι βλάβες είναι ενεργείς αλλά παραμέ-νουν μέσα στα όρια των οστών και σχετίζονται με κα-ταστροφή των οστών ή αναδιαμόρφωση. Στο στάδιο3 οι βλάβες είναι ενεργείς και τοπικά επιθετικές μετάση να επεκταθούν πέρα από τον φλοιό στους πέριξμαλακούς ιστούς.

Η εκτίμηση του σταδίου είναι χρήσιμη όχι μόνο γιανα τεκμηριώσει τη διάγνωση αλλά και για να γίνει οκατάλληλος θεραπευτικός σχεδιασμός. Οι βλάβες τουσταδίου 1 συνήθως δεν απαιτούν χειρουργική παρέμ-βαση και μπορούν να παρακολουθούνται περιοδικάγια να επιβεβαιώνεται ότι η βλάβη είναι στατική. Οιβλάβες του σταδίου 2 μπορεί να χρειαστούν παρέμ-βαση αν προκαλούν δομική/στηρικτική αδυναμία ή εί-ναι σοβαρά συμπτωματικές. Η φύση της παρέμβασηςεξαρτάται από πολλούς παράγοντες συμπεριλαμβα-

νομένων του ειδικού τύπου του όγκου, της εντόπισήςτου και της ηλικίας του ασθενούς. Οι βλάβες του στα-δίου 3 συνήθως απαιτούν χειρουργική θεραπεία. Στιςπερισσότερες περιπτώσεις συστήνονται επεμβάσειςδιαμέσου της βλάβης αλλά μπορεί να απαιτηθεί ενί-σχυση με επιπρόσθετους τρόπους θεραπείας. Μηολοκληρωμένη ή ανεπαρκής θεραπεία μπορεί ναωθήσει τέτοιες βλάβες σε τοπική υποτροπή.

Κλινική εικόνα

Η παραπομπή ενός παιδιού με καλοήθη όγκο τωνοστών σε Ορθοπαιδικό επισπεύδεται συνήθως απότην ανεύρεση μιας οστικής βλάβης ως τυχαίο εύρημασε ακτινογραφία μετά από τραυματισμό ή εξαιτίας τηςέναρξης σημείων ή συμπτωμάτων όπως άλγος, ψη-λαφητή μάζα ή ένα παθολογικό κάταγμα. Δεν υπάρχειμία χαρακτηριστική εικόνα για όλους τους καλοήθειςόγκους των οστών αλλά μπορεί να υπάρχει μια πολύχαρακτηριστική εικόνα για έναν δεδομένο τύπο όγ-κου, συνήθως ένα ειδικό σύνολο σημείων, συμπτω-μάτων και ακτινολογικών ευρημάτων. Σε σπάνια πα-ραδείγματα ένας καλοήθης όγκος μπορεί να είναι ηαρχική εκδήλωση μιας συστηματικής νόσου όπως στοσύνδρομο Albright και στην ιστιοκύττωση Langerhans.Σε άλλες περιπτώσεις μπορεί να προσομοιάζει με μιακακοήθη διαδικασία που μπορεί να οδηγήσει σε άσκο-πο άγχος και διαγνωστικές εξετάσεις [5].

Άλγος

Όποτε ένα παιδί διαμαρτύρεται για μυοσκελετικόάλγος ο θεράπων πρέπει να εξετάζει τη φύση και τηνεντόπιση του πόνου, τη διάρκεια των συμπτωμάτωνκαθώς και κάθε παράγοντα που προκαλεί επίταση ήύφεση των συμπτωμάτων. Τα συμπτώματα του παιδιούσυχνά αποδίδονται αρχικά σε «άλγη ανάπτυξης» ή σεμη γνωστό τραυματισμό. Αυτό πράγματι συμβαίνειόταν δεν λαμβάνονται ακτινογραφίες ή είναι χαμηλήςποιότητας ή διαλάθουν ορθής διάγνωσης. Η πιθανό-τητα ενός καλοήθους όγκου των οστών πρέπει πάντανα περιλαμβάνεται στην διαφορική διάγνωση ανεξή-γητων μυοσκελετικών αλγών στα παιδιά.

Οι καλοήθεις όγκοι των οστών μπορεί να είναι μιαπηγή άλγους χωρίς υποκείμενο κάταγμα αναλόγωςμε τον τύπο του όγκου, το μέγεθος και την εντόπιση.Οι όγκοι που εμφανίζονται συνήθως με εντοπισμένοάλγος περιλαμβάνουν την ανευρυσματική κύστη, τηνιστιοκύττωση Langerhans (παλαιότερα γνωστή ως ηω-σινόφιλο κοκκίωμα), το οστεοβλάστωμα και το οστε-

50 Oστούν

Καλοήθεις όγκοι των οστών στα παιδιά

οειδές οστέωμα. Τα συμπτώματα μπορεί να σχετίζον-ται με δομική αδυναμία στο πάσχον οστό ή στην πε-ρίπτωση του οστεοειδούς οστεώματος, σε υψηλές το-πικές συγκεντρώσεις προσταγλανδινών μέσα στον όγ-κο. Ακόμα και βλάβες του ινώδους ιστού της μετάφυ-σης μπορεί να γίνουν επώδυνες αν μεγαλώσουν αρ-κετά ώστε να καταστρέφουν την οστική δομή και ακε-ραιότητα. Άλλοι τυπικά ασυμπτωματικοί όγκοι όπωςτο οστεοχόνδρωμα μπορεί να είναι συμπτωματικοί λό-γω δευτερευόντων αιτιών όπως το κάταγμα, υποτρο-πιάζον τραύμα και τοπικό ερεθισμό από περιβάλλου-σες δομές (τένοντας, μυς, αρτηρία ή νεύρο). Όταν τοάλγος που σχετίζεται με οστεοχόνδρωμα είναι απο-τέλεσμα μηχανικού ερεθισμού τα συμπτώματα εντο-πίζονται στη θέση του όγκου και τυπικά επιδεινώνονταιαπό συγκεκριμένες δραστηριότητες.

Από την άλλη, μπορεί να προκαλέσουν σημαντικόπόνο όταν επηρεάζουν παρακείμενο νεύρο. Ένα οστε-οχόνδρωμα που περιλαμβάνει το εγγύς άκρο της πε-ρόνης μπορεί να πιέζει το κοινό περονιαίο νεύρο.Ομοίως οστεοβλάστωμα της σπονδυλικής στήλης μπο-ρεί να εκδηλώνεται ως πόνος στο κάτω άκρο, μιμού-μενο πάθηση μεσοσπονδυλίου δίσκου, ή ως σκολίω-ση. Το μέγεθος και η εντόπιση του όγκου μπορεί επί-σης να είναι παράγοντες για το εάν ή όχι ο όγκος μπο-ρεί να γίνει συμπτωματικός. Η ινώδης δυσπλασία καιτο μη οστεοποιό ίνωμα είναι συνήθως ασυμπτωματι-κές βλάβες, εκτός αν λάβουν μεγάλες διαστάσειςώστε να εξασθενίσουν το οστό και να προκαλέσουνμικροκατάγματα τα οποία προκαλούν συμπτώματα.

Ο χαρακτήρας του άλγους μπορεί να κατευθύνειστη διάγνωση. Το ιστορικό άλγους για εβδομάδες ήμήνες, το οποίο επιδεινώνεται τη νύχτα και ανακου-φίζεται με ασπιρίνη ή μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη,χαρακτηρίζει τόσο συχνά το οστεοειδές οστέωμα πουείναι σχεδόν διαγνωστικό. Όταν ο γιατρός λαμβάνειτέτοιο ιστορικό η υποψία ενός οστεοειδούς οστεώμα-τος πρέπει να είναι ισχυρή ακόμα και αν οι αρχικέςακτινογραφίες της περιοχής αδυνατούν να αποκαλύ-ψουν μια αδρή βλάβη. Χαρακτηριστική είναι η αντα-νάκλαση του πόνου προς το γόνατο, όταν η συγκε-κριμένη βλάβη εντοπίζεται στην περιοχή του ισχίου.Ο συνδυασμός ισχυρής υποψίας ενός μικρού όγκουκαι η λήψη λεπτομερούς ιστορικού θα πρέπει να οδη-γούν το θεράποντα σε σπινθηρογράφημα οστών ή/καιακτινογραφίες ισχίου όταν οι ακτινογραφίες γόνατοςαποτύχουν να αποκαλύψουν την αιτία των συμπτωμά-των του ασθενούς [6].

Ψηλαφητή μάζα

Ο πιο συχνός καλοήθης όγκος των οστών που προ-βάλει ως ψηλαφητή μάζα σε ένα αναπτυσσόμενο παιδίείναι το οστεοχόνδρωμα. Η μάζα που σχετίζεται μεμια τέτοια βλάβη, είναι σταθερή και ακίνητη και μπορείνα είναι μαλακή. Η φυσική εξέταση μπορεί να προσ-διορίσει αν η μάζα έχει οστική προέλευση. Στην περί-πτωση ενός μισχωτού οστεοχονδρώματος, είναι ίσωςσχετικά εύκολο να εκτιμήσει κανείς ότι εξορμάται απόοστό. Όταν το οστεοχόνδρωμα έχει ευρεία βάση καιείναι χωρίς μίσχο μπορεί να είναι πιο δύσκολο να γίνειδιάκριση αν η μάζα προέρχεται από το υποκείμενοοστό. Αυτός ο τύπος βλάβης μπορεί να φαίνεται ότιεκτείνεται στο οστό, όπως στην περίπτωση της μονό-χωρης οστικής κύστης, της ινώδους δυσπλασίας ήστην περίπτωση ανευρυσματικής κύστης.

Οι γονείς και το παιδί συχνά είναι ανίκανοι να πα-ρέχουν ένα ιστορικό ανάπτυξης της βλάβης αν αυτήέχει παρατηρηθεί πρόσφατα. Εντούτοις μπορεί να εί-ναι ικανοί να δώσουν ένα ιστορικό πρόσφατης σκε-λετικής ανάπτυξης ή ενός οικογενειακού μοντέλουκληρονομικότητας. Ο ιατρός πρέπει να εξετάσει τονασθενή προσεκτικά, ψάχνοντας για οστικές μάζες ήγωνιώδεις παραμορφώσεις των άκρων για να εκτιμη-θεί αν ο ασθενής έχει πολλαπλά οστεοχονδρώματα.Οι μεμονωμένες εξοστώσεις υπερτερούν των πολλα-πλών κληρονομικών εξοστώσεων τουλάχιστον 10:1.Ένας αυτοσωματικός επικρατούν τύπος μεταβίβασηςεμφανίζεται στο 70% των ασθενών με πολλαπλά οστε-οχονδρώματα. Μετά από τη λήψη ιστορικού και τηνκλινική εξέταση, πρέπει να ληφθούν απλές ακτινογρα-φίες της προσβαλλόμενης περιοχής [7,8].

Παθολογικό κάταγμα

Ορισμένοι καλοήθεις όγκοι των οστών υποδιαγιγνώ-σκονται μέχρις ότου προσβάλλουν δομικά το οστό σετέτοιο σημείο ώστε να υποστεί κάταγμα. Οι όγκοι πουμπορεί να προβάλλουν με παθολογικό κάταγμα συνή-θως αναπτύσσονται βραδέως και εξασθενούν το οστό(σταδίου 2 βλάβες). Οι πιο συνήθεις περιλαμβάνουντη μονόχωρη οστική κύστη, την ινώδη δυσπλασία καιτο μη οστεοποιό ίνωμα. Περίπου 50% των μονόχωρωνοστικών κύστεων πρωτοδιαγιγνώσκονται μετά από πα-θολογικό κάταγμα. Λιγότερο πιθανό να εκδηλωθούνευθύς εξαρχής με παθολογικό κάταγμα είναι οι πιοεπιθετικοί καλοήθεις όγκοι όπως οι ανευρυσματικέςκύστεις των οστών οι οποίες έχουν την τάση να προ-καλούν συμπτώματα άλγους νωρίτερα από κάταγμα.

Oστούν 51

Ι. Λυμπάρη

Επομένως όταν ένα παιδί προσέρχεται με παθολογικόκάταγμα, πρέπει να λαμβάνεται ένα λεπτομερές ιστο-ρικό για τα προηγηθέντα συμπτώματα [9].

Τυχαίο εύρημα

Πολλοί καλοήθεις όγκοι των οστών στα παιδιά ανακα-λύπτονται ως τυχαίο εύρημα σε ακτινογραφίες ή σπινθη-ρογραφήματα που πραγματοποιήθηκαν για άλλους λό-γους. Οι ιατροί που δεν είναι εξοικειωμένοι με την κλινικήκαι ακτινολογική εικόνα των καλοηθών όγκων των οστώνσυχνά αντιμετωπίζουν δυσκολία να διαβεβαιώσουν μεακρίβεια τον ασθενή και τους γονείς ότι η βλάβη είναι κα-λοήθης, γεγονός που οδηγεί σε άγχος, πολλαπλές απει-κονιστικές εξετάσεις, ακόμα και βιοψία. Είναι υποχρέωσητου Ορθοπαιδικού να είναι ικανός να αναγνωρίζει την κα-λοήθη φύση της βλάβης και να διαβεβαιώσει ότι ο όγκοςδεν είναι απειλητικός για τη ζωή του ασθενούς.

Οι καλοήθεις όγκοι των οστών που τείνουν να ανα-καλύπτονται τυχαία είναι συνήθως σταδίου 1 ή σταδί-ου 2. Οι όγκοι σταδίου 3 συχνά εκδηλώνονται με πόνοπριν ανακαλυφθούν ακτινολογικά. Καλοήθεις όγκοιπου γενικά είναι ασυμπτωματικοί αλλά παρουσιάζουναυξημένη δραστηριότητα στο σπινθηρογράφημαοστών περιλαμβάνουν την ινώδη δυσπλασία, τις πα-θήσεις του ινώδους συνδετικού ιστού των οστών και

το εγχόνδρωμα. Σε αυτές τις περιπτώσεις οι απλέςακτινογραφίες της προσβληθείσας περιοχής και ηγνώση ότι οι καλοήθεις βλάβες (ειδικά του σταδίου 2βλάβες) μπορεί να είναι ενεργείς στο σπινθηρογρά-φημα οστών είναι αυτά που χρειάζεται ο ιατρός γιανα διαβεβαιώσει ότι η βλάβη είναι πιθανότατα καλοή-θης. Άλλοι καλοήθεις όγκοι των οστών που μπορεί ναείναι ενεργείς στο σπινθηρογράφημα οστών περιλαμ-βάνουν την ανευρυσματική οστική κύστη και το οστε-οειδές οστέωμα. Εντούτοις καθώς οι δύο αυτοί όγκοισυνδυάζονται συχνά με άλγος, οι περισσότεροι ασθε-νείς αναζητούν ιατρική βοήθεια πριν η βλάβη ανευ-ρεθεί ακτινολογικά. Επειδή οι καλοήθεις όγκοι ανα-καλύπτονται ως τυχαίο εύρημα συνεπάγεται ότι πολλοίάλλοι παραμένουν αδιάγνωστοι (Εικόνα 1).

Απεικονιστικά ευρήματα

Η πιο χρήσιμη απεικονιστική εξέταση για την εκτίμη-ση ενός όγκου των οστών είναι η απλή ακτινογραφία.Τουλάχιστον λήψεις δύο επιπέδων (κατά μέτωπο καιπλάγια) επικεντρωμένες στη βλάβη πρέπει να ληφθούν.Στις περισσότερες περιπτώσεις οι απλές ακτινογραφίες,σε συνδυασμό με το κλινικό ιστορικό είναι τα μόνα πουαπαιτούνται για να τεθεί η σωστή διάγνωση.

52 Oστούν

Εικ. 1. Α) Ινώδες έλειμμα του φλοιού. Ονομάζεται έτσι όταν η βλάβη είναι μικρή (<2 εκ.). Δυνατόν να είναι υποπεριοστικό ή μέσα στοφλοιό. Β) Μη οστεοποιούμενο ίνωμα. Ο όρος χρησιμοποιείται για μεγαλύτερες βλάβες. Επεκτείνεται και προς τη μυελική κοιλότητα.


Σε ορισμένες περιπτώσεις, η αξονική τομογραφίακαι λιγότερο συχνά η μαγνητική τομογραφία μπορείνα φανούν χρήσιμες στην εκτίμηση συγκεκριμένωνβλαβών. Το σπινθηρογράφημα οστών με τεχνήτιο χρη-σιμοποιείται για να εκτιμηθούν άλλες θέσεις πιθανήςοστικής συμμετοχής σε καταστάσεις που μπορεί να εί-ναι πολυοστικές όπως η ινώδης δυσπλασία, το πολλα-πλό εγχόνδρωμα και η ιστιοκύττωση Langerhans [10].

Απλή ακτινογραφία

Η απλή ακτινογραφία είναι η πιο χρήσιμη απεικονι-στική εξέταση για να τεθεί η διάγνωση όταν υπάρχειυποψία όγκου των οστών. Στις περισσότερες περιπτώ-σεις η ειδική διάγνωση μπορεί να τεθεί χωρίς επιπλέοναπεικονιστικές εξετάσεις. Οι σημαντικοί παράγοντεςπου συνήθως μπορούν να ληφθούν από ανασκόπησητων ακτινογραφιών και είναι χρήσιμοι στο να περιορι-στεί η διαφορική διάγνωση είναι η εντόπιση του όγκου(πλατύ έναντι μακρού οστού), το τμήμα του οστού (επί-φυση, μετάφυση ή διάφυση), τα χαρακτηριστικά ανά-πτυξης της βλάβης (όπως καθορίζονται από τα όριατου όγκου και την παρουσία ή απουσία αντίδρασηςτου περιόστεου) και την παρουσία ή απουσία επασβε-στώσεων στον όγκο [11].

Η μονόχωρη (απλή) οστική κύστη, το εγχόνδρωμα,το οστεοβλάστωμα και το μη οστεοποιό ίνωμα έχουνπροτίμηση σε ορισμένα οστά. Οι μονόχωρες οστικέςκύστεις είναι πιο πιθανό να συμβούν στο εγγύς βρα-χιόνιο και στο εγγύς μηριαίο. Αυτές οι θέσεις αποτε-λούν το 80-90% των περιπτώσεων. Τα οστεοβλαστώ-ματα έχουν προτίμηση στα οπίσθια στοιχεία της σπον-δυλικής στήλης. Τα μη οστεοποιά ινώματα απαντώνταισυχνότερα στο άπω μηριαίο και στην εγγύς κνήμη.

Οι περισσότεροι καλοήθεις όγκοι στα παιδιά προ-σβάλλουν τις μεταφύσεις των μακρών οστών. Αυτόισχύει για το οστεοειδές οστέωμα, το οστεοχόνδρωμα,το εγχόνδρωμα, το χονδρομυξοειδές ίνωμα, την ινώ-δη δυσπλασία, το μη οστεοποιό ίνωμα, τη μονόχωρηοστική κύστη και την ανευρυσματική κύστη. Η ιστιο-κύττωση Langerhans έχει προτίμηση στα πλατέα οστά,όπου περίπου το 70% αυτών των βλαβών συμβαίνουνστο κρανίο, τη γνάθο, την σπονδυλική στήλη, τα οστάτης λεκάνης και τις πλευρές. Σπάνια προσβάλει ταοστά της άκρας χειρός και του ποδός. Σε αντίθεσητο οστεοχόνδρωμα και το χονδροβλάστωμα προσβάλ-λουν τα πλατέα οστά στο 10% μόνο των περιπτώσεων.Η ινώδης δυσπλασία μπορεί να προσβάλλει κάθε μα-κρύ οστό καθώς και τις πλευρές και το κρανίο. Συμ-

μετοχή της σπονδυλικής στήλης, της λεκάνης, τηςωμοπλάτης των χεριών ή των ποδιών είναι σπάνια [12].

Το τμήμα του οστού που συμμετέχει αποτελεί επί-σης παράγοντα. Οι περισσότεροι όγκοι των οστών βρί-σκονται στη μετάφυση ή τη διάφυση. Μια αξιοσημεί-ωτη εξαίρεση αποτελεί το χονδροβλάστωμα. Περισ-σότερα από 95% όλων των χονδροβλαστωμάτων εν-τοπίζονται στην επίφυση. Έτσι όταν η βλάβη εντοπίζε-ται στην επίφυση ενός μακρού οστού, ειδικά στο εγγύςβραχιόνιο, η διάγνωση του χονδροβλαστώματος πρέ-πει να θεωρείται πολύ πιθανή. Στην περίπτωση αυτήη διαφορική διάγνωση περιλαμβάνει το γιγαντοκυττα-ρικό όγκο, την οστεομυελίτιδα και το εγχόνδρωμα.Βλάβες που τείνουν να εντοπίζονται περιλαμβάνουντο οστεοχόνδρωμα, το εγχόνδρωμα, το οστεοβλάστω-μα και την ανευρυσματική κύστη. Λίγοι καλοήθεις όγ-κοι των οστών αναπτύσσονται τυπικά στη διάφυση. Τοοστεοειδές οστέωμα και η ιστιοκύττωση Langerhansείναι πολύ πιο συχνά σε αυτή τη θέση.

Ορισμένοι όγκοι επεκτείνονται πέραν της αρχικήςθέσης προτίμησής. Η ινώδης δυσπλασία μπορεί να πε-ριλαμβάνει την μετάφυση ή/και τη διάφυση ενός δε-δομένου οστού. Ομοίως οι μονόχωρες οστικές κύστειςθεωρείται ότι ξεκινούν από τη μετάφυση αλλά μετα-ναστεύουν πέρα από την επίφυση καθώς το οστό υφί-σταται κατά μήκος αύξηση, έτσι ώστε μπορεί να εντο-πίζονται στη διάφυση όταν τελικά ανακαλύπτονται.

Η εντόπιση του όγκου πρέπει να διευκρινίζεται ανείναι στο φλοιό ή στο μυελό. Οι ενδομυελικές βλάβεςθα πρέπει περαιτέρω να χαρακτηριστούν ως κεντρικέςή έκκεντρες. Οι όγκοι που έχουν τη βάση τους στονφλοιό περιλαμβάνουν το οστεοχόνδρωμα και το οστε-οειδές οστέωμα. Οι όγκοι που τείνουν να εντοπίζονταικεντρικά στο μυελικό τμήμα του οστού περιλαμβάνουντο εγχόνδρωμα, την ινώδη δυσπλασία και τη μονόχω-ρη οστική κύστη. Οι έκκεντρες μυελικές βλάβες πε-ριλαμβάνουν το μη οστεοποιό ίνωμα, το χονδρομυ-ξοειδές ίνωμα και την ανευρυσματική κύστη.

Οι καλοήθεις όγκοι των οστών μπορεί να προσβά-λουν τη σπονδυλική στήλη, αν και αυτό δε συμβαίνεισυχνά. Τα παιδιά με συμμετοχή των σπονδύλων μπορείνα παρουσιάσουν ραιβόκρανο ή σκολίωση με ή χωρίςπόνο. Ειδικά το καλόηθες οστεοβλάστωμα έχει προτί-μηση στη σπονδυλική στήλη, με συχνότητα που φθάνειτο 40% όλων των οστεοβλαστωμάτων. Από την άλλη,το 10% όλων των οστεοειδών οστεωμάτων, εντοπίζον-ται στη σπονδυλική στήλη και το ιερό οστό. Άλλες βλά-βες που μπορεί να περιλαμβάνουν την σπονδυλική

Oστούν 53

Ι. Λυμπάρη

στήλη είναι η ιστιοκύττωση Langerhans, το οστεοχόν-δρωμα και η ανευρυσματική οστική κύστη [13].

Οι απλές ακτινογραφίες μπορούν να παρέχουν στοι-χεία για το στάδιο και επομένως την βιολογική συμπε-ριφορά μιας βλάβης. Τρία ακτινολογικά πρότυπα έχουνπεριγραφεί από τους Madewell και συν. [14]: γεωγρα-φικό (geographic), σκωροφαγωμένο (moth-eaten), δι-εισδυτικό (permeative). Αυτά τα πρότυπα καταστροφήςαντιπροσωπεύουν αύξοντες ρυθμούς ανάπτυξης, απότον αργό στο γεωγραφικό πρότυπο στο ταχύ στο διεισ-δυτικό πρότυπο. Το πιο συνηθισμένο πρότυπο πουαπαντάται στις καλοήθεις βλάβες είναι το γεωγραφικόμε έναν τυπικά αργό ρυθμό ανάπτυξης. Σε αντίθεση,οι περισσότεροι πρωτογενείς κακοήθεις όγκοι τωνοστών στα παιδιά έχουν ακτινολογικά ένα διεισδυτικόπρότυπο. Υπάρχει ωστόσο μία αλληλεπικάλυψη. Δενείναι όλοι οι καλοήθεις όγκοι με γεωγραφική εμφάνισηκαι δεν είναι όλοι οι κακοήθεις διεισδυτικοί. Η ιστιοκύτ-τωση Langerhans μπορεί να προσομοιάζει σε μια επι-θετική κακοήθη βλάβη ακτινολογικά.

Οι γεωγραφικές βλάβες μπορεί να χαρακτηρίζονταιαπό σκληρία στα όριά τους. Τα σκληρυντικά όρια σχε-τίζονται με βλάβες, όπως η ινώδης δυσπλασία, το χον-δρομυξοειδές ίνωμα και περιστασιακά το χονδροβλά-στωμα. Η απουσία σκληρυντικού ορίου είναι ενδεικτικήαυξανόμενου ρυθμού ανάπτυξης. Οι όγκοι που μπορείνα εκδηλώνονται με αυτόν τον τρόπο περιλαμβάνουντην ινώδη δυσπλασία, την ανευρυσματική οστική κύ-στη, το χονδροβλάστωμα και περιστασιακά το χονδρο-μυξοειδές ίνωμα. Εντούτοις υπάρχει αξιοσημείωτη αλ-ληλεπικάλυψη στην ακτινολογική εικόνα και τη βιολο-γική δραστηριότητα ορισμένων όγκων. Το χονδροβλά-στωμα και η ινώδης δυσπλασία για παράδειγμα μπορείνα είναι είτε ανενεργείς είτε ενεργείς βλάβες. Επιπρό-σθετα της διάγνωσης το πρότυπο του οστού παρέχειπληροφορίες για το αν θα απαιτηθεί παρέμβαση. Στηνπερίπτωση της ινώδους δυσπλασίας ένα σκληρυντικόόριο υποδηλώνει ότι η βλάβη είναι ανενεργής και είναιλιγότερο πιθανό να εξελιχθεί συγκριτικά με μια παρό-μοια βλάβη χωρίς σκληρυντικό όριο.

Τέλος, η ύπαρξη επασβέστωσης μπορεί να παρέχεισημαντικές πληροφορίες για τον τύπο του ιστού του όγ-κου. Αυτό γίνεται ιδιαίτερα εμφανές στο χονδροβλάστω-μα, το εγχόνδρωμα και το χονδρομυξοειδές ίνωμα. Ανκαι η αξονική τομογραφία και η μαγνητική τομογραφίαείναι πιο ευαίσθητες για την ανίχνευση χόνδρου μέσασε έναν οστικό όγκο από την απλή ακτινογραφία, συνή-θως δεν είναι απαραίτητες για να τεθεί η διάγνωση [15].

Σπινθηρογράφημα οστών

Ο ρόλος του σπινθηρογραφήματος οστών με τε-χνήτιο στην εκτίμηση των παιδιών με καλοήθεις όγ-κους είναι είτε να βοηθήσει στη διευκρίνιση της ακρι-βούς θέσης μιας μικρής επώδυνης βλάβης σε μια πε-ριοχή με σύνθετη ανατομία (π.χ. οστεοειδές οστέωμα)ή να εκτιμήσει το παιδί για σε περιπτώσεις βλαβώνπου μπορεί να εντοπίζονται σε περισσότερες θέσεις,όπως η ινώδης δυσπλασία και το πολλαπλό εγχόν-δρωμα. Η εντόπιση μικρών βλαβών στη σπονδυλικήστήλη, στη λεκάνη ή τις πλευρές συχνά επιτυγχάνεταιμε σπινθηρογράφημα οστών με τεχνήτιο.

Ασθενείς με ιστιοκύττωση Langerhans πρέπει ναεκτιμώνται για πολλαπλές οστικές εντοπίσεις αλλά τοσπινθηρογράφημα οστών δεν είναι αξιόπιστο καθώςορισμένες βλάβες μπορεί να παρουσιάζουν αυξημένηδραστηριότητα ενώ άλλες όχι. Έτσι το σπινθηρογρά-φημα μπορεί να αποδειχθεί ιδιαίτερα επιβοηθητικόστην περίπτωση διαφορικής διάγνωσης μεταξύ ενόςκακοήθους όγκου, που απεικονίζεται ως ενεργός, καιτης ιστιοκύττωσης Langerhans που μπορεί να μην εί-ναι ενεργή. Αν η βλάβη δεν παρουσιάζει αυξημένηδραστηριότητα στο σπινθηρογράφημα η διάγνωση τηςιστιοκύττωσης Langerhans πρέπει να λαμβάνεται έν-τονα υπόψη. Στην τελευταία περίπτωση, προκειμένουνα τεθεί με ακρίβεια η διάγνωση, μπορεί να απαιτηθείβιοψία [16].

Αξονική τομογραφία

Η αξονική τομογραφία χρησιμοποιείται καλύτεραως επιπρόσθετη εξέταση μετά την απλή ακτινογραφίαγια σκοπούς σταδιοποίησης και προεγχειρητικού σχε-διασμού παρά ως διαγνωστικό εργαλείο. Θα πρέπεινα προτιμάται της μαγνητικής τομογραφίας επειδή οκαθορισμός της αρχιτεκτονικής των οστών είναι πρω-ταρχικής σημασίας. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στην εκτί-μηση της έκτασης της διαταραχής του φλοιού λόγωενεργών ή επιθετικών όγκων, όπως η ανευρυσματικήκύστη, η ινώδης δυσπλασία και το εγχόνδρωμα. Ανκαι καμιά απεικονιστική μέθοδος δεν μπορεί να προ-βλέψει τον κίνδυνο παθολογικού κατάγματος, η αξο-νική τομογραφία μπορεί με περισσότερη ακρίβεια ναεκτιμήσει την ακεραιότητα του φλοιού συγκριτικά μετην απλή ακτινογραφία. Στις περιπτώσεις στις οποίεςυπάρχει ανησυχία για επικείμενο κάταγμα ή υπάρχειήδη κάποιο μικροκάταγμα, η ακεραιότητα του φλοιούεκτιμάται καλύτερα με αξονική τομογραφία. Μπορείεπίσης μπορεί να έχει ένδειξη όταν ένας όγκος που

54 Oστούν


περιλαμβάνει τις πλευρές, την σπονδυλική στήλη ήτην λεκάνη δεν μπορεί επαρκώς να απεικονιστεί μεαπλή ακτινογραφία λόγω ανατομικών παραγόντων.

Η αξονική τομογραφία είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στηνεντόπιση της φωλεάς (nidus) ενός οστεοειδούς οστε-ώματος. Η φωλεά αποτελεί μια στρογγυλή αραιωτικήσκίαση διαμέτρου 0.5-1 εκατοστό συχνά με πυκνωτικήκεντρική κηλίδα, που περιβάλλεται στα μακρά οστάαπό χαρακτηριστική αντιδραστική σκλήρυνση με ατρα-κτοειδή μορφή. Αξίζει να παρατηρήσει κανείς ότι στασπογγώδη οστά, καθώς και στις επιφύσεις λείπει η αν-τιδραστική σκλήρυνση. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στονπροεγχειρητικό σχεδιασμό όταν η φωλεά εντοπίζεταισε υποπεριοστική θέση. Σε σπάνιες περιπτώσεις έναοστεοχόνδρωμα μπορεί να φαίνεται ότι εξορμάταιαπευθείας από τον φλοιό του οστού παρά να περι-λαμβάνει ανάμικτα στοιχεία του μυελού του πάσχον-τος οστού και του όγκου. Όταν απαντάται αυτή η πε-ρίπτωση η βλάβη πρέπει να διαχωριστεί από ένα πα-ραοστικό οστεοσάρκωμα. Η αξονική τομογραφία ενόςοστεοχονδρώματος θα δείξει συνέχεια ανάμεσα στονμυελό του πάσχοντος οστού και του όγκου. Στο πα-ραοστικό οστεοσάρκωμα δεν υπάρχει τέτοια συνέ-χεια. Η αξονική τομογραφία μπορεί επίσης να φανείχρήσιμη στο διαχωρισμό μιας μονόχωρης οστικής κύ-στης από μια ανευρυσματική κύστη [17].

Μαγνητική τομογραφία

Γενικά η μαγνητική τομογραφία δεν ενδείκνυται γιατη διάγνωση ή την εκτίμηση καλοηθών όγκων τωνοστών στα παιδιά. Εντούτοις ασθενείς συχνά προσέρ-χονται στον Ορθοπαιδικό αφού η μαγνητική τομογρα-φία έχει ήδη πραγματοποιηθεί. Παρόλα αυτά μπορείνα είναι χρήσιμη σε ορισμένες περιπτώσεις καλοηθώνόγκων των οστών.

Το χόνδρινο περίβλημα ενός οστεοχονδρώματοςέχει αξιοσημείωτα όμοια χαρακτηριστικά με εκείνατου αρθρικού χόνδρου (π.χ. αυξημένη ένταση σήμα-τος στην Τ1 και Τ2 ακολουθίες). Επιπρόσθετα, η μα-γνητική τομογραφία μπορεί να είναι χρήσιμη στην εκτί-μηση του μεγέθους του χόνδρινου περιβλήματος ότανεκτιμάται ο κίνδυνος δευτεροπαθούς χονδροσαρκώ-ματος. Βλάβες που περιέχουν χόνδρινο ιστό όπως τοχονδροβλάστωμα, το εγχόνδρωμα και το χονδρομυ-ξοειδές ίνωμα έχουν αυξημένη ένταση στην Τ2 ακο-λουθία και μπορεί να είναι λοβωτές σε εμφάνιση. Πε-ριοχές με πυκνή αποτιτάνωση μπορεί να φαίνονταισαν εστιακές περιοχές με σήμα χαμηλής εντάσεως

στις Τ2 ακολουθίες. Τα χονδροβλαστώματα είναι γνω-στό ότι προκαλούν σημαντικό οίδημα γύρω από τονόγκο. Όταν ελέγχεται με μαγνητική τομογραφία μιασημαντικής έκτασης περιοχή με οίδημα (φωτεινή απει-κόνιση στις Τ2 ακολουθίες) που περιβάλει τον όγκομπορεί να οδηγήσει στο εσφαλμένο συμπέρασμα ότιη υποκείμενη διαταραχή είναι λοιμώδης, τραυματικήή κακοήθης.

Η απεικόνιση της ινώδους δυσπλασίας σε μαγνητι-κή τομογραφία ποικίλει. Σε μερικές περιπτώσεις έχειμειωμένης έντασης σήμα και στις Τ1 και στις Τ2 ακο-λουθίες. Σε άλλους ασθενείς εντούτοις η ένταση τουσήματος στις Τ2 ακολουθίες μπορεί να είναι αυξημένημε ταυτόχρονη στικτή απεικόνιση.

Θεραπεία

Αφού τεθεί η διάγνωση ενός καλοήθους όγκου τωνοστών σε ένα παιδί, ο θεράπων ιατρός θα πρέπει νασκεφτεί έναν αριθμό παραγόντων προτού αποφασίσειτη θεραπεία. Αυτοί περιλαμβάνουν την φυσική πορείατου όγκου, τον κίνδυνο παθολογικού κατάγματος καιτους κινδύνους και τα οφέλη που σχετίζονται με τηνεπεμβατική ή την μη επεμβατική θεραπεία. Το σύστη-μα σταδιοποίησης της Εταιρίας Μυοσκελετικών Όγ-κων (Musculoskeletal Tumor Society) για τους καλοή-θεις όγκους είναι χρήσιμο για να καθοριστεί ποιοι όγ-κοι είναι πιο πιθανό να απαιτήσουν θεραπεία και ποιοιμπορούν απλά να παρακολουθούνται με ασφάλεια.Οι όγκοι του σταδίου 1 συνήθως είναι αυτοπεριοριζό-μενοι ή σταθεροί και στις περισσότερες περιπτώσειςδεν απαιτούν χειρουργική θεραπεία. Αυτό είναι ξεκά-θαρο στα εγχονδρώματα, οστεοχονδρώματα, μονό-χωρες κύστεις των οστών και στα μικρού μεγέθουςμη οστεοποιά ινώματα. Εντούτοις μεγάλες μονόχωρεςκύστεις των οστών και μη οστεοποιά ινώματα μπορείνα ενέχουν έναν κίνδυνο για παθολογικό κάταγμα.

Βλάβες που γειτνιάζουν με το συζευκτικό χόνδροείναι καλύτερο να αντιμετωπίζονται μη επεμβατικά μέ-χρις ότου η βλάβη να απομακρυνθεί από την περιοχήανάπτυξης του οστού ώστε να ελαχιστοποιηθεί ο κίν-δυνος τραυματισμού της αυξητικής πλάκας. Τοπικήυποτροπή είναι εξαιρετικά σπάνια. Τα παθολογικά κα-τάγματα θα αντιμετωπιστούν με χειρουργική ή μη χει-ρουργική θεραπεία [18].

Τα οστεοειδή οστεώματα θεωρούνται βλάβες στα-δίου 2. Έχει φανεί ότι η φυσική πορεία αυτού του όγ-κου είναι αυτόματη υποχώρηση σε σειρές αρκετώνετών. Τα συμπτώματα μπορεί σε μερικές περιπτώσεις

Oστούν 55

Ι. Λυμπάρη

να ελεγχθούν με σαλικυλικά ή μη στεροειδή αντιφλεγ-μονώδη. Στους ασθενείς που δεν ανέχονται ή δεν θέ-λουν φαρμακευτική αντιμετώπιση μπορεί να εφαρμο-σθεί η χειρουργική εξαίρεση της βλάβης [19]. Η πλή-ρης αφαίρεση του όγκου μειώνει τον κίνδυνο τοπικήςυποτροπής συγκριτικά με λιγότερο επιθετικές μεθό-δους, αλλά ενέχει τον κίνδυνο επαπειλούμενου κα-τάγματος. Σε οστά που φορτίζονται υπό το βάρος τουσώματος, η εξαίρεση της βλάβης μπορεί να απαιτείεπιπλέον πλήρωση της περιοχής με οστικό μόσχευμαή/και εσωτερική οστεοσύνθεση. Στο κενό που δημι-ουργείται τοποθετούνται σπογγώδη μοσχεύματα απότο λαγόνιο ή σπανιότερα από την κνήμη ή όταν η βλά-βη είναι μεγαλύτερη από τράπεζα οστών.

Για να ελαχιστοποιηθεί το ποσό του αφαιρούμενουοστού και ο κίνδυνος επαπειλούμενου κατάγματος,οι Ward και συν. [20] συστήνουν τη χρήση γλυφάνουγια την αφαίρεση τέτοιου είδους βλάβης. Αυτή η τε-χνική περιλαμβάνει τη χρήση υψηλής ταχύτητας γλύ-φανο για την αφαίρεση του φλοιού μέχρις ότου νααναγνωρισθεί η φωλεά. Η τελευταία τότε αφαιρείταιΤο nidus τότε εκτέμνεται με τη χρήση ειδικού ξέστρουκαι ο ιστός αποστέλλεται για ιστολογική επιβεβαίωσηκαι καλλιέργεια.

Άλλες ελάχιστα επεμβατικές τεχνικές που περιγρά-

φονται για την αφαίρεση του οστεοειδούς οστεώματοςπεριλαμβάνουν τον καθοδηγούμενο υπό αξονική το-μογραφία θερμικό καυτηριασμό της φωλεάς με ρα-διοκύματα (RF) ή laser [21].

Τα πλεονεκτήματα της αφαίρεσης με ραδιοκύματαπεριλαμβάνουν το γεγονός ότι μπορεί να πραγματο-ποιηθεί σε ασθενείς χωρίς να απαιτηθεί νοσηλεία,συνδυάζεται με λιγότερες επιπλοκές συγκριτικά με τιςανοιχτές επεμβάσεις και είναι σχεδόν ισάξια με τηνχειρουργική εκτομή σε σχέση με τα ποσοστά υποτρο-πής του όγκου [22], (Εικόνα 2).

Η αντιμετώπιση του οστεοχονδρώματος είναι η χει-ρουργική (εξαίρεση ολόκληρης εξόστωσης συμπερι-λαμβανομένου του υπερκείμενου θυλάκου, μαζί μετο περιόστεο και βάση με λεπτό στρώμα φυσιολογικούοστού) εφόσον υπάρχουν συγκεκριμένες ενδείξεις:όταν προκαλούνται συμπτώματα από πίεση αγγείων ήνεύρων, δυσχέρεια κινητικότητας άρθρωσης και αι-σθητικοί λόγοι. Έχει παρατηρηθεί υποτροπή έως 2%επί ατελούς χειρουργικής εκτομής καθώς και εξαλ-λαγή σε χονδροσάρκωμα σε ποσοστό 1%. Κλινικάστοιχεία υπέρ εξαλλαγής, θεωρούνται η γρήγορη αύ-ξηση ή αύξηση μετά την ωρίμανση του σκελετού καιο πόνος, ενώ ακτινολογικά η πυκνή ασβέστωση στηνκορυφή πάχους άνω των 2 χιλιοστών με μυξοειδείς

56 Oστούν

Εικ. 2. Α) Απεικόνιση με αξονική τομογραφία (CT) οστεοειδούς οστεώματος στο σώμα του 12ου θωρακικού σπονδύλου σε αγόρι 15 ετών.Β) και Γ) Χρήση θερμικού καυτηριασμού της βλάβης με ραδιοκύματα με καθοδήγηση υπό CT. Δ) 6 μήνες μετά την παρέμβαση διαπιστώνεταιη βλάβη με στοιχεία νέκρωσης.


αλλοιώσεις και η υποτροπή μετά την εγχείρηση.Όγκοι όπως το εγχόνδρωμα, η ινώδης δυσπλασία

και η μονόχωρη κύστη μπορεί να εκδηλώνονται σανβλάβες σταδίου 1 ή σταδίου 2. Τα περισσότερα εγ-χονδρώματα στα παιδιά είναι σταδίου 1 και μπορούννα αντιμετωπιστούν μη επεμβατικά. Σε περιπτώσειςυποτροπιαζόντων καταγμάτων ενδείκνυνται η απόξε-ση και η πλήρωση. Ομοίως η ινώδης δυσπλασία πουεκδηλώνεται ως βλάβη σταδίου 1 μπορεί επίσης νααντιμετωπιστεί συντηρητικά. Οι βλάβες σταδίου 2, ανά-λογα με την εντόπισή τους την ηλικία του ασθενούς,τα συμπτώματά του και τον κίνδυνο κατάγματος, μπο-ρεί να απαιτήσουν χειρουργική θεραπεία. Σε σκελε-τικά ανώριμους ασθενείς οι ενδείξεις για χειρουργείοπεριλαμβάνουν υποτροπιάζον κάταγμα και προοδευ-τική δυσμορφία. Δυστυχώς η απλή απόξεση και ταοστικά μοσχεύματα στα παιδιά και στους ενήλικες σχε-τίζονται με τοπική υποτροπή. Η χειρουργική θεραπείαθα περιλαμβάνει την ολική εξαίρεση της βλάβης καιτην πλήρωση της περιοχής με οστικό μόσχευμα καιαν απαιτηθεί εσωτερική οστεοσύνθεση [23].

Η φυσική πορεία της μονόχωρης οστικής κύστηςείναι η τάση να υποχωρεί με τη σκελετική ωρίμανσηκαι πολλές μπορούν απλά να παρακολουθηθούν χω-ρίς ειδική θεραπεία. Πριν από τη σκελετική ωρίμανσηοι μονόχωρες οστικές κύστεις μπορούν να προκαλέ-σουν υποτροπιάζοντα κατάγματα. Αυτό γίνεται ιδιαί-τερα έκδηλο σε βλάβες που σχετίζονται με σημαντικήλέπτυνση του φλοιού, σε περιοχές που δέχονται τοσωματικό βάρος, όπως το εγγύς μηριαίο και σε πε-ριοχές που υπόκεινται σε στροφικές δυνάμεις, όπωςτο βραχιόνιο. Αρχικά τα περισσότερα παθολογικά κα-τάγματα πρέπει να θεραπεύονται συντηρητικά. Κα-τάγματα με παρεκτόπιση που περιλαμβάνουν το εγγύςμηριαίο μπορεί να απαιτήσουν χειρουργική αντιμετώ-πιση με σταθεροποίηση.

Πριν από το 1979 η θεραπεία των μονόχωρων οστι-κών κύστεων αποτελείτο πρωτίστως από απόξεση καιπλήρωση με οστικό μόσχευμα. Οι Scaglietti και συν.[24] δημοσίευσαν μελέτη με διαδερμική αναρρόφησηκαι έγχυση κορτικοστεροειδούς (μεθυλπρεδνιζολόνη).Η διαδερμική αναρρόφηση και έγχυση, φαίνεται νασυνδέεται με μικρότερη νοσηρότητα συγκριτικά με τιςανοιχτές διαδικασίες. Εντούτοις οι ασθενείς και οι γο-νείς τους θα πρέπει να ενημερώνονται ότι περισσό-τερες από μια εγχύσεις μπορεί πιθανόν να απαιτηθούνκαι ότι μια ανοιχτή επέμβαση πιθανόν να ενδείκνυταιόταν οι κλειστές διαδικασίες αποτύχουν.

Η ιστιοκύττωση Langerhans μπορεί περιστασιακάνα ιαθεί αυτόματα με την πάροδο του χρόνου. Πρα-κτικά πολλοί ασθενείς με ιστιοκύττωση υποβάλλονταισε βιοψία ή αναρρόφηση για να επιβεβαιωθεί η διά-γνωση όταν είναι αδύνατον να αποκλεισθεί λοίμωξηή σάρκωμα Ewing βάσει κλινικών και ακτινολογικώνκριτηρίων μόνο. Η βιοψία μπορεί να πραγματοποιηθείδιαδερμικά ή με ανοικτή επέμβαση. Αν η διάγνωσηεπιβεβαιωθεί με ανοικτή βιοψία η βλάβη μπορεί νααντιμετωπισθεί με απλή απόξεση. Οι Capanna και συν.[25] δημοσίευσαν ποικίλα αποτελέσματα μετά από έγ-χυση κορτικοστεροειδών. Μικρής δόσης ακτινοβολία(500-600 cGy) είναι πολύ αποτελεσματική για μεγάλεςή μη προσπελάσιμες βλάβες όπως εκείνες στη σπον-δυλική στήλη ή τη λεκάνη αλλά μπορούν να χρησιμο-ποιηθούν και σε κάθε βλάβη.

Το οστεοβλάστωμα, το χονδροβλάστωμα, το χον-δρομυξοειδές ίνωμα και η ανευρυσματική κύστη συ-νήθως εκδηλώνονται ως βλάβες σταδίου 2 ή 3.Το χον-δρομυξοειδές ίνωμα μπορεί να θεραπευτεί με πλήρηαπόξεση και πλήρωση με οστικό μόσχευμα. Στα παιδιάμε ανοιχτές επιφυσιακές πλάκες, η χειρουργική επέμ-βαση θα πρέπει να καθυστερεί όσο το δυνατόν πε-ρισσότερο για να αποφευχθεί τραυματισμός του επι-φυσιακού δίσκου.

Τα χονδροβλαστώματα εκδηλώνονται ως βλάβεςσταδίου 2 ή 3 αλλά σε αντίθεση με το χονδρομυξοει-δές ίνωμα έχουν τάση για πιο επιθετική συμπεριφοράκαι τοπική υποτροπή. Για αυτό το λόγο συνιστάται θε-ραπεία με απόξεση. Βλάβες που περιλαμβάνουν τηναυξητική πλάκα απαιτούν ολική εξαίρεση ακόμα καιμε τον κίνδυνο πρώιμης σύγκλισης. Μεγάλες βλάβεςμπορεί να απαιτήσουν πλήρωση με οστικό μόσχευμα.

Τα οστεοβλαστώματα σταδίου 2 και 3 διαφέρουνστην ανταπόκρισή τους στη θεραπεία. Για βλάβες πουπεριορίζονται μέσα στο οστό (σταδίου 2) η απόξεσηκαι η πλήρωση με μόσχευμα συνήθως αρκούν. Στιςβλάβες σταδίου 3, η ίδια θεραπεία μπορεί να οδηγήσεισε υποτροπή περίπου 20%. Γι’ αυτό το λόγο η εκτομήθα πρέπει να είναι ευρεία. Εντούτοις αυτό μπορεί ναμην είναι πάντα εφικτό χωρίς σημαντική νοσηρότηταειδικά στη σπονδυλική στήλη. Ο ρόλος της θεραπείαςμε ακτινοβολία παραμένει αμφιλεγόμενος. Φαίνεταιπως έχει θέση σε περιπτώσεις βλαβών της σπονδυλι-κής στήλης με εξάπλωση στα μαλακά μόρια ή στονεπισκληρίδιο χώρο, ή μετά από τοπική υποτροπή.

Οι ανευρυσματικές κύστεις επίσης εκδηλώνονταιως σταδίου 2 ή 3 βλάβες. Η φυσική τους πορεία είναι

Oστούν 57

Ι. Λυμπάρη

αυτή της συνεχιζόμενης αύξησης αν παραμείνουν χω-ρίς θεραπεία. Απλή απόξεση συνδέεται με μη αποδε-κτά υψηλά ποσοστά (>50%) τοπικής υποτροπής. Σεμια προσπάθεια να μειωθεί η τοπική υποτροπή μπορείνα χρησιμοποιηθεί εκτενής απόξεση μέσω ειδικούγλυφάνου υψηλής ταχύτητας. Σε μερικές περιπτώσειςμπορεί να χρειαστεί η σταθεροποίηση του οστού μεεσωτερική οστεοσύνθεση. Επίσης έχει εφαρμοσθεί ηκρυοχειρουργική μέθοδος με εισαγωγή στην κύστη,ύστερα από απόξεση, υγρού αζώτου σε πολύ χαμηλήθερμοκρασία (-20οC). Ανεγχείρητες ή δύσκολα προ-σπελάσιμες βλάβες ειδικά αυτές που περιλαμβάνουντην σπονδυλική στήλη πρέπει να αντιμετωπίζονται αρ-χικά με εμβολισμό και στη συνέχεια με ακτινοβολία.

Συμπέρασμα

Ενώ η πραγματική επίπτωση των καλοηθών όγκωνστα παιδιά είναι άγνωστη παραμένει μια κλινική οντότηταμε την οποία συχνά έρχεται αντιμέτωπος ο γενικός Ορ-θοπαιδικός. Καθώς εξοικειώνονται με τα κλινικά καιακτινολογικά χαρακτηριστικά των πιο κοινών καλοηθώνόγκων, οι θεράποντες θα είναι σε θέση να θέσουν μεακρίβεια τη σωστή διάγνωση χωρίς την ανάγκη βιοψίαςστις περισσότερες περιπτώσεις. Με την κατανόηση τηςφυσικής πορείας του όγκου και το στάδιο κατά την εμ-φάνισή του μπορούν να γίνουν οι κατάλληλες συστάσειςθεραπείας. Αυτό επιτρέπει στους γονείς και το παιδί ναενημερωθούν κατάλληλα εξαρχής και να αποφευχθείη υπερ- και η υπο- θεραπεία αυτών των όγκων.

58 Oστούν

AλληλογραφίαΙουλία Λυμπάρη,

Νοσοκομείο Παίδων «Αγία Σοφία»,Αθήνα


CorrespondenceJulia Lympari,“Aghia Sophia” Children’s Hospital,Athens, GreeceE-mail: [email protected]


1. Codman EA (1922). The registry of cases of bonesarcoma. Surg Gynecol Obstet 34:335-343.

2. Unni KK (1996). Dahlin’s Bone Tumors: GeneralAspects and Data on 11,087 Cases, 5th ed.Philadelphia: Lippincott-Raven, pp 11-24, 47-58,121-142.

3. Jaffe H (1935). “Osteoid osteoma”: A benignos-teoblastic tumor composed of osteoid and atyp-ical bone. Arch Surg 31:709-728.

4. Jaffe HL (1950). Aneurysmal bone cyst. Bull HospJoint Dis 11:3-13.

5. Frassica FJ, Waltrip RL, Sponseller PD, Ma LD,McCarthy EF Jr (1996). Clinicopathologic fea-tures and treatment of osteoid osteoma and os-teoblastoma in children and adolescents. OrthopClin North Am 27:559-574.

6. Carnesale PG (1998). Benign tumors of bone, inCanale ST (ed): Campbell’s Operative Or-thopaedics, 9th ed. St Louis: Mosby Year Book,vol 1, pp 683-702.

7. Scarborough MT, Moreau G (1996). Benign car-tilage tumors. Orthop Clin North Am 27:583-589.

8. Schmale GA, Conrad EU III, Raskind WH (1994).The natural history of hereditary multiple exos-

toses. J Bone Joint Surg Am 76:986-992.9. Copley L, Dormans JP (1996). Benign pediatric

bone tumors: Evaluation and treatment. PediatrClin North Am 43:949-966.

10. Crone-Munzebrock W, Brassow F (1983). A com-parison of radiographic and bone scan findingsin histiocytosis X. Skeletal Radiol 9:170-173.

11. Tachdjian MO (1990). Pediatric Orthopedics, 2nd

ed. Philadelphia: WB Saunders, vol 2, pp 1163-1171, 1206-1217, 1251-1272.

12. Brien EW, Mirra JM, Kerr R (1997). Benign andmalignant cartilage tumors of bone and joint:Their anatomic and theoretical basis with an em-phasis on radiology, pathology and clinical biol-ogy: I. The intramedullary cartilage tumors. Skele-tal Radiol 26:325-353.

13. Boriani S, Capanna R, Donati D, Levine A, PicciR, Savini R (1992). Osteoblastoma of the spine.Clin Orthop 278:37-45.

14. Madewell JE, Ragsdale BD, Sweet DE (1981).Radiologic and pathologic analysis of solitarybone lesions: Part I. Internal margins. Radiol ClinNorth Am 19:715-748.

15. Giudici MA, Moser RP Jr, Kransdorf MJ (1993).Cartilaginous bone tumors. Radiol Clin North Am31:237-259.


16. Yasko AW, Fanning CV, Ayala AG, Carrasco CH,Murray JA (1998). Percutaneous techniques forthe diagnosis and treatment of localized Langer-hans-cell histiocytosis (eosinophilic granulomaof bone). J Bone Joint Surg Am 80:219-228.

17. Kransdorf MJ, Sweet DE (1995). Aneurysmalbone cyst: Concept, controversy, clinical pres-entation and imaging. AJR Am J Roentgenol164:573-580.

18. Arata MA, Peterson HA, Dahlin DC (1981). Patho-logical fractures through nonossifying fibromas:Review of the Mayo Clinic experience. J BoneJoint Surg Am 63:980-988.

19. Kneisl JS, Simon MA (1992). Medical manage-ment compared with operative treatment for os-teoid-osteoma. J Bone Joint Surg Am 74:179-185.

20. Ward WG, Eckardt JJ, Shayestehfar S, Mirra J,Grogen T, Oppenheim W (1993). Osteoid osteo-ma: Diagnosis and management with low mor-bidity. Clin Orthop 291:229-235.

21. Roger B, Bellin MF, Wioland M, Grenier P (1996).Osteoid osteoma: CT-guided percutaneous exci-sion confirmed with immediate follow-up scintig-raphy in 16 outpatients. Radiology 201:239-242.

22. Rosenthal DI, Hornicek FJ, Wolfe MW, JenningsLC, Gebhardt MC, Mankin HJ (1998). Percuta-neous radiofrequency coagulation of osteoid os-teoma compared with operative treatment. JBone Joint Surg Am 80:815-821.

23. Enneking WF, Gearen PF (1986). Fibrous dysplasiaof the femoral neck: Treatment by cortical bone-grafting. J Bone Joint Surg Am 68:1415-1422.

24. Scaglietti O, Marchetti PG, Bartolozzi P (1979).The effects of methylprednisolone acetate in thetreatment of bone cysts: Results of three yearsfollow-up. J Bone Joint Surg Br 61:200-204.

25. Capanna R, Springfield DS, Ruggieri P, et al(1985). Direct cortisone injection in eosinophilicgranuloma of bone: A preliminary report on 11patients. J Pediatr Orthop 5:339-342.

Oστούν 59

60 Oστούν

Ανασκόπηση(2012) 23 (1): 60-64

Σχετιζόμενη με διφωσφονικά οστεονέκρωσητης γνάθουΑ. ΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ1, Ε. ΜΗΤΣΙΟΚΑΠΑ2, Α.Φ. ΜΑΥΡΟΓΕΝΗΣ3, Π.Ι. ΠΑΠΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΣ3

1 Χειρουργός Οδοντίατρος, Πάτρα2 Μονάδα Φυσικής Ιατρικής και Αποκατάστασης, Γενικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πατρών3 Α’ Ορθοπαιδική Κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο «ΑΤΤΙΚΟΝ», Aθήνα

Εισαγωγή

Τα διφωσφονικά αρχικά χρησιμοποιηθήκαν για τηναντιμετώπιση καταστάσεων και επιπλοκών σχετιζόμε-νων με τον καρκίνο όπως οστικές μεταστάσεις, υπε-ρασβεστιαιμία, και οστεολυτικές βλάβες. Στη συνέ-χεια, χρησιμοποιήθηκαν για την αντιμετώπιση διαφό-ρων άλλων παθήσεων του σκελετού όπως συγγενείςσκελετικές παθήσεις στα παιδιά, και στην αντιμετώ-

πιση της οστεοπόρωσης (νεανική, μετεμμηνοπαυσια-κή, μετά θεραπεία με κορτιζόνη, μετά μεταμόσχευση,από ακινητοποίηση, και από ανεπάρκεια των ανδρο-γόνων) [1,2].

Η οστεονέκρωση της γνάθου αποτελεί σπάνια αλλάσοβαρή επιπλοκή της θεραπείας με διφωσφονικά, ηοποία περιγράφηκε για πρώτη φορά το 2003 [1-6]. Οιασθενείς που δεν έχουν ιστορικό ακτινοθεραπείας,

Περίληψη

Τα διφωσφονικά χρησιμοποιήθηκαν αρχικά για τη θεραπεία καταστάσεων που συνδέονται με τον καρκίνο όπως οστικές μεταστάσεις,υπερασβεστιαιμία και οστεολυτικές βλάβες, και στη συνέχεια η χρήση τους εγκρίθηκε για την αντιμετώπιση της οστεοπόρωσης. Η οστε-ονέκρωση της γνάθου αποτελεί σπάνια αλλά σοβαρή επιπλοκή των διφωσφονικών, με συνεχώς αυξανόμενη κλινική σημασία λόγω τηςσυχνότερης χρήσης των διφωσφονικών σήμερα σε σχέση με το παρελθόν. Η αιτιολογία και η παθογένεια της οστεονέκρωσης της γνάθουπαραμένουν άγνωστες. Έχουν αναγνωρισθεί δύο σημαντικοί παράγοντες κινδύνου: η δραστικότητα και διάρκεια της θεραπείας με διφω-σφονικά, και οι πρόσφατες οδοντιατρικές χειρουργικές επεμβάσεις. Η πρόληψη είναι ο σκοπός της σύγχρονης αντιμετώπισης. Η θεραπείαπαραμένει εμπειρική και εξαρτάται από το στάδιο της νόσου. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η σύνοψη των σύγχρονων οδηγιώνγια την πρόληψη και θεραπεία της οστεονέκρωσης της γνάθου σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με διφωσφονικά.

Λέξεις κλειδιά: Διφωσφονικά, Οστεονέκρωση, Γνάθος

Bisphosphonates related osteonecrosis of the jawA. MITROPOULOS1, E. MITSIOKAPA2, A.F. MAVROGENIS3, P.J. PAPAGELOPOULOS3

1 Dentist, Patras, Greece2 Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University Hospital of Patras, Greece3 First Department of Orthopaedics, Athens University Medical School, “ATTIKON” University Hospital, Athens Greece

Summary

Bisphophonates have been initially used for the treatment of complications of cancer including bone metastases, hypercalcemia,lytic skeletal lesions, and recently for the management of osteoporosis. Osteonecrosis of the jaw is a rare and serious complicationof bisphosphonate therapy. The problem is growing because biphosphonates are currently more commonly used than in the past.The etiopathogenesis of osteonecrosis of the jaw remainσ unknown. Two risk factors have been identified: the potency and lengthof bisphosphonate uptake, and recent dental intervention. Prevention is the mainstay of management. Treatment is based on expertsopinion and depends on the stage of the disease. The purpose of the present study is to summarize the current guidelines for the pre-vention and management of osteonecrosis of the jaw in patients with bisphosphonates treatment.

Keywords: Bisphosphonates, Οsteonecrosis, Jaw

Σχετιζόμενη με διφωσφονικά οστεονέκρωση της γνάθου

Oστούν 61

οι οποίοι πρόσφατα ή κατά το παρελθόν έλαβαν δι-φωσφονικά και εκδηλώνουν συμπτώματα στη γναθο-προσωπική χώρα τα οποία επιμένουν για περισσότεροαπό 8 εβδομάδες, μπορεί να πάσχουν από σχετιζό-μενη με διφωσφονικά οστεονέκρωση της γνάθου [1].Ο κίνδυνος οστεονέκρωσης της γνάθου σε ασθενείςμε κακοήθη νεοπλάσματα που αντιμετωπίσθηκαν μεδιφωσφονικά κυμαίνεται από 1% έως 11%, ανάλογαμε το φάρμακο, τη δοσολογία και τη διάρκεια της θε-ραπείας με διφωσφονικά, και την εκτέλεση οδοντια-τρικών ή σπανιότερα άλλων χειρουργικών επεμβάσε-ων στη στοματική κοιλότητα [2-5]. Για παράδειγμα, σεασθενείς με πολλαπλούν μυέλωμα, η συχνότητα οστε-ονέκρωσης της κάτω γνάθου είναι 7% έως 10% [2].

Κλινική εικόνα και αιτιοπαθογένεια

Η οστεονέκρωση είναι όρος που χρησιμοποιείταιγια να περιγράψει το θάνατο των κυττάρων των οστών(οστεοκύτταρα του φλοιώδους οστού και κύτταρα τουμυελού των οστών στο σπογγώδες οστούν, όπως αι-μοποιητικά βλαστικά κύτταρα, στρωματικά κύτταρα,προ-οστεοβλάστες, ώριμες οστεοβλάστες, επιθηλιακάκύτταρα, και οστεοκλάστες). Η οστεονέκρωση επίσηςπροκαλεί το θάνατο των ενδοθηλιακών κυττάρων τωνοστών και των αγγείων των οστών με αποτέλεσμα μεί-ωση της ροής του αίματος στο οστό. Συνεπώς, η οστε-ονέκρωση από μόνη της δεν είναι νόσος αλλά το τε-λικό αποτέλεσμα της διακοπής της ροής του αίματοςστο οστούν από διάφορους παράγοντες.

Παρά το γεγονός ότι η αιτιοπαθογένεια της σχετι-ζόμενης με διφωσφονικά οστεονέκρωσης της γνάθουπαραμένει ασαφής, διαφέρει κλινικά από τις υπόλοι-πες μορφές οστεονέκρωσης. Η κλινική εικόνα χαρα-κτηρίζεται από επώδυνη διόγκωση και λοίμωξη τηςγνάθου, οίδημα των μαλακών ιστών, χαλάρωση τωνοδόντων, και αποκάλυψη του οστού. Σπανιότερα μπο-ρεί να είναι ασυμπτωματική [7]. Όλες οι περιπτώσειςέχουν περιγραφεί στα οστά της κάτω και άνω γνάθου,με συχνότερη εντόπιση στην κάτω γνάθο (63%) σεσχέση με την άνω γνάθο (38%) [8]. Μία περίπτωσηέχει αναφερθεί στα οστά του έξω ακουστικού πόρου[9]. Γενικά, η νόσος προσβάλλει περιοχές εντός τηςστοματικής κοιλότητας οι οποίες καλύπτονται από λε-πτό και ευάλωτο βλεννογόνο, όπως οι υπερώες και ηγλωσσική επιφάνεια της κάτω γνάθου [10].

Έχουν συσχετισθεί δύο σημαντικοί παράγοντες κιν-δύνου με την αιτιοπαθογένεια της σχετιζόμενης με δι-φωσφονικά οστεονέκρωσης της γνάθου: η δραστικό-

τητα του φαρμάκου και η διάρκεια της θεραπείας μεδιφωσφονικά, και οι πρόσφατες οδοντιατρικές χειρουρ-γικές παρεμβάσεις στη στοματική κοιλότητα [1-6]. Τακύρια διφωσφονικά που έχουν συνδεθεί με την εκ-δήλωση οστεονέκρωσης της γνάθου ήταν τα ενδο-φλέβια χορηγούμενα διφωσφονικά ζολεδρονικό οξύ(Zometa®) και παμιδρονάτη (Aredia®). Ο κίνδυνοςοστεονέκρωσης ήταν σημαντικά υψηλότερος με τηχoρήγηση του ζολεδρονικού οξέος σε σχέση με τηνπαμιδρονάτη [4,6]. Ο κίνδυνος ήταν 1% το πρώτοέτος και έως 21% το τρίτο έτος θεραπείας με ζολε-δρονικό οξύ, ενώ ο αντίστοιχος κίνδυνος σε ασθενείςπου ελάμβαναν παμιδρονάτη ήταν 0% τα δύο πρώταέτη θεραπείας και 7% στα τέσσερα έτη [6]. Ωστόσο,έχουν αναφερθεί περιπτώσεις οστεονέκρωσης τηςγνάθου σε ασθενείς οι οποίοι ελάμβαναν από τουστόματος διφωσφονικά όπως αλεδρονάτη (Fosamax®)και ρισεδρονάτη (Actonel®) [11,12]. Η ισχυρή συσχέτισημε τα δύο ενδοφλέβια χορηγούμενα διφωσφονικά μπορείνα σχετίζεται με τη μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα των εν-δοφλέβιων συγκριτικά με εκείνη των από του στόματοςχορηγούμενων διφωσφονικών. Ποσοστό μεγαλύτερο του50% των ενδοφλέβια χορηγούμενων διφωσφονικών είναιβιοδιαθέσιμο για ενσωμάτων στην οστική θεμέλια ουσίασυγκριτικά με περίπου 1% των από του στόματος χορη-γούμενων διφωσφονικών που απορροφώνται από το γα-στρεντερικό σωλήνα [13].

Η διάρκεια της θεραπείας με διφωσφονικά έχει επί-σης συσχετισθεί με την εκδήλωση οστεονέκρωσηςτης γνάθου: οι ασθενείς με οστεονέκρωση της γνά-θου είχαν λάβει κατά μέσο όρο 35 εγχύσεις διφω-σφονικών σε σύγκριση με 15 εγχύσεις σε ασθενείςχωρίς οστεονέκρωση της γνάθου. Περίπου το 70%των ασθενών που αναπτύσσουν οστεονέκρωση τηςγνάθου είχαν στο ιστορικό τους κάποια πρόσφατηοδοντιατρική ή άλλη χειρουργική επέμβαση στη στο-ματική κοιλότητα [10]. Ωστόσο, ακόμη και αυτόματη(χωρίς χειρουργική επέμβαση) σχετιζόμενη με διφω-σφονικά οστεονέκρωση της γνάθου έχει αναφερθείσε ποσοστό έως 30% των ασθενών [4].

Πρόληψη

Η πρόληψη είναι η καλύτερη προσέγγιση για τηναντιμετώπιση της σχετιζόμενης με διφωσφονικά οστε-ονέκρωσης της γνάθου [1-3]. Έχει σημασία να παρα-κολουθούνται κλινικά οι ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουνδιφωσφονικά για πρώιμα κλινικά σημεία εκδήλωσηςτης νόσου. Η πρόληψη θα πρέπει να περιλαμβάνει:

Α. Μητρόπουλος και συν.

62 Oστούν

• Πριν την έναρξη της θεραπείας με διφωσφονικάόλοι οι ασθενείς θα πρέπει να υφίστανται οδοντια-τρικό έλεγχο, να θεραπεύεται οποιαδήποτε πιθανήεγκατεστημένη λοίμωξη της στοματικής κοιλότητας,και να αντιμετωπίζονται δυνητικοί παράγοντες ανά-πτυξης στοματικής λοίμωξης οι οποίοι αναγνωρί-ζονται από την οδοντιατρική εξέταση. Η οδοντιατρι-κή θεραπεία θα πρέπει να περιλαμβάνει εξαγωγήοδόντων τα οποία δεν δύναται να διασωθούν, καινα ολοκληρώνονται επανορθωτικές οδοντιατρικέςχειρουργικές επεμβάσεις στη στοματική κοιλότηταμε σκοπό τη στοματική υγιεινή. Μετά την ολοκλή-ρωση των οδοντιατρικών πράξεων, πριν την έναρξητης θεραπείας με διφωσφονικά θα πρέπει να επι-τρέπεται ο απαραίτητος χρόνος για την πλήρη επού-λωση των οδοντιατρικών χειρουργικών τραυμάτων,και οι ασθενείς να λαμβάνουν οδηγίες και να εκ-παιδεύονται σχετικά με τους κανόνες στοματικήςυγιεινής, την αποφυγή κακώσεων του στοματικούβλεννογόνου, και την έγκαιρη αναγνώριση κλινικώνσυμπτωμάτων που μπορεί να σχετίζονται με την εκ-δήλωση οστεονέκρωσης όπως πόνος, οίδημα, οστι-κή προβολή ή/και αποκάλυψη οστού από το στομα-τικό βλεννογόνο [1-5].

• Κατά τη διάρκεια της θεραπείας με διφωσφονικά,οι ασθενείς θα πρέπει να ακολουθούν αυστηρά τουςκανόνες στοματικής υγιεινής και να αποφεύγουν μηεπείγουσες επεμβάσεις στη στοματική κοιλότητα.

• Σε ασυμπτωματικούς ασθενείς οι οποίοι βρίσκονταιυπό θεραπεία με διφωσφονικά θα πρέπει να συστή-νεται αυστηρή στοματική υγιεινή, αποφυγή οποιον-δήποτε οδοντιατρικών χειρισμών που μπορεί ναοδηγήσουν σε οστική βλάβη, τα δόντια που δεν μπο-ρούν να διασωθούν δεν θα πρέπει να αφαιρούνταιαλλά να αντιμετωπίζονται με ενδοδοντική θεραπεία,να αποφεύγεται η τοποθέτηση οδοντιατρικών γνα-θικών εμφυτευμάτων, και να γίνεται τακτική εξέτασηαπό οδοντίατρο [1,3,4].

• Ασυμπτωματικοί ασθενείς οι οποίοι βρίσκονται υπόθεραπεία με διφωσφονικά και χρειάζεται να υπο-βληθούν σε κοινές οδοντιατρικές επεμβάσεις θαπρέπει να ενημερώνονται για τον κίνδυνο εκδήλω-σης οστεονέκρωσης της γνάθου, και τη σημασίαδιατήρησης ιδανικής στοματικής υγιεινής, προλη-πτικής οδοντικής υγείας, και άμεσης οδοντιατρικήςεξέτασης σε περίπτωση εμφάνισης κλινικών συμ-πτωμάτων [1,2]. Ο κίνδυνος οστεονέκρωσης σεασθενείς υπό θεραπεία με από τους στόματος δι-

φωσφονικά είναι σημαντικά μικρότεροι συγκριτικάμε εκείνους υπό ενδοφλέβια θεραπεία, αλλά εξαρ-τάται περισσότερο από τη διάρκεια της θεραπείαςσε εκείνους υπό από του στόματος θεραπεία [12].

• Σε ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν διφωσφονικά γιαλιγότερο από τρία έτη και δεν έχουν παράγοντεςκινδύνου δεν απαιτείται αναβολή της χειρουργικήςεπέμβασης στην στοματική κοιλότητα ή στη γναθο-προσωπική περιοχή [1]. Απλές οδοντιατρικές επεμ-βάσεις μπορεί να γίνουν στους ασθενείς αυτούςχωρίς κίνδυνο. Ωστόσο, εξαγωγές οδόντων και γνα-θοπροσωπικές επεμβάσεις θα πρέπει να αποφεύ-γονται καθώς η πώρωση των οστών μπορεί να είναιμειονεκτική. Οι ασθενείς με αφαιρούμενες τεχνητέςοδοντοστοιχίες θα πρέπει να εξετάζονται για περιο-χές κάκωσης του στοματικού βλεννογόνου [10].

• Σε ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν διφωσφονικά γιαπερισσότερο από τρία έτη και σε εκείνους οι οποίοιλαμβάνουν κορτικοστεροειδή μαζί με διφωσφονικά,η θεραπεία με διφωσφονικά θα πρέπει να διακό-πτεται για τουλάχιστον τρεις μήνες πριν την οδον-τιατρική επέμβαση, και να ξεκινά αφού έχει επέλθειπλήρης επούλωση του οδοντιατρικού/χειρουργικούτραύματος στη στοματική κοιλότητα [1].

Θεραπεία

Σε ασθενείς με κλινικά έκδηλη οστεονέκρωση τηςγνάθου, η διακοπή της θεραπείας και η επαναχορή-γηση των διφωσφονικών (ειδικά για τα ενδοφλέβιαχορηγούμενα) εξαρτάται από την αξιολόγηση των κιν-δύνων και τα οφέλη για τον ασθενή, τα οποία θα πρέ-πει να καθορίζονται σε συνεργασία από τον αιματο-λόγο/ογκολόγο και τον οδοντίατρο/γναθοχειρουργό[1]. Η διακοπή της θεραπείας με διφωσφονικά σχετί-ζεται με σταθεροποίηση της νόσου, αποφυγή επέκτα-σης ή εμφάνισης νέων εστιών οστεονέκρωσης, καισταδιακή βελτίωση της κλινικής εικόνας. Ωστόσο, ηδιακοπή της θεραπείας με διφωσφονικά για 6 έως 12μήνες μπορεί να οδηγήσει σε πλήρη ίαση ή αυτόματηαπολυματοποίηση του προσβεβλημένου οστού [1].

Η θεραπεία της σχετιζόμενης με διφωσφονικάοστεονέκρωσης της γνάθου σήμερα είναι εμπειρική,και εξαρτάται από το κλινικό στάδιο της νόσου ανά-λογα με την παρουσία ή απουσία κλινικών συμπτωμά-των των ασθενών (Πίνακας) [14]. Ο σκοπός της θε-ραπείας είναι η ανακούφιση από τον πόνο, ο έλεγχοςτης λοίμωξης, και η αναστολή της εξέλιξης της οστε-ονέκρωσης. Δυστυχώς, οι ασθενείς με σχετιζόμενη

Σχετιζόμενη με διφωσφονικά οστεονέκρωση της γνάθου

Oστούν 63

με διφωσφονικά οστεονέκρωση της γνάθου δεν αν-ταποκρίνονται στις κλασσικές θεραπείες για οστεο-μυελίτιδα και μετακτινική οστεονέκρωση όπως η ευ-ρεία χειρουργική εκτομή και το υπερβαρικό οξυγόνο.Ο χειρουργικός καθαρισμός του νεκρωτικού οστούείναι δύσκολος καθώς ολόκληρο το οστούν της γνά-θου έχει συνήθως προσβληθεί (από τη δράση του δι-

φωσφονικού ή τη νόσο). Για το λόγο αυτό, η χειρουρ-γική θεραπεία θα πρέπει να καθυστερεί όσο το δυνατόκαθώς τα χειρουργικά τραύματα μπορεί να οδηγή-σουν σε επέκταση της οστεονέκρωσης [1,2]. Η χει-ρουργική θεραπεία ενδείκνυται για ασθενείς με οστε-ονέκρωση της γνάθου σταδίου 3 και για εκείνους μεοστικά απολύματα [1].

Πίν. 1. Σταδιοποίηση και θεραπεία της σχετιζόμενης με διφωσφονικά οστεονέκρωσης της γνάθου. (Από American Association of Oral andMaxillofacial Surgeons).

Στάδιο Θεραπεία

Στάδιο 0Μη ειδικά κλινικά ευρήματα και συμπτώματα, Καμία θεραπεία, ενημέρωση και εκπαίδευση των ασθενών απουσία οστεονέκρωσης ή αποκάλυψης του οστού, ασθενείς με θεραπεία με από τους στόματος ή ενδοφλέβια διφωσφονικά

Στάδιο 1Οστεονέκρωση ή αποκάλυψη του οστού, Στοματικές πλύσεις με στοματικά διαλύματα με αντιβιοτικά, ασυμπτωματικοί ασθενείς χωρίς σημεία λοίμωξης κλινική εξέταση κάθε τρεις μήνες, εκπαίδευση των ασθενών,

αναθεώρηση των ενδείξων θεραπείας με διφωσφονικά

Στάδιο 2Οστεονέκρωση ή αποκάλυψη του οστού Στοματικές πλύσεις με στοματικά διαλύματα με αντιβιοτικά, με σημεία λοίμωξης (πόνος, ερυθρότητα, από του στόματος αντιβιοτικά ευρέος φάσματος, αναλγητικά, με ή χωρίς πυώδη έκκριση) επιπολής καθαρισμός για νεαροποίηση και περιορισμό της

λοίμωξης των μαλακών ιστών

Στάδιο 3Οστεονέκρωση ή αποκάλυψη του οστού, λοίμωξη, Στοματικές πλύσεις με στοματικά διαλύματα με αντιβιοτικά, και ένα ή περισσότερα από τα παρακάτω: αντιβιοτικά ευρέος φάσματος, αναλγητικά, χειρουργικός παθολογικό κάταγμα, συρίγγιο εκτός της στοματικής καθαρισμός του νεκρωτικού οστού και της λοίμωξης κοιλότητας, σημαντική οστεόλυση η οποία επεκτείνεται στο κάτω χείλος της γνάθου

AλληλογραφίαΑνδρέας Μητρόπουλος,

Ρήγα Φεραίου 48-50,ΤΚ 26221, Πάτρα


CorrespondenceΑndreas Mitropoulos,48-50 Riga Fereou Str,PC 26221, Patra, GreeceE-mail: [email protected]


1. Ruggiero SL, Dodson TB, Assael LA, et al (2009).American 1 Association of Oral and MaxillofacialSurgeons position paper on bisphosphonate-re-lated osteonecrosis of the jaw - 2009 update.Austral Endodontic J 35:119-130.

2. Drake MT, Clarke BL, Khosla S (2008). Bisphos-phonates: Mechanism of action and role in clini-cal practice. Mayo Clinic Proc 83:1032-1045.

3. Kyle RA, Yee GC, Somerfield MR, et al (2007). Amer-ican Society of Clinical Oncology 2007 clinical prac-tice guideline up-date on the role of bisphosphonatesin multiple myeloma. J Clin Oncol 25:2464-2472.

Α. Μητρόπουλος και συν.

64 Oστούν

4. Lacy MQ, Dispenzieri A, Gertz MA, et al (2006).Mayo clinic consensus statement for the use ofbisphosphonates in multiple myeloma. MayoClinic Proc 81:1047-1053.

5. Terpos E, Sezer O, Croucher PI, et al (2009). Theuse of bisphosphonates in multiple myeloma:Recommendations of an expert panel on behalfof the European Mye-loma Network. Ann Oncol20:1303-1317.

6. Bamias A, Kastritis E, Bamia C, et al (2005). Os-teonecrosis of the jaw in cancer after treatmentwith bisphosphonates: incidence and risk fac-tors. J Clin Oncol 23:8580-8587.

7. Marx RE (2003). Pamidronate (Aredia) and zole-dronate (Zometa) induced avascular necrosis ofthe jaws: a growing epidemic. J Oral MaxillofacSurg 61:1115-1117.

8. Marx RE, Sawatari Y, Fortin M, Broumand V(2005). Bisphosphonate-induced exposed bone(osteonecrosis/osteopetrosis) of the jaws: riskfactors, recognition, prevention, and treatment.J Oral Maxillofac Surg 63:1567-1575.

9. Polizzotto MN, Cousins V, Schwarer AP (2006).Bisphosphonate-associated osteonecrosis of the

auditory canal. Br J Haematol 132:114.10. Migliorati CA, Schubert MM, Peterson DE, Sene-

da LM (2005). Bisphosphonate-associated os-teonecrosis of mandibular and maxillary bone.An emerging oral complication of supportive can-cer therapy. Cancer 104: 83–93.

11. Ruggiero SL, Mehrotra B, Rosenberg TJ, EngroffSL (2004). Osteonecrosis of the jaws associatedwith the use of bisphosphonates: a review of 63cases. J Oral Maxillofac Surg 62:527-534.

12. American Dental Association Council on Scien-tific and Affairs (2006). Dental management ofpatients receiving oral bisphosphonate therapy:expert panel recommendations. J Am Dent As-soc 137:1144-1150.

13. Ezra A, Golomb G (2000). Administration routesand delivery systems of bisphosphonates for thetreatment of bone resorption. Adv Drug Deliv Rev42:175-195.

14. Ruggiero SL, Fantasia J, Carlson E (2006). Bis-phosphonate-related osteonecrosis of the jaw:background and guidelines for diagnosis, stagingand management. Oral Surg Oral Med OralPathol Oral Radiol Endod 102:433-441.

Oστούν 65

To «ΟΣΤΟΥΝ», επιστημονικό όργανο της Ελληνικής Εταιρείας ΜελέτηςΜεταβολισμού των Οστών, έχει σκοπό την ενημέρωση και επιμόρφωσητων ιατρών πάνω στον τομέα της φυσιολογίας και παθολογίας του μυο-σκελετικού συστήματος και ειδικότερα των Μεταβολικών Νοσημάτων τωνΟστών. Για την πραγμάτωση του σκοπού αυτού το περιοδικό δημοσιεύει:- Άρθρα του εκδότη.- Ξένες δημοσιεύσεις. Γράφονται από ξένο, διαπρεπή συγγραφέα κατό-

πιν συνεννοήσεως με τη συντακτική επιτροπή. Μεταφράζονται με ευ-θύνη της συντακτικής επιτροπής.

- Ανασκοπήσεις. Ολοκληρωμένες αναλύσεις ιατρικών θεμάτων στιςοποίες θα υπογραμμίζονται ιδιαίτερα οι σύγχρονες απόψεις.

- Κλινικές και εργαστηριακές μελέτες.- Ερευνητικές εργασίες.- Ενδιαφέρουσες περιπτώσεις (Case Reports).- Σεμινάρια, στρογγύλες τράπεζες, συμπόσια.- Επίκαιρα θέματα. Σύντομη περιγραφή των τελευταίων απόψεων σε συγ-

κεκριμένο θέμα.- Γράμματα προς τον Εκδότη.

Έκταση άρθρων: Οι ανασκοπήσεις δεν πρέπει να ξεπερνούν τις 7.500λέξεις (25 δακτυλογραφημένες σελίδες). Η σύνταξη διατηρεί το δικαίωμανα δημοσιεύει άρθρα ανασκόπησης με μεγαλύτερη έκταση. Οι ερευνητι-κές εργασίες, καθώς και οι κλινικές και εργαστηριακές μελέτες, δεν πρέ-πει να υπερβαίνουν τις 3.500 λέξεις. Οι ενδιαφέρουσες περιπτώσεις καιτα επίκαιρα θέματα δεν πρέπει να ξεπερνούν τις 1.000 λέξεις και τα γράμ-ματα προς τον Εκδότη τις 400 λέξεις.

Σύνταξη των κειμένων: Τα άρθρα πρέπει να είναι δακτυλογραφη-μένα με διπλό διάστημα, σε λευκό χαρτί, στη μία μόνο όψη, με περιθώριατουλάχιστον 3.5 εκ. Σε ξεχωριστή σελίδα γράφονται ο τίτλος, η Ελληνικήπερίληψη με τους όρους ευρετηρίου, η Αγγλική περίληψη, το κείμενο, οιβιβλιογραφικές παραπομπές, οι πίνακες, οι εικόνες και οι λεζάντες τωνεικόνων. Η αρίθμηση των σελίδων αρχίζει από τη σελίδα με τον τίτλο. Οιαριθμοί αναγράφονται στο άνω δεξιό μέρος κάθε σελίδας.

Σελίδα με τον τίτλο: Περιλαμβάνει: 1) τον τίτλο του άρθρου, 2) τοόνομα του (ων) συγγραφέα (ων), 3) το ίδρυμα από το οποίο προέρχεται ηεργασία, 4) το όνομα, διεύθυνση και τηλέφωνο του συγγραφέα, 5) ενδε-χόμενες πηγές που ενίσχυσαν και βοήθησαν στην πραγματοποίηση τηςεργασίας.

Ελληνική περίληψη και όροι ευρετηρίου: Η περίληψη πρέπει ναείναι ουσιαστική και κατατοπιστική και να μην υπερβαίνει τις 200 λέξεις.Μετά την περίληψη παρατίθενται 3-10 λέξεις (όροι ή μικρές φράσεις) ευ-ρετηριασμού, απαραίτητες για τη σύνταξη των ευρετηρίων του περιοδικού.Οι λέξεις αυτές πρέπει να αντιστοιχούν στους διεθνείς όρους λεξικογρά-φησης που χρησιμοποιεί το Index Medicus.

Αγγλική περίληψη (Summary): Στην Αγγλική περίληψη πρέπει να πε-ριλαμβάνονται ο τίτλος και τα ονόματα των συγγραφέων. Η περίληψη πρέπεινα είναι εκτεταμένη και να αποτελεί πραγματική σύνοψη του κειμένου. Τηναγγλική περίληψη συνοδεύουν οι όροι ευρετηριασμού επίσης στα Αγγλικά.

Βιβλιογραφικές παραπομπές: Η βιβλιογραφία και οι βιβλιογραφικέςπαραπομπές στο κείμενο θα τοποθετούνται με αριθμητική σειρά. Πρέπει

να χρησιμοποιούνται μόνο απαραίτητες βιβλιογραφικές παραπομπές πουθα αναφέρονται στο κείμενο. Όταν σε ένα σημείο του κειμένου χρειάζονταιπολλές παραπομπές, τότε αναφέρονται με χρονολογική σειρά. Αναγρά-φονται κατά σειρά τα επώνυμα, τα αρχικά των ονομάτων των συγγραφέων,το έτος δημοσιεύσεως (σε παρένθεση), ο τίτλος της εργασίας, το όνοματου περιοδικού, ο τόμος και η πρώτη σελίδα του άρθρου, με τις συντομεύ-σεις που αναφέρονται στο Index Medicus π.χ.

Handler NM (1985) Osteoarthritis as a public health problem.Clin Rheum Dis 11:175Προκειμένου για βιβλίο θα αναφέρεται το όνομα του συγγραφέα, η χρο-

νολογία εκδόσεως, ο τίτλος, ο εκδοτικός οίκος και η πόλη που εκδόθηκετο βιβλίο π.χ.

Rasmussen Η. Bordier PJ (1974). The Physiological and CellularBasis of Metabolic Bone Disease. Williams and Wilkins. Baltimore.

Καλούνται οι συγγραφείς να ερευνούν την Ελληνική βιβλιογραφία καινα αναφέρονται στους Έλληνες συγγραφείς.

Πίνακες: Δακτυλογραφούνται με διπλό διάστημα σε χωριστή σελίδα οκαθένας. Αναφέρονται στο κείμενο και αριθμούνται με αραβικούς αριθ-μούς. Πρέπει να συνοδεύονται από περιεκτική, σύντομη λεζάντα, ώστεγια την κατανόησή τους να μην είναι απαραίτητη η αναφορά του αναγνώ-στη στο κείμενο.

Εικόνες (σχήματα, φωτογραφίες): Τα σχήματα (σχεδιαγράμματα)πρέπει να γίνονται σε ριζόχαρτο με σινική μελάνη ή ραπιντογράφο. Τοίδιο ισχύει και για τα στοιχεία που αναφέρονται σε αυτά. Οι φωτογραφίεςπρέπει να είναι ασπρόμαυρες, τυπωμένες σε γυαλιστερό χαρτί, στο πίσωμέρος του οποίου να σημειώνεται με απλό μολύβι το όνομα του συγγρα-φέα και ο αριθμός της εικόνας όπως μπαίνει στο κείμενο. Ένα βέλος δεί-χνει το πάνω μέρος της φωτογραφίας. Εάν χρησιμοποιηθούν εικόνεςασθενών θα πρέπει τα πρόσωπά τους να μην διακρίνονται, αλλιώς θα πρέ-πει να υποβληθεί στη Σύνταξη έγγραφη συγκατάθεση του ασθενούς γιατη δημοσίευση των φωτογραφιών. Εάν μία φωτογραφία έχει δημοσιευθείαλλού πρέπει να συνοδεύεται από γραπτή άδεια του εκδότη που έχει τοcopyright αναδημοσίευσης της φωτογραφίας. Στη λεζάντα της φωτογρα-φίας θα πρέπει να αναφέρεται η πηγή προέλευσής της. Οι λεζάντες τωνσχημάτων και των φωτογραφιών δακτυλογραφούνται με διπλό διάστημα,σε ξεχωριστή σελίδα και αριθμούνται με αραβικούς αριθμούς.

Γλώσσα: Ως γλώσσα του περιοδικού θεωρείται η νεοελληνική και ωςσύστημα γραφής το μονοτονικό. Ξένοι όροι πρέπει να αποφεύγονται, ιδίωςόταν υπάρχουν αντίστοιχοι Ελληνικοί σε χρήση. Αν ο Ελληνικός όρος θε-ωρηθεί αδόκιμος μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ο ξενικός σε παρένθεση.

Τα άρθρα που υποβάλλονται θα θεωρούνται για δημοσίευση με τηνπροϋπόθεση ότι τα αποτελέσματα ή το ίδιο το κείμενο δεν έχουν δημοσι-ευθεί και δεν έχουν υποβληθεί για δημοσίευση σε άλλο περιοδικό. Ό,τιδημοσιεύεται στο «ΟΣΤΟΥΝ» δεν μπορεί να αναδημοσιευθεί χωρίς τη γρα-πτή έγκριση του Διευθυντή Σύνταξης.

Τα προς δημοσίευση άρθρα θα πρέπει να στέλνονται σε 3 πλήρη αντί-γραφα, με συνοδευτική επιστολή, στη διεύθυνση: «ΟΣΤΟΥΝ», ΔιευθυντήΣύνταξης, Θράκης 2, 151 24 Mαρούσι.

Οδηγίες προς τους συγγραφείς

Θράκης 2, 151 24 MαρούσιΤηλ./FAX: 210-6128606


66 Oστούν

ΠΡΟΣΕΧΕΙΣΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ

27 Ιουνίου - 1 Ιουλίου 20128ο ΘΕΡΙΝΟ ΣΧΟΛΕΙΟ, ΕΕΜΜΟRoyal Myconian Hotel, MύκονοςΔιοργάνωση: Ελληνική Εταιρεία Μελέτης Μεταβολισμού των ΟστώνΘράκης 2, 15124, ΜαρούσιΤηλ./Fax: 210 6128606E-mail: [email protected]: www.eemmo.grOργάνωση-Γραμματεία: PCO-CONVIN S.A.,Κ. Βάρναλη 29, 15233 ΧαλάνδριΤηλ.: 210 6833600Fax: 210 6847700Email: [email protected]

1-4 July 2012OSTEOPOROSIS AND BONE CONFERENCE2012Manchester Central Convention ComplexConference Secretariat:HG3 ConferencesFirst FloorHornbeam Business ParkHookstone RoadHarrogateHG2 8QTTel.: +44 (0)843 289 4750Fax: +44 (0)1423 855999Email: [email protected]: www.nos.org.uk/conference

November 29 - December 1, 2012IOF-ECCEO 12INTERNATIONAL CONFERENCE ONPROGRESS IN BONE AND MINERAL RESEARCH 2012Vienna / AustriaContact: Conference Secretariat, Vienna Academy of Postgraduate Medical Education and ResearchTel.: 011-43-1-40-513-8335Fax: 011-43-1-40-513-8318Email: [email protected]: http://www.ausbmr.at/ausbmr.htm

28-30 Σεπτεμβρίου 201220ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΕΕΜΜΟAvra Imperial Hotel, ΧανιάΔιοργάνωση: Ελληνική Εταιρεία Μελέτης Μεταβολισμού των ΟστώνΘράκης 2, 15124, ΜαρούσιΤηλ./Fax: 210 6128606E-mail: [email protected]: www.eemmo.grOργάνωση-Γραμματεία: PCO-CONVIN S.A.,Κ. Βάρναλη 29, 15233 ΧαλάνδριΤηλ.: 210 6833600Fax: 210 6847700Email: [email protected]

ΗΟΜΕ · boea, το αφέψημα του οποίου (τσάι του βουνού της...

Documents

Transcript of ΗΟΜΕ · boea, το αφέψημα του οποίου (τσάι του βουνού της...