OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR TOXOPLASMA GONDII E … · Obrigada por me ensinar a viver com...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANDREA DANTAS DE MEDEIROS
OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR TOXOPLASMA
GONDII E AVALIAÇÃO DA IMUNIZAÇÃO EM CAPRINOS
DO SERTÃO DO CABUGI, RIO GRANDE DO NORTE.
NATAL/RN
OUTUBRO/2010
II
ANDREA DANTAS DE MEDEIROS
OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR TOXOPLASMA
GONDII E AVALIAÇÃO DA IMUNIZAÇÃO EM CAPRINOS
DO SERTÃO DO CABUGI, RIO GRANDE DO NORTE.
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas do Centro de
Biociências, da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, como parte
dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Ne to
DMP/ CB / UFRN
NATAL / RN
2010
III
AAAA DEUSDEUSDEUSDEUS
Por nunca me deixar desanimar, por me dar coragem para continuar seguindo a trilha da vida e pela oportunidade de conviver ao lado de pessoas maravilhosas. Pela presença real em minha vida, capacitando-me em tempos difíceis e revelando sua infinita graça e misericórdia nas horas de alegria.
À Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria DalvaÀ Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria DalvaÀ Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria DalvaÀ Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria Dalva
Minha amada, o presente mais precioso que ganhei de DEUS ao nascer. Obrigada por me ensinar a viver com dignidade, mesmo passando por tantas batalhas em teu caminho. Você é todo o exemplo que eu preciso carregar para toda minha vida. Muito obrigada por tudo que sacrificaste por mim, para me fazer a pessoa que sou hoje.
AAAA Meu pai, meu ídoloMeu pai, meu ídoloMeu pai, meu ídoloMeu pai, meu ídolo, João Medeiros , João Medeiros , João Medeiros , João Medeiros (In memórian(In memórian(In memórian(In memórian))))
Pai, o pouco tempo que passou comigo, me ensinou diversas experiências belas, transmitidas nos poucos e intensos anos em que convivemos. Sei que sempre esteve presente ainda que eu nunca pudesse ver cada momento em que te aproximavas para cuidar de mim, sempre senti tuas palavras no meu coração. Pai, de onde estás me impulsiona a continuar adiante e a triunfar, a me olhar no espelho e saber que tu me apóias. Meu pai, apesar de meus lábios não poderem mais te afirmar o quanto te amo olhando em seus olhos, meu coração sabe dizer e sentir: “COMO É GRANDE O MEU AMOR POR VOCÊ”!!!! SEMPRE TE AMAREI PAIZÃO!!!
Aos meus irmãosAos meus irmãosAos meus irmãosAos meus irmãos
Por me aceitar como sou, por me amar, mesmo sabendo de minhas falhas e de meus erros. Obrigado por sempre estarem abertos para mim e por me dar força. Obrigada por me oferecer sempre um lugar de apoio, de encorajamento e consolo nas horas difíceis.
Ào meu companheiro, amor de minha vida, WidnesÀo meu companheiro, amor de minha vida, WidnesÀo meu companheiro, amor de minha vida, WidnesÀo meu companheiro, amor de minha vida, Widnes
Muito obrigada por ter me aceitado com meus defeitos e por saber também elogiar minhas virtudes. Por me ensinar que a cada dia podemos recomeçar. Por me fazer sentir um alguém diferente. E por eu saber que sempre poderei contar contigo
Ao mestre, ValterAo mestre, ValterAo mestre, ValterAo mestre, Valter
Por me servir de exemplo de alguém que venceu na vida por seus
estudos, obrigada pelas lições ensinadas, pela coragem em ajudar pessoas nunca antes vistas. Nunca lembra que existe cansaço, tempo ou preocupação, tornando tudo, como você mesmo diz, simples ou fácil.
A vocês.............dedico!!!
IV
AGRADECIMENTOS
A Deus, por dar sentido à vida, por ter me abençoado grandemente durante toda a minha jornada, por ter sido sempre tão generoso comigo. À minha família, por permitir que eu pudesse chegar até aqui com tranquilidade. Obrigada acima de tudo, pelas orações, amor, carinho, atenção, compreensão e dedicação incansável. Obrigada por contribuírem para mais esta vitória – ela também é de vocês. Ao meu marido Widnes, pelo seu amor, compreensão, paciência e também por estar sempre ao meu lado em todos os momentos. Desculpa pelos momentos em que não pude dedicar o meu tempo. A minha eterna gratidão ao meu orientador Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto, por toda paciência e orientação nesse projeto, quem sempre me deu apoio e incentivo. Nunca vou esquecer a forma carinhosa com que abriu as portas de seu laboratório para que eu crescesse não só como profissional mas também como ser humano. Aos meus sogro, sogra e cunhados: por todo apoio e carinho por mim, pela contribuição positiva a realização deste curso! Às minhas sobrinhas: Giordana e Alexia, pelos momentos agradáveis. Quantas vezes tentei estudar e vocês não deixaram!!!! Titia ama vocês. Ao Técnico em Laboratório Edson Santana, mais que um amigo, um pai que não dá mesada aos filhos, mas sim “puxões de orelha”, estando sempre preocupado em oferecer as melhores condições de trabalho no laboratório. Muito obrigada pela agradável companhia e serviços prestados em nossas viagens, pela ajuda e paciência demonstrada nas coletas dos materiais utilizados nas análises. À Otani pela amizade e ajuda em tudo o que estivesse a seu alcance, sempre pronta para nos fornecer material de expediente para o LaBMaT. À Drª. Antônia Cláudia, pelo incentivo e pelas dicas importantes dadas ao longo dos anos. À Drª. Janeusa Trindade e à Drª. Selma Jerônimo, pelos empréstimos do laboratório e de alguns aparelhos utilizados neste projeto. Ao Dr. Ricardo Vitor (Depto. Parasitologia/UFMG) e ao Dr. Oscar Romero (Depto. Microbiologia), pela colaboração no projeto, dicas e sugestões dadas. Aos professores Dr. Alexandre Vasconcelos, Dr. Gilberto Corso e Dr. Umberto pelas orientações quanto às análises estatísticas.
V
À minha amiga-irmã Magaly Mota, pelas longas horas de conversa, pela ajuda, dedicação, paciência, compreensão, pelas lágrimas derramadas juntas, por me trazer tranqüilidade nos momentos mais difíceis desta jornada. À Lis Tavares, a Flor do laboratório que com sua meiguice e simplicidade soube cativar a todos. Obrigada pelas conversas agradáveis, pelas ajudas e pela preocupação a mim dispensada sempre. À Milena Clementino, “companheira de batalhas”, obrigada pela amizade, confiança e pela oportunidade de trabalhar em conjunto em alguns projetos. Aos meus amigos do LaBMaT: Aline, Norma, Ywlliane, Valéria, Thales, Samira, Cláudio Bruno pelos momentos de descontração e pelas “gargalhadas nossas de cada dia”, e pelas ajudas nos momentos em que mais precisei. Obrigada por tornar nosso ambiente de trabalho tão agradável. À Elainne Potter, Louise da Matta e Juliane, pela amizade e por sempre ajudar na parte burocrática dos processos relacionados ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Ao Senhor Idalécio, Presidente da Associação de Criadores de Caprinos e Ovinos do Sertão do Cabugi, por tornar viável o nosso estudo nessa região e por sua dedicação e empenho. Às professoras Fátima Ximenes, Cecília Holanda, Louisianne Guerra, Antônia Cláudia e Adriana Uchôa pelas sugestões e orientações no nosso trabalho. A Raimundo (Depto. de Biofísica e Farmacologia) pelo fornecimento dos camundongos utilizados na rotina do labmat. À direção, funcionários e professores do Centro de Biociências, que efetivamente se preocupam em construírem pessoas mais solidárias, autênticas e felizes; se preocupam com todos os passos que percorremos e como trilhamos nossos caminhos. Agradeço pela cooperação, confiança e dedicação. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela qualidade de professores e pela estrutura e apoio aos estudantes. Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pela colaboração em meu aperfeiçoamento profissional. À FAPERN pelo apoio financeiro. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse concluído... o meu muito obrigada!
VI
Aprender é a única coisa de que a mente
nunca se cansa, nunca tem medo e
nunca se arrepende.
(Leonardo da Vinci)
VII
RESUMO
A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo protozoário Toxoplasma
gondii. Os caprinos, dentre os animais de produção, são uma das espécies
mais suscetíveis a este parasito, sendo um dos principais agentes envolvidos
no abortamento de ovinos e caprinos, determinando grandes perdas
econômicas e tendo implicações para saúde pública, já que a presença do
parasita nos produtos de origem caprina, constituem-se em uma das principais
fontes de infecção para o homem.
Neste estudo foram coletadas 244 amostras de sangue em 8 fazendas
situadas em 4 municípios da região do Sertão do Cabugi, Estado do Rio
Grande do Norte, região Nordeste do Brasil e testadas através do Ensaio
Imunoenzimático (ELISA). Os resultados obtidos mostraram uma prevalência
de 47,13% para anticorpos anti-T. gondii e uma associação significativa entre
positividade e as variáveis avaliadas tais como idade, localidade e propriedade.
Foi realizado o ensaio IgG de avidez em 115 amostras positivas com o intuito
de discriminar infecção aguda e crônica. Doze amostras (10,4%) apresentaram
anticorpos de baixa avidez enquanto 103 (89,6%) anticorpos de alta avidez;
indicando que a maior parte dos animais foi exposto ao parasita precocemente.
Foi verificada diferença estatística significativa apenas para a variável sexo.
Avaliamos também a capacidade de adenovírus recombinantes
codificando SAG1, SAG2, SAG3 e CMV em induzir ativação de resposta imune
em caprinos. Estes animais receberam 109 pfu de AdSAG1, AdSAG2,
AdSAG3, AdCMV ou PBS em protocolo vacinal com 3 imunizações. Amostras
de soro obtidas dos animais, antes e após cada imunização, foram submetidas
ao ELISA. Os resultados demonstram que as imunizações induziram a
produção anticorpos IgG específicos contra as proteínas de T. gondii.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii, caprinos, ELISA, vetores virais
recombinantes, SAG, vacinas.
VIII
ABSTRACT
Toxoplasmosis is one zoonosis caused by Toxoplasma gondii protozoan.
Goats, amongst the production animals, are one of the species most
susceptible to this parasite, being one them main involved agents in ovine and
goat abortions, determining great economic losses and implications for public
health, since the presence it parasite in the products of goat origin, consist in
one of the main sources of infection for the man.
In this study 244 blood samples in 8 farms situated in 4 cities from the
Sertão do Cabugi region, Rio Grande do Norte State, northeast of Brazil and,
tested by ELISA assay. The results had shown a prevalence of 47.13% for anti-
T. gondii antibodies and a significant association between positivity and variable
evaluated as age, locality and property. The IgG avidity assay evaluated in 115
positive samples was carried to discriminate acute and chronic infection. Twelve
samples (10.4%) had presented antibodies of low avidity while 103 (89.6%)
presented high avidity antibodies; indicating that most of the animals was
precocious exposure to the parasite. Significant difference was verified only for
the variable sex.
We also evaluate the capacity of recombinant adenoviruses codifying
SAG1, SAG2, SAG3 and CMV in inducing activation of specific immune
response in goat. These 109 animals received 109 pfu of the AdSAG1,
AdSAG2, AdSAG3, AdCMV or PBS in vaccine protocol with 3 immunizations.
Serum samples of the each animal, before and after mmunization, had been
submitted to the ELISA. The results demonstrate that the immunizations had
induced the production of IgG antibodies specific against T. gondii proteins.
Keywords : Toxoplasma gondii, goats, ELISA, recombinant viruses,
SAG, vaccines.
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Taquizíoto do T. gondii. Adaptada de: Ajioka et.al., (2001)............... 10
Figura 2- Ciclo de vida do T. gondii com várias fontes de infecção ................. 11
Figura 3- Ruptura da parede do cisto, liberando bradizoítos ........................... 14
Figura 4- Avidez de IgG em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com
sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação ao sexo.................... 41
Figura 5- Avidez de IgG em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com
sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a idade...................... 41
Figura 6- Avidez de IgG em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com
sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação a raça...................... 42
Figura 7- Avidez de IgG em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com
sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação as fazendas............. 42
Figura 8- Avidez de IgG em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com
sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação a cidade................... 43
Figura 9- Média de Absorbâncias de IgG em soro de caprinos da Fazenda DI,
imunizados pela via intramuscular com a vacina AdSAG1 (expressando o
adenovírus recombinante proteína SAG1 do Toxoplasma gondii, após três
séries de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A) Absorbância dos soros
na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800].45
Figura 10- Média de Absorbâncias de IgG em soro de caprinos da Fazenda DI,
imunizados pela via intramuscular com a vacina AdSAG2 (expressando o
adenovírus recombinante proteína SAG2 do Toxoplasma gondii, após três
séries de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A) Absorbância dos soros
na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800].46
X
Figura 11- Média de Absorbâncias de IgG em soro de caprinos da Fazenda DI,
imunizados pela via intramuscular com a vacina AdSAG3 (expressando o
adenovírus recombinante proteína SAG3 do Toxoplasma gondii, após três
séries de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A) Absorbância dos soros
na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800].47
Figura 12- Média de Absorbâncias de IgG em soro de caprinos da Fazenda DI,
imunizados pela via intramuscular com a vacina AdCMV (expressando o
adenovírus recombinante proteína CMV do Toxoplasma gondii, após três séries
de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A) Absorbância dos soros na
diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800]..... 48
Figura 13- Média de Absorbâncias de IgG em soro de caprinos da Fazenda DI,
imunizados pela via intramuscular com a solução de PBS usado como controle
negativo, após três séries de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A)
Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição
1:100 até 1:12.800]........................................................................................... 49
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuição da soropositividade de IgG anti-Toxoplasma gondii em
caprinos oriundos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em
comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.... 38
Tabela 2- Distribuição da avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em
caprinos oriundos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em
comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.... 40
XII
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ACOSC
Ad
Associação de Criadores de Caprinos e Ovinos do Sertão do Cabugi Adenov
AIDS/SIDA
CMV
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome) Adenovírus recombinante codofocando SAG1, SAG2 e SAG3
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) FAO Organização das Nações Unidas sobre alimentação e Agricultura
(Food and Agriculture Organization on the United States) HAI
IFN- γ IgA IgG IgM
Hemaglutinação Indireta Interferon gama Imunoglobulina A Imunoglobulina G Imunoglobulina M
IR Índice de Reatividade LaBMaT Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose
NK OPD PBS SAG
Células de morte natural (Natural Killer) Orto-fenilenodiamina (σ-phenylinediamine) Solução Salina Fosfatada (Phosphate Saline Solution) Antígeno de Superfície Geneticamente Modificado (Genetically Modified Surface Antigens)
SRD Sem Raça Definida Tween Mono-laurato de polioxietileno sorbitano (Polyoxyethylene sorbitan
mono-laurate)
XIII
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS IX
LISTA DE TABELAS XI
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS XII
1 – INTRODUÇÃO 1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3
2.1- Caprinocultura 3
2.2 - Toxoplasmose e a Ovinocaprinocultura 5
2.3 - O Agente Etiológico 8
2.3.1 – Taxonomia 8
2.3.2 - Características Biológicas 9
2.3.3 – Morfologia 9
2.4 - Ciclo Evolutivo 11
2.5 - Diversidade biológica do Toxoplasma gondii 15
2.6 - Mecanismos de Invasão da Célula Hospedeira pelo T. gondii 17
2.7 - Resposta imune ao Toxoplasma gondii 19
2.8 - Vacinas contra Toxoplasmose 21
3 - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 28
3.1 - Objetivo Geral 30
3.2 - Objetivos Específicos 30
4 – METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO 31
4.1 – Área de Estudo 31
4.2 – Amostragem 32
4.3 – Coleta do Sangue 32
4.4 – Antígeno 32
4.5 – Testes sorológicos 32
4.5.1 – ELISA 33
4.5.2- ELISA para avaliação da avidez de anticorpos IgG 34
4.5.3- ELISA de Titulação 35
4.6 - Imunização de caprinos 36
4.7– Processamento e análise de dados 36
XIV
5 – RESULTADOS 38
5.1 - Prevalência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii no rebanho caprino 38
5.2 - Determinação da avidez de anticorpos anti-T. gondii, da classe IgG em
soros de caprinos naturalmente infectados, avaliados pelo ELISA 40
5.3 - Avaliação da imunogenicidade em grupos de caprinos imunizados com
vacina de adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2, SAG3 e
CMV. 45
5.3.1 - Vacina AdSAG1 47
5.3.2 - Vacina AdSAG2 48
5.3.3 - Vacina AdSAG3 49
5.3.4 - Vacina AdCMV 50
5.3.5 - PBS 1x 51
6 – DISCUSSÃO 52
6.1 - ELISA para determinação da avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii em
soros de caprinos naturalmente infectados. 57
6.2 - Avaliação da imunogenicidade após imunizações com vacinas de
adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2, SAG3 e CMV em
soros de caprinos. 60
7 – CONCLUSÂO 66
8 - PERSPECTIVAS 66
9 - REFERÊNCIAS 67
1
1. INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição geográfica mundial,
causada por Toxoplasma gondii, um protozoário intracelular obrigatório,
podendo apresentar, em determinadas regiões, grande impacto médico-
veterinário (APPLEFORD & SMITH, 2000); sendo considerada uma das
enfermidades infecciosas mais difundidas dentre as transmissíveis.
Do ponto de vista epidemiológico, a toxoplasmose é uma enfermidade
cosmopolita sendo a sua distribuição influenciada por diversos fatores, entre os
quais se podem incluir: os climáticos, os sócio-econômicos, contato com
animais domésticos, em especial o gato, e o consumo de carne crua ou mal
cozida (CORCUERA, LOZANO & LOPEZ, 1981). Sendo, a toxoplasmose,
citada como a terceira causa mais freqüentemente diagnosticada de mortes
relacionadas à alimentação nos Estados Unidos (MEAD et al, 1999)
A cada ano, o T. gondii infecta mais de um bilhão de pessoas em todo o
mundo (EL-ON & PEISER, 2003), sendo a sua infecção normalmente
assintomática, em adultos saudáveis, com o parasito persistindo por toda a
vida do hospedeiro. Em recém-nascidos infectados congenitamente e em
indivíduos imunocomprometidos, a infecção se manifesta de maneira mais
grave, provocando doenças oculares e psiquiátricas (DUBEY, 1996; PASSOS
et. al, 2000; SORRENTINO, 2005).
Diversos aspectos desta parasitose contribuem para a elevação de sua
prevalência e morbidade. As conseqüências da infecção intra-uterina pelo T.
gondii estão ganhando reconhecimento e a toxoplasmose vem sendo
diagnosticada em um número crescente de pacientes com imunossupressão
decorrente de várias causas, tais como doenças malignas, transplantes de
órgãos e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Clinicamente, a
encefalite toxoplásmica aparente tem sido relatada em 30 a 40 % dos
pacientes com AIDS (KOSKINIEMI et. al., 1989).
A incidência mundial da toxoplasmose congênita é estimada variando de
0,3 a 1,0 para cada mil nascimentos vivos (TROJOVSKY, 1998) e, segundo
2
Kawazoe (2005), cerca de 40% dos fetos humanos podem adquirir o T. gondii
durante a gravidez, estando a gestante na fase aguda da doença (ou se houver
reativação de cistos da fase crônica da doença; o que se percebe mais raro).
O Toxoplasma gondii tem a capacidade de invadir vários tecidos,
células (exceto hemácias) e líquidos orgânicos, sendo uma parasitose de
considerável importância médica e veterinária, apresentando um grande
impacto na pecuária caprina e ovina podendo levar a abortos, má-formações
fetais e mortalidade neo-natal. Entre os animais de produção, os caprinos são
os mais susceptíveis ao T. gondii (DUBEY & ADAMS, 1990), justificando a
necessidade de estudos nesses rebanhos no Sertão do Cabugi que é a maior
região produtora desses animais no Rio Grande do Norte.
O impacto econômico anual da toxoplasmose nos Estados Unidos é
estimado em 7,7 bilhões de dólares, sendo a toxoplasmose a terceira maior
causa de morte causada por alimentos nesse país (JONES et al., 2001). Em
1993, os Estados Unidos tiveram um custo anual de 5,3 bilhões de dólares
devido às perdas com cuidados médicos, baixa na produtividade e custos com
educação especial para a toxoplasmose congênita (ROBERTS et al., 1994),
constituindo-se um sério problema de Saúde Pública em vários países, sendo o
seu diagnóstico crucial para programas de assistência a gestantes (SPALDING
et al., 2005). No Brasil não existem dados sistematizados quanto ao impacto
econômico dessa parasitose.
Este parasito é estudado mundialmente no que se refere ao seu
controle, no entanto, nenhuma vacina segura contra a infecção encontra-se
disponível. Uma vacina para a toxoplasmose deverá utilizar antígenos do
parasito associado com uma via e um adjuvante adequados.
3
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- Caprinocultura:
A caprinocultura é uma atividade explorada em todos os continentes,
estando presente em áreas sob as mais diversas características climáticas,
edáficas e botânicas. Os caprinos estão mais concentrados em áreas secas
tropicais e subtropicais,com terras pobres, pouco voltadas à agricultura
(MORAND-FEHR & BOYAZOGLU, 1999).
Nos anos em que as estiagens arrasam as plantações, as cabras estão
entre as únicas alternativas alimentares e, ao mesmo tempo, constituem a
única fonte de renda dos agricultores mais pobres, sendo de fundamental
importância sócio-econômica para o Nordeste brasileiro, por representar uma
alternativa na oferta de carne, leite e derivados, favorecendo o aspecto
alimentar, especialmente da população rural, sendo responsável pelo
fornecimento de cerca de 40% de toda proteína animal consumida pela
população rural (ALVES, 2005).
Segundo a FAO (2007), as exportações de carnes e de derivados
lácteos deverão dobrar até 2015, com deslocamento da oferta exportadora de
commodities competitivas dos países ricos para os emergentes. Este
comportamento é esperado também para o mercado interno brasileiro, o que
gerará uma demanda por alimentos que pode ser atendida parcialmente com a
carne e o leite de pequenos ruminantes. Neste cenário, podem-se projetar
significativas oportunidades para os produtos da caprinocultura, tanto na
dimensão econômica, quanto na social. No caso dos produtos da
caprinocultura, destacam-se a carne e o leite por suas características
nutricionais, que lhes conferem importante potencial de mercado em virtude do
crescimento do consumo de alimentos saudáveis e funcionais (EMBRAPA,
2008).
O interesse pela caprinocultura de corte tomou proporção jamais vista
no cenário mundial e esse efeito pode ser claramente percebido no Brasil.
4
Combinada à capacidade de resistir às adversidades climáticas, aos baixos
custos de manutenção, a cabra apresenta uma grande virtude que, aos
poucos, foi sendo percebida pela população do semi-árido: a sintonia com a
atividade de subsistência praticada na região. Uma das vantagens é que a
dieta alimentar do animal não rivaliza com a humana, principalmente no que se
refere ao consumo de grãos. Assim, não há dependência das safras incertas
que, por vezes, são incapazes de suprir até mesmo as necessidades da
população. Outra vantagem é que caprinos e bovinos podem ser criados em
regime de consórcio, já que nesse caso também não existe competição pela
alimentação, pois as dietas são diferentes.
Alia-se a esse fato a característica reprodutiva de poliestria contínua,
isto é, apresentam cio (estro) e ovulam ao longo de todos os meses do ano,
onde o fotoperíodo não constitui fator limitante para a reprodução, uma vez
atendidas as necessidades de alimentação, nutrição e saúde dos rebanhos
(SIMPLÍCIO, 2006). Só nas décadas mais recentes a caprinocultura passou a ser objeto de
atenção oficial. Isso quando se percebeu que o animal, adaptado às condições
inóspitas da caatinga, poderia contribuir com o desenvolvimento da região,
gerando empregos e oportunidades de negócios para as famílias mais pobres,
colaborando para evitar os fluxos migratórios contribuindo de forma significativa
para fixação do homem no campo e constituindo-se importante fonte de
proteína animal numa região em que a segurança alimentar ainda é um
desafio, além de gerar divisas para o Estado e para o País. Nos últimos anos,
esta atividade pecuária tem recebido bastante incentivos dos governos,
chegando até a ter programas próprios e exclusivos destinados ao seu
desenvolvimento (LEITE, 2005).
Segundo o IBGE (2007), o rebanho mundial de caprinos no ano de 2007
era de 830.391.683 cabeças. O rebanho da América do Sul é de 29.191.834,
ou seja, 3,5% do rebanho mundial. O efetivo de caprinos do Brasil é da ordem
de 9.450.312 (1,1% do rebanho mundial e 32,3% do rebanho da América do
Sul). Deste total, o Nordeste concentra 8.633.722 cabeças, sendo responsável
5
por 91,3% do efetivo nacional de caprinos, enquanto que as regiões Sul,
Sudeste, Norte e Centro-Oeste, detêm 2,96%, 2,68%, 1,77% e 1,22%
respectivamente . Do total do rebanho nordestino, 401.510 cabeças (4,65%)
pertencem ao Rio Grande do Norte, 39,92% à Bahia, 18,47% à Pernambuco,
15,88% ao Piauí, 11,31% ao Ceará, 7,37% à Paraíba, 4,39% ao Maranhão,
0,78% às Alagoas, e 0,20% a Sergipe. A importância dos caprinos não pode ser mensurada somente pelo
número de animais ou pelo valor da produção. Em várias fazendas, os animais
e produtos não são vendidos, fazendo parte da subsistência familiar, ao
contrário do que acontece com os produtos da espécie bovina, cuja função
principal é a comercialização (PINHEIRO et al., 2000).
Por outro lado, a produção e a produtividade desses animais ainda
apresentam limitações que envolvem problemas sanitários e nutricionais,
manejo inadequado no sistema de criação, o que contribui para o aumento da
incidência e da gravidade das doenças que afetam os animais. Destacamos,
neste contexto, as parasitoses que apresentam importante impacto para a
saúde animal, repercutindo em elevadas perdas econômicas em virtude da
diminuição do crescimento do animal, do peso, do consumo de alimentos e
aumento nos abortos, infecções maciças, e taxas de mortalidade.
2.2 - Toxoplasmose e a Ovinocaprinocultura
Dentre as parasitoses, a toxoplasmose, uma doença por vezes
negligenciada, apresenta repercussões sanitárias importantes, uma vez que
pode induzir ao aborto, má-formação fetal e mortalidade neonatal em caprinos
e ovinos (DUBEY & THULLIEZ, 1993). Feldman & Miller (1956) estudaram
rebanhos caprinos nos Estados Unidos encontraram a primeira prova da
toxoplasmose nesta espécie. Munday & Mason (1979), na Austrália, foram os
primeiros a descrever a toxoplasmose como uma importante causa para os
problemas reprodutivos em caprinos. Os cistos teciduais viáveis de
Toxoplasma gondii têm sido freqüentemente encontrados nesses animais
6
(GARCIA-VASQUEZ et al., 1993), comprometendo enormemente o setor
pecuário e de agronegócios, ocasionando com isso grandes perdas
econômicas (DUBEY & THULLIEZ., 1989; BUXTON, 1990), bem como, com
potencial risco para a saúde humana.
Em vários locais do mundo a prevalência da toxoplasmose caprina, em
rebanhos experimentalmente ou naturalmente infectados, vem sendo estudada
utilizando-se de várias técnicas de sorodiagnóstico, e os dados variam entre
0% e 92,4% de soropositividade (CHIARI et al., 1987; TENTER et al., 2000).
Os levantamentos sorológicos mostram que a prevalência da toxoplasmose em
caprinos é maior entre os animais mais velhos, atingindo igualmente machos e
fêmeas, com maior freqüência nos rebanhos leiteiros em relação aos de
exploração mista, sendo este parasito mais patogênico para animais jovens do
que para animais adultos (DUBEY et al., 1985; DUBEY, 1987; DUBEY, 1989;
DUBEY, 1990; DUBEY & ADAMS, 1990; OPEL et al., 1991; PANDEY & van
KNAPEN, 1992).
A patogenia da toxoplasmose em caprinos adultos está bastante
relacionada com o sistema reprodutor, podendo ocasionar esterilidade, abortos,
morte embrionária precoce e reabsorção fetal, fetos mumificados ou
macerados, nascimento de filhotes prematuros e fracos; podendo inclusive
causar a morte de cabras jovens e adultas devido às complicações recorrentes
(DUBEY, 1987; DUBEY & ADAMS, 1990).
Dentre os sintomas comuns da toxoplasmose caprina estão a encefalite,
nefrite, hepatite, abomasite necrosante, enterite, cistite e pneumonia (MEDHI et
al.,1983; DUBEY, 1987). Cabras gestantes desenvolvem quadro clínico
inespecífico apresentando hipertemia, hiporexia e apatia (CHHABRA et al.,
1981; DUBEY, 1988). A infecção, na primeira metade da gestação, causa
maiores prejuízos, porém, ainda há risco de transmissão transplacentária em
fases mais tardias causando menor acometimento do feto (DUBEY, 1988;
VITOR et al., 1991). As alterações mais comumente encontradas são: necrose
placentária, encefalomielite, lesões no fígado e no miocárdio do feto (DUBEY,
1988).
7
Embora pouco freqüente, a morte por toxoplasmose aguda disseminada
é relatada em caprinos adultos, sendo descritas encefalite, febre, diarréia
dispnéia, apatia, edema e congestão pulmonar, infarto renal, vários focos
necróticos no fígado e baço, enterite, cistite e abomastite (MEHDI et al., 1983;
DUBEY, 1987). A morte dos animais está associada a lesões fibro-necróticas,
congestão e edema em tecido intestinal e pulmonar, enfarto e necrose focal de
linfonodos mesentéricos, encefalite, hepatite, e comprometimento renal, sendo
a gravidade do quadro diretamente proporcional ao tamanho do inóculo
utilizado experimentalmente (DUBEY et al., 1980; DUBEY, 1989).
No Brasil, a soro-prevalência da toxoplasmose em rebanhos caprinos é
muito variável (AMARAL et al, 1978; CHIARI et al, 1987; SELLA et al, 1994).
Na Bahia, Amaral et al, (1978) encontrou uma soro-reatividade de 10%. Araujo
et al., (1984) no Rio Grande do Sul encontraram 16,1 % dos animais reativos a
T. gondii. Em Minas Gerais, Chiari et al., (1987) descobriram uma prevalência
de 92,4%. Serra-Freire (1994), no Rio de Janeiro encontrou 15,84% e no
Paraná, Sella et al. (1994), verificaram uma prevalência de 30,71% em
caprinos leiteiros da região de Londrina, norte do Estado.
Tenter et. al. (2000) descreveram que os animais domésticos que mais
comumente estão envolvidos no ciclo de T. gondii como hospedeiros
intermediários, onde só haverá a reprodução assexuada do parasito (formação
de cistos), são os suínos, ovinos e caprinos, seguidos em menor frequência
dos cães, coelhos, aves silvestres, equinos, aves domésticas e, por fim, em
muito menor grau, bovinos e bubalinos.
A eliminação de T. gondii pelo leite (RIEMANN et al, 1975; DUBEY et al.,
1980; VITOR et al., 1991; DUBEY, 1994) e a persistência de cistos na
musculatura dos caprinos (DUBEY, 1980), revelaram a importância desta
espécie na transmissão da toxoplasmose ao homem (SACKS et al., 1982;
PEPIN et al., 1997). Desta forma, a carne e leite destes animais
persistentemente infectados, quando inadequadamente preparados, é uma das
fontes potenciais mais importantes da toxoplasmose humana (LUNDÉN e
UGGLA, 1992; TENTER et. al., 2000; CLEMENTINO et. al, 2009), aliando-se a
8
isto a tendência ao aumento no número destes rebanhos em nossa região e as
significantes perdas econômicas, o que torna essencial a investigação da
prevalência da infecção por T. gondii entre estes animais.
2.3- O Agente Etiológico
2.3.1- Taxonomia:
O Toxoplasma gondii está classificado segundo Levine et. al., (1980) da
seguinte forma:
REINO Protista
SUBREINO Protozoa
FILO Apicomplexa
CLASSE Sporozoea
SUBCLASSE Coccidia
ORDEM Eucoccidiida
SUBORDEM Eimeriina
FAMÍLIA Sarcocystidae
SUB-FAMÍLIA Toxoplasmatinae
GÊNERO Toxoplasma
ESPÉCIE Toxoplasma gondii
9
2.3.2- Características Biológicas:
O Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório de baixa
especificidade, como a maior parte dos apicomplexas, pois tem a capacidade
de infectar quaisquer animais homeotérmicos (DUBEY et al., 1970; HASHEMI-
FESHARKI, 1996; ESTEBAN-REDONDO & INNES, 1997; INNES, 1997;
DUBEY et al., 1998; DUBRUMETZ, 1999). Os protozoários que pertencem a
este Filo possuem como principal característica, o complexo apical, permitindo-
o invadir células nucleadas, vários tecidos e líquidos orgânicos. É prevalente na
maioria das áreas do mundo e tem uma significativa importância médica e
veterinária, por causar aborto ou doença congênita em seus hospedeiros
intermediários (TENTER et. al., 2000).
Em algumas circunstâncias a toxoplasmose pode ocorrer em graus
variáveis de morbidade que podem ocasionar seqüelas graves e fatais como
acontece com cepas de maior virulência, uma carga infectante maior, uma via
de penetração mais favorável e um hospedeiro com suas defesas orgânicas
deficitárias. Os grupos de indivíduos mais susceptíveis incluem receptores de
órgãos transplantados, pacientes com certos tipos de câncer e pacientes
portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Segundo
Dubey (1987), a idade do animal, o gênero e a espécie também influenciam na
susceptibilidade a T. gondii.
2.3.3- Morfologia
Toxoplasma gondii é encontrado sob três formas evolutivas importantes
do ponto de vista da infecção e transmissibilidade:
a) taquizoítos : forma de multiplicação rápida produzida pelo ciclo
assexuado do parasito em células nucleadas dos hospedeiros intermediários
(GROSS et al., 1996; MONTOYA & LIESENFELD, 2004), característica da
infecção aguda. Apresenta a forma de arco com o extremo posterior
arredondado e o anterior afilado. Constitui a forma menos resistente do
10
parasito, sendo facilmente destruída pelas condições ambientais adversas,
pela desidratação, variáveis osmóticas e pela tripsina ou pepsina (JACOBS et
al., 1996). É encontrada na maioria das células e tecidos do hospedeiro e
facilmente em líquidos biológicos, facilitando assim, sua manutenção no
hospedeiro (PARK et al., 1993). Possuem importância epidemiológica por
serem as formas transmitidas verticalmente, via gestação, constituindo um
problema em Saúde Pública (TENTER et al., 2000), e do ponto de vista
médico, esta fase é importante, porque o parasito fica vulnerável aos fármacos
(ACHA & SZYFRES, 1977).
FIGURA 1- Taquizoíto do Toxoplasma gondii. Esquema adaptado de Ajioka et.
al., 2001.
b) bradizoítos: estão contidos no interior dos cistos e caracteriza a
forma de multiplicação lenta, nas infecções crônicas ou assintomáticas. São
resistentes às enzimas proteolíticas e ao esfriamento à 4ºC por 30 dias
(JACOBS et al., 1996; FRENKEL, 1997). Possuem grande tropismo pelo
cérebro, retina, músculos esqueléticos e cardíacos, órgãos ricos em células
estáveis, sendo encontrado com menor intensidade em órgãos como pulmão,
fígado e rins (DUBEY et al., 1998).
c) oocistos/esporozoítos: encontrados nas fezes de felídeos,
resultantes do ciclo enteroepitelial do parasito que ocorre apenas no intestino
de membros da família Felidae (ACHA & SZYFRES, 1987; DUBEY, 1987;
LAPPIN, 1994; DUBEY et. al., 1998; DUBEY, 2004; MONTOYA &
11
LIESENFELD, 2004). Sobrevivem por longos períodos em condições
ambientais adversas, podendo sobreviver por meses a anos em solo úmido
(DUBEY & BEATTIE, 1988) e ser transportado mecanicamente por moscas,
baratas, besouros e outros artrópodes. Sendo, portanto uma forma de
resistência e de disseminação ambiental dessa parasitose.
2.4- Ciclo Evolutivo
O ciclo de vida do T. gondii está bem estabelecido (Fig. 5). É heteroxeno
facultativo, tendo como hospedeiros definitivos representantes da família
Felidae, entre eles o gato doméstico. Os caprinos e outros animais, bem como
os homens são os hospedeiros intermediários (ESTEBAN-REDONDO &
INNES, 1997; DUNCANSON et al., 2001). No hospedeiro definitivo ocorre a
fase sexuada e assexuada, enquanto que no hospedeiro intermediário, passa
por duas fases de desenvolvimento assexuado (BENESON et al., 1982;
BOWIE et al., 1997).
FIGURA 2: Ciclo de vida do T. gondii (Fonte: MEIRELES, 2001).
12
A fase assexuada ou extra-intestinal pode ocorrer em todos
hospedeiros, incluindo felídeos e o homem, contaminando-se através de uma
das três formas do parasito. Ao ingerir as formas infectantes, estas penetram
nas células do hospedeiro, localizando-se no interior do vacúolo parasitóforo,
iniciando o processo de reprodução assexuada por endodiogenia em vários
tipos diferentes de células hospedeiras. A multiplicação ocorre repetidamente
levando ao rompimento das células, sendo os taquizoítos levados pela corrente
sanguínea ou linfática e penetrando em novas células. Após ingerirem oocistos
maduro, da água ou comida contaminada, ocorre a ruptura do oocisto no
intestino liberando os oito esporozoítos, que se multiplicam nas células
intestinais e nódulos linfáticos, e são formados os taquizoítos, que se
multiplicam rapidamente, continuando o processo já descrito anteriormente.
Esse processo de intensa e rápida multiplicação caracteriza a fase aguda da
doença, onde é observada a sintomatologia, em geral aparecendo após os
primeiros 5-15 dias de infecção (DUBEY et al., 1998).
Após esse período de intensa multiplicação, o sistema imune atua nesse
protozoário e o mesmo se refugia dentro do tecido, multiplicando-se
lentamente, formando cistos teciduais com bradizoítos (ou cistozoítos) em seu
interior, caracterizando a fase crônica da doença (DUBEY et al., 1998). Estes
se multiplicam por endodiogenia permanecendo em um estado de latência.
Alguns bradizoítos diferenciam-se em taquizoítos, no intestino delgado, 18
horas após a ingestão de cistos.
Nos hospedeiros intermediários também pode ocorrer transmissão
vertical pelos taquizoítos e a invasão dos tecidos do feto. Um hospedeiro
susceptível pode, durante a amamentação, ingerir taquizoítos eliminados no
leite, com as formas de taquizoítos que chegam ao estômago, algumas serão
destruídas, mas as outras penetram na mucosa oral e poderão evoluir do
mesmo modo que os cistos e oocistos (KAWAZOE, 2005).
Se houver a administração de agentes quimioterápicos ou ocorrência de
moléstias debilitantes, pode levar a reativação da multiplicação e os bradizoítos
diferenciam-se em taquizoítos, proliferando-se.
13
A fase sexuada ou enteroepitelial (Ciclo coccidiano) ocorre apenas no
intestino de membros da família Felidae, após a injestão de alguma das formas
infectantes. De acordo com MOURA (2008), o ciclo intracelular do parasito
parece ser dependente da carga parasitoria induzindo ao ciclo lítico, a
cistogênese ou ao ciclo sexuado do parasito em células epiteliais intestinais
dos felinos, sugerindo ainda que o ciclo do T. gondii nos felinos deve ser
modulado por moléculas presentes nos enterócitos destes animais, tendo em
vista o alto grau de especificidade do parasito por esse único hospedeiro
definitivo.
Após a injestão de qualquer uma das formas infectantes, ocorre no
interior do epitélio intestinal a multiplicação por endodiogenia, seguida de
esquizogonia, produzindo esquizonte maduro ou meronte. As células epiteliais
rompem-se, liberando merozoítos e estes penetram em outras células, dando
início à formação de gametócitos e da fase sexuada. Após maturação dos
gametócitos, o macrogameta (gameta feminino) e o microgameta (gameta
masculino) unem-se formando ovo ou zigoto, seguindo-se a formação de uma
parede dupla, dando origem ao oocisto imaturo não esporulados, que são
eliminados nas fezes de felinos (DUBEY, 2004). Ao encontrar condições
ambientais favoráveis (aeração e temperaturas ideais) ao seu desenvolvimento
se tornam infectantes.
A ingestão de cistos pelo hospedeiro definitivo caracteriza o fechamento
do ciclo evolutivo do parasito. Quando os felídeos ingerem o cisto tecidual, a
parede do cisto é dissolvida por enzimas proteolíticas no estômago e intestino
delgado, liberando os bradizoítos (Figura 3) que infectam as células epiteliais
do intestino delgado dos felinos, se multiplicam por esquizogonia, diferenciam-
se em gametas e formam oocistos (DUBEY, 1994; DUBEY, 1998b). Alguns
parasitos disseminam-se para os tecidos extra-intestinais (DUBEY, 2004). Os
oocistos não esporulados são liberados no lúmen intestinal e eliminados no
meio ambiente junto com as fezes. A esporogonia ocorre fora do hospedeiro e
resulta no desenvolvimento de oocistos infecciosos, contendo dois
14
esporocistos, cada um com quatro esporozoítos (DUBEY & THULLIEZ,1993;
FRENKEL, 2000).
Os felídeos excretam oocistos de T. gondii em fezes 3 a 10 dias depois
de ingerir bradizoítos, 11-17 dias depois de ingerir taquizoítos, e 18 dias depois
de ingerir oocistos esporulados (DUBEY, 2006).
Figura 3- Ruptura da parede do cisto, liberando bradizoítos. Fonte:
LabMaT/UFRN
Os oocistos como são formas ambientais resistentes, podem
permanecer por meses ou anos no ambiente e ao se aderirem ao pasto,
contaminam a água ou vegetais, infectando novos hospedeiros definitivos ou
intermediários.
15
2.5- Diversidade biológica do Toxoplasma gondii
A partir da década de 80 diversos estudos foram realizados usando
diferentes técnicas biológicas, bioquímicas e moleculares, com a finalidade de
caracterizar as cepas deste parasito. Esses estudos forneceram evidências de
que este organismo possui duas linhagens clonais, compostas de cepas
virulentas e de baixa virulência (JONHSON, 1997).
Entende-se por virulência a capacidade apresentada por determinados
organismos para causarem infecção grave em determinadas circunstâncias,
mas os organismos podem ser patogênicos ou não (CLARK & DIAMOND,
1994).
A virulência de cepas de T. gondii é observada pela mortalidade de
camundongos infectados com inóculos graduais de parasitos e o tempo de
sobrevivência daqueles que resistiram à infecção. A classificação das cepas,
em virulentas e avirulentas, tem como base o seguinte critério: (a) Virulentas
são aquelas que causam sintomas agudos e morte em camundongos em uma
semana; (b) Baixa virulência são aquelas que não causam sintomas evidentes
nos camundongos, que se tornam, cronicamente afetados, apresentando cistos
teciduais no cérebro (JONHSON, 1997).
Utilizando este critério, Ferreira (2004), realizou estudo de
caracterização de oito cepas de T. gondii isoladas no Brasil, concluindo que
existe heterogeneidade de virulência entre elas.
De acordo com Literák et. al., (1998) o modo de circulação de cepas
virulentas de T. gondii na natureza é pouco conhecido. É conhecido apenas
que cepas de alta virulência que circulam no meio ambiente não produzem
oocistos, sendo a produção de cistos teciduais em camundongos infectados
experimentalmente induzida pela administração de sulfadiazina (DARDÉ et al.,
1992; DARDÉ, 1996)
Diversos estudos têm mostrado que as linhagens do T. gondii podem ser
classificadas em três grandes grupos clonais genotipicamente distintos, tipo I
(virulenta), II e III (não-virulentas ou com baixa virulência), podendo infectar
16
animais e humanos e, aparentemente, diferem em sua virulência,
comportamento biológicos e padrões epidemiológicos de ocorrência. Existe
uma predominância de cepas do tipo II na toxoplasmose humana e a
freqüência do tipo III foi mais elevada em animais. (HOWE & SIBLEY, 1995;
GRIGG et al., 2001; DIANA et al., 2004; VILLENA et al., 2004).
A possibilidade do genótipo influenciar a gravidade da doença no
humano é observada experimentalmente pela virulência em animais. As
linhagens de T. gondii tipo I são extremamente virulentas, produzindo altos
níveis de parasitemia, com aumento do risco de transmissão transplacentária e
aumento da morbi-mortalidade em fetos em desenvolvimento; as linhagens dos
tipos II e III levam a cronificação da infecção e produção de cistos teciduais
(HOWE & SIBLEY, 1995).
Com relação ao comportamento biológico, as cepas I e II têm sido
associadas à infecção congênita e a cepa III à infecção animal. Essas
observações têm implicações importantes na epidemiologia, gravidade da
doença, manifestações clínicas e eficácia ao tratamento (BOOTHROYD &
GRIGG, 2002).
Dentre as cepas de T. gondii que já foram descobertas, a cepa RH (tipo
I), é a mais virulenta (LEVINE et al, 1980). A cepa P-Br altamente cistogênica
apresenta genótipo híbrido tipo I/III, constituindo-se na primeira cepa de T.
gondii naturalmente híbrida descrita no Brasil (FUX et al., 2003).
Em seus estudos, Ferreira (2004), demonstrou que as cepas brasileiras
apresentam genótipos recombinantes (mistura dos genes dominantes), com
alelos típicos de cepas dos tipos I, II e III na maioria dos loci examinados.
17
2.6- Mecanismos de Invasão da Célula Hospedeira pel o T. gondii
Diversos estudos mostram que o T. gondii é capaz de expressar
diferentes antígenos de superfície (SAG) localizados na membrana do parasito,
os quais são codificados por genes de cópia única e que tem um importante
papel nos mecanismos imune, patogênico e de invasão do parasito (TOMAVO
et al., 1991; AUBERT et al.; 2000). O SAG1 e o SAG2 são agrupados com
genes de cópia única, sendo conhecidos como genes codificadores de
antígenos, nestes se incluem os principais antígenos de superfície de
taquizoítos (PRINCE et al., 1990). O SAG3 e o SAG4 foram encontrados na
superfície de bradizoítos, não tendo sido observado a presença de SAG1 e
SAG2 nesse estágio de desenvolvimento (KASPER et al., 1985; ODBERG-
FERRAGUT et al. 1996). Além desses genes, outros têm sido utilizado na
realização de estudos moleculares, como B1; cB21-4; cS10-A6; GRA1, GRA2,
GRA4, GRA6 e GRA7 (compartimentalizados nos dos grânulos densos); L363
e ROP1 e ROP2 (compartimentalizados nas roptrias) (MARTIN et al., 1998;
AUBERT et al., 2000; FUX et al., 2003).
A invasão da célula pelos taquizoítos é extremamente rápida, durando
de 15 a 40 segundos, sofrendo influências da concentração de íons
extracelulares, da motilidade do taquizoíto e de seus produtos secretados
(SAFFER & SCHWARTZMAN, 1991; MORISAKY et al., 1995; McLEOD, et al.,
1991). A existência do parasito na célula do hospedeiro depende do processo
de invasão celular que é extremamente complexo e coordenado (SAFFER et
al., 1992; DUBREMETZ & SCHWARTZMAN, 1993; CARRUTHERS & SIBLEY,
1997). Os mecanismos que permitem a entrada do parasito na célula do
hospedeiro são movimentos de contração do conóide e as secreções liberadas
pelas organelas presentes no complexo apical, ocorrendo penetração de forma
ativa ou por fagocitose (NICHOLS & CHIAPPINO, 1987; PACHECO-SOARES
& DE SOUZA, 2000).
Inicialmente ocorre o reconhecimento e junção da porção anterior do
parasito na membrana da célula hospedeira, formando uma área de aderência
18
bastante firme. Em seguida ocorre a protrusão do conóide que dá a força
mecânica para a motilidade dos taquizoítos e a secreção de organelas do
parasito que irão facilitar a penetração para o interior da célula (CARRUTHERS
& SIBLEY, 1997). Logo em seguida ocorrem os eventos de secreção das
micronemas, e estas secreções não são transferidas ao vacúolo parasitóforo,
indicando que são importantes para o mecanismo de adesão. Logo após, na
fase de penetração, as roptrias descarregam seus produtos (que estão
associados a eventos precoces na formação do vacúolo parasitóforo), e após 6
horas de invasão esses produtos das roptrias diminuem drasticamente da
membrana do vacúolo.
Após a invasão, os parasitos colidem ao acaso com as células do
hospedeiro e a penetração ocorre só quando há a reorientação da porção
anterior do parasito com a superfície da célula parasitada (PERKINS, 1992),
formando o vacúolo parasitóforo que não se une ao lisossomo e não é
acidificado, permitindo a multiplicação do parasito no vacúolo (SADAK et al.,
1988; BONHOMME et al., 1990; LECORDIER et al, 1999).
Quando o parasito já está dentro do vacúolo, ocorrem as secreções dos
grânulos densos, com um pico máximo 20 minutos após a invasão, estando
envolvidas na sobrevivência intracelular do T. gondii (CARRUTHERS &
SIBLEY, 1997). Com o advento da resposta imune, os taquizoítos formam os
bradizoítos, enquanto o vacúolo parasitóforo dá origem ao cisto tecidual
(CAMUS et al., 1995).
Os mecanismos pelos quais o parasito evita a sua destruição no vacúolo
parasitóforo ainda não estão totalmente esclarecidos (CAMUS et al., 1995).
Afinal, considera-se que a patogênese da toxoplasmose seja resultado direto
de efeito citopático. As características relevantes do parasito na patogenicidade
incluem: capacidade de invadir células, habilidade de utilizar substratos da
célula hospedeira para sobrevivência e multiplicação, e persistência
proliferativa ou cística infectante (FRENKEL, 1961).
19
2.7- Resposta imune ao Toxoplasma gondii
A imunidade protetora contra o T. gondii é específica e ocorre através
dos mecanismos humoral e celular; sendo suas formas extracelulares
diretamente afetadas por anticorpos, o que não acontece como as formas
intracelulares do parasito.
De acordo com Denkers & Gazzinelli (1998) o T. gondii caracteriza-se
por ativar uma marcante resposta imune celular. Uma característica dessa
resposta é que praticamente não existe imunopatologia associada à mesma,
sendo os sintomas mais comuns febre e linfoadenopatia. A resposta imune
induz a elevação da temperatura corpórea, um sinal para a formação dos cistos
teciduais (DUBEY et al., 1998).
Algumas espécies, tais como ratos e galinhas, exibem um alto grau de
resistência natural. A idade também se constitui em um fator importante para a
resistência natural, sendo que os animais jovens, nas diferentes espécies,
apresentam-se mais susceptíveis ao T. gondii (DUBEY, 1993).
O controle da infecção aguda causada pelo Toxoplasma, inicialmente,
deflagra resposta inata, seguida por resposta adquirida antígeno-específica,
que é particularmente crítica para a resolução da infecção por taquizoítos. A
imunidade inata inclui macrófagos, polimorfonucleares, monócitos, células
citotóxicas naturais (Natural Killer), complemento, lisoenzimas e interferon.
Enquanto que a imunidade adquirida-específica caracteriza-se pela presença
de linfócitos T, B, e imunoglobulinas. As células do sistema imune que freiam o
parasito num primeiro momento, são monócitos/macrófagos com o auxílio de
anticorpos específicos da classe imunoglobulinas M (IgM) e imunoglobulinas A
(IgA), e posteriormente, os linfócitos T sensibilizados (CAMARGO, 1995). Após
a fase aguda o hospedeiro desenvolve uma imunidade duradoura e protetora
para re-infecções.
Altos títulos de anticorpos específicos e a citotoxicidade dependente de
anticorpos podem lisar os parasitos extracelulares, bloqueando a invasão da
célula do hospedeiro uma vez que a produção máxima de anticorpos coincide
20
com o desaparecimento de taquizoítos viáveis (FRENKEL, 1990; WASTUNG et
al., 1995)
Sob ação da imunidade celular, o T. gondii, que, na fase aguda da
toxoplasmose, se encontram principalmente na forma de taquizoítos, alguns
são destruídos devido ao rompimento de sua membrana celular, enquanto
outros, na forma de bradizoítos, formam cistos teciduais. Esses cistos,
localizados dentro das células hospedeiras, ficam protegidos da ação do
sistema imune durante a fase crônica da doença (FRENKEL, 1985). Quando,
circunstancialmente, se liberam desses locais, são prontamente eliminados
pela imunidade do hospedeiro (GAZZINELLI et al., 1993).
Os taquizoítos ativam células como macrófagos e células Natural Killer
(NK). No estágio precoce da infecção, os macrófagos produzem citocinas pro-
inflamatórias, induzindo a produção, pelas células NK, de interferon-gama (INF-
γ), as quais promovem ativação macrofágica e aquisição da atividade
microbiostática e a diferenciação das células Th1, que induzem a imunidade
celular protetora contra patógenos intracelulares (GAZZINELLI et al., 1993).
O INF-γ ativa o macrófago para que ocorra a destruição do T. gondii e
ainda inibe o processo alimentar dos taquizoítos, induzindo a diferenciação
desses em bradizoítos, e estimula o afluxo de macrófagos e outras células
defensivas, mantendo os bradizoítos em latência, permanecendo o paciente na
fase crônica (DUBEY et al., 1998, KAWAZOE, 2005).
Quanto aos mecanismos humorais, inicialmente ocorre produção de IgM
e IgA, o que caracteriza a fase aguda da doença, seguida da produção de IgG
em pequenas quantidades e são de baixa avidez. Aumentos nos títulos de IgM
duram um curto período, e a IgA, que não possui capacidade protetora,
servindo apenas como indicadores da doença, desaparece antes dos
anticorpos IgM. As IgG podem persistir com altos títulos e com alta afinidade
por um longo tempo, caracterizando a fase crônica, onde os taquizoítos
intracelulares e bradizoítos persistem, podendo durar por toda a vida do
hospedeiro (CAMARGO, 1995). A IgM e IgA são incapazes de atravessar a
placenta e por esta razão são utilizadas para o diagnóstico da toxoplasmose
21
congênita. A IgG aparece cerca de 8 dias após a infecção, podendo ser
detectada nos testes sorológicos, permanecendo detectáveis enquanto durar a
infecção (KAWAZOE, 2005).
Os taquizoítos de T. gondii podem persistir por longo tempo no cordão
espinhal e cerebral e como cistos viscerais porque a imunidade é pouco efetiva
nos órgãos neuronais (DUBEY, 1998).
A resposta imunológica dos organismos ao T. gondii é complexa e faz
com que o hospedeiro imunocompetente desenvolva imunidade contra o
parasito durante toda a sua vida, tornando-se este hospedeiro muito resistente
a uma reinfecção, uma vez que foi gerada uma memória imunológica de longa
duração (DENKERS et al., 1994).
2.8 – Vacinas contra Toxoplasmose
A infecção por T. gondii raramente apresenta sinais clínicos no
hospedeiro, entretanto, a severidade da doença, quando esta ocorre, está
relacionada à espécie, idade do hospedeiro, prenhes, condições imunológicas
ou nutricionais, virulência do parasito, estágio do parasito e infecções
concomitantes (LUFT & REMINGTON, 1992; DUBEY, 1994; DUBEY et al.,
1994; LIESENFELD et al., 2001; DUBEY & JONES, 2008).
Atualmente o controle desta parasitose depende basicamente do
tratamento curativo dos casos agudos e de medidas profiláticas que impeçam a
disseminação de oocistos esporulados. Entretanto, existe uma crescente
preocupação com o desenvolvimento da resistência as drogas por animais
destinados a alimentação humana. Além disso, não existe nenhuma droga
disponível que possa agir contra o estágio de cisto tecidual do T. gondii e assim
curar pessoas ou animais nesta fase da infecção.
Como este parasito é intracelular obrigatório, os mecanismos imunes
mediados pelas células são componentes importantes para a proteção do
hospedeiro. Por isso o desenvolvimento de vacinas se mostra uma estratégia
promissora para o controle da toxoplasmose. Algumas estratégias bem
22
sucedidas usando vacinas experimentais com parasitos atenuados permitem o
processamento e apresentação correta dos antígenos ao sistema imunológico
do hospedeiro estimulando uma resposta imune eficiente. Contudo vacinas
vivas podem apresentar problemas relacionados com a segurança, a reduzida
vida-útil, e a produção em larga escala; conseqüentemente existe um interesse
continuado em planejar vacinas novas usando antígenos recombinantes
definidos (INNES & VERMEULEN, 2006).
As vacinas são classificadas em três grupos: as vivas (virulentas ou
atenuadas), as de subunidades e as genéticas. As vacinas vivas normalmente
estimulam tanto a resposta imune humoral quanto a celular. As vacinas
constituídas por vírus atenuados preservam os mecanismos de que os vírus
dispõem para se ligar às células hospedeiras, introduzir seu material genético e
comandar a síntese de proteínas virais, ou de antígenos, que serão mostrados
pelas células infectadas. Dessa maneira, essas vacinas estimulam o ataque
pelos linfócitos T e pelos anticorpos sintetizados pelos linfócitos B. Essa dupla
atividade é essencial para o bloqueio da infecção viral e para assegurar a
imunidade. Outra vantagem importante é que essas vacinas freqüentemente
conferem imunidade para o resto da vida e não necessitam de adição de
adjuvantes. São as que mimetizam melhor uma infecção real.
As vacinas de subunidades apresentam, ainda, a incapacidade de se
replicar no hospedeiro ou de reverter à virulência, não sendo transmissíveis
para os indivíduos receptores, o que representa enorme vantagem, do ponto de
vista, de viabilidade como protótipo vacinal. Além disso, elas conferem um
direcionamento da resposta imunológica para o antígeno de interesse vacinal,
oferecendo uma boa indução da resposta imune celular e humoral. Elas
também contêm pouco ou nenhum material estranho e por isso tendem a
produzir menos efeitos adversos ao organismo.
Já as vacinas genéticas, além da imunidade humoral e celular
específica, oferecem vantagens adicionais em relação às vacinas clássicas.
Não causam infecções, pois não possuem os genes necessários para a
replicação do patógeno. Podem ser produzidas em grandes quantidades,
23
utilizando a tecnologia do DNA recombinante, o que diminui os custos da
produção, podem ser construídas para transportar genes de diferentes
linhagens de vírus e bactérias, fornecendo imunidade contra vários patógenos
ao mesmo tempo. Além de tudo, os genes transferidos por essas vacinas
resultam em antígenos específicos, contra os quais a resposta imunológica é
desejada, resultando numa resposta imunitária mais específica por parte do
organismo. O custo de produção das vacinas gênicas em larga escala é
significativamente menor do que o custo de produção das vacinas
recombinantes, peptídeos sintéticos e outras. O controle de qualidade é mais
fácil, e a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois
estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente. Estes fatores facilitam o
transporte, a distribuição e o estabelecimento de amplos programas de
imunizações em regiões de difícil acesso.
O desenvolvimento de vacinas para o T. gondii é baseado na
observação de que a exposição ao parasito pode produzir resposta imune de
vida longa, capaz de proteger o hospedeiro contra o desafio secundário com o
parasito (DENKERS & GAZZINELI, 1998). A vacinação tem como objetivo
reduzir as lesões fetais, o número de cistos teciduais, além de prevenir a
formação de oocistos em felinos (DUBEY, 1996). Atualmente não existem
vacinas comerciais para a toxoplasmose humana, que previna a infecção
congênita, ou a formação e reativação de cistos (GOTTSTEIN, 1995).
As tentativas iniciais para induzir proteção contra a toxoplasmose em
camundongos envolveu o uso de taquizoítos vivos atenuados de cepas
mutantes de T. gondii, tais como a cepa ts-4 sensível a temperatura
(GAZZINELLI et al.,1991; HIRAMOTO et al., 2002). Devido à elevada eficiência
em termos de ativação de células T CD4+ e CD8+ e a eficácia de proteção,
vacinas baseadas em taquizoítos vivos não são aplicáveis a humanos, por
causa do risco de efeitos colaterais patogênicos. Portanto, a maioria dos
protocolos mais recentes tem focado no desenvolvimento de vacinas
recombinantes (CAETANO et al., 2006).
24
Como antígeno alvo é grande o interesse em proteínas de superfície
abundantes no taquizoíto, tais como SAG1, SAG2 e SAG3, ancoradas na
membrana do parasito por estruturas de GPI (glicosilfosfatidilinositol) e que
estão envolvidas no processo de invasão da célula hospedeira, sendo suas
seqüências altamente conservadas nas diferentes cepas de T. gondii,
compartilhando um elevado grau de homologia entre cepas tipo I (patogênica e
letal em camundongos) e o tipo II/III (cistogênica) (CAETANO et al., 2006).
De acordo com Montoya & Liesenfeld (2004) uma vacina humana contra
a toxoplasmose é muito desejável, porém, ainda está longe da realidade. Neste
sentido, diversos estudos estão sendo conduzidos na tentativa de desenvolver
uma vacina que ofereça proteção eficaz contra esta parasitose. Em algumas
pesquisas, por exemplo, o objetivo é de induzir a proteção por linfócito T (Th1)
e por respostas humorais, para que a imunidade dure por toda a vida.
Entretanto, hoje isso só ocorre quando existe a infecção natural.
Em 1988, começou a ser comercializada na Nova Zelândia e na Grã-
Bretanha, a vacina viva (TOXOVAX) para o controle de abortos provocados
pelo T. gondii em ovinos, e utiliza taquizoítos da cepa S-48, que não persistem
nos tecidos dos animais, reduzindo a perda de fetos e evitando a formação de
cistos na carne que será usada para consumo. Ela é capaz, ainda, de reduzir a
infecção em ovinos, que em pastejo livre são expostos a contaminação por
oocistos. Se a vacina for usada com este fim, os filhotes (machos e fêmeas)
deverão ser vacinados ao nascimento. (BUXTON et al., 1993; McALLISTER,
2005).
Segundo Parmley et al. (2002), muitas vacinas vivas atenuadas com
cepas de T. gondii tem sido desenvolvidas para serem utilizadas em gatos,
suínos e ovinos, contudo uma vacina recombinante seria mais segura e
eficiente para a saúde humana e animal. Os melhores antígenos para uso em
vacinas seriam os de superfície e os secretores, pois são os melhores alvos da
resposta imune em infecção natural.
25
Nos últimos anos vem se trabalhando experimentalmente com a
utilização de vacinas de DNA para várias doenças como a malária,
criptosporidiose, leishmaniose e toxoplasmose.
As vacinas de DNA contra o T. gondii têm evoluído no uso de vários
tipos de antígenos, principalmente em vacinações estratégica de mucosas,
com focos em vacinações intranasais com antígenos de superfícies de T.
gondii (SAG1). As administrações de SAG1, purificado de lisado do parasito
adicionado, utilizando como adjuvantes a toxina colérica (BOURGUIN et al.,
1993; DEBARD et al., 1996; VELGE-ROUSSEL et al., 2000) ou as
enterotoxinas (BONENFANT et al., 2001) vem proporcionando as induções de
linfócitos T-auxiliar do tipo 1 nas respostas imunológicas.
Os genes codificando os antígenos de superfície do T. gondii, SAG1 e
SAG2, têm sido clonados e expressos em sistemas recombinantes de
organismos procariotos e eucariotos, e tanto proteínas recombinantes como
moléculas de DNA plasmidial tem sido usadas para imunizar camundongos e
outras espécies de roedores. Observou-se que proteínas recombinantes
geralmente induz altos títulos de anticorpos IgG1, que respondem fracamente
ao desafio com cepas patogênicas de T. gondii, e que a melhoria da resposta
depende da combinação com adjuvantes adequados. Por outro lado, vacinas
baseadas em plasmídeos codificando SAG1 e SAG2, foram capazes em
muitos casos dependendo da rota de administração e formulação, de induzir
uma resposta imune celular, com um perfil Th1, induzindo a uma melhor
proteção.
Neste contexto, vetores virais tais como os adenovírus, podem melhorar
a resposta imune em comparação com vacinas sem plasmídeo porque eles são
mais eficientes em transferir as seqüências genéticas e induzir a expressão da
proteína; apresentam baixa patogenicidade o que permite o desenvolvimento
de vetores de imunização praticamente inócuos aos hospedeiros; suas
estratégias de replicação e genoma já são caracterizados, sendo o material
genético viral incapaz de integrar-se ao da célula hospedeira; infectam uma
grande variedade de células, incluindo células chave do sistema imunológico,
26
como as células dendríticas, que pode ser a razão de sua elevada
imunogenicidade quando comparado com outros vírus; são de fácil
propagação, podendo ser obtidos em altos títulos (>109 unidades formadoras
de placas/mL (PFU)), o que permite sua produção em larga escala (BABIUK &
TIKOO, 2000; MERCIER et al., 2002; WORGALL et al., 2004; SOUZA et. al.,
2005). Devido a essas características, adenovírus são ativadores eficiente de
células T CD4+ e CD8+ e são capazes de conduzir a resposta imune para o
perfil Th1 desejado (CAETANO et al., 2006).
Vercammem et. al. (2000) vacinaram camundongos com plasmídeos
liberando antígenos de GRA1, GRA7, e ROP2 e verificaram um estímulo
específico de células T e secreção de IFN-γ, em cultura de baços de animais
vacinados. A taxa de sobrevivência dos animais foi maior no grupo vacinado
(variando de 10 a 90 %) que no controle e o número de cistos cerebrais foi
significativamente menor no grupo vacinado.
Freire et. al. (2003) imunizaram suínos com uma vacina utilizando-se de
um lisado de taquizoítos do T. gondii incorporados ao ISCOM (antígenos
incorporados em complexos de imunoestimulação) e, após o desafio
verificaram que a vacina foi capaz de estimular uma forte resposta imune
humoral.
Garcia et al. (2005) estudaram o uso de proteínas de roptrias do T.
gondii incorporadas ao ISCOM para proteger suínos desafiados com oocistos,
e verificaram a proteção parcial do grupo vacinado, quando comparado ao
grupo controle positivo, contra a formação de cistos teciduais, observando
ainda que, a imunização sistêmica pela via subcutânea, não foi eficaz para
estimular a proteção da mucosa intestinal.
O uso de vacinas pela via nasal associadas a adjuvantes apropriados
pode induzir resposta imune tanto local como sistêmica. Esta via requer menos
antígenos para promover a imunidade do que a via oral, pois a atividade
proteolítica na via nasal é muito menor do que na via oral (VELGE-ROUSSEL
et al., 2000).
27
A imunização de mucosa foi estudada por Debard et al. (1996) através
do uso de vacina aplicada pela via nasal em camundongos utilizando a SAG1
adicionada de toxina colérica, e induziram uma imunidade local e sistêmica que
assegurou proteção parcial e persistente contra a infecção crônica.
Velge-Roussel et al. (2000) verificaram a transferência passiva de
células linfóides de camundongos doadores, imunizados com SAG1 pela via
nasal associada à toxina colérica, foi capaz de reduzir o número de cistos
cerebrais quando comparados ao grupo controle.
Bonenfant et al. (2001) obtiveram proteção contra a formação de cistos
cerebrais do T. gondii em camundongos vacinados pela via nasal e desafiados
com cistos pela via oral. Eles relacionaram esta imunidade aos altos títulos de
anticorpos IgG anti-T. gondii obtidos pela vacinação da SAG1 associada à
enterotoxinas como adjuvante.
Igarashi (2006) verificou a indução de resposta imune humoral e celular
e uma proteção contra a formação de cistos teciduais em camundongos
vacinados pela via nasal com as proteínas recombinantes ROP2, GRA5 e
GRA7 associados à toxina colérica e desafiados com cistos teciduais da cepa
VEG de T. gondii por via oral.
O protótipo de vacina utilizada neste estudo foi fornecido pelo Prof. Dr.
Oscar Bruña-Romero (ICB/UFMG), sendo construída com adenovírus
recombinante deficiente de replicação para expressar SAG1, SAG2, SAG3 e
CMV de T. gondii capaz de induzir uma resposta imune protetora contra um
desafio com o parasito vivo em camundongos. Os resultados mostraram que
todos os adenovírus recombinantes expressando os vários antígenos de
superfície do taquizoíto foram imunogênicos, induzindo altos níveis de IgG2a
antígeno-específico bem como IFN-γ que leva a redução da formação de cistos
cerebrais em camundongos desafiados com a cepa P-Br.
28
3 - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
Devido à grande importância da ovinocaprinocultura para o Nordeste, e
em especial para o Rio Grande do Norte, sendo uma atividade que favorece o
aspecto alimentar e econômico, há urgência e necessidade de estudos que
visem contribuir para a identificação do Toxoplasma gondii. Essa parasitose em
determinadas circunstâncias, pode acarretar complicações e mortes em
pequenos ruminantes.
Este trabalho visa produzir conhecimento científico que possa subsidiar
programas de controle de doenças parasitárias, contribuindo desta forma para
a otimização do manejo e da produtividade dos rebanhos, seu bem-estar e
conseqüentemente a saúde humana. A detecção e combate a toxoplasmose,
uma doença bastante negligenciada em nosso meio, terá conseqüências
diretas na ovinocaprinocultura, com à obtenção de melhores níveis produtivos,
melhor qualidade dos produtos e da saúde animal e humana.
Parasitoses como esta se encontram de forma direta, afetando
negativamente a produção de caprinos e ovinos, seja por perdas ocasionadas
devido a distúrbios nas condições fisiológicas dos animais, ou devido à
mortalidade e abortos. Esses fatores estão diretamente relacionados às perdas
ou redução no ganho de peso, queda na produção de leite e baixa na
qualidade e no rendimento das carcaças, além de estarem relacionadas à
baixa reprodução. Indiretamente, com a necessidade de mão de obra
capacitada, custos com o tratamento, baixo preço final com venda de animais
e/ou seus produtos, devendo-se este último fator as restrições impostas pelas
barreiras comerciais existentes, esta doença trás prejuízos econômicos à
cultura.
O leite de cabra é amplamente utilizado na alimentação de crianças que
são alérgicas ao leite de vaca (FIGUEIREDO et al., 2001), portanto, a
necessidade de saber a prevalência desta doença nos rebanhos caprinos, por
meio de teste sorológico rápido, viável, sensível e específico.
29
Uma vez que inexistem dados epidemiológicos sistematizados a respeito
da toxoplasmose caprina nas fazendas da Associação de Criadores de
Caprinos e Ovinos do Sertão do Cabugi e também programas oficiais de
assistência aos pecuaristas, este trabalho é de grande importância já que
propicia a avaliação indireta dos impactos negativos desta parasitose sobre os
rebanhos. A determinação da real prevalência da toxoplasmose em caprinos e
suas implicações epidemiológicas gerando informações cientificas
consistentes, podem subsidiar programas de controle de doenças parasitárias
e contribuir para a otimização da produtividade dos rebanhos quantitativa e
qualitativamente.
A escolha da técnica sorológica Elisa para este estudo de soro-
prevalência deve-se ao fato de que esta é considerada uma das mais sensíveis
para o estudo da toxoplasmose em caprinos (SAWADOGO, 2005), sua
aceitação universal, grande utilização, e ao custo reduzido da técnica. Nas
amostras positivas, foi feito o teste de Elisa de avidez de anticorpos para
detectar se o animal está na fase crônica ou aguda.
Por isso, desenvolver novas estratégias de vacinas contra toxoplasmose
através da construção de adenovírus vacinal recombinante contendo epítopos
protetores de toxoplasmose prevê avanços significativos na geração de novas
ferramentas para o controle dessa parasitose em ovinos e caprinos, dentre os
quais podemos citar: (i) dados epidemiológicos importantes; (ii) bases para o
desenvolvimento de novos fármacos com ação antitoxoplásmica; (iii) alvos
potenciais para fármacos e vacinas; (iv) técnicas de diagnóstico.
A vacinação e a avaliação de imunogenicidade preliminar nos rebanhos,
uma segunda abordagem deste projeto, permitirá abrir nova linha de pesquisa
no LABMAT no que se refere a vacinas e resposta imune, de modo a criar
perspectivas para limitar, a médio e longo prazo, a parasitemia aguda e
proteger os rebanhos caprinos contra a toxoplasmose congênita garantindo
assim uma melhoria nos rebanhos da região central do Cabugi dada a criação
recente de uma Incubadora de Empresas de Agronegócios (INEAGRO
30
CABUGI) voltada para a implementação e criação de rebanhos caprinos e
ovinos.
Por isso, em colaboração com o Prof. Dr. Oscar Bruña Romero,
Professor do Departamento de Microbiologia da UFMG, foram produzidas e
testadas vacinas contra T. gondii. As proteínas de superfície SAG1, SAG2 e
SAG3 encontrada nos taquizoítos do Toxoplasma gondii são moléculas
imunodominantes e vem sendo utilizadas para a produção de vacinas. Estes
antígenos de T. gondii são extensivamente estudados e altamente indutor das
respostas imunes do tipo Th1 e Th2 (KHAN, SMITH e KASPAR, 1988; MINEO
et al, 1993). Assim sendo, esta vacina pretende limitar a parasitemia aguda e
proteger contra a toxoplasmose congênita, protegendo contra a doença fetal
em rebanhos caprinos e ovinos. Além disso, pretendemos fornecer dados
confirmatórios acerca da imunogenicidade desse protótipo de vacina.
3.1 - Objetivo Geral:
Determinar à prevalência de Toxoplasma gondii em caprinos na região
de atuação da Associação de Criadores de Ovinos e Caprinos do Sertão do
Cabugi, validando a eficiência de imunização, visando contribuir para a
melhoria do rebanho.
3.2 - Objetivos Específicos:
● Estudar a ocorrência do Toxoplasma gondii em caprinos.
● Determinar a ocorrência das fases aguda e crônica nesses animais.
• Avaliar a imunogenicidade de diferentes formas de apresentação do
adenovírus vacinal recombinante (protótipo de vacina) contra
toxoplasmose caprina.
31
4.0 - METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO
4.1 – Área de Estudo
O Estado do Rio Grande do Norte, situado na Região Nordeste do
Brasil, apresenta uma extensão territorial de 53.077,3 Km2, o que representa
3,41% de área da Região Nordeste e cerca de 0,62% do território nacional. A
temperatura média anual do estado é em torno de 25,5 0C, com máxima de
31,3 0C e mínima de 21,1 0C, sendo sua pluviometria bastante irregular. Em
cerca de 60% do Estado predominam o clima semi-árido, caracterizado por sua
baixa precipitação pluviométrica, em torno de 400 a 600 mm por ano,
distribuídas as chuvas nos meses de janeiro a abril (IDEMA, 2007). O Estado é
dividido em quatro mesorregiões geográficas: Agreste Potiguar, Leste Potiguar,
Central Potiguar e Oeste Potiguar. (IBGE, 2007).
Os animais testados neste estudo foram provenientes da mesorregião
Central Potiguar, nos municípios de Lajes, Angicos, Pedro Avelino e Afonso
Bezerra. Estes municípios têm em comum clima muito quente e semi-árido,
temperatura média anual de 27,2º C, umidade relativa média anual em torno de
70% e vegetação de caatinga (IDEMA, 2007).
O município de Lajes tem área de 676,42 km², altitude de 199 metros,
precipitação pluviométrica anual média de 414,7 mm. Angicos tem as seguintes
características físicas: área de 741,65 km², altitude de 110 metros, precipitação
pluviométrica anual média de 402,6 mm. O município de Pedro Avelino tem
área de 874,4 km², altitude de 95 metros, precipitação pluviométrica anual
média de 449,5 mm. Afonso Bezerra tem área de 576,2 km², altitude de 62
metros, precipitação pluviométrica anual média de 485,0 mm (IDEMA, 2007).
Este trabalho foi realizado em propriedades incluídas na Associação dos
Criadores de Ovinos e Caprinos do Sertão do Cabugi (ACOSC), Estado do Rio
Grande do Norte. As propriedades estudadas receberam códigos de
identificação para que os respectivos nomes não fossem divulgados garantindo
a isenção durante a realização do estudo.
32
4.2 – Amostragem Amostras de sangue de caprinos de diferentes raças, de ambos os
sexos e com idade entre 5 meses e 7 anos, foram coletadas de agosto de 2007
a outubro de 2008, totalizando 244 animais em 8 fazendas. Estas amostras
foram retiradas de animais destinados à produção leiteira e ao corte. Estes
animais foram marcados com etiquetas e registrados em fichas individuais
contendo as seguintes informações: número do animal, idade, raça e sexo.
4.3 – Coleta do Sangue
Foi retirado sangue através da veia jugular com o auxilio de tubos de
coleta a vácuo tipo vacutainer ® sem anticoagulante estéreis. Estes tubos foram
acondicionado numa caixa de isopor contendo gelo em gel e transportada até o
Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose (LaBMaT), do
Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
4.4 – Antígeno
O antígeno foi preparado por ressuspensão de taquizoítos (cepa RH) em
PBS, pH 7.2 e sonicado em água gelada de acordo com o protocolo de Elsaid
et. al., (1995). Apenas o sobrenadante (200 x g por 10 min) foi considerado
como estrato antigênico do Toxoplasma gondii (AET). A concentração de
proteína foi determinada pelo método de Lowry (1951).
4.5 – Testes sorológicos
No laboratório os tubos foram centrifugados a 2000 r.p.m durante 5
minutos para a obtenção do soro, o qual foi aliquotado, devidamente
identificado e armazenado a -200C até a realização do testes laboratoriais. Em
33
seguida estas amostras foram testadas pelo ELISA - Ensaio Imunoenzimático -
para a detecção de anticorpos IgG específicos para Toxoplasma gondii.
4.5.1 - ELISA
Neste estudo o ELISA foi realizado segundo Clementino et. al. (2007)
com modificações. Desse modo, antes da utilização do ensaio nas amostras
de soros a serem testadas, realizou-se uma padronização como descrito a
seguir. Microplacas de 96 cavidades com fundo chato (Corning Incorporated -
USA) foram utilizadas para testar diferentes concentrações de antígeno
(0,5µg/cavidade e 0,1µg/cavidade de proteína por cavidade), de soros (1:400,
1:100, 1:200) e de conjugado (1:7500, 1:5000) e de peróxido de hidrogênio
(pura e 30 volumes). Os controles negativos também foram testados por
diversas vezes. Após o processo de padronização a técnica foi realizada de
acordo com protocolo abaixo.
As microplacas de poliestireno de 96 cavidades com fundo chato foram
sensibilizadas com 100µL do antígeno em cada cavidade na concentração de
1µg/ml diluído em tampão carbonato/bicarbonato (pH 9,6), seguindo-se
incubação overnight a 4oC. No momento do uso a solução de antígeno foi
desprezada e a placa lavada quatro vezes com solução salina contendo
Tween-20 a 0,05% (PBS-T).
Após secagem das placas por inversão sobre papel de filtro absorvente,
os soros foram diluídos em PBS-T (Tween-20 a 0,05% em PBS pH 7,2), na
diluição de 1:100, e distribuídos 100µL por cavidade da placa, seguida da
incubação a 37oC por 45 minutos. Os soros foram ensaiados em duplicada.
Após este período de incubação, foi realizada uma série de quatro lavagens
com PBS.
Em cada cavidade da placa foram adicionados 100µL de conjugado
imunoglobulinas anti-caprinos IgG, marcado com peroxidase (SIGMA, produto
no A-5420) diluída a 1:5000 em PBS-Tween 20, e posteriormente incubada por
45 minutos a 37oC. Após este período, foram lavadas em uma série de quatro
34
lavagens com PBS. A reação foi revelada por adição de 100µL do substrato
(3µg de σ-phenylinediamine (SIGMA) em 15 mL de solução de ácido cítrico e
3µL de peróxido de hidrogênio – 30volumes) por orifício.
A reação foi interrompida após 20 minutos com 30µL de H2SO4 (4 N) por
cavidade e a leitura realizada em leitor de ELISA (BIO RAD Modelo 3550 com
filtro de 490nm). Foram utilizados como os “controles brancos”, cavidades de
cada placa em número de quatro, com antígeno, conjugado e substrato, sem
soro.
O ponto de corte para o ELISA foi a média de absorbância de três
amostras de soro de ovinos negativos para T. gondii mais três desvios padrão
testados em cada placa. A média dos soros testados em duplicata foi dividida
pelo valor do ponto de corte da placa com o objetivo de determinar o índice de
reatividade (IR). Soros com valores de IR ≥ 1 foram considerados positivos.
4.5.2- ELISA para avaliação da avidez de anticorpos IgG
Paralelamente ao ELISA convencional foi realizado um ELISA para
avaliação da avidez de anticorpo IgG, nas amostras positivas previamente
testadas pelo ELISA convencional, utilizando a uréia como agente dissociante
da ligação antígeno-anticorpo.
A técnica foi realizada de acordo com protocolo descrito por Clementino
et. al. (2007), sendo adotado como pontos de corte os valores citados por
Suarez-Aranda et al. (2000), onde avidez com valores iguais ou maiores que
50% indicam toxoplasmose crônica e valores menores que 50% indicam
infecção aguda ou recente.
As placas foram sensibilizadas e lavadas como descrito anteriormente.
Após secagem das placas, os soros foram diluídos em PBS-T, na diluição de
1:100, e distribuídos nas cavidades da placa, seguida da incubação a 37oC por
45 minutos. Os soros foram ensaiados em duas séries duplicadas na mesma
placa, de tal forma que nas colunas 1 a 6 de cada placa, foram processados os
35
mesmos soros trabalhados nas colunas de 7 a 12, de tal forma que uma
metade da placa era uma réplica idêntica da outra metade.
Após este período de incubação uma série de três lavagens foi
realizada. Na primeira lavagem uma das séries (coluna de 1 a 6) foi lavada com
PBS-T (100µL /cavidade) e a outra série (colunas 7 a 12) com uréia 6M em
PBS-T (100µl/cavidade) sob agitação por 5 minutos. As outras duas lavagens
foram feitas com PBS-T (100µL /cavidade) sob agitação, também em dois
ciclos de cinco minutos. Foi adicionado então, a cada orifício da placa, 100µL
de conjugado na diluição de 1:5000 em PBS-T. A partir da adição do conjugado
o procedimento será idêntico ao descrito para o ELISA convencional.
A avidez de anticorpos IgG será calculada como a razão entre a
absorbância média para cada soro obtida nas cavidades tratadas com uréia
(AU) pela absorbância média de cavidade não tratados (A) expressos em
percentagem: AU/A X 100 (COZON et al., 1998).
4.5.3- ELISA de Titulação
No que se refere à avaliação da efetividade da imunização do rebanho
foi realizado paralelamente ao ELISA convencional, um ELISA de titulação para
detectar até que diluição encontrava-se os anticorpos IgG específicos para T.
gondii. Soros foram diluídos a partir de 1:100 até 1:12.800.
As placas foram sensibilizadas e lavadas como descrito anteriormente.
Após secagem das placas, os soros foram diluídos em PBS-T, nas diluições de
1:100; 1:200; 1:400; 1:800; 1:1600; 1:3200; 1:6400; 1:12800 e distribuídos nas
cavidades da placa, seguida da incubação a 37oC por 45 minutos. Os soros
foram ensaiados em séries duplicadas na mesma placa, de tal forma que uma
coluna era uma réplica idêntica da coluna seguinte, sendo as diluições feitas da
linha 1 (diluição 1:100) em direção a linha 8 (diluição 1:12800) de cada placa.
Após este período de incubação, foi realizada uma série de quatro lavagens
com PBS. Os procedimentos seguintes foram idênticos ao descrito para o
ELISA convencional.
36
O ponto de corte para o ELISA foi a média de absorbância de três
amostras de soro de caprinos negativos para T. gondii mais três desvios
padrão testados em cada placa. A média dos soros testados em duplicata foi
dividida pelo valor do ponto de corte da placa com o objetivo de determinar o
índice de reatividade (IR). Soros com valores de IR ≥ 1 foram considerados
positivos.
4.6 - Imunização de caprinos
Para a realização da imunização, 24 caprinos tiveram seu sangue
coletado, como descrito anteriormente, antes da primeira imunização, com a
finalidade de descobrir se tais animais apresentavam anticorpos IgG
específicos para o T. gondii. Em seguida, os animais foram separados
aleatoriamente grupos de 5 caprinos (com exceção do grupo controle que
contava com apenas 4 animais) que receberam três doses (109 PFU –
quantidade de partículas infecciosas individuais – cada dose) do protótipo de
vacina com adenovírus recombinante deficiente de replicação, com cerca de 25
dias de intervalo de acordo com protocolo cedido pelo Prof. Dr. Oscar Bruña-
Romero. Antes de cada imunização amostras de sangue destes caprinos foram
coletadas e o soro armazenado a – 20º C até a realização do teste de ELISA.
O grupo 1 recebeu a AdSAG1, o grupo 2 recebeu AdSAG2, o grupo 3
recebeu AdSAG3, o grupo 4 recebeu AdCMV e o grupo 5 recebeu PBS 1X pH,
7.2, atuando como grupo controle. A partir daí foram avaliados os níveis de
anticorpos IgG anti-T. gondii antes e depois do esquema de imunização.
4.7 – Processamento e análise de dados
Os dados obtidos foram tabulados e analisados por programas
estatísticos. O teste Qui-quadrado foi utiliz!do para avaliar as diferenças entre
as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade e a absorbância nos
grupos de animais estudados. O teste t de Student ANOVA foi utilizado para
37
averiguar as diferenças estatísticas na quantificação de anticorpos IgG antes e
após a imunização. Para todos os testes o nível de significância foi de 5%.
38
5 – RESULTADOS
5.1 – Prevalência de anticorpos anti- Toxoplasma gondii no rebanho
caprino
Observou-se que a melhor concentração do antígeno capaz de distinguir
os soros reativos dos não reativos testados em diferentes diluições foi a de 0,1
µg de proteína por cavidade, com o soro diluído a 1:100. Em relação ao
conjugado e o peróxido de hidrogênio, optou-se por utilizar a diluição 1:5000 e
30 volumes respectivamente.
Das 244 amostras de soros de caprinos analisados, 47,13% (115/244)
foram considerados reativos para o Toxoplasma gondii pelo teste de ELISA
(Tabela 1).
Com relação ao sexo, as maiores prevalências foram observadas nas
fêmeas, sendo 92,2% (106/115) animais reagentes para IgG anti-toxoplasma
gondii, enquanto que 7,8% (9/115) animais eram machos, não sendo esta
diferença significativa pelo teste do Qui-quadrado (p>0,05).
De acordo com a faixa etária, do total dos 115 animais sororeativos,
26,9% (31/115) estavam entre 0 e 12 meses; 14,8% (17/115) entre 13 e 24
meses; 8,7% (10/115) entre 25 e 36 meses e 49,6% (57/115) mais de 37
meses. A avaliação estatística desta variável pelo Qui-quadrado mostrou existir
diferença significativa (p<0,05).
Em relação à raça, 44,3% (51) dos animais eram Sâanen, 10,4% (12)
Moxotó, 16,7% (18) Pardo, 14,8% (17) Anglo, 14,8% (17) Sem Raça Definida.
A análise dos resultados para esta variável, pelo Qui-quadrado, mostrou que
não houve diferença significativa (p>0,05).
No que se refere à localidade das fazendas, 17,2% dos animais (42)
sororeativos encontravam-se em Lajes; 10,2% (25) em Angicos; 7,8% (19) em
Pedro Avelino e 11,9% (29) em Afonso Bezerra. O teste Qui-quadrado mostra
que para esta variável estas diferenças foram estatisticamente significativas.
39
Em relação à propriedade estudada, a fazenda BV encontrava-se com
1,64% (4); SG com 5% (12); DI 5,7% (14); SR1 5% (12); BN 10,2% (25); RF
3,7% (9); AF 4,1% (10); SR2 8,6% (21); UN 3,3% (8). O teste do Qui-quadrado
mostrou que houve diferença estatística significativa para esta variável. A
tabela 2 resume todas as variáveis analisadas, bem como a prevalência
observada.
TABELA 1- Distribuição da soro-reatividade para IgG anti-Toxoplasma gondii em caprinos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.
ELISA
REATIVO
(%) NÃO-REATIVO
(%) X² P TOTAL (%)
SEXO MACHO 09(3,7) 11(4,5) 0,04 0,84 20(8,2)
(%) FÊMEA 106(43,4) 118(48,4) 224(91,8)
≤12 31(12,7) 23 (9,4) 54(22,1)
IDADE EM 13 – 24 17(7) 36(14,7) 17,04 0.0007 53(21,7)
MESES (%) 25 – 36 10(4,1) 27(11,1) 37(15,2)
≥37 57(23,4) 43(17,6) 100(41)
PURA 98(40,1) 118(48,4) 216(88,5)
RAÇA (%) SRD 17(7) 11(4,5) 2,34 0,12 28(11,5)
LJ 42(17,2) 82(33,7) 124(50,8)
LOCALIDADE AG 25(10,2) 11(4,5) 19,68 0,0002 36(14,8)
(%) PA 19(7, 8) 12(4,9) 31(12,7)
AB 29(11,9) 24(9,8) 53(21,7)
BV 4(1,64) 9(3,7) 13(5,3)
SG 12(5) 2(0,8) 14(5,7)
DI 14(5,7) 48(19,7) 62(25,4)
PROPRIEDADE SR1 12(5) 23(9,4) 45,2 0,0000 35(14,3)
(%) BN 25(10,2) 11(4,5) 36(14,8)
RF 9(3,7) 7(2,9) 15(6,2)
AF 10(4,1) 5(2) 16(6,6)
SR2 21(8,6) 9(3,7) 30(12,3)
UM 8(3,3) 15(6,1) 23(9,4) SRD = Sem Raça Definida; LJ = Lajes; AG = Angicos; PA = Pedro Avelino; AB = Afonso Bezerra
40
5.2 – Determinação da avidez de anticorpos anti- T. gondii, da classe IgG
em soros de caprinos naturalmente infectados, avali ados pelo ELISA
Foi realizado o ELISA de avidez de anticorpos IgG como indicativo de
infecção recente ou crônica pelo T. gondii nos soros de 115 caprinos reativos
pelo ELISA tradicional. Destes, 103 (89,6%) soros apresentaram anticorpos
IgG de alta avidez (infecção crônica) e 12 (10,4%) possuíam anticorpos IgG de
baixa avidez (infecção aguda). Comparando com o total dos soros estudados
(244), 42,2% dos animais estavam provavelmente na fase crônica, 4,9% na
fase aguda e 52,9% não tinham anticorpos IgG anti-T. gondii.
Ao analisar a correlação de anticorpos IgG anti- T. gondii com as
variáveis idade, raça, sexo, localidade e propriedade pelo teste do Qui-
quadrado (Tabela 2) foi encontrado diferença estisticamente significativa para a
variável sexo (p<0,05). Para todas as outras variáveis estudadas foi
demonstrado não existir diferença estatística significativa (p>0,05).
Nas figuras 4, 5, 6, 7 e 8 são apresentados os percentuais de anticorpos
IgG de alta e baixa avidez para o T. gondii, para as variáveis sexo, idade, raça,
fazenda e cidade respectivamente. Em todas as figuras observa-se que o
percentual de animais apresentando anticorpos IgG de alta avidez é mais
elevado quando comparado com os resultados obtidos para anticorpos de
baixa avidez na maioria das variáveis estudadas, com exceção da variável
fazenda.
41
TABELA 2- Distribuição da avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em caprinos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.
AVIDEZ IgG
ALTA (%) BAIXA(%) X² P TOTAL (%)
SEXO MACHO (%) 5(4,35) 4(3,48) 12,08 0,0005 9(7,8)
FÊMEA (%) 98(85,22) 8(6,95) 106(92,2)
≤12 28(24,35) 3 (2,62) 31(26,96)
IDADE EM 13 – 24 15(13,04) 2(1,74) 4,19 0,24 17(14,78)
MESES (%) 25 – 36 7(6,08) 3(2,62) 10(8,69)
≥37 53(46,08) 4 (3,48) 57(49,57)
PURA 89(77,4) 9(7,8) 98(85,22)
RAÇA (%) SRD 14(12,2) 3(2,6) 1,11 0,29 17(14,78)
LJ 35(30,43) 7(6,09) 42(36,52)
LOCALIDADE AG 24(20,87) 1(0,87) 2,65 0,45 25(21,74)
(%) PA 17(14,78) 2(1,74) 19(16,52)
AB 27(23,48) 2 (1,74) 29(25,22)
BV 2(1,74) 2(1,74) 4(3,48)
SG 11(9,56) 1(0,87) 12(10,43)
DI 13(11,3) 1(0,87) 14(12,17)
PROPRIEDADE SR1 9(7,8) 3(2,6) 8,38 0,29 12(10,43)
(%) BN 24(20,87) 1 (0,87) 25(21,74)
RF 8(6,95) 1(0,87) 9(7,8)
AF 9(7,8) 1(0,87) 10(8,69)
SR2 20(17,4) 1(0,87) 21(18,26)
UM 7(6,1) 1(0,87) 8(6,95) SRD = Sem Raça Definida; LJ = Lajes; AG = Angicos; PA = Pedro Avelino; AB = Afonso Bezerra
42
Alta Avidez Baixa AvidezMachos Fêmeas
Sexo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Sor
os T
esta
dos
(%)
55,6
44,4
92,5
7,5
Figura 4. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação ao sexo.
Alta Avidez Baixa Avidez
=12 13-I24 25-I36 =37
Idade (meses)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
So
ros
Tes
tad
os
(%)
90,3
9,7
88,2
70
93
11,8
30
7
Figura 5. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a idade.
43
Alta Avidez Baixa AvidezPura SRD
Raça
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Sor
os T
esta
dos
(%)
88
914
3
Figura 6. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a raça (SRD = Sem Raça Definida).
Alta Avidez Baixa AvidezBN SG DI SRL BN RF AF SR UN
Fazenda
0
20
40
60
80
100
Sor
os T
esta
dos
5050
8,3
91,7
83,3
96
88,9
7,2
92,8
16,7
4
11,1
95,2
87,5
12,5
4,8
10
90
Figura 7. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação as fazendas.
44
Alta Avidez Baixa Avidez
LG AG PA AB
Cidade
0
20
40
60
80
100S
oros
Tes
tado
s (%
)
16,7
4
89,5
6,9
88,388,3
96
10,5
93,1
Figura 8. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a cidade.
45
5.3 – Avaliação da imunogenicidade em grupos de cap rinos imunizados
com vacina de adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2,
SAG3 e CMV.
Os adenovírus recombinates codificando as preteinas SAG1 (AdSAG1),
SAG2 (AdSAG2), SAG3 (AdSAG3) e CMV (AdCMV) foram usados em
vacinação de caprinos de acordo com o protocolo descrito anteriormente.
A figura 9 mostra que nos soros testados dos animais imunizados com
AdSAG1. Após a aplicação da primeira imunização houve um aumento
significativo (p ≤ 0,05) nos níveis séricos de IgG com posterior diminuição após
a aplicação da segunda e terceira imunização. Percebe-se que houve uma
pequena variação individual verificada pela diminuição do desvio padrão. No
que se refere as diluições dos soros, percebe-se também esta diminuição nos
níveis de anticorpos séricos após as sucessivas imunizações até a diluição
1:800.
Com relação aos soros testados dos animais imunizados com AdSAG2 a
figura 10 mostra que existiu uma grande variação individual, verificada pelo
aumento no desvio padrão, entretanto isto é compreensível uma vez que não
estamos trabalhando com camundongos isogênicos. Percebemos que ocorreu
um incremento significativo nos níveis séricos de IgG após a terceira
imunização. Isto também se verifica até a diluição do soro de 1:800.
Já os soros dos animais imunizados com AdSAG3 a figura 11 mostra
que os indivíduos tiveram uma grande variabilidade individual. Houve
diminuição na produção de anticorpos após a aplicação da primeira imunização
com quedas subseqüentes após a segunda e terceira imunizações. Essa
diminuição foi verificada até a diluição de 1:800. Estes animais apresentaram
altos títulos de anticorpos IgG. Na imunização com AdSAG3, apesar de haver
uma tendência de crescimento da absorbância, nota-se que após a primeira
imunização houve queda na absorbância.
No que se refere às imunizações com AdCMV, observa-se pela figura
12, que houve grande variabilidade individual. Percebe-se que, após a primeira
46
e segunda imunização se mantém a média na produção de anticorpos, com
queda após a terceira imunização. Na imunização com AdCMV existe uma
tendência à manter um platô.
Com relação ao grupo controle (que recebeu apenas solução salina
PBS), os níveis séricos de anticorpos IgG se mantém numa média até após a
segunda imunização, com queda nesses níveis após a terceira imunização,
como mostrado na figura 13. O nível de positividade inicial já era elevado, mas
não houve melhora com a imunização. Houve uma tendência a um platô, com a
manutenção ou diminuição de absorbância.
47
5.3.1- Vacina AdSAG1
A)
B)
Figura 9. Média de Absorbâncias de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
nos soros de caprinos da Fazenda DI, imunizados pela via intramuscular com a
vacina AdSAG1 (expressando o adenovírus recombinante proteína SAG1 do
Toxoplasma gondii, após três séries de imunização com intervalo de 25 dias.
(A) Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na
diluição 1:100 até 1:12.800.
48
5.3.2- Vacina AdSAG2
A)
B)
Figura 10. Média de Absorbâncias de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
nos soros de caprinos da Fazenda DI, imunizados pela via intramuscular com a
vacina AdSAG2 (expressando o adenovírus recombinante proteína SAG2 do
Toxoplasma gondii, após três séries de imunização com intervalo de 25 dias.
(A) Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na
diluição 1:100 até 1:12.800.
49
5.3.3- Vacina AdSAG3
A)
B)
Figura 11. Média de Absorbâncias de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
nos soros de caprinos da Fazenda DI, imunizados pela via intramuscular com a
vacina AdSAG3 (expressando o adenovírus recombinante proteína SAG3 do
Toxoplasma gondii, após três séries de imunização com intervalo de 25 dias.
(A) Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na
diluição 1:100 até 1:12.800.
50
5.3.4- Vacina AdCMV
A)
B)
Figura 12. Média de Absorbâncias de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
nos soros de caprinos da Fazenda DI, imunizados pela via intramuscular com a
vacina AdCMV (expressando o adenovírus recombinante proteína CMV do
Toxoplasma gondii, após três séries de imunização com intervalo de 25 dias.
(A) Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na
diluição 1:100 até 1:12.800.
51
5.3.5- PBS 1x
A)
B)
Figura 13. Média de Absorbâncias de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
nos soros de caprinos da Fazenda DI, imunizados pela via intramuscular com a
solução de PBS usado como controle negativo, após três séries de imunização
com intervalo de 25 dias. (A) Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B)
Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800.
52
6 - DISCUSSÃO
A toxoplasmose é uma relevante zoonose mundial, sendo os pequenos
ruminantes bastante importantes na cadeia epidemiológica, como é o caso dos
caprinos. Por serem importante fonte de alimentação humana, os produtos de
origem caprina, quando contaminados pelo protozoário Toxoplasma gondii e
inadequadamente preparados podem acarretar problemas de saúde pública,
sendo a toxoplasmose, comumente, negligenciada em países em
desenvolvimento, o que acarreta perdas reprodutivas e econômicas nos
rebanhos, principalmente em áreas rurais e peri-urbanas.
O seu diagnóstico é bastante complexo, podendo ser feito por métodos
parasitológicos e/ou sorológicos. Como esta infecção pode assumir quadros
clínicos facilmente confundidos com várias infecções, além da grande maioria
ser assintomática, tanto em humanos como em animais; por isso a detecção de
anticorpos através da sorologia, é fundamental para o tratamento e controle da
toxoplasmose (FIGUEIREDO et al., 2001; SILVA et al., 2002).
A escolha do ELISA – Ensaio Imunoenzimático – para este estudo se
deve ao fato desta técnica ser considerada sensível, específica, simples,
pratica, rápida, de boa reprodutibilidade e de leitura automatizada (GARCIA-
VAZQUEZ et al., 1993; SILVA et al., 2002), além de oferecer informações
adicionais sobre a evolução dos níveis de anticorpos específicos da
toxoplasmose (CONDE et al., 2001).
A soro-prevalência da toxoplasmose caprina é bastante variável,
mostrando uma freqüência de reações positivas, variando de 0 a 100% em
diferentes regiões do mundo (TENTER et al., 2000; OLIVIER et al., 2007). Esta
variabilidade nas taxas de infecção da toxoplasmose caprina é multifatorial e se
deve provavelmente a diferenças entre testes sorológicos utilizados, idade,
sexo, habito alimentar e manejo dos animais, fatores epidemiológicos,
localização geográfica, condições ambientais, tipos de fauna, hábitos culturais,
grau de desenvolvimento do país, infra-estrutura hídrica e sanitária (DUBEY,
1990; TENTER et al., 2000; SILVA et al., 2003).
53
Neste trabalho realizamos o segundo estudo da toxoplasmose caprina
no Estado do Rio Grande do Norte, sendo o primeiro estudo realizado por Neto
et al. (2008) na região Seridó Oriental utilizando a técnica de
imunofluorescência (RIFI). No presente estudo, através do ELISA, avaliou-se a
frequência de anticorpos IgG anti-T. gondii no soro de caprinos de diferentes
municípios pertencentes a Associação de Criadores de Ovinos e Caprinos de
Sertão do Cabugi (ASCOC).
No mundo, os inquéritos sorológicos realizados em diferentes países,
mostram uma freqüência bastante variável, sendo demonstrado por alguns
estudos feitos por Karaca et al. (2007) na Turquia (80,61%), Rodríguez-Ponce
et al. (1995) na Espanha (63,3%), Prelezov et al. (2008) na Bulgária (59.8%),
Bisson et al. (2000) na Uganda (31%), Jittapalapong et al. (2005) na Tailândia
(27,9%), Van der Puije et al. (2000) em Ghana (26,8%), Hamzavi et al. (2007)
no Iran (23,7%), Hashemi-Fesharki (1996) no Irã (19,2%), Massala et al. (2003)
em Sardínea, Itália (12,3%), Garcia-Vazquez et al. (1993) no México (3,2%).
No Brasil, esta variação na soro-prevalência também ocorre, como foi
demonstrado pelos estudos feitos por Chiari et al. (1987) em Minas Gerais
(92.4%), Carneiro (2006) em Minas Gerais (43%), Silva et al. (2003) em
Pernambuco (40,4%), Sella et al. (1994) em Londrina (30,7%), Pita-Gondim et
al. (1999) na Bahia (28.9%), Figliuolo et al. (2004) em São Paulo (28,7%),
Cavalcante (2004) no Ceará (25,1%), Uzêda et al. (2004) na Bahia (16,4%),
Serra-Freire et al. (1994) no Rio de Janeiro (15,8%), Mainardi et al. (2003) em
São Paulo (14,5%). Em estudos recentes realizado por Modolo et al. (2008) em
cidades do Estado de São Paulo, foi encontrado uma prevalência de 78,20%
em São Paulo, Mogi-Guaçu 68,57%, Piquete 81,25%, São José dos Campos
41,86%.
A soro-prevalência da toxoplasmose observada por Neto et al. (2008)
em caprinos da microrregião Seridó Oriental no Rio Grande do Norte (30,6%)
foi mais baixa do que a encontrada neste estudo (47,13%). Essas diferenças
encontradas dentro do mesmo Estado podem ser devido a vários fatores como,
por exemplo, as características dos animais amostrados, a presença ou não de
54
gatos, diferentes condições climáticas, tipos de manejo e principalmente em
relação às diferenças nas técnicas utilizadas, uma vez que nesse estudo atual,
foi usado o ELISA, bem mais sensível que o RIFI anteriormente usado.
Assim sendo, algumas variáveis observadas neste estudo foram
confrontadas com os dados de soro-reatividade buscando correlacioná-los com
a prevalência. Deste modo, a reatividade e o sexo foi avaliada neste estudo. O
rebanho era constituído por 20 machos sendo 3,7% reativos ao T. gondii e 224
fêmeas, das quais 43,4% eram reativas, não apresentando diferença estatística
significativa (p>0,05), indicando que na região estudada, a taxa de soro-
positividade não esta relacionada ao sexo dos caprinos. Entretanto, é
importante atentar para o fato que o número de machos estudados foi
pequeno, para que se pudessem fazer comparações.
Estes dados são corroborados com os encontrados por Chiari et al.
(1987), Bisson et al. (2000), Cavalcante (2004), Carneiro (2006), que também
não encontraram associação significativa entre o sexo e a presença de
anticorpos anti-T. gondii. Alguns estudos sugerem que as fêmeas são mais
susceptíveis ao T. gondii do que os machos (ALEXANDER et al., 1988; VAN
DER PIUJE et al., 2000; SILVA et al., 2003; UZÊDA et al., 2004;
JITTAPALAPONG et al., 2005; NTAFIS et al., 2007; ACICI et al., 2008). Isto
ocorre provavelmente devido a possível imunossupressão relacionada a
gestação e lactação (UZÊDA et al., 2004), e ao tipo de manejo, uma vez que as
fêmeas destinadas a exploração leiteira encontram-se em manejo intensivo de
criação (SILVA et al., 2003).
Em relação à idade, observou-se que houve diferença estatisticamente
significativa (p<0,05). Os animais com idade superior aos 37 meses
apresentaram índice de reatividade significativamente maior do que os animais
mais jovens. Provavelmente este fato está relacionado à maior probabilidade
de infecção uma vez que permanecem por mais tempo expostos ao agente
etiológico e aos fatores de risco, corroborando com diversos outros estudos
(CHIARI et al., 1987; RUPPANNER et al., 1978; MACHADO & LIMA, 1987,
SELLA et al., 1994; FIGUEIREDO et al., 2001; FIGLIUOLO et al., 2004;
55
CAVALCANTE, 2004; JITTAPALAPONG et al., 2005; CARNEIRO, 2006).
Nossos resultados, contudo vão de encontro aos resultados obtidos por Garcia-
Vazquez et al. (1993) e Uzêda et al (2004) que não encontraram diferença
significativa para a variável idade.
Nos animais incluídos no grupo etário ≤12 meses que tinham idade
superior a cinco meses, verificou-se uma porcentagem de 12,7% de animais
positivos, indicando infecção recente, porém não é possível afirmar que a
contaminação ocorreu passivamente pelo colostro ou de outra forma, uma vez
que a presença de anticorpos no leite materno é verificada até os sete meses,
não podendo ser descartada a infecção congênita.
Outra variável estudada foi a raça dos animais analisados. Os animais
foram agrupados em duas categorias: raça pura e sem raça definida (SRD).
Neste caso, não houve diferença estatística entre os animais com raça pura e
os animais sem raça definida no tocante a prevalência de anticorpos anti-T.
gondii. Este resultado foi similar aos estudos realizados por Van der Puije et al.
(2000), Cavalcante (2004) e Uzêda et al. (2004). Em contrapartida,
Jittapalapong et al. (2005), Borde et al. (2006) e Carneiro (2006) observaram
em seus estudos, uma associação significativa entre as raças e a presença do
T. gondii. Este fato pode estar relacionado às diferenças no manejo dos
animais nestas áreas, onde os animais de raça pura são cuidados em
condições diferenciadas dos animais sem raça definida, levando a um aumento
nas taxas de positividade dessa parasitose em diferentes regiões e países
(SILVA et al., 2003; JITTAPALAPONG et al., 2005). Isto não foi observado em
nosso trabalho, uma vez que os animais em todas as propriedades estudadas
são submetidos a um mesmo manejo, sendo confinados juntos e alimentados
da mesma maneira, não importando a raça.
Em relação à variável localidade, verificou-se uma diferença significativa
entre as quatro cidades estudadas. Esta diferença, contudo, deve ser avaliada
com cautela devido ao pequeno número de amostras analisadas em Angicos,
Pedro Avelino e Afonso Bezerra comparados ao número de amostras de Lajes.
56
Com relação as nove fazendas avaliadas, observou-se que houve
diferença estatisticamente significativa no que se refere a presença de
anticorpos específicos para T. gondii. Essa estratégia foi aventada, pois a
maioria dos estudos realizados para identificar a prevalência da toxoplasmose
em caprinos não abordam estes dois parâmetros citados acima. O que se tem
observado é que alguns estudos relacionam a soro-reatividade com
mesorregiões diferentes (CAVALCANTE, 2004; CARNEIRO, 2006).
O manejo, exploração, clima, temperatura, umidade relativa e a
precipitação pluviométrica média anual nos municípios são similares. Diversos
estudos demonstram que existe relação entre fatores ambientais e a presença
de T. gondii (RODRIGUEZ-PONCE et. al., 1995; PITA-GONDIM et. al., 1999;
BISSON et. al., 2000; VAN DER PUINJE et. al., 2000; SILVA et. al., 2003;
JITTAPALAPONG et. al., 2005). Sabe-se que animais de um mesmo rebanho
reagem de forma homogênea quando são mantidos em condições
semelhantes, enquanto a dispersão da toxoplasmose pode variar entre os
animais de diferentes procedências (CARNEIRO, 2006).
O elevado percentual de caprinos reativos para T. gondii nestes
municípios pode ser explicada entre outros fatores pela própria resistência dos
oocistos no ambiente. A temperatura média anual e a precipitação
pluviométrica dos municípios estudados, apesar de ser bem diferente dos
locais onde os oocistos permanecem viáveis por mais de um ano, também se
mostram favoráveis ao desenvolvimento e manutenção dos oocistos de T.
gondii no meio ambiente (DUBEY & BEATTIE, 1988). A temperatura de 25 º C
é considerada como a temperatura ideal para o desenvolvimento dos oocistos.
Também tem sido observado que em regiões que apresentam temperaturas
mais baixas, as proporções de caprinos positivos para T. gondii, são menores
quando comparadas com regiões de temperaturas mais elevadas (FRENKEL &
DUBEY, 1973; RODRÍGUEZ-PONCE et al. 1995).
Chiari et al. (1987), avaliaram a soro-epidemiologia da toxoplasmose
caprina em Minas Gerais em função da origem dos rebanhos (urbanos, peri-
urbanos e rurais), bem como consideraram as diferenças climáticas e
57
geográficas e encontraram diferença significativa no tocante a procedência do
rebanho, onde observou-se um percentual de soro-reativos de 92,4% para os
rebanhos urbanos, 70% para os rebanhos peri-urbanos e 32% para os
rebanhos rurais.
6.1- Avidez de anticorpos IgG anti- T. gondii em soros de caprinos
naturalmente infectados.
Nas reações imunológicas, a interação de um anticorpo com um
antígeno multivalente é feito por meio de ligações químicas, e o termo que
define a força destas ligações é denominado avidez. Na resposta imunológica
primária, os anticorpos desencadeados por um estímulo antigênico
apresentam, inicialmente, baixa avidez. À medida que a resposta imunológica
se torna amadurecida, os anticorpos da classe IgG também aumentam sua
avidez. Desta forma a determinação de avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii
é utilizada como marcador de infecção recente ou tardia na toxoplasmose.
Tradicionalmente, se o percentual da avidez de IgG for maior que 60%, é
provável que a infecção tenha ocorrido há mais de 4 meses e que o anticorpo
IgM presente possa ser apenas anticorpo residual, geralmente associado com
baixos índices nos imunoensaios (CAMARGO et al., 1991; EISEN & SISKIND,
1964).
De acordo com Camargo et al. (1991), no início da infecção
toxoplásmica, existem elevados níveis de anticorpos IgG com baixa avidez
para antígenos correspondentes e posteriormente após meses, os anticorpos
IgG apresentam alta avidez, indicando infecções crônicas. Entretanto Figliuolo
et al. (2004) afirmam que os altos títulos de anticorpos em soros de caprinos
não é o bastante para se associar com a fase clínica da infecção nem para
confirmar a fase aguda nos animais, pois os títulos podem permanecer altos
por longo período.
58
A avidez de anticorpos para um dado antígeno é um fenômeno biológico
e, por esta razão, variações individuais da resposta imunológica podem,
naturalmente, ser encontradas. Alta avidez de IgG possui um bom valor de
predição de que a infecção aguda ocorreu há não menos que 4 meses. Por
outro lado, nada se pode afirmar nos casos de avidez baixa ou intermediária, já
que há grande variação interindividual para o tempo máximo de persistência de
baixa avidez. Em outras palavras, o teste de avidez é mais uma ferramenta
auxiliar utilizada para definir o período mínimo decorrido desde o
estabelecimento da infecção, caso os valores estejam elevados (HEDMAN et
al., 1989; CAMARGO et al., 1991).
Desta forma, nos animais positivos observados neste estudo foi
realizada a determinação da avidez de IgG, no intuito de sugerir o tempo de
infecção. Os resultados mostram que a maioria dos soros avaliados tinham
anticorpos de alta avidez, indicando nesses rebanhos, que um considerável
percentual de animais eram portadores de infecção crônica. O elevado
percentual de animais apresentando anticorpos de alta avidez, provavelmente
deve-se a um maior tempo de infecção, superior a 100 dias (SUAREZ-
ARANDA et al., 2000). Estes resultados são similares aos encontrados por
Cavalcante (2004) que estudou o rebanho caprino no Ceará e Carneiro (2006)
que analisou o rebanho caprino de Minas Gerais.
As variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade foram
analisadas em relação aos anticorpos de avidez. Foi encontrado associação
estatisticamente significativa apenas para a variável sexo (p<0,05), diferindo
dos resultados encontrados por Cavalcante (2004) e Carneiro (2006) que não
encontraram associação entre o sexo e a presença de anticorpos IgG anti-T.
gondii. Além disso, as fêmeas apresentaram elevados percentuais de
anticorpos de alta avidez quando comparados aos machos. Entretanto, com
relação aos anticorpos de baixa avidez, as fêmeas apresentaram percentuais
inferiores aos dos encontrados para os machos. Isto provavelmente se deve ao
fato do pequeno número de machos analisados.
59
A ocorrência de animais com anticorpos de baixa avidez nas faixas
etárias de 25-36 meses e maior ou igual a 37 meses apontam para ocorrência
de fêmeas em idade reprodutiva, em fase aguda da toxoplasmose. Isto
provavelmente permitirá casos de transmissão congênita do parasito, com
possibilidade de perdas por abortos ou má-formação fetal.
Os animais de raça pura apresentaram maiores percentuais de
anticorpos de alta avidez (77,4%) do que os animais sem raça definida
(12,2%). De acordo com Jittapalapong et al. (2005) e Borde et al. (2006)
animais de raça pura são mais susceptíveis a infecção por T. gondii. Além
disso, neste estudo o número de animais de raça pura analisados e reativos
para o T. gondii era superior aos animais sem raça definida.
Com relação à localidade, altos percentuais de anticorpos de alta avidez
foram encontrados em todos os municípios, indicando que os animais do
Sertão do Cabugi foram expostos precocemente ao parasito. No que diz
respeito às propriedades estudadas, apenas na fazenda BN, os animais
apresentaram percentuais iguais para anticorpos com alta e baixa avidez (50%
para cada). Nas demais fazendas, a porcentagem de alta avidez nos rebanhos
foi superior a porcentagem de baixa avidez, sugerindo que nestas propriedades
os animais são expostos mais cedo ao parasito do que na fazenda BN.
Em contrapartida, o sistema de criação de caprinos de extensiva/semi-
intensiva, manejo muito comum na região, leva a uma grande probabilidade do
contato destes animais com oocistos esporulados no pasto, possivelmente
decorrentes da eliminação por felídeos selvagens e/ou gatos domésticos.
60
6.2 - Avaliação da imunogenicidade após imunizações com vacinas de
adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2, SA G3 e CMV em
soros de caprinos.
O desenvolvimento de uma vacina contra o T. gondii é uma
possibilidade viável já que indivíduos naturalmente infectados desenvolvem
imunidade intensa e duradoura contra o agente, sendo capaz de protegê-los
contra subseqüentes re-infecções, já tendo sido demonstrado que o mesmo
grau de resposta pode ser obtido com a administração de formas atenuadas do
parasito. O uso de vacinas atenuadas em humanos é improvável, uma vez que
é composta por taquizoítos vivos, podendo estabelecer infecções crônicas ou
reverter a um estado patogênico e causar doença aguda. Desta forma, para
desenvolver uma vacina contra a toxoplasmose é essencial a identificação de
imunógenos e delineamento de protocolos de imunização que utilizem somente
estes componentes (MENDES, 2006).
Para que uma vacina possa ser considerada excelente, deve-se sempre
levar em conta alguns fatores como custo, período de proteção, riscos de
infecção humana acidentais, efeitos colaterais, e principalmente a imunidade
conferida pela mesma. Atualmente as pesquisas concentram-se na tentativa de
identificar antígenos capazes de gerar resposta imune protetora, para o
desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o Toxoplasma gondii.
Segundo Mendes (2006), diversos modelos experimentais têm sido
gerados na tentativa de se obter um protocolo de imunização eficiente e seguro
contra a toxoplasmose, sendo que alguns desses propõem a utilização de
vetores plasmidiais ou proteínas do T. gondii expressas de forma
recombinante. Esses modelos são capazes de gerar níveis significativos de
proteção contra a infecção, no entanto, muitos desses protocolos possuem
determinados inconvenientes que limitam sua utilização. Com relação às
vacinas de DNA, existe a possibilidade de integração do mesmo no genoma do
hospedeiro ou o desenvolvimento de doenças auto-imunes devido à indução
de resposta anti-DNA. Por outro lado, as proteínas recombinantes têm
61
capacidade limitada de indução de respostas imunes, e a maioria dos
protocolos que as empregam necessitam de adjuvantes para a ativação do
sistema imune em níveis significativos.
Nesse contexto, em que se procura aliar a alta imunogenicidade com
utilização segura, os adenovírus recombinantes aparecem como uma
alternativa viável para desenvolvimento de uma vacina contra toxoplasmose,
uma vez que são capazes de ativar uma forte resposta mediada por células T
CD8+ com atividade citotóxica, são modificados para se tornarem deficientes
em replicação e incapazes de se propagarem em células de mamíferos, seu
genoma não se integra ao genoma celular, as infecções provocadas por
adenovírus podem ser eliminadas em até 30 dias, são capazes de induzir alta
expressão do transgene, superando os níveis de expressão dos transgenes se
comparados com outros métodos de vacinação, como as plasmídiais
(MENDES, 2006).
Diversos grupos de pesquisas em vacinas utilizam os adenovírus
codificando antígenos de superfície dos taquizoítos, denominados SAGs ,
dentre os quais SAG1, SAG2, SAG3 que são os mais abundantes expressos
na superfície dos taquizoítos. Acredita-se que estas proteínas atuam
interagindo com a célula hospedeira, mediando os processos de adesão,
invasão/penetração. Diversos estudos relacionados à vacinas contra
toxoplasmose, utilizando as proteínas SAGs, possuem resultados animadores,
na medida em que demonstram a possibilidade de se obter uma proteção
significativa contra a doença em modelos animais (PARMLEY et. al., 1994;
DEBARD et. al., 1996; LETSCHER-BRU et. al., 1998; PETERSEN et. al., 1998;
NIELSEN et. al., 1998; DZIERSZINSKI et. al., 2000; BONENFANT et. al., 2001;
COUPER et. al., 2003).
Neste estudo, o adenovírus codificando as proteínas de T. gondii SAG1,
SAG2, SAG3, e a combinação destas três proteínas, a CMV, foram
empregados para vacinação de caprinos. A avaliação dos ensaios mostraram
que a maioria dos animais utilizados eram reativos ao Toxoplasma gondii (por
isso que as médias de absorbâncias demonstradas nos gráficos começam
62
acima de zero, em níveis mais altos). Vimos ainda nesse trabalho, que as
vacinas recombinates expressando SAG1 (AdSAG1), SAG2 (AdSAG2), SAG3
(AdSAG3) e CMV (AdCMV) foram capazes de gerar resposta imune humoral,
com produção de IgG em todos os animais analisados, indicando que 100%
deles apresentaram reatividade. É importante frisar que a presença de
anticorpos pode auxiliar no controle da toxoplasmose em sua fase crônica,
atuando na opsonização das formas do parasito que são liberados a partir dos
cistos teciduais (KANG et al., 2000).
As vacinas AdSAG1, AdSAG3 e CMV tiveram níveis semelhantes na
produção de anticorpos IgG, com a elevação destes níveis após a aplicação da
primeira imunização, seguida por diminuição gradual na produção de IgG até
após a aplicação da terceira imunização. Existem diversas possíveis razões
para que após a 3ª imunização os títulos sejam menores, dentre elas: a vacina
desta 3ª imunização se degradou um pouco mais durante a obtenção e/ou
transporte, ou então durante o congelamento e descongelamento no
laboratório. Além disso, existe um fenômeno que se chama Immune
Exhaustion, segundo o qual repetir as imunizações pode acabar com os clones
de linfócitos B específicos para o antígeno (respondem demais e morrem por
apoptose); três imunizações podem causar anergia (falta de resposta por
tolerização ao antígeno ou ainda, passou tempo demais desde a 3ª imunização
e a coleta do soro e então os níveis de anticorpos caíram, esta última
possibilidade, entretanto, pode ser descartada uma vez que o tempo entre a
imunização e a coleta do soro foi de apenas 25 dias. Outro ponto importante a
ser considerado é que a proteção pode está correlacionado com a presença ou
ausência de determinadas citocinas produzidas pelos perfis de resposta Th1 ou
Th2, células T regulatórias e ainda citocinas relacionadas à reposta Th17
(GADDI & YAP, 2007; PASSOS et al., 2010).
A vacina AdSAG2 apresentou diferença na indução do padrão de
produção de IgG, mostrando elevada produção após a aplicação da primeira
imunização e mantendo-se crescente após a 2ª e 3ª imunizações. De acordo
com Mendes (2006), a indução de anticorpos específicos não parece ser um
63
mecanismo essencial para proteção contra a toxoplasmose aguda, tendo em
vista que, em vários estudos de vacinação, a presença de anticorpos
específicos contra proteínas de T. gondii não se correlaciona com a proteção
contra a infecção com a cepa RH – que causa infecções agudas com alto nível
de proliferação de taquizoítos. Existem muitas hipóteses quanto às funções da
SAG2, contudo, está claro que ela está associada com o processo de
adesão/invasão na célula hospedeira, agindo sinergicamente com SAG 1 e 3
(PARMLEY et al., 1994; CRAWFORD et al., 2010). Entretanto, diversos
estudos mostram que estes antígenos de superfície são capazes de induzir
aumento da resposta imune tanto celular quanto humoral. Caetano et. al.
(2006) observaram que a vacinação usando adenovírus recombinantes, foi
capaz de induzir resposta imune e redução significativa entre 50-70% na carga
de cistos cerebrais em camundongos BALB/c desafiados com a cepa P-Br.
Angus et. al. (2000), vacinaram camundongos com cDNA codificando a
proteína de superfície SAG1, verificando a presença de altos títulos de
anticorpos para SAG1 através do teste de ELISA.
A imunização intranasal de camundongos CBA/J com uma combinação
de SAG1 e toxina colérica levou a uma diminuição significante de cisto
cerebrais após infecção oral com a cepa de T. gondii 76k, desenvolvendo ainda
elevados níveis de anticorpos IgG anti-SAG1, bem como aumento na resposta
celular, com aumento de IL-2 e IL-5 (DEBARD et. al., 1996).
De acordo com Couper et. al. (2003), a vacinação de camundongos
BALB / c com DNA codificando SAG1 do taquizoíto de T. gondii, induziu uma
resposta imune Th-1 mediada pela produção de anticorpos IgG2a e aumentou
produção de IFN- γ.
Em seu estudo, Mendes et. al. (2006), avaliaram a capacidade de
adenovírus recombinantes codificando SAG1, SAG2 e SAG3 em induzir
ativação de resposta imune humoral e celular, além de imunidade protetora
contra cepas cistogênicas do parasito imunizando camundongos BALB/c e
C57BL/6 e verificaram que a imunização gerou anticorpos IgG específicos
contra as três proteínas, AdSAG1 levou a ativação de células T CD8+
64
produtoras de IFN- γ e proteção parcial em camundongos vacinados com
AdSAG1, os quais apresentaram maior taxa de sobrevivência e menor número
de cistos cerebrais se comparado ao grupo controle. Evidentemente, em nosso
estudo, foi feito um ensaio de campo, onde foram imunizados caprinos e não
camundongos, além disso, existe a variabilidade individual desses animais
criados no pasto, que podem exibir uma resposta bem diferente do que ocorre
em modelos murinos isogênicos. Outro fato importante a ser levado em
consideração é que não sabemos que tipo de cepa do T. gondii circulante entre
estes ruminantes no Rio Grande do Norte. Este fato, contudo, deverá ser
esclarecido em breve, através dos estudos de avaliação genotípica conduzidos
por nosso grupo em colaboração com o Departamento de Parasitologia da
UFMG (Projeto de Tese em andamento). Além disso, este é o primeiro estudo
com uma vacina que combina os três antígenos de superfície (SAGs 1, 2 e 3),
o que faz desse trabalho pioneiro na tentativa de imunização com a AdCMV.
É importante ressaltar que todos os modelos discutidos aqui utilizam
cepas diferentes e linhagens de camundongos o que difere dos caprinos
utilizados neste estudo. Além disso, estes animais foram imunizados de
maneira aleatória, não foram infectados experimentalmente. Pelo contrário,
verificamos a ocorrência da toxoplasmose crônica em quase sua totalidade. O
que torna difícil uma comparação, em parte, com os resultados de outros
estudos, principalmente, no que se refere aos níveis de anticorpos. Contudo, os
nossos resultados, corroborados com os dados existentes na literatura mundial,
indicam que, adenovírus recombinantes juntamente com as proteínas de
superfície SAG1, SAG2, SAG3, bem como sua associação a estas três
proteínas combinadas, apresentam um grande potencial para futura utilização
como uma vacina contra o Toxoplasma gondii. Entretanto, diversos estudos
ainda precisam ser feitos para que se possam elucidar algumas questões, tais
como, que adenovírus utilizar, para que os indivíduos que o recebam não
apresentem altos índices de anticorpos neutralizantes contra o mesmo,
entender melhor a imunidade anti-vetor que é induzida após a primeira
imunização, dentre outros fatores como avaliação das citocinas de perfil Th1
65
que representa de fato a efetividade destes regimes de imunizações testados,
uma vez que a resposta efetiva contra o T. gondii e a resposta celular.
66
7 - CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho permitiram as seguintes
conclusões:
• Foi verificada a freqüência de anticorpos anti-T. gondii em caprinos da
região Sertão do Cabugi; bem como, pela primeira vez no Estado do Rio
Grande do Norte, se avaliou neste animais, a toxoplasmose no tocante a
fase aguda e crônica;
• Pela primeira vez no Nordeste foram avaliados os esquemas de
imunizações em caprinos criados de maneira extensiva/semi-intensiva
utilizando protótipo de vacinas expressando SAGs 1, 2 e 3; sendo todos
os esquemas de imunizações bastante promissores;
• A utilização de adenovírus recombinantes como vetor vacinal se mostrou
eficiente no sentido de proporcionar uma indução na imunogenicidade,
sendo capaz de ativar a resposta imune humoral específica.
8 – PERSPECTIVAS
Pretende-se continuar a avaliação desta vacina, verificando outros
protocolos de imunização, bem como comparar a resposta imune celular e
humoral.
67
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