Obtencin de Aureomicina por fermentacin solida e ...

Obtención de Aureomicina por Fermentación Sólida e Identificación por Electroforesis Capilar utilizando Streptomyces aurofaciens

Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Obtención de Aureomicina por Fermentación Sólida e Identificación por Electroforesis Capilar utilizando

Streptomyces aurofaciens

Informe Técnico de la Opción Curricular en la Modalidad de:

Proyecto de Investigación

Que para Obtener el Título de:

Ingeniero Farmacéutico

Presenta:

Linares Hernández David

Asesor Interno: María Esther Bautista Ramírez

Evaluador: Marcela Segura Granados

25 de Noviembre del 2011


Agradecimiento

A DIOS por regalarme la gran bendición de vivir y disfrutar plenamente de la vida.

Jehová es mi pastor, nada me faltará,

En prados herbosos me hace recostar;

Me conduce por descansaderos donde Abunda el agua.

Refresca mi alma.

Me guía por los senderos trillados de la justicia por causa de su nombre.

Aunque ande en el valle de sombra profunda,

No temo nada malo, porque tú estás conmigo;

Tu vara y tu cayado son las cosas que me consuelan.

Dispones ante mí una mesa enfrente de los que me muestran hostilidad.

Con aceite me has untado la cabeza; mi copa está bien llena.

De seguro la expresión de lo bueno y la bondad amorosa misma seguirán tras de mí todos los días de mi vida;

Y ciertamente moraré en la casa de Jehová Hasta la largura de días.

Salmos 23 Gracias por todo lo que me has brindado.


CONTENIDO

Índice Página

1. Resumen 1

2. Introducción 2

2.1 Mecanismo de Acción de la Tetraciclinas 4

2.2 Fermentación Sólida 5

2.2.1 Ventajas y desventajas de la Fermentación Sólida 5

2.3 Electroforesis Capilar 8

3. Justificación 14

4. Objetivos 15

4.1 Objetivo General 15

4.2 Objetivos Específicos 15

5. Materiales y Métodos 16

5.1 Material 16

5.2 Metodología 16

5.2.1 Preparación del inóculo 16

5.2.2 Medio de Esporulación 16

5.2.3 Preparación del Medio de Cultivo 16

5.2.4 Preparación del Sistema de Fermentación 17

5.2.5 Toma y Tratamiento de la Muestra 17

5.2.6 Manejo de Resultados 17

5.3 Diagrama de Flujo de la Metodología 18

5.4 Metodologías de Identificación por Electroforesis Capilar 19

5.4.1 Condiciones Instrumentales y de Operación 19


5.4.2 Estándares y Reactivos 19

5.4.3 Procedimiento de Electroforesis Capilar 19

5.4.4 Métodos de Identificación de Tetraciclinas por EC 20

5.4.5 Preparación del Estándar 20

6. Resultados 21

7. Conclusiones 32

8. Referencias Bibliográficas 33


ÍNDICE DE TABLAS

Página

1. Clasificación Científica del Género Streptomyces 2

2. Principales componentes de las Tetraciclinas según su

Descubrimiento 3

3. Métodos de Identificación de Tetraciclinas utilizando

Diferentes condiciones de Separación 20

4. Método 1 para identificación por EC del Estándar de

Tetraciclina 21


Tetraciclina 23


Tetraciclina 24

7. Optimización del Método 3 para identificación por EC

del Estándar de Tetraciclina 25

8. Relación de la Concentración de la Curva Estándar de

Tetraciclina y las áreas bajo la curva obtenidas 26

9. Curva Estándar de Tetraciclina obtenida en el bioensayo

con S. aureus 28

10. Monitoreo del pH contra el tiempo 29

11. Concentración de Producción de Tetraciclina obtenida en el

bioensayo con S. aureus 30


ÍNDICE DE FIGURAS

Página

1. Estructura de la Tetraciclina 3

2. Mecanismo de Acción de las Tetraciclinas 4

3. Componentes Básicos del Equipo de Electroforesis

Capilar 10

4. Representación de la doble capa eléctrica y flujo

electrosmótico que aparece al aplicar una diferencia de

potencial en los extremos de un capilar de sílice 11

5. Electroferograma obtenido para la Identificación del Estándar

de Tetraciclina por EC por el Método 1 21

6. Electroferograma obtenido de la comparación entre el Estándar

de Tetraciclina y Agua para identificar impurezas 22






de Tetraciclina por EC por el Método 3 Optimizado 25

10. Curva Estándar de Tetraciclina por EC (Método 3 Optimizado) 26

11. Identificación de la muestra de Tetraciclina por FES y el

medio de producción 27


ÍNDICE DE GRÁFICAS

Página

1. Curva Estándar de Tetraciclina obtenida por EC 27

2. Curva Estándar de Tetraciclina obtenida en el bioensayo

con S. aureus 28

3. Monitoreo del pH a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas 29

4. Producción de Tetraciclina a los distintos tiempos de muestreo

por bioensayo con S. aureus 30

5. Relación del pH y Producción de Tetraciclina 31


1

1. RESUMEN El objetivo de este trabajo fue adaptar un método de electroforesis capilar para

cuantificar la producción de aureomicina utilizando Streptomyces aureofaciens durante

la fermentación sólida. El medio de producción utilizado consta básicamente de

sacarosa, agua de cocimiento de maíz y sales minerales (fosfato de amonio,

carbonato de calcio, fosfato de potasio, sulfato de magnesio, sulfato de zinc y cloruro

de magnesio), se añadió aceite de cacahuate al 0.5%.

Se realizaron determinaciones de pH y bioensayo en placa. Para su detección por

electroforesis capilar se utilizó un equipo Beckman Coulter P/ACE MDQ Capillary

Electrophoresis System utilizando un buffer de carbonato de sodio anhidro 50 mM +

EDTA 10 mM, pH 10.0, un capilar de sílice de 70 cm y 75 μm de diámetro, aplicando

un voltaje de 13 kV, inyección hidrodinámica de 15 psi por 8 segundos, temperatura de

23°C y fue detectada a 270 nm. El tiempo de migración de la tetraciclina fue a los

10.25 minutos en las condiciones probadas que equivalen a 8.219 µg/ml.

Esta metodología presenta la ventaja de que no es necesario realizar ningún

pretratamiento a la muestra solamente es necesario diluirla lo que representa una

ventaja sobre el tratamiento que se les da a las muestras para determinarlas en otros

métodos analíticos (HPLC). La electroforesis capilar ofrece una alternativa para su

determinación considerando las ventajas que ofrece esta técnica como son tiempos

cortos de análisis, utiliza pequeñas cantidades de muestra y el uso de pequeñas

cantidades de buffer que además de ser un ahorro en reactivos representa menor

contaminación al ambiente.


2

2. INTRODUCCION

Existen diferentes clases de antibióticos los cuales tienen un valor económico

importante debido a su aplicación clínica, en México actualmente las enfermedades de

etiología infecciosa representan el tercer lugar de causa de mortalidad, siendo de

mayor demanda las cefalosporinas, penicilinas y tetraciclinas, éstas últimas

representan el 17.5% en ventas del mercado mundial de antibióticos y están

considerados dentro del cuadro básico de medicamentos del sector salud de nuestro

país.

Las propiedades de las tetraciclinas (TC), tales como su amplio espectro de actividad

(contra bacterias Gram positivas y negativas, microorganismos aerobios y anaerobios,

gérmenes resistentes a los antibióticos beta-lactámicos), la posibilidad de

administración oral, y la ausencia de efectos secundarios mayores, han conducido a

su uso extensivo en la terapia ya que son antibióticos de amplio espectro del grupo de

las tetraciclinas, ampliamente utilizadas en infecciones humanas y en animales. En

animales, son utilizados en el tratamiento de mastitis bovina y son adicionados en

niveles sub terapéuticos en los animales para propósitos profilácticos. Otra aplicación

es en la conservación de frutas y vegetales y la exterminación de plagas.

Todas poseen un núcleo de estructura tetracíclica lineal compuesta de cuatro anillos

fusionados (Figura 1). La suma de diferentes grupos funcionales ha dado lugar a

numerosos compuestos que pueden agruparse en tres generaciones según el orden

de su descubrimiento (Tabla 2). Las glicilciclinas constituyeron la última generación de

tetraciclinas descubiertas tras modificar la posición 9 del anillo tetracíclico. La

tigeciclina es el principal representante y se encuentra en fase experimental.

Streptomyces es el género más extenso de actinobacterias, un grupo de bacterias

gram positivas de contenido GC (guanina y citosina) generalmente alto.

Clasificación Científica

Dominio Bacteria

Filo Actinobacteria

Orden Actinomycetales

Suborden Streptomycineae

Familia Streptomycetaceae

Género Streptomyces Tabla 1: Clasificación Científica del Género Streptomyces


3

Figura 1: Estructura de la Tetraciclina

Generación Nombre Genérico

Primera (1948- 1963)

Clortetraciclina

Oxitetraciclina

Producidas por dos

diferentes especies de

Streptomyces

(aureofaciens y rimosus);

descubiertas a finales de

los años 1940

Tetraciclina

Demeclociclina

Obtenidas a partir de

Streptomyces en la década

de 1950

Rolitetraciclina

Limeciclina

Clomociclina

Derivados semisintéticos

caracterizados por su

hidrosolubilidad

Segunda (1965- 1972)

Metaciclina

Doxiciclina

Minociclina

Derivados semisintéticos

de la primera generación

Tercera (1993- )

Glicilciclinas

El grupo más

recientemente descrito: en

fase experimental.

Tabla 2: Principales componentes de las tetraciclinas según su descubrimiento


4

2.1 Mecanismo de Acción de las Tetraciclinas

Para que las tetraciclinas ejerzan su acción a través del ribosoma de las bacterias

Gram negativas, se requiere que penetren a la célula del microorganismo por

mecanismos de difusión pasiva a través de los canales hidrófilos (porinas) y por

procesos de transporte activos dependientes de energía. Lo anterior determina que la

concentración intracelular sea mayor que la extracelular. Una vez dentro de la célula,

las tetraciclinas se unen de manera reversible a los receptores en la subunidad 30S

del ribosoma bacteriano y de esta manera bloquear la fijación del aminoacil- tRNA al

sitio aceptor en el complejo mRNA- ribosoma, esto evita la incorporación de nuevos

aminoácidos a la cadena peptídica en crecimiento, inhibiendo la síntesis de proteínas.

Se conocen con menos detalle los mecanismos de penetración de las tetraciclinas a

las bacterias Grampositivas. La selectividad de las tetraciclinas para inhibir la síntesis

de proteínas de las bacterias, radica en el hecho de que las células de mamífero

carecen del sistema de transporte activo y, además, las características del ribosoma

bacteriano son diferentes al ribosoma de los mamíferos.

Figura 2: Mecanismo de Acción de las Tetraciclinas

Figura 2: Mecanismo de Acción de la Tetraciclina


5

2.2 Fermentación Sólida

La producción de tetraciclinas se realiza por fermentación líquida con altos costos de

operación, lo que se refleja en el alto valor agregado del producto, por lo que resulta

interesante generar procesos de producción de antibióticos con aplicación de

biotecnologías alternativas que resulten más rentables como es el caso de la

fermentación en estado sólido (FES), la cual es ampliamente utilizada en los países

orientales.

La fermentación en estado sólido indica el cultivo aerobio o anaerobio de

microorganismos que crecen en la superficie o al interior de una matriz sólida porosa.

Esta matriz puede estar constituida por un sustrato humidificado o por un soporte

inerte capaz de absorber los nutrientes que se encuentran disueltos en una solución

sin escurrimiento de líquidos.

Es un proceso microbiológico que ocurre comúnmente en la superficie de materiales

sólidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin nutrientes

solubles. (Viniegra-González 1997).

2.2.1 Ventajas de la fermentación en estado sólido (Doelle y col. 1992):

• Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que

presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios.

• La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones,

especialmente de bacterias y de levaduras.

• La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una alta

transferencia de oxígeno al microorganismo.

• El proceso de recobro es simplificado. Algunos productos son utilizados

integralmente como alimento animal, productos para el control biológico, etc.


6

Desventajas:

• Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos de

humedad.

• La extracción del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se

trabaja a gran escala y no se controla el proceso.

• La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los parámetros de la

fermentación, tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la

concentración de sustrato y productos.

• Muchos aspectos de ingeniería como el diseño de reactores y el escalado están muy

poco caracterizados.

• El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se utilizan

microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de crecimiento.

Las condiciones ambientales, tales como la humedad, la actividad del agua, el pH, la

temperatura, la concentración y disponibilidad del sustrato, la aireación, el tamaño de

partículas y la forma de inoculación afectan significativamente el crecimiento y la

formación de productos. En el cultivo líquido agitado, el control de las condiciones

ambientales es relativamente simple, ya que estos sistemas son homogéneos desde el

punto de vista de la concentración celular, nutrientes y productos. Sin embargo, se

presentan serios problemas en los sistemas sólidos con el mezclado, la transferencia

de oxígeno, el intercambio de calor y el control de la humedad y el pH, debido -

principalmente- a la heterogeneidad y la consistencia del sistema.

En este tipo de fermentaciones, la humedad del medio puede variar entre 30 y 80%

(Oriol y col., 1988), en dependencia del sólido utilizado, del microorganismo y el

objetivo del proceso. La actividad del agua no sólo va a afectar el crecimiento del

microorganismo que en el sistema se desarrolle, sino también los productos de interés

obtenidos a partir del metabolismo de dicho microorganismo.

Hoy se reconoce que no es sólo la cantidad de agua presente en el sistema la que

ejerce su influencia sobre la eficiencia del proceso, sino el carácter de las


7

interacciones entre el agua y el medio sólido. Por eso no es contradictorio observar

que un mismo microorganismo se desarrolle plenamente en dos sustratos diferentes

con porcentajes de humedad bastante disímiles.

El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los procesos de fermentación en

estado sólido, al igual que lo hace en otro tipo de cultivos. Este se puede ver afectado

por la secreción de ácidos, o algunos otros metabolitos durante el proceso. Hablando

de la fermentación en medio sólido, el control es algo complicado más no imposible; la

complejidad es debida a la ausencia de instrumentos capaces de medir el pH en la

capa de líquido que rodea el sólido (Mitchell y col., 2002).

Al igual que para cualquier otro organismo, la temperatura es un factor importante en

el crecimiento de estos, y también para que se lleven a cabo toda una serie de

diversas y múltiples reacciones químicas, de manera que así puedan llevar a cabo

todas sus actividades celulares. Este factor puede ser considerado como una variable

crítica, debido a la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y a la baja

conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido-líquido-gas, lo que favorece la

acumulación del calor metabólico en el sistema y un aumento de la temperatura del

cultivo.

Con el aumento de la temperatura se van a favorecer tres inconvenientes: la actividad

microbiana se desacelera o se detiene; se deshidrata el medio sólido, y el

metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o ante la

deshidratación (Gutiérrez y col., 1995).

En cuanto al medio de cultivo sobre el cual se desarrollaran los microorganismos, este

debe tener todos los nutrientes necesarios de forma balanceada y con

concentraciones adecuadas para favorecer el crecimiento del microorganismo.

Al igual que en cualquier otro medio de cultivo, las relaciones entre algunos de sus

elementos son de particular importancia; por ejemplo, carbono-nitrógeno y fósforo-

oxígeno. En la mayoría de los procesos de fermentación en medio sólido participan

microorganismos aerobios; es decir, que para que los microorganismos puedan crecer

requieren de oxígeno, y es por esto que la aireación es un factor fundamental para el

desarrollo del proceso. La aireación se utiliza para suministrar el oxígeno necesario,

extraer el dióxido de carbono formado, así como para extraer el calor metabólico

formado, de manera que el flujo óptimo de aire debe tomar en consideración la

naturaleza del microorganismo utilizado, los requerimientos de oxígeno para el


8

crecimiento y/o la formación del producto deseado, la velocidad de generación de calor

metabólico, la concentración crítica del dióxido de carbono y otros metabolitos

volátiles, el espesor de la masa de sólido, entre otros.

La aireación en las fermentaciones en medio sólido es más fácil que las

fermentaciones sumergidas, porque la superficie de contacto es mayor entre el aire y

el líquido que está absorbido en las partículas (Viniegra y col., 2003). El tipo de inóculo

en las fermentaciones en medio sólido puede ser de dos tipos fundamentales tanto a

nivel laboratorio y a nivel industrial: esporas o micelio.

La fermentación en medio sólido ha aparecido como una tecnología potencial para la

obtención de productos microbiológicos, los cuales son de utilidad en la industria

alimenticia, química y farmacéutica, La utilización de los residuos agro-industriales

como sustratos en los procesos de fermentación en medio sólido proporcionan una

alternativa de utilización.

2.3 Electroforesis Capilar

Muchas propuestas han sido seguidas para la determinación de tetraciclinas (TC),

clortetraciclinas (CTC), oxitetraciclinas (OTC) y doxiciclinas (DXC) por la Farmacopea

de Estados Unidos (USP), utilizando cromatografía de líquidos de alta resolución

(HPLC) para el control de calidad de estos antibióticos.

Se conoce como electroforesis capilar (EC) a un conjunto de técnicas que emplean

corriente eléctrica que atraviesa tubos capilares (20-100 µm de diámetro interno) de

sílice fundida para realizar separaciones de alta resolución de los componentes de una

mezcla.

Hasta la aparición de la electroforesis capilar, las separaciones electroforéticas no se

realizaban en columnas, sino en un medio estabilizado plano, como papel o un gel

semisólido poroso. La técnica era lenta, tediosa y requería mucha habilidad del

operador. A principios de la década de 1980, los científicos empezaron a explorar la

posibilidad de realizar las mismas separaciones en cantidades micro de muestra, en

tubos capilares de sílice fundida. Sus resultados fueron prometedores en cuanto a

resolución, velocidad y potencial de automatización. En consecuencia, la EC ha

llegado a ser una herramienta importante para gran variedad de problemas de

separación analítica.


9

La electroforesis capilar continúa creciendo rápidamente como una técnica analítica

para una amplia gama de áreas de aplicación, incluyendo el análisis de fármacos. La

electroforesis capilar tiene muchas ventajas sobre el HPLC para la determinación de

las tetraciclinas, además de no tener las dificultades asociadas al coleo de los picos y

la baja eficiencia de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) proveniente

de la interacción con grupos silanol residuales en la sílica de los materiales de

empaque de las columnas. La EC también tiene la ventaja de tiempos de análisis más

cortos y menor consumo de muestras y solventes, en comparación con el HPLC.

Las características básicas de la EC son:

• Utiliza campos eléctricos, a veces superan los 500 V/cm

• Tiene un poder separador comparable al de la cromatografía de gases.

• Requiere muy poca cantidad de muestra y reactivos.

• Es sencillo de utilizar y fácilmente automatizable.

• Es aplicable a una amplia gama de analitos.

Los elementos de un equipo de electroforesis capilar son los siguientes (Ver Figura 3):

• Capilar: Es en donde se lleva a cabo la separación de las moléculas, está

hecho de sílice fundida cubierta con poliamida para darle flexibilidad, este

capilar está relleno de solución amortiguadora. Los grupos hidroxilo de l sílice

se disocian dejando el tubo con una carga negativa.

• Sistema de Refrigeración del Capilar: Durante la separación se aplican grandes

cantidades de corriente. Debido a la resistencia al movimiento de las cargas, se

genera una gran cantidad de calor que ha de ser disipado para tener

controladas las condiciones y evitar que el capilar se funda.

• Fuente de corriente eléctrica de alto voltaje: Debe suministrar una diferencia de

potencial entre los extremos del capilar de hasta 20-30 kV con una intensidad

de 200-250 µA.

• Viales con electrolito y muestra: Contienen una disolución amortiguadora en la

que se va a realizar la separación, o bien, la muestra que va a ser analizada.

Normalmente se colocan en un carrusel de muestras que suele estar

termostatizado. El sistema mueve los viales automáticamente y los eleva e

inserta en los extremos del capilar mediante un sistema neumático.


10

• Dos electrodos de platino: Cada uno se encuentra en contacto con un extremo

del capilar y sumergido en los recipientes que contienen la solución

amortiguadora donde se va a realizar la separación. Se denomina cátodo al

electrodo negativo (hacia el que migran las cargas positivas por atracción

electrostática), mientras que el ánodo es el electrodo positivo (hacia el que

migran las cargas negativas por atracción electrostática).

• Detector: En el extremo del capilar se encuentra un sistema que registra una

propiedad física de los analitos que llegan a él. El detector más común es el de

absorción de radiación UV- VIS de longitud de onda variable o de batería de

diodos.

Figura 3. Componentes básicos de un equipo de electroforesis capilar. La computadora controla la fuente de poder y la señal del detector. La muestra se introduce al capilar, generalmente por presión. La entrada y salida del capilar deben estar inmersas en el buffer que realiza la separación. Los electrodos, que están conectados a la fuente de poder, se encuentran en cada extremo del capilar. La corriente se establece de cátodo a ánodo. Cuando los analitos migran, pasan a través de una ventana dentro del mismo capilar y la señal se transforma para poder ser interpretada.

La instrumentación para la electroforesis capilar es sencilla. Se coloca un capilar de

sílice fundida relleno de una solución amortiguadora, uniendo dos depósitos de

solución amortiguadora que contienen también electrodos de platino. La introducción

de la muestra se realiza por un extremo y la detección por el otro. Se aplica un

potencial de 5 a 30 kV cc a través de los dos electrodos. La introducción de la muestra

se realiza por inyección a presión, en la que un extremo del capilar se inserta en un

recipiente que contiene la muestra. Entonces el recipiente es elevado brevemente por

encima del nivel del capilar para obligar a la muestra a entrar al tubo. Otra opción


11

consiste en aplicar vacío al extremo detector del tubo. La introducción se puede

realizar también por medio del flujo electroosmótico.

Cuando se aplica un alto voltaje a través de un tubo capilar de sílice fundida que

contiene una disolución amortiguadora, se genera habitualmente un flujo

electroosmótico en la que el disolvente migra hacia el cátodo. La velocidad de

migración puede ser considerable. La causa del flujo electroosmótico es la doble capa

eléctrica que se desarrolla en la interfase sílice/ disolución. A valores de pH mayores

de 3, la pared interna de un capilar de sílice se carga negativamente a causa de la

ionización de los grupos silanol de la superficie (Si---OH) [Ver Figura 4].

Figura 4: Representación de la doble capa eléctrica y el flujo electroosmótico que aparece al aplicar una

diferencia de potencial en los extremos de un capilar de sílice.

Los cationes de la solución amortiguadora se congregan en una doble capa eléctrica

adyacente a la superficie negativa del capilar de sílice. Los cationes de la parte

exterior difusa de la doble capa son atraídos hacia el cátodo o electrodo negativo. El

resultado es un flujo neto de fluido que migra hacia el electrodo negativo. Este flujo es

el que va a arrastrar a los aniones y moléculas neutras hacia el detector situado en el

cátodo.

El flujo electroosmótico puede ser controlado. Así, a mayor pH, el grado de ionización

de los grupos silanol será mayor, y por lo tanto también lo será el flujo electroosmótico.

A la inversa, si el pH es bajo, disminuirá el porcentaje de grupos silanol ionizados y

también lo hará el flujo electroosmótico. La adición de modificadores orgánicos

miscibles con la solución amortiguadora (acetonitrilo, metanol) también se han

utilizado para regular el flujo electroosmótico.


12

La velocidad del flujo electroosmótico suele ser mayor que las velocidades de

migración electroforéticas de los iones individuales y, en efecto, se convierte en la

bomba de la fase móvil en la electroforesis capilar de zona. Aún cuando los analitos

migran según sus cargas dentro del capilar, la velocidad de flujo electroosmótico

generalmente es suficiente para arrastrar todas las especies positivas, neutras e

incluso negativas, hacia el mismo extremo del capilar, de manera que todas pueden

ser detectadas a su paso por un punto común. El electroferograma resultante tiene la

apariencia de un cromatograma, pero con picos más estrechos.

La velocidad de migración ν de un ion en un campo eléctrico se expresa mediante:

ν = µeE = µe (V/L)

Donde E es la intensidad del campo eléctrico en voltios por centímetro, V es el voltaje

aplicado, L es la longitud del tubo entre los electrodos, y µe es la movilidad

electroforética, que es proporcional a la carga del ion y inversamente proporcional a la

fuerza de retardo por fricción sobre el ion. La fuerza de retardo por fricción sobre un

ion viene determinada por el tamaño y la forma del ion y por la viscosidad del medio.

Se ha demostrado que el número de platos N de una columna de electroforesis capilar

se obtiene mediante

N = µe V

2D

Donde D es el coeficiente de difusión del soluto (cm2/s). Dado que la resolución

aumenta con el número de platos, es deseable usar voltajes aplicados altos para

lograr separaciones de alta resolución.

En la electroforesis capilar de zona (CZE) la composición de la solución

amortiguadora es constante en toda la región de la separación. El campo aplicado

hace que cada uno de los componentes iónicos de la mezcla migre de acuerdo con su

propia movilidad y se separen en zonas, que pueden estar resueltas por completo o

pueden solaparse parcialmente.

En la mayoría de las separaciones electroforéticas de iones pequeños, el menor

tiempo de análisis se registra cuando los iones del analito se mueven en la misma

dirección que el flujo electroosmótico. Así, para separaciones de cationes, las paredes

del capilar no se someten a tratamiento alguno, y tanto el flujo electroosmótico como el


13

movimiento de cationes se dirigen hacia el cátodo. Sin embargo, para la separación de

aniones, el flujo electroosmótico se invierte habitualmente tratando las paredes del

capilar con una sal de alquilamonio, como el bromuro de cetil trimetilamonio. Los iones

amonio cargados positivamente son atraídos por la superficie de sílice cargada

negativamente y, a su vez, crean una doble capa de disolución con carga negativa que

es atraída por el ánodo, lo cual invierte el flujo electroosmótico.


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3. JUSTIFICACIÓN

La producción de tetraciclinas se realiza por fermentación liquida con altos costos de

operación, lo que se refleja en el alto valor agregado del producto, por lo que resulta

interesante generar procesos de producción de antibióticos con aplicaciones

biotecnológicas alternativas que resulten más rentables como es el caso de la

fermentación en estado sólido (SSF) la cual es ampliamente utilizada en los países

orientales y presenta ventajas sobre la fermentación sumergida.

La fermentación sólida se realiza sobre soportes que generalmente son seleccionados

de acuerdo a sus características y abundancia regional, y siendo México un país con

gran cantidad de residuos agroindustriales con poca aplicación o nula, la utilización de

éstos en procesos de SSF para la producción de metabolitos microbianos, representa

una alternativa para su aprovechamiento y una mejoría ambiental de las regiones en

las que se produce.

En consecuencia, el salvado de trigo por su consistencia y bajo costo, ha sido utilizado

como soporte para la producción de enzimas y ácidos orgánicos por SSF.

Por las propiedades fisicoquímicas de las tetraciclinas, tales como su naturaleza

iónica, múltiples sitios de ionización y su solubilidad en agua, hace de estos

compuestos más adecuados para el análisis electroforético.

Por ello, se utilizó la electroforesis capilar como técnica analítica, debido a su alto

grado de detección, los cortos tiempos de detección de las moléculas, su especificidad

y su menor utilización de solventes, comparados con el HPLC.


15

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Obtener aureomicina por fermentación sólida e identificarla por Electroforesis Capilar.

4.2 Objetivos específicos

Producir aureomicina en un medio de fermentación sólido.

Cuantificar la concentración de aureomicina por Electroforesis Capilar.

Determinar la concentración de aureomicina por Bioensayo.


16

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 MATERIAL

Microorganismo: Streptomyces aurofaciens (ATCC-10762) como productor de

aureomicina. La cepa pertenece a la Colección Nacional de Cepas Microbianas y

Cultivos Celulares del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV)

del Instituto Politécnico Nacional de México.

5.2 METODOLOGÍA

5.2.1 Preparación del inóculo

• Añadir el inóculo a un cultivo esporulado en tubo inclinado de 0.85% para

obtener una suspensión de 108 esporas/ mL

• Ajustar a una absorbancia de 0.5 a una longitud de onda (λ) 540nm.

5.2.2 Medio de Esporulación

Si es líquido se diluye 1:3 de los ingredientes:

• Peptona Biotriptasa 2.0 g

• Extracto de Levadura 1.0 g

• Extracto de Carne 1.0 g

• Glucosa 10.0 g

• FeSO4 trazas

Ajustar el pH a 7.2

5.2.3 Preparación del Medio de Cultivo

• Sacarosa 2%

• Agua de cocimiento de maíz 1%

• Aceite de cacahuate 1%

• Sulfato de amonio 0.5%

• Sales minerales:

o Carbonato de calcio 0.1%

o KH2PO4 0.2 %


17

o MgSO4 ·7H2O 0.025%

o ZnSO4·7H2O 0.003%

o MnCl2 ·7H2O 0.003%

Ajustar el pH a 6.2.

5.2.4 Preparación del Sistema de Fermentación Sólida

En matraces Erlenmeyer de 250 ml añadir 10 g de salvado de trigo, 10 ml del

medio de producción e inocular con 3% de la suspensión de esporas. Agregar

5 mL de agua para obtener una humedad relativa de 58%.

5.2.5 Toma y tratamiento de la muestra

• Monitorear la fermentación cada 24 horas sacando 2 matraces por toma de

muestra (hacerlo hasta las 96 horas)

• Diluir el material restante en una proporción 1:5 y agitar a temperatura

ambiente durante 10 min.

• Medir el pH

• Filtrar

5.2.6 Manejo de Resultados

• Cuantificación del antibiótico obtenido por bioensayos (Método USP)14

• Cuantificación del antibiótico obtenido por EC, determinando las condiciones

óptimas de detección.4,12,13


18

5.3 DIAGRAMA DE FLUJO DE LA METODOLOGÍA


19

5.4 METODOLOGÍAS DE IDENTIFICACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR

5.4.1 Condiciones Instrumentales y de Operación:

• Sistema de Electroforesis Capilar Beckman Coulter

• Software 32 Karat para procesamiento de resultados

• Potenciómetro

• Capilar de Sílice (70 cm x 0.75 μm)

5.4.2 Estándares y Reactivos:

• Buffer pH 12: fosfato de sodio 30mM, sal disódico de EDTA y 2.5 de 2-

propanol.

• Buffer pH 10: carbonato de sodio 50mM, EDTA 10mM.

• Buffer pH 2.5: HCL 1M, acido cítrico 50mM.

• Agua grado Milli Q.

• NaOH grado HPLC.

• Estándar de tetraciclina.

5.4.3 Procedimiento de la electroforesis capilar:

Antes de su uso diario, el capilar fue lavado con agua Milli Q durante 5 minutos, con

NaOH por 5 minutos, con agua por 5 minutos, después se acondiciona con el buffer de

corrimiento por 20 minutos; durante el análisis y después de cada determinación el

capilar fue secuencialmente lavado con agua por 5 minutos y con NaOH por 5

minutos.


20

5.4.4 Métodos de Identificación de la Tetraciclina por Electroforesis Capilar

Condiciones de

Separación

Método 1 Método 2 Método 3

Buffer

Fosfato de sodio

30mM, sal disódica

de EDTA y 2.5% de

2-propanol pH 12.

HCl 1M y acido

cítrico 50mM pH

2.5.

Carbonato de sodio 50

mM, EDTA 10 mM pH

10.

Voltaje 14KV 10KV 13KV

Tiempo de

Inyección

5 seg 10 seg 20 seg

Longitud de Onda 360 nm 260nm 270 nm

Tiempo de Corrida 12 minutos 20 minutos 20 minutos

Temperatura N/A 25º C 23°C Tabla 3: Métodos de Identificación de Tetraciclina utilizando diferentes condiciones de separación

N/A= No aplica

5.4.5 Preparación del Estándar

Solución primaria estándar de tetraciclina (100 µg/mL)

Pesar exactamente 1000 µg (0.001 g) de estándar de Tetraciclina y transferir a un

matraz volumétrico de 10 mL, aforar con solución de ácido clorhídrico (HCl) 0.1 N.

Tomar de la solución estándar de tetraciclina las alícuotas correspondientes para

realizar la curva estándar de tetraciclina a las siguientes concentraciones: 20, 40, 60,

80 y 100 μg/mL.


21

6. RESULTADOS

Método 1

En la figura 5, se puede observar en el electroferograma diferentes picos detectados

con esta metodología, el pico de interés es decir, la tetraciclina, es el que se

encuentra a un tiempo de retención de 13.5 minutos con una absorbancia (Au) de

0.005, a una longitud de onda (λ) de 340 nm.

Tabla 4: Método 1 para identificación por EC del estándar de Tetraciclina (J.M. Miranda, J.A. Rodrigues , C.A. Galan-Vidal, 1996)

Figura 5: Electroferograma obtenido para la Identificación del Estándar de Tetraciclina por EC por el

Método 1

Buffer Fosfato de sodio 30mM, sal disódica de

EDTA y 2.5% de 2-propanol pH 12.

Voltaje 14KV

Tiempo de Inyección 5 seg

Longitud de Onda 360 nm

Tiempo de Corrida 12 minutos

Temperatura N/A


22

En el electroferograma donde se corrió sólo el agua (Figura 6), se puede observar la

presencia de un solo pico, por lo tanto, se confirma que en la corrida del estándar, el

pico más alto que se obtiene corresponde a la tetraciclina, y los picos más pequeños a

su lado, se piensa que pueden corresponder a productos de degradación propios de la

tetraciclina.

Debido a que no se obtuvo una buena separación del pico de la tetraciclina y sus

respectivos productos de degradación, se procedió a realizar una investigación con el

objetivo de encontrar nuevos métodos con los que se mejorara la obtención del pico

de la tetraciclina, es decir, obtener una mejor señal y se procedió a probarlos. Las

condiciones de electroforesis se muestran en la tabla 3.

Figura 6: Electroferograma obtenido de la comparación entre el estándar de tetraciclina y agua para

identificar impurezas.


23

Método 2

Como se puede observar en la Figura 7, el pico que se obtuvo no es una señal

adecuada, por lo que se cambiaron algunas condiciones de este método, como

presión y tiempo de inyección, sin embargo, se siguieron obteniendo los mismos picos

observados en la Figura 7, por lo que se dedujo que debido al capilar se obtenían esos

picos y, se procedió a buscar otro método más adecuado

Tabla 5: Método 2 para identificación por EC del estándar de Tetraciclina (L. Nozal, L. Arce, B. M. Simonet, A. Ríos, M. Valcárcel, 2004)

Figura 7: Electroferograma obtenido para la identificación del Estándar de Tetraciclina por Método 2.

Buffer HCl 1M y ácido cítrico 50mM pH 2.5.

Voltaje 10KV


Longitud de Onda 260nm


Temperatura 25º C


24

Método 3

En la figura 8 se puede observar que el pico obtenido coeluye con los probables

productos de degradación de la tetraciclina, es decir, el pico obtenido no tiene buena

resolución, además de que la línea base nunca se mantiene estable, por lo que se

procedió a hacer pequeñas variaciones en las condiciones de corrida, con el fin de

optimizar el método, se redujo la presión así como el tiempo de inyección (Tabla 6).

Buffer Carbonato de sodio 50 mM,

EDTA 10 mM pH 10.

Voltaje 13KV




Temperatura 23°C Tabla 6: Método 3 para identificación por EC del estándar de Tetraciclina

(Vargas Mamani, Mónica Cecilia, Amaya Farfán, Jaime, Reyes Reyes, Félix Guillermo, Rath, Susanne, 2006)

Figura 8: Electroferograma obtenido para la identificación del Estándar de Tetraciclina por EC (Método 3)


25

Optimización del Método 3

En la figura 9, se aprecian los resultados obtenidos de la optimización del método 3

(tabla 7), los cuales son favorables, ya que se obtuvo un pico simétrico y la línea

base se mantuvo estable (Figura 9).

Una vez que se obtuvo un método adecuado, se procedió a realizar la curva estándar

de tetraciclina, para lo cual se hicieron diluciones del estándar a 20, 40, 60 y 80 µg, las

cuales se pueden observar en la (Figura 10).

Tabla 7: Optimización del método 3 para identificación por EC del estándar de Tetraciclina

Figura 9: Electroferograma obtenido para la identificación del Estándar de Tetraciclina por EC (Método 3 optimizado)

Buffer Carbonato de sodio 50 mM,

EDTA 10 mM pH 10.

Voltaje 13 kV

Tiempo de Inyección 8 seg|



Temperatura 23°C


26

En la figura 10, se muestran los resultados obtenidos de la curva estándar de

tetraciclina a diferentes diluciones (20, 40, 60, 80 y 100 μg/mL), en donde se obtuvo un

tiempo de migración promedio de 9.3 minutos.

Figura 10: Curva Estándar de Tetraciclina por EC (Método 3 optimizado)

En la tabla 8 se muestran los resultados obtenidos al procesar los picos obtenidos

(área bajo la curva) de la curva estándar de tetraciclina a las diferentes diluciones

realizadas.

Concentración (μg/ml) Area (Ac)

20 184798

40 467420

60 731440

80 1107297

Tabla 8: Relación de las concentraciones de la curva estándar de tetraciclina y las áreas bajo la curva

obtenidas.


27

Se puede observar en la gráfica 1 los resultados obtenidos de la Curva Estándar de

Tetraciclina por EC, en donde se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9935.

y = 15158x - 135141R2 = 0.9935

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 20 40 60 80 1

Concentración (mcg/ml)

Áre

a (A

c)

00

Gráfica 1: Curva Estándar de Tetraciclina obtenida por Electroforesis Capilar

En la figura 11 se muestra el electroferograma obtenido al analizar la muestra de la

fermentación sólida, como se puede observar, el tiempo de migración se modifica

respecto al estándar (el estándar tiene un tiempo de migración de 9.3 minutos,

mientras que la muestra tiene un tiempo de 10.25 minutos), debido a la influencia del

medio de producción ya que a la muestra no se le realiza ningún pretratamiento.

Figura 11: Detección de la muestra de tetraciclina por fermentación sólida y el medio de producción.


28

Se realizó una curva tipo para monitorear la producción de aureomicina (tabla 9,

gráfica 2) y poder comprobar la potencia del antibiótico producido.

Concentración (μg/ml)

ln (μg/ml)

Longitud del halo de inhibición

(mm)

200 5.29 16.95

400 5.99 17.25

800 6.68 19.75

1600 7.37 21

3200 8.07 24.5

Tabla 9: Curva Estándar de Tetraciclina obtenida en el bioensayo con S. aureus

Gráfica 2: Curva Estándar de Tetraciclina obtenida en el bioensayos con S. aureus


29

La fermentación se monitoreó cada 24 horas determinando pH (tabla 10, gráfica 3) y

producción de antibiótico (tabla 11, gráfica 4), se utilizó S. aureus como

microorganismo de prueba (Método USP).

La gráfica 4 nos demuestra que la producción de tetraciclina aumentó con respecto al

tiempo de fermentación, ya que, aunque entre el día 2 y 3 no se apreció un aumento

significativo de la producción de antibiótico, en el día 4 se obtuvo la mayor producción.

Tiempo (h) pH

0 6.2

24 5.6

48 5.43

72 5.86

96 6.65

Tabla 10: Monitoreo del pH contra tiempo

Gráfica 3: Monitoreo del pH a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas


30

Tiempo

(t)

Concentración (μg/ml)

24 4.916

48 7.01

72 7.08

96 7.825

Tabla 11: Concentración de producción de tetraciclina obtenida por bioensayo con S. aureus

Producción de Tetraciclina

4

5

6

7

8

9

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tiempo (h)

Prod

ucci

ón (m

cg/m

L)

Gráfica 4: Producción de tetraciclina a los distintos tiempos de muestreo por bioensayo con S. aureus


31

En la gráfica 5 se puede apreciar que el pH se mantiene en un rango de 5.43 a 6.65, lo

que permite que el microorganismo siga aumentando su producción a lo largo del

tiempo.

4

4.55

5.5

66.5

7

7.58

8.5

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Tiempo (h)

pH y

Pro

ducc

ión

(mcg

/mL)

Monitoreo del pH Producción de Tetraciclina

Gráfica 5: Relación del pH y la producción de tetraciclina


32

7. CONCLUSIONES

Se estableció la metodología adecuada para la detección de la aureomicina por

Electroforesis capilar, en la cual se pudo detectar la producción de aureomicina en un

medio de fermentación sólida, la cual fue de 8.219 μg/mL, el tiempo de migración fue

de 10.25 minutos en las condiciones de electroforesis probadas. Del análisis de

linealidad se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.9935.

Se pudo comprobar la efectividad de la aureomicina obtenida por fermentación sólida

mediante el ensayo microbiológico con el microorganismo Staphylococcus aureus,

resultando una concentración de 7.825 μg/mL. Del análisis de linealidad se obtuvo un

coeficiente de correlación de 0.9322.

La electroforesis capilar permite identificar la producción de aureomicina directamente

de la muestra de fermentación sólida (FES) sin realizar ningún pretratamiento. Esta

técnica muestra grandes ventajas respecto al HPLC, como es la poca o nula utilización

de solventes, lo cual representa un ahorro en la economía y además, protección al

medio ambiente.


33

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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http://www.google.com/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Eugenio+Vilanova+Gisbert%22

Obtencin de Aureomicina por fermentacin solida e ...

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