NÁZOV VYSOKEJ ŠKOLY - uniag.skcrzp.uniag.sk/.../P/8D3E1FADF5AA4B9FBF60918937A9104B.docx · Web...
Transcript of NÁZOV VYSOKEJ ŠKOLY - uniag.skcrzp.uniag.sk/.../P/8D3E1FADF5AA4B9FBF60918937A9104B.docx · Web...
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA
V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA1130939
NÁZOV FAKULTYNÁZOV VYSOKEJ ŠKOLY
UPLATNENIE PROGRESÍVNYCH ANALYTICKÝCH
METÓD PRI DETEKCII FALŠOVANIA SYROV
2011 Juraj Paulov
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA
V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
UPLATNENIE PROGRESÍVNYCH ANALYTICKÝCH
METÓD PRI DETEKCII FALŠOVANIA SYROV Bakalárska práca
Študijný program: Bezpečnosť a kontrola potravín
Študijný odbor:ŠO4170700 Spracovanie poľnohospodárskych
produktov
Školiace pracovisko: Katedra hygieny a bezpečnosti potravín
Školiteľ: Lucia Zeleňáková, Ing., PhD.
Konzultant: Radoslav Židek, Ing., PhD.
Nitra 2011 Juraj Paulov
Čestné vyhlásenie
Podpísaný Juraj Paulov vyhlasujem, že som záverečnú prácu na tému
„Uplatnenie progresívnych analytických metód pri detekcii falšovania syrov“
vypracoval samostatne s použitím uvedenej literatúry.
Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, ak uvedené údaje nie sú pravdivé.
V Nitre 12. mája 2011
....................................
podpis
Poďakovanie
Chcel by som touto cestou poďakovať vedúcej bakalárskej práce Ing. Lucii
Zeleňákovej, PhD. za cenné rady a odbornú pomoc pri vypracovaní zadanej práce.
Abstrakt
Hlavným cieľom bakalárskej práce bolo získanie poznatkov zaoberajúcich sa
aktuálnou problematikou falšovania syrov. Práca má kompilačný charakter, pričom
poskytuje ucelené informácie zahrňujúce zloženie kravského a ovčieho mlieka a opisuje
jeho pozitívny vplyv na ľudské zdravie. Zároveň sa zameriava na zložky mlieka, ktoré
slúžia ako indikátor falšovania mlieka a syrov. Osobitná pozornosť je venovaná
analytickým metódam PCR a ELISA, ktorými možno nežiaduce falšovanie detegovať.
Medzidruhové falšovanie mlieka vzniká pridaním kravského mlieka do drahšieho
ovčieho mlieka. V dôsledku toho zloženie syrov a syrových výrobkov nezodpovedá
údajom uvedených na obale. Konzumácia takýchto výrobkov môže pri určitej skupine
ľudí vyvolať alergické reakcie. Ochranu spotrebiteľa zabezpečujú legislatívne normy a
predpisy. Obsahujú základné informácie týkajúce sa označovania a zloženia syrov a
syrových výrobkov. Kontrolu a dodržiavanie právnych predpisov zabezpečuje ŠVPS
SR, ktorá uskutočňuje pravidelné odbery vzoriek syrov a syrových výrobkov
dostupných na trhu.
Kľúčové slová: falšovanie, kravské mlieko, ovčie mlieko, ELISA, PCR
Abstrakt
The main objective of thesis was to gain knowledge concerning “adulteration of
cheeses”. Compilation work has character, providing comprehensive information,
including the composition of cow and sheep milk. Describes a positive impact on
human health. It also focuses on the components of milk, which serve as indicator of
adulteration of milk and cheeses. Particular attention is devoted to analytical methods
of PCR and ELISA. These analytical methods can detect adulteration of milk.
Interspecific adulteration created by adding cow's milk to sheep's milk. Consequently,
the composition of cheese and cheese products are not correctly written on the
packaging. Consumption of such products may cause in certain group of people allergic
reactions. Legislative standards and regulations provide consumer protection. Contain
basic information regarding the labeling and composition of cheeses and cheese
products. Control and compliance legislative standards ensures ŠVPS SR. It carrying
out regular sampling of cheeses and cheese products available on the market.
Keywords: adulteration, cow's milk, sheep's milk, ELISA, PCR
Obsah
Obsah .....................................................................................................................................6
Zoznam ilustrácií ...................................................................................................................8
Zoznam tabuliek ..................................................................................................................9
Zoznam skratiek a značiek...................................................................................................10
Úvod.....................................................................................................................................11
1 Cieľ práce ........................................................................................................................12
2 Metodika práce a metódy skúmania ...............................................................................13
3 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí ................................................14
3.1 Charakteristika kravského mlieka.................................................................................14
3.1.1 Bielkoviny v kravskom mlieku..............................................................................14
3.1.1.1 Kazeíny v kravskom mlieku.............................................................................15
3.1.1.2 Srvátkové bielkoviny v kravskom mlieku........................................................15
3.1.2 Tuk v kravskom mlieku..........................................................................................16
3.1.3 Sacharidy v kravskom mlieku................................................................................17
3.1.4 Minerálne látky v kravskom mlieku.......................................................................18
3.1.5 Vitamíny v kravskom mlieku.................................................................................19
3.2 Charakteristika ovčieho mlieka.....................................................................................21
3.2.1 Bielkoviny v ovčom mlieku....................................................................................22
3.2.1.1 Kazeíny v ovčom mlieku...................................................................................22
3.2.1.2 Srvátkové bielkoviny v ovčom mlieku..............................................................23
3.2.2 Tuk v ovčom mlieku................................................................................................23
3.2.3 Laktóza v ovčom mlieku.........................................................................................23
3.2.4 Minerálne látky v ovčom mlieku................................................................................24
3.3 Charakteristika syrov a syrových výrobkov..................................................................25
3.3.1 Požiadavky na kvalitu syrov a syrových výrobkov.................................................26
3.3.2 Všeobecné požiadavky na označovanie potravín...................................................27
3.3.3 Označovanie syrov a syrových výrobkov...............................................................28
3.4 Medzidruhové falšovanie mlieka a syrov......................................................................29
6
3.5 Analytické metódy detekcie falšovania syrov...............................................................32
3.5.1 ELISA......................................................................................................................32
3.5.1.1 Princíp ELISA...................................................................................................32
3.5.1.2 Sandwich ELISA...............................................................................................34
3.5.1.3 Kompetetívna ELISA........................................................................................35
3.5.2 Izoelektrická fokusácia............................................................................................36
3.5.2.1 Voľná prietoková elektroforéza........................................................................37
3.5.3 Chromatografické metódy.......................................................................................37
3.5.3.1 Hydrofóbna interakčná chromatografia.............................................................37
3.5.4 PCR metóda.............................................................................................................38
3.5.4.1 Charakteristika PCR..........................................................................................38
3.5.4.2 Princíp PCR.......................................................................................................38
3.5.4.3 Imuno-PCR........................................................................................................40
Záver.....................................................................................................................................41
Zoznam použitej literatúry...................................................................................................42
7
Zoznam ilustrácií
Obr. 1 Vzorec laktózy 18
Obr. 2 Štruktúra protilátky 34
Obr. 3 Schéma Sandwich ELISA 35
Obr. 4 Schéma kompetetívnej ELISA 36
8
Zoznam tabuliek
Tab. 1 Zloženie mliečneho tuku 16
Tab. 2 Zastúpenie minerálnych látok v jednotlivých formách 19
Tab. 3 Zastúpenie vitamínov v ovčom a kravskóm mlieku 20
Tab. 4 Zloženie ovčieho a kravského mlieka 21
Tab. 5 Minerálne zloženie ovčieho a kravského mlieka 24
Tab. 6 Rozdelenie syrov podľa vody v beztukovej hmote syra 26
Tab. 7 Rozdelenie syrov podľa tuku v sušine 26
9
Zoznam skratiek a značiek
TCA kyselina trichlóroctová
NPN nebielkovinové dusikaté látky
Asn asparagín
Lys lyzín
Asp kyselina asparagová
Glu kyselina gluténová
Gln glutamín
Thr treonín
β-Lg β-laktoglobulín
α-La α-laktoalbumín
Tyr tyrozín
Arg arginín
Ca3(PO4)2. fosforečnan vápenatý
KM Michaelisova konštanta
TFA transportné mastné kyseliny
MCFA stredne dlhé mastné kyseliny
PCR polymerázová reťazová reakcia
ELISA enzýmová imunosorpčná analýza
EIA enzýmová imunoanalýza
HPLC vysokoúčinná kvapalinová
chromatografia
VBHS voda v beztukovej hmote syra
PDO ochranná značka originality
IEF izoelektrická fokusácia
(pl) izoelektrický bod
FFE voľná prietoková elektroforéza
HIC hydrofóbna interakčná
chromatografia
IPCR imunitná PCR
10
Úvod
Mlieko bolo už v minulosti súčasťou výživy ľudí. Mlieko v ľudskej výžive sa dá
považovať za najhodnotnejšiu potravinu, pretože obsahuje všetky živiny, nevyhnutné
pre zdravie a vývoj. Mlieko je vhodná potravina pre každodennú konzumáciu počas
celého života. Pravidelným pitím mlieka sa dopĺňa vápnik v kostiach a predchádza sa
úbytku kostrovej hmoty, osteoporóze. Spotreba mlieka a mliečnych výrobkov
na Slovensku klesá, čo ma za následok znižovanie produkcie mlieka. V mlieku
prevládajú pozitívne vlastnosti nad negatívnymi.
Mlieko je hlavným zdrojom vápnika. Obsahuje tiež fosfor, draslík, horčík, sodík,
chlór, síru a ďalšie stopové prvky. Mlieko má veľmi málo železa. Obsahuje aj množstvo
vitamínov, ako sú: B1, B2, B3, B6, E, K a taktiež malé množstvo vitamínov D a C.
Mlieko je ľahko stráviteľná potravina. Stráviteľnosť mlieka je závislá aj na obsahu tuku.
Ľahšie stráviteľné mlieko je s nižším obsahom tuku.
Ovčie mlieko je hustejšie a výživnejšie ako kravské, pretože obsahuje
dvojnásobok bielkovín, tuku a vitamínov B-komplexu. Taktiež vitamíny rozpustné
v tuku (A, D, E, K) i minerálne látky napr. vápnik, fosfor, horčík, železo, zinok, meď.
Ovčí tuk má vhodnejšie zloženie mastných kyselín ako kravský tuk. Je ľahšie
stráviteľný a zdravší. Z ovčieho mlieka sa na salašoch vyrába ovčí hrudkový syr. Je to
základná surovina na výrobu bryndze. Vzhľadom na cenu a množstvo ovčieho mlieka
na trhu, výrobcovia do ovčieho mlieka pridávajú kravské mlieko, aby tak redukovali
ceny bryndze. Pridanie kravského mlieka môže u citlivých jedincov vyvolať zdravotné
komplikácie (laktózová intolerancia, alergia na bielkoviny). Znížením nutričnej hodnoty
bryndze vzniká nedôvera medzi zákazníkmi.
V súčasnosti sú vypracované metódy na odhalenie nepovoleného pridávania
kravského mlieka do ovčieho. Medzi najpoužívanejšie analytické testy patrí ELISA
a PCR. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) pri detekcií využíva DNA. DNA
molekula mlieka je termostabilná. Táto metóda je vhodnejšia pri analýze vzoriek
tepelne upraveného mlieka alebo mliečnych výrobkov. ELISA (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) metóda, taktiež označovaná ako EIA (Enzyme Immunoassay)
je najpoužívanejšou imunologickou metódou na detekciu protilátok a antigénu.
11
1 Cieľ práce
Cieľom záverečnej práce bolo vypracovať tvorivú štúdiu poznatkov na
tému: ,,Uplatnenie progresívnych analytických metód pri detekcii falšovania syrov“.
Pre splnenie stanoveného cieľa bolo potrebné charakterizovať a porovnať fyzikálno-
chemické zloženie kravského a ovčieho mlieka, definovať a charakterizovať syry
a syrové výrobky, poukázať na dôvody falšovania mlieka a syrov a popísať princípy
vybraných analytických metód určených na stanovenie medzidruhového falšovania.
12
2 Metodika práce a metódy skúmania
Záverečná bakalárska práca je kompilačná tvorivá práca vypracovaná na
tému: ,,Uplatnenie progresívnych analytických metód pri detekcii falšovania syrov“.
Základným východiskom bola príprava literálneho prehľadu s využitím aktuálnych
databáz v knižniciach (knižnický a časopisecký fond SLPK) a v rámci rôznych
internetových zdrojov (elektronická knižnica vedeckých a odborných časopisov: Web of
Science, Springer LINK, Knovel, ScienceDirect a iné). V rámci kapitoly: ,,Súčasný stav
riešenej problematiky doma a v zahraničí” je práca rozdelená do týchto samostatných
na seba nadväzujúcich častí:
a) charakteristika kravského a ovčieho mlieka,
b) charakteristika syrov a syrových výrobkov,
c) medzidruhové falšovanie mlieka a syrov,
d) analytické metódy detekcie falšovania syrov.
13
3 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
3.1 Charakteristika kravského mlieka
Mlieko je uznávaný ako takmer kompletný potravinársky výrobok ľudskej
stravy, pretože poskytuje všetky makroživiny (tuky, cukry, bielkoviny) a všetky stopové
prvky (minerálne látky, vitamíny a enzýmy). Táto skutočnosť platí najmä v prípade
ranného detstva, pretože mlieko je jediným zdrojom živín v priebehu prvých mesiacov
života dieťaťa. Strava rastúcich detí obsahuje vysoký podiel mlieka a mliečnych
produktov. Adekvátny príjem mlieka je tiež odporúčaný pre dospelých ako zdroj
vápnika, pre zachovanie kostnej hmoty, takže zlomeninám a osteoporóze sa dá
predchádzať (Kira, Maio, 2004).
Mlieko je veľmi komplexná tekutina, obsahuje niekoľko stoviek molekúl.
Navyše sa v mlieku nachádzajú početne stopové prvky, napr. minerálne látky, vitamíny,
hormóny, enzýmy a ďalšie zlúčeniny. Chémia týchto zlúčenín je všeobecne podobná
v rámci druhu, ale v mnohých prípadoch sa ich štruktúra líši, čo je odrazom evolučných
zmien. Zloženie mlieka sa líši v rámci každého druhu, medzi jednotlivými druhmi,
plemenami, vo fáze laktácie, krmivom, zdravotným stavom zvierat a v mnohých ďalších
faktoroch. Obsah tuku v mlieku dobytka vykazuje veľké rozdiely medzi plemenami a v
akomkoľvek plemene existuje široká škála obsahu tuku a bielkovín pre jednotlivé
zvieratá. Podobné rozdiely sa vyskytujú v mlieku oviec, kôz a byvolov (Fox, 2009).
Ročná celková produkcia mlieka v súčasnosti sa pohybuje okolo 600 miliónov
ton. Produkcia kravského mlieka predstavuje viac ako 80 %. Mlieko je často
popisované ako koloidná suspenzia, obsahujúca emulgované tukové častice. Zatiaľčo sú
jednotlivé zložky podobné pre mlieko od väčšiny druhov, existujú značné rozdiely
medzi druhmi, a to kvalitatívne (charakter zložiek) a kvantitatívne (množstvo
jednotlivých zložiek na liter) (Huppertz, Kelly, 2009).
3.1.1 Bielkoviny v kravskom mlieku
Kravské mlieko obsahuje približne 3,5 % bielkovín. Koncentrácia sa výrazne
mení počas laktácie, a to najmä počas prvých niekoľkých dní po pôrode. Najväčšia
zmena nastáva v srvátkovej zložke bielkovín. Prirodzenou funkciou mliečnych
bielkovín je dodávanie esenciálnych aminokyselín mláďatám. Aminokyseliny sú
potrebné pre rozvoj svalového tkaniva a iných tkanív obsahujúcich biologicky aktívne
14
proteíny, napr. imunoglobulíny, vitamíny a hormóny bielkovinovej povahy. Vlastnosti
mnohých mliečnych výrobkov v skutočnosti závisia od vlastností bielkovín. Hoci
významný vplyv na výsledný produkt má tuk, laktóza a obzvlášť anorganické soli (Fox,
McSweeney, 1998).
Existujú dva hlavné typy bielkovín v mlieku, ktoré môžu byť oddelené na
základe ich rozpustnosti pri pH 4,6 a 20 ºC. Bielkoviny, ktoré za týchto podmienok
vytvárajú zrazeniny, sa nazývajú kazeíny. Bielkoviny, ktoré zostanú rozpustné
pri pH 4,6 sú známe ako srvátkové bielkoviny (Fox, Kelly, 2004).
3.1.1.1 Kazeíny v kravskom mlieku
Približne 80 % celkového dusíka u hovädzieho dobytka, oviec, kôz a byvolieho
mlieka je kazeín. Kazeín predstavuje len 40 % bielkovín z celkového množstva.
Asi 3 % celkového dusíka v kravskom mlieku sú rozpustné v 12 % kyseline
trichlóroctovej (TCA) a jeho názov je nebielkovinový dusík (NPN). Hlavnou zložkou je
močovina. Tuk v globulínových membránach obsahuje niekoľko špecifických
proteínov, vrátane mnohých enzýmov, v stopových úrovniach, približne 1 % z bielkovín
v mlieku (Fox, Kelly, 2004).Proteíny kazeínu sú rozdelené do 5 tried, αs1-kazeín, αs2-kazeín, β-kazeín, γ-
kazeín, κ-kazeín. Kazeíny sú globulárne proteíny s fosfoserínovým zvyškom, ktorý ma
výnimočné vlastnosti. Molekuly obsahujú tiež hydrofóbne zvyšky. β-kazeín obsahuje
najviac hydrofóbnych komponentov. Afinitný charakter kazeínov a ich fosforylácia
uľahčuje interakciu medzi kazeínom s Ca3(PO4)2. Vytvára vysoko hydratované
komplexy známe ako micely. Kazeínové micely sa skladajú z veľkého počtu sub-micél,
ktoré sa skladajú z viacerých agregátov molekúl kazeínu (Kailasapathy, 2008).
3.1.1.2 Srvátkové bielkoviny v kravskom mlieku
Srvátkové bielkoviny obsahujú β-laktoglobulín a α-laktoalbumín, sérový
albumnín, imunoglobulíny a malé množstvá krvných bielkovín. Srvátkové bielkoviny
majú typický globulárny charakter s pomerne jednoduchou sekvenciou (Kailasapathy,
2008).
3.1.2 Tuk v kravskom mlieku
15
Lipidy v kravskom mlieku sú prítomné v mikroskopických kvapôčkach ako
olejové vodné emulzie. Hlavným účelom týchto lipidov je poskytnúť zdroj energie pre
novonarodené teľa. Obsah tuku a mastných kyselín sa môže líšiť v dôsledku rozličných
faktorov ako sú plemeno, poradie a štádium laktácie, krmivo, zdravotný stav. Obsah
tuku môže kolísať od 3,0 do 6,0 %. Priemerné hodnoty sa pohybujú v rozmedzí 3,5 až
4,7 %. Zmeny v zložení mastných kyselín môžu viesť k zmenám fyzikálnych vlastností
tuku. Z praktického hľadiska, mliečne tuky sú veľmi dôležité ako nutričná výživa,
ovplyvňuje textúrne a senzorické vlastnosti mliečnych výrobkov, ako sú smotana,
maslo, sušené plnotučné mlieko a syry. Mliečne lipidy hovädzieho dobytka sú podobné
mliečnym lipidom ostatných druhov. Existujú rozdiely v množstve diacylglycerolov,
monoacylglycerolov, voľných mastných kyselín, fosfolipidov a sterolov.
Triacylglyceroly tvoria asi 98 % celkového tuku, majú priamy vplyv na
vlastnosti mliečneho tuku, napr. hydrofóbnosť, hustotu mlieka, teplotu tuhnutia.
Triacylglyceroly sa značne líšia v molekulovej hmotnosti a v stupni nasýtenia. Po dojení
čerstvé mlieko obsahuje iba malé množstvo diacylglycerolov a monoacylglycerolov
a voľných mastných kyselín.
Fosfolipidy tvoria asi 0,8 % mliečnych tukov. Avšak, zohrávajú významnú
úlohu v mlieku kvôli ich amfolitickým vlastnostiam. Asi 65 % sa nachádza
v globulárnych membránach, zatiaľčo zvyšok zostáva vo vodnej fáze. Steroly patria
k minoritným zložkám, zahŕňajú približne 0,3 % tuku. Hlavným sterolom je cholesterol,
predstavuje 95 % z celkového množstva sterolov. Mliečny tuk je prítomný v guľových
kvapkách. Ich veľkosť sa pohybuje od 0,2 do 15,0 µm v priemere. Globulárna
membrána tukových kvapiek pozostáva asi zo 40 peptidov (MacGibbon et al, 2006).
Tab. 1 Zloženie mliečneho tuku (MacGibbon et al, 2006)
Skupina lipidov Podiel z celkového obsahu lipidov (%)Triacylglyceroly 98,3
Diacylglyceroly 0,3
Monoacylglyceroly 0,03
Voľné mastné kyseliny 0,1
Fosfolipidy 0,8
Steroly 0,3
3.1.3. Sacharidy v kravskom mlieku
16
Laktóza je hlavným sacharidom v mlieku všetkých cicavcov. Mlieko obsahuje
len stopové množstvá ostatných sacharidov ako sú glukóza, fruktóza, glukozamín,
galaktozamín. Koncentrácia laktózy v mlieku závisí od živočíšneho druhu i od plemena
zvieraťa. Na množstvo pôsobia aj individuálne faktory, infekcia vemena a najmä fázy
laktácie. Mastitída spôsobuje zvýšenie hladiny NaCl v mlieku a následne NaCl
vyvoláva pokles sekrécie laktózy. Laktóza spolu so sodíkom, draslíkom a iónmi
chloridu sa podieľa na udržiavaní osmotického tlaku v prsnom systéme. Každe zvýšenie
alebo zníženie obsahu laktózy je kompenzované zvýšením alebo znížením obsahu
rozpustných solí v mlieku. Laktóza je disacharid zložený z galaktózy a glukózy,
prepojených β (1-4) glykozidovými väzbami. Systémový názov je β-D-galaktóza-(1-4)-
α-D-glukóza. V štruktúre vzorca hydroxyluje skupina na prvom uhlíku
C1 k hydroxylovej skupine C2 orientovanej smerom dole. Laktóza je unikátny sekrét.
Je syntetizovaná z glukózy, ktorá sa vstrebáva z krvi. Jedna molekula glukózy
je izomerizovaná na UDP-galaktózu cez 4 kroky prostredníctvom Leloir enzýmu. UDP-
galaktóza je následne spojená s ďalšou molekulou glukózy (Fox, McSweeney, 1998).
Laktóza je syntetizovaná v epitelových bunkách mliečnych žliaz. V metabolizme
sacharidov má významnú úlohu kontrola a modifikácia α-laktoalbumínu (α-La). Jedna
z úloh mliečnych bielkovín je redukcia Michaelisovej konštanty (KM) pre glukózu až
1000-krát. Existuje pozitívna korelácia medzi obsahom α-La a obsahom laktózy
v mlieku. Syntéza laktózy si vyžaduje osmotické čerpanie vody do vezikúl Golgiho
aparátu. Laktóza ovplyvnuje objem mlieka a koncentráciu kazeínu. Laktóza slúži ako
primárny zdroj energie pre novorodencov. Poskytuje 30 % kalórií kravského mlieka
a slúži ako alternatíva energeticky bohatších lipidov. Mlieko s vysokou koncentráciou
laktózy má nižšiu hladinu lipidov. Laktóza zodpovedá za 50 % osmotického tlaku, ktorý
je v izotonickom pomere s krvou. V mlieku s nízkou koncentráciou laktózy je zvýšená
koncentrácia anorganických solí. Počas mastitídy je poškodená celistvosť bunkových
membrán. Rastie prenikanie zložiek z krvi do mlieka. Osmotický tlak sa zvyšuje.
Následne klesá koncentrácia laktózy. Vlastnosti laktózy sú všeobecne podobné iným
cukrom, ale laktóza sa v niektorých dôležitých technických vlastnostiach líši. Patrí
medzi redukujúce cukry, čo znamená, že ma voľnú karbonylovú skupinu. Aldehydovú
skupinu v prípade laktózy. Môže tvoriť pomocou aldehydových skupín hemiacetálovú
štruktúru. Vznik hemiacetálu je v dôsledku chirálneho uhlíka. Laktóza sa môže
podieľať na Maillardovom neenzymatickom hnednutí. Štandardné metódy na
kvantitatívne určenie laktózy sú polarometrické, spektrofotometrické stanovenia, alebo
17
vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Rozpustnosť laktózy sa pohybuje
od 70 g do 500 g na liter. Rozpustné množstvo závisí od teploty. Laktóza je dôležitá pri
výrobe fermentovaných mliečnych výrobkov. Slúži ako zdroj uhlíka pre baktérie
mliečneho kvasenia, ktoré produkujú kyselinu mliečnu (Fox, 2009).
Obr. 1 Vzorec laktózy (URL 1)
3.1.4 Minerálne látky v kravskom mlieku
Minerálne látky v mlieku sú tvorené hlavne hydrogén uhličitanmi, chloridmi,
citrátmi, hydrogén uhličitanmi vápnika, horčíka, draslíka a sodíka. Väčšina minerálov je
rozdelená medzi rozpustnú fázu a koloidnú fázu. 60 % vápnika a 50 % fosforu môže
byť v koloidnej fáze. Distribúcia vápnika, citrátu, horčíka a fosfátov medzi rozpustnou
a koloidnou fázou a ich vzájomné interakcie s mliečnymi proteínmi majú významný
vplyv na stabilitu mlieka a mliečnych výrobkov. Minerály sú prítomné v rovnovážnom
komplexe. Zmena v pomere zastúpenia minerálnych látok v koloidnej a rozpustnej fáze
môže mať vplyv na tieto vlastnosti:
a) tepelná stabilita a alkoholová koagulácia surového mlieka,
b) kvalita a stabilita pri skladovaní koncentrovaných, sušených výrobkov,
c) množstvo kvapiek tuku počas homogenizácie mliečneho tuku,
d) množstvo vápnika v mlieku ovplyvňuje pevnosť tvarohu pri výrobe syrov
a viskozitu fermentovaných výrobkov.
Koncentrácia citrátu mlieka sa líši počas sezóny a zmenou krmiva. Vysoké
množstvo citrátu môže mať vplyv na obsah rozpustného vápnika a stabilitu mlieka.
Minerály ako sodík, draslík a chloridy sú väčšinou v pravých roztokoch v iónovej
forme. Ľahko sa šíria cez membrány počas ultrafiltrácie a elektrodialýzy. Vápnik,
horčík, fosfor a citrát sú čiastočne v roztoku a čiastočne v koloidnej suspenzii,
18
v závislosti od pH mlieka. Približne 20 – 30 % difúzneho vápnika a horčíka
je prítomného vo forme voľných iónov a zvyšok ako soli citrátu a fosfátu. Klesaním pH
mlieka pri výrobe jogurtov a fermentovaného mlieka sa koloidná forma prevádza
na iónovú formu. Minerálne látky sa podieľajú na udržiavaní osmotického tlaku
(Kailasapathy, 2008).
Tab. 2 Zastúpenie minerálnych látok v jednotlivých formách (Kailasapathy, 2008)
Minerálne látky Koloidná forma (%) Rozpustná forma (%)
Vápnik 67 33Horčík 36 64Sodík 4 96
Draslik 6 94Fosór 55 45Citrát 6 94
Chloridy 0 100Síra 0 100
3.1.5 Vitamíny v kravskom mlieku
Vitamíny sú organické látky, ktoré telo potrebuje v stopových množstvách.
Nedokáže si ich syntetizovať v metabolizme. Vitamíny potrebné pre rast a udržiavanie
zdravia sú rozličné medzi druhmi. Vitamíny pre jeden druh môžu byť syntetizované
v primeraných množstvách v metabolizme iných druhov. V chemickej štruktúre
vitamínov neexistuje žiaden vzájomný vzťah. Hlavná klasifikácia vitamínov
je na základe rozpustnosti. Do prvej skupiny patria vitamíny rozpustné vo vode.
Vitamíny skupiny B sú tiamín, riboflavín, niacín, biotín, kyselina pantoténová, kyselina
listová, pyridoxín, kobalamín. Taktiež do tejto skupiny patrí kyselina askorbová
(vitamín C). Druhá skupina pozostáva z vitamínov rozpustných v tukoch: retinol
(vitamín A), kalciferol (vitamín D), tokoferol (a príbuzné zlúčeniny, vitamín E),
fylochinón (a príbuzné látky, vitamín K). Vo vode rozpustné vitamíny a vitamín K majú
funkciu ako koenzýmy pri metabolických reakciách. Vitamín A je dôležitý v procese
videnia, vitamín D funguje ako hormón a vitamín E je primárny antioxidant.
Mlieko je jediným zdrojom živín pre novorodenca v priebehu rannej fázy života.
Musí zabezpečiť dostatok vitamínov na podporu rastu novorodenca. Ľudia by mali
19
konzumovať mlieko počas celého života. Mlieko sa spracováva v menšej alebo
vo väčšej miere pred spotrebou. Pri jeho spracovaní by sa malo dbať na zachovanie
vitamínov v mlieku a v mliečnych výrobkoch (Fox, McSweeney, 1998).
Tab. 3 Zastúpenie vitamínov v ovčom a kravskóm mlieku (Raynal-Ljutovac, 2008)
Vitamíny Ovčie mlieko Kravské mlieko
Vitamin A (mg) 0,08 0,04
Vitamin C (mg) 5 1
Vitamin D (µg) 0,18 0,08
Vitamin E (µg) 0,11 0,11
Vitamin B1 (mg) 0,08 0,04
Vitamin B2 (mg) 0,35 0,17
Vitamin B3 (mg) 0,42 0,09
Vitamin B5 (mg) 0,41 0,34
Vitamin B6 (mg) 0,08 0,04
Vitamin B8 (µg) - 2
Vitamin B9 (µg) 5 5,3
Vitamin B12 (µg) 0,71 0,35
3.2 Charakteristika ovčieho mlieka
Chov oviec je dôležitou súčasťou v národnom hospodárstve v mnohých
krajinách, najmä v oblastiach Stredomoria a Stredného východu. Chov oviec je veľmi
20
dobre rozvinutý vo Francúzsku, Taliansku, Španielsku a Grécku. (Park, Haenlein,
2006).
Avšak, vo veľkom meradle je produkcia ovčieho mlieka a mliečnych výrobkov
obmedzená nízkym objemom v sezónnych cykloch, v objeme okolo 50 kg ročne.
Informácie o zložení a fyzikálno-chemických vlastnostiach ovčieho mlieka sú
rozhodujúce pre úspešný vývoj ovčieho priemyslu. Medzi jednotlivými druhmi mlieka
existujú zreteľné rozdiely v chemickom zložení. V produkcii kravského mlieka sa
vyskytujú minimálne zmeny v priebehu celého roka. Na druhej strane, kravské mlieko
sa odlišuje od ovčieho a kozieho mlieka, ktoré je prevažne vyrábané v sezónnych
chovoch oviec. Počas obdobia produkcie ovčieho mlieka nastávajú zmeny v zložení.
Ku koncu laktácie sa obsah tuku, bielkovín, pevných látok a minerálov zvyšuje, avšak
obsah laktózy klesá. Ovčie mlieko má vyššiu viskozitu, index lomu, titračnú kyslosť
a nižší bod mrazu, ako je priemer kravského mlieka (Haenlein, Wendorff, 2006).
Tab. 4 Zloženie ovčieho a kravského mlieka (Park et al., 2007)
Zloženie Ovčie mlieko Kravské mlieko
Tuk (%) 7,9 3,6Netukové pevne látky ( %) 12 9
Laktóza (%) 4,9 4,7Bielkoviny (%) 6,2 3,2
Kazeín (%) 4,2 2,6Albumín, Globulín (%) 1 0,6Nebielkovinový N (%) 0,8 0,2
Popol (%) 0,9 0,7Kalórie/100ml 105 69
3.2.1 Bielkoviny v ovčom mlieku
Priemerný obsah bielkovín v ovčom mlieku je 5,8 %, oproti kravskému (3,3 %).
Zloženie bielkovín sa mení v rámci druhu, plemena, štádia laktácie, kŕmenia,
klimatických podmienok a zdravotného stavu vemena. Ovčie mlieko obsahuje asi
0,4 až 0,8 % dusíka. Proteíny v ovčom mlieku tvoria približne 95 % celkových
dusíkatých látok a 5 % patrí k nebielkovinovým dusíkatým látkam (Park et al., 2007).
21
Bielkoviny v mlieku sa veľmi dobre zrážajú. Hlavné proteíny ovčieho mlieka sú
približne rovnaké ako v kravskom mlieku. Mliečne bielkoviny sa vyskytujú v dvoch
odlišných fázach. Jedna z nich je stabilná fáza micélií zložená z kazeínov. Micélia majú
v priemere 190 nm. Sú prepojené Ca3(PO4)2 a malým množstvom horčíka, sodíka,
draslíka a citrátu, ktorý rozptyľuje svetlo a spôsobuje nepriehľadný biely vzhľad mlieka.
Druhú fázu bielkovín tvoria rozpustné srvátkové bielkoviny (Ramos, Juarez, 2003).
3.2.1.1 Kazeíny v ovčom mlieku
Kazeíny ako αs1-kazeíny, αs2-kazeíny, β-kazeíny, γ-kazeíny patria medzi
majoritné bielkoviny v ovčom mlieku 76 – 83 % z celkového množstva. Rôznorodosť
kazeínov sa určuje podľa prítomnosti genetických variant, alebo inými faktormi, ako je
fosforylácia, zmeny v rozsahu glykozylácie. Existuje päť polymorfných variant αs1-
kazeínu (A až E variant). Jedným zo skupiny je D variant αs1-kazeínu. Je to najmenej
fosforylovaný genetický variant. Obsahuje menší počet fosfátových skupín. αs1-kazeín
D prechádza dlhšiu dobu cez alkalický polyakrylamidový gel pri kapilárnej
elektroforéze v kyslom pH. Variant αs1-kazeín C sa líši od variantu
αs1-kazeín A aminokyselinami serotonín a prolín na pozícii C13. Určuje straty fosfátovéj
skupiny na C12 z proteínu. Dva varianty αs1-kazeínu A a B, ktoré boli popísané, sa líšia v
nahradení aminokyselín Asn49 a Lys200 za Asp49 a Asn200. Ovčí kazeín β-kazeín je
tvorený 209 aminokyselinami. Negenetickému polymorfizmu dochádza v dôsledku
rôznych stupňov fosforylácie. Existujú tri genetické varianty (A až C). Zistený
sekvenčný rozdiel medzi variantmi A a C bol v substitúcii aminokyseliny Glu z varianty
A na Gln vo variante C. Štruktúra varianty B nie je zatiaľ popísaná. Dostupnosť
a distribúcia vápnika je ovplyvnená rozsahom fosforylácie kazeínov. Sekvencia
ovčieho γ-kazeínu bola určená 171 aminokyselinami. Žiadne genetické varianty neboli
zistené. Negenetické polymorfizmy nastali kvôli rôznym stupňom glykolyzácie. Thr sa
nachádza na pozícii C135, C137,C138. (Park et al., 2007).
3.2.1.2 Srvátkové bielkoviny v ovčom mlieku
Srvátkové bielkoviny v ovčom mlieku predstavujú 17– 22 % z celkových
bielkovín. Medzi srvátkové bielkoviny zaraďujeme β-laktoglobulín (β-Lg) a α-
laktoalbumín (α-La), imunoglobulíny, sérový albumín, proteázové peptóny, ktoré sú
prítomné v menších koncentráciách. Toto sú produkty rozkladu β-kazeínu na plazmín.
Ďalšou rozpustnou bielkovinou v malých množstvách prezentujúcou antibakteriálne
22
vlastnosti je laktoferín. Sérový albumín a imunoglobulíny nie sú špecifické pre mlieko
a sú považované za látky pochádzajúce z krvi. Hlavnou srvátkovou bielkovinou je
β-laktoglobulín. V ovčom mlieku sa skladá z polypeptidového reťazca obsahujúceho
162 aminokyselín. Tri genetické varianty, β-Lg A až C boli popísané. Ovčí β-Lg B
sa odlišuje od β-Lg A v jednej aminokyseline Tyr na pozícii C20. β-Lg C je podtypom β-
Lg A s jednou výmenou (Arg za Gln na pozícii C14). Tieto tri varianty môžu byť
izolované izoelektrickou fokusáciou alebo pomocou kapilárnej elektroforézy. Ovčie β-
Lg alely A a B sú prítomné takmer u všetkých plemien, kým alela C je pomerne
zriedkavejšia a obmedzená na niekoľko konkrétnych plemien (Park et al., 2007).
3.2.2 Tuk v ovčom mlieku
Tuk je kvantitatívna i kvalitatívna pohyblivá zložka mlieka, v závislosti na fáze
laktácie, sezóny, plemena, genotypu a kŕmenia. Rozborom mliečneho tuku bolo
zistené, že krmivo má významný vplyv na zloženie tukov a ich kvalitatívne
a kvantitatívne vlastnosti (Sanz Sampelayo et al., 2007).
Hlavnou charakteristikou mliečneho tuku je vysoký obsah krátkych a stredne
dlhých reťazcov mastných kyselín (MCFA). Tieto mastné kyseliny majú rôzny
metabolizmus v závislosti od dĺžky reťazca. MCFA môžu byť uvoľnené z triglyceridov
v žalúdku žalúdočnou lipázou a pankreatickou lipázou, vstrebávane priamo črevnými
bunkami (Raynal-Ljutovac, 2008).
3.2.3 Laktóza v ovčom mlieku
Laktóza v ovčom mlieku je zastúpená 4,9 %. Jej koncentrácia sa príliš nemení.
Oligosacharidy s dĺžkou uhlíkového reťazca C3 až C10 podporujú rast bifidobaktérií,
ktoré zohrávajú klúčovú úlohu ako bunky črevnej sliznice v ochrane proti patogénom
(Raynal-Ljutovac, 2008).
3.2.4 Minerálne látky v ovčom mlieku
Ovčie mlieko predstavuje najvyššiu hodnotu sušiny. Rozdelenie vápnika,
fosforu a horčíka medzi rozpustnú a koloidnú fázu mlieka je podobné pre oba typy
mlieka (Holt, Jenness, 1984). Čo sa týka koncentrácie kontaminujúcich kovov výsledky
sú veľmi variabilné v závislosti od určitých faktorov (kŕmenie, zemepisné oblasti,
znečistenie životného prostredia). Preto sa ťažko porovnávajú koncentrácie kovov
23
medzi druhmi a plemenami. Priame informácie o biologickej dostupnosti minerálnych
látok chýbajú. Väčšina doterajších štúdií bola vykonaná v podmienkach in vitro,
s výnimkou vápnika, u ktorých biologická dostupnosť bola dokázan na myšiach
(Buchowski et al., 1989).
Podľa Guéguen et al. (2000) obsah železa je najvyšší v ovčom mlieku.
Vyšší obsah nukleotidov prispieva k lepšiemu vstrebávaniu železa v čreve (Schlimme
et al., 2000). Pokiaľ sa jedná o biologickú dostupnosť zinku (Shen et al., 1995), vyššie
hodnoty má ovčie mlieko a priemerné hodnoty má kravské mlieko.
Tab. 5 Minerálne zloženie ovčieho a kravského mlieka (Raynal-Ljutovaca, 2008)
Prvok Ovčie mlieko Kravské mlieko
Vápnik (mg) 1950 – 2000 1200Fosfor (mg) 1240 – 1580 920Draslík (mg) 1360 – 1400 1500Sodík (mg) 440 – 580 450
Chlorid (mg) 1100 – 1120 1100Horčík (mg) 180 – 210 110Zinok (µg) 5200 – 7470 3800Železo (µg) 720 – 1222 460Meď (µg) 400 – 680 220
Mangán (µg) 53 – 90 60Jód (µg) 104 70
3.3 Charakteristika syrov a syrových výrobkov
Legislatívne požiadavky na mlieko a výrobky z mlieka ošetruje Výnos
Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva zdravotníctva
Slovenskej republiky zo 14. augusta 2006 č. 2143/2006-100.
Syr je zrejúci alebo nezrejúci mäkký, polotvrdý, tvrdý alebo extra tvrdý
výrobok, v ktorom pomer srvátkových bielkovín ku kazeínu nepresahuje pomer
24
bielkovín v mlieku, vyrába sa úplným alebo čiastočným vyzrážaním bielkovín z mlieka
kravského, ovčieho alebo kozieho o rôznom množstve tuku alebo z cmaru, alebo ich
vzájomnou kombináciou pôsobením syridla alebo iných vhodných koagulačných
činidiel, alebo kyseliny mliečnej, vzniknutej biologickým kysnutím mliečneho cukru
a čiastočným oddelením srvátky, uvoľnenej v procese spracovania, alebo inými
výrobnými technikami zahŕňajúcimi koaguláciu bielkovín mlieka, ktorých výsledok je
výrobok s obdobnými fyzikálnymi, chemickými a organoleptickými vlastnosťami.
Zrejúci syr je syr, ktorý nie je určený na konzumáciu krátko po výrobe, ale
ktorý sa musí uchovávať určitú dobu pri určitej teplote, aby došlo k nevyhnutným
biochemickým a fyzikálno-chemickým zmenám, charakterizujúcim príslušný druh
zrejúceho syra. Medzi tieto syry sa zaraďujú aj syry zrejúce pod mazom, ktorých
charakteristický znak je tvorba mazu na povrchu syra počas jeho zrenia.
Hrudkový syr je syr vyrábaný vyzrážaním bielkovín z kravského mlieka
pôsobením syridla a čiastočným oddelením srvátky uvoľnenej v procese jeho výroby.
Ovčí hrudkový syr je syr vyrábaný vyzrážaním bielkovín z ovčieho mlieka
pôsobením syridla a čiastočným oddelením srvátky uvoľnenej v procese výroby.
Bryndza je prírodný syr, vyrábaný zo zrejúceho ovčieho hrudkového syra alebo
zo zmesi zrejúceho ovčieho hrudkového syra vykysnutého syra, alebo zo zmesi
skladovaného ovčieho syra a vykysnutého hrudkového syra. Bryndza musí obsahovať
najmenej 50 hmotnostných percent ovčieho syra zo sušiny výrobku.
3.3.1 Požiadavky na kvalitu syrov a syrových výrobkov
Podľa Výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky
a Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky zo 14. augusta 2006 č. 2143/2006-
100 sú syry charakterizované:
a) množstvom tuku
1. v celej hmote v hmotnostných percentách,
25
2. v sušine v hmotnostných percentách,
b) množstvom sušiny v hmotnostných perchtách
Syry sa podľa množstva vody v beztukovej hmote syra (VBHS) v hmotnostnýchpercentách členia na tieto skupiny:
Tab. 6 rozdelenie syrov podľa vody v beztukovej hmote syra (Výnos MP SR2143/2006-100)
Skupina syra VBHS (%)Extra tvrdý menej ako 47
Tvrdý 47 a menej ako 55Polotvrdý 55 a menej ako 62
Polomäkký 62 a menej ako 68Mäkký najmenej 68
Syry sa podľa spôsobu zrenia členiana na tieto skupiny: a) zrejúce
b) nezrejúce
c) v slanom náleve
Tab. 7 rozdelenie syrov podľa tuku v sušine (Výnos MP SR 2143/2006-100)
Skupina syra t. v s. hmotnostné (%)Vysokotučný 60 a viac
Plnotučný 45 a menej ako 60Polotučný 25 a menej ako 45
Nízkotučný 10 a menej ako 25Odtučnený menej ako 10
Na výrobu syrových výrobkov možno použiť syry vyrábané z mlieka kravského,
ovčieho alebo kozieho, mliečne výrobky z kravského mlieka, ovčieho alebo kozieho
mlieka, obsahujú zložky a prídavné látky len v technologicky nevyhnutne potrebnom
množstve podľa zásad správnej výrobnej praxe, následne ich možno tepelne ošetriť.
Syrové výrobky pomenované podľa niektorého druhu syra nesmú obsahovať
väčší podiel zložiek nemliečneho pôvodu ako 15,0 hmotnostného percenta. Pridávane
zložky možno používať len na dosiahnutie špecifickej chuti, nesmú nahrádzať mliečnu
zložku. Syrové výrobky s pridaním zložiek, ktoré nie sú pomenované podľa niektorého
druhu syra, musia obsahovať podiel syrov v množstve najmenej 51,0 hmotnostného
percenta zo surovín použitých na ich výrobu.
26
3.3.2 Všeobecné požiadavky na označovanie potravín
Požiadavky na označovanie potravín uvádzaných do obehu pre konečného
spotrebiteľa ustanovuje Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky
a Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky z 28. apríla 2004 č. 1187/2004-100
nasledovne:
a) slovné označenie potravín uvádzaných do obehu údajmi podľa Potravinového
kódexu SR musí byť v štátnom jazyku, označovanie v iných jazykoch nie je
zakázané, avšak nesmie byť prekážkou čitateľnosti údajov uvádzaných
v štátnom jazyku,
b) potraviny sa musia označovať tak, aby spotrebiteľ nemohol byť uvedený
do omylu, najmä:
- ak ide o ich vlastnosti, a to najmä druh, pôvod, miesto pôvodu,
zloženie, množstvo, trvanlivosť a spôsob výroby,
- pripisovaním takých účinkov a vlastností, ktoré potraviny nemajú,
- poukazovaním, že potraviny majú osobitné vlastnosti,
hoci v skutočnosti obdobné potraviny majú tiež takéto vlastnosti,
c) v označení potravín sa nesmú uvádzať také údaje, ktoré sa používajú
na označovanie prírodných minerálnych vôd a potravín na osobitné výživové
účely podľa osobitných predpisov, ktoré pripisujú potravine vlastnosť, že
pôsobí preventívne na zdravie ľudí alebo lieči chorobu, alebo sa odvoláva
na takéto vlastnosti,
d) potraviny možno uvádzať do obehu, len ak sú označené podľa hláv PK SR.
Na obale, na jeho súčastiach, ako aj v sprievodnej dokumentácii sa nesmú uvádzať
údaje:
a) potravina je zdrojom všetkých životne dôležitých živín,
b) bežné potraviny nedodajú potrebné množstvo živín, ktoré obsahuje ponúkaná
potravina,
c) potravina má zvýšenú alebo osobitnú výživovú hodnotu v dôsledku prídavku
prídavných látok alebo potravinových doplnkov, ak takúto vlastnosť nemá,
d) potravina má osobitné vlastnosti, aj keď vlastnosti vykazujú všetky
porovnateľné potraviny,
e) potravina je vhodná na prevenciu, zmiernenie, liečenie zdravotnej poruchy
27
alebo na lekárske účely, ak osobitné právne predpisy neustanovujú inak.
3.3.3 Označovanie syrov a syrových výrobkov
V názve syrov so špeciálnou úpravou, ako je údenie, parenie, strúhanie,
porciovanie, sušenie a pod., sa táto úprava musí uvádzať.
Názov ,, ovčia bryndza“ možno uvádzať, len ak ide o bryndzu, na výrobu ktorej
bol ako surovina požitý len ovčí hrudkový syr.
V Názve tepelne ošetrených výrobkov sa musí uvádzať aj spôsob ich tepelného
ošetrenia slovami „ termizované “ alebo „pasterizované”.
V názve mliečnych výrobkov možno používať slovo „bryndzová”, napr.
„bryndzová nátierka”, len ak mliečny výrobok obsahuje podiel bryndze väčší ako 50,0
hmotnostného percenta.
V označovaní syrov vrátane syrových výrobkov, tvarohov, bryndze a výrobkov
z nich, tavených syrov a tavených syrových výrobkov sa musí uvádzať množstvo tuku
niektorým z týchto spôsobov:
a) celkové množstvo tuku v hmotnostných percentách,
b) množstvo tuku v sušine v hmotnostných percentách (t. v s.), pričom množstvo
tuku (x) sa uvádza skratkou „x %” alebo „x % hmot.” (Výnos MP SR
2143/2006-100).
3.4 Medzidruhové falšovanie mlieka a syrov
Ochrana záujmov spotrebiteľa je legislatívne ošetrená v Nariadení (ES) č.
178/2002 Európskeho parlamentu a Rady z 28. Januára 2002.
Potravinové právo sa zameriava na ochranu záujmov spotrebiteľa a poskytuje
spotrebiteľovi podklady na informované rozhodnutia v súvislosti s potravinami, ktoré
konzumuje. Zameriava sa na:
28
a) podvodné alebo nekalé (klamlivé) postupy,
b) falšovanie potravín,
c) akýkoľvek iný postup, ktorý môže spotrebiteľa uviesť do omylu.
Podľa Popelku et al. (2002) sa falšovanie potravín spája so zhoršujúcou sa
kvalitou potravín. Cieľom falšovania potravín je vlastne oklamať spotrebiteľa alebo štát
a získať ekonomický prospech, pričom falšovanie môže predstavovať v niektorých
prípadoch aj závažné zdravotné následky (Hamr, Cuhra, 2004).
Vo svete dopyt po ovčích syroch vzrastá, pretože vzrastá záujem o zdravé
potraviny, získané z ekologického prostredia bez „chémie”, čo posúva ovčie syry na
kvalitatívne vyššiu úroveň. Na Slovensku má svoju tradíciu i ovčie mliekarstvo.
Predurčujú ho k tomu klimatické a pôdne podmienky, členitosť terénu, najmä na
severnom a strednom Slovensku. Pohoria s dostatočným množstvom pasienkov, ktoré
sa ťažšie dajú využiť pre hovädzí dobytok. Zloženie ovčieho mlieka sa výrazne líši od
zloženia kravského mlieka. Ovčie mlieko má v porovnaní s kravským mliekom
približne o 60 – 75 % vyšší obsah bielkovín, z ktorých kazeín tvorí 80 – 85 % a takmer
dvojnásobný obsah tuku. Pri analýze tuku v kravskom a ovčom mlieku potvrdili viacerí
autori bohatšie zastúpenie mastných kyselín v ovčom mlieku, čo mu dáva osobitné
vlastnosti, prejavujúce sa najmä charakteristickou chuťou a vôňou ovčích syrov.
V súčasnosti sa u nás ovčie mlieko spracováva hlavne na hrudkový syr na salašoch
s následným spracovaním na bryndzu v bryndziarňach (Kontová, 2003).
Kvalita mlieka ako suroviny je veľmi široký pojem, ktorý v sebe zahŕňa súbor
výživových, zdravotných, zoohygienických, technologických, ekonomických
i estetických požiadaviek. Mlieko a mliečne výrobky zaujímajú v správnej výžive
ústredné postavenie vďaka typickým organoleptickým vlastnostiam. Originálnemu
a vyváženému zloženiu, či širokému spektru esenciálnych zložiek, ktoré sú nevyhnutné
z hľadiska správnej a preventívnej výživy. Mlieko sa stáva dôležitou surovinou aj pre
ďalšie technologické spracovanie. Pričom kvalita zohráva aj v tomto prípade podstatnú
úlohu. Bielkoviny ovčieho mlieka a výrobkov z neho sa vyznačujú vysokou biologickou
hodnotou a ich obsah a zloženie sú považované za hlavné faktory determinujúce
výťažnosť syrov a kvalitu konečných výrobkov. Základnou technologickou vlastnosťou
mlieka je jeho syriteľnosť. Dobrá syriteľnosť závisí na jeho neporušenom zložení, na
obsahu kazeínových bielkovín, ich zložení, genetickom typ, na obsahu minerálnych
látok a na prirodzenom pH mlieka, ktoré s týmito faktormi súvisia. Množstvo mlieka
29
u oviec sa mení počas dňa, v priebehu laktácie i s poradím laktácie. Na produkciu
mlieka vplýva plemeno, početnosť vrhu, výživa, klimatické podmienky, ako i mnohé
ďalšie činitele. To nabáda spracovateľov ovčieho mlieka k jeho falšovaniu. Dôvody na
falšovanie mlieka sú v prvom rade ekonomické (Zeleňáková et al., 2008).
Dôvody, prečo je odhalenie falšovania mlieka dôležité pre spotrebiteľa:
a) pri miešaní drahšieho ovčieho a kozieho mlieka s kravským dochádza
k redukcii výrobných nákladov a zníženiu produkcie kvalitných výrobkov,
b) chrániť konzumentov, ktorí si neprajú konzumovať mlieko iných druhov;
isté percento obyvateľstva sa vyznačuje alergiou na zložky niektorých druhov
mliek.
V mnohých krajinách má detekcia falšovania syrov mimoriadny význam najmä
z hľadiska zachovania tradícií ich výroby. Z uvedeného dôvodu získali mnohé syry tzv.
ochrannú značku originality (PDO), čo znamená že sú vyrábané z jedného druhu mlieka
a v označení je táto skutočnosť deklarovaná (Zeleňáková et al., 2010b).
V minulých rokoch sa stala druhová identifikácia živočíšnych produktov
dôležitou otázkou týkajúcou sa autentifikácie potravín (Sawyer et al., 2003). Pre
zaručenie originality potravín je potrebný vývoj analytických techník umožňujúcich
úradom a producentom kontrolovať, či produkty sú správne popísané a označené
(Santos et al., 2003).
Mlieko, syry a ďalšie mliečne výrobky sú konzumované na celom svete a majú
veľký obchodný význam v rámci potravinárskeho priemyslu. Mlieko používané pri
výrobe týchto produktov je získané z niekoľkých druhov, vrátane kráv, oviec, kôz a
byvolov. Hoci syr vyrábaný z kravského mlieka dominuje trhu vo väčšine krajín,
významný podiel na trhu tvoria aj syry vyrobené z mlieka iných druhov. Stredomorské
krajiny boli dlhodobo výrobcami vysoko-kvalitných tradičných syrov, ktoré sú
vyrobené z kozieho, ovčieho alebo byvolieho mlieka (napr. Feta, Roquefort,
Mozzarella). Zloženie mlieka jednotlivých živočíšnych druhov ovplyvňuje
charakteristickú chuť a senzorické vlastnosti každého syra. Falšovanie mlieka určeného
na výrobu syra je nežiadúca praktika, ktorá vedie nielen k technologickým
manipuláciam počas spracovania, ale vyvoláva aj zdravotné problémy u spotrebiteľa.
Výrobcovia syra podvodne falšujú drahšie ovčie mlieko za kravské mlieko, aby sa
dosiahlo zníženie výrobných nákladov a zvýšenie zisku. Výrobcovia potravín sú
30
povinní uviesť pôvod mlieka v označení syrov alebo na iných mliečnych výrobkoch.
Niektorí spotrebitelia sa vyhýbajú konzumácii kravského mlieka z dôvodov
neznášanlivosti, alergií, náboženských, etických alebo kultúrnych dôvodov. Preto
z právnych dôvodov týkajúcich sa ochrany spotrebiteľa a zachovania dôvery, by mali
byť syry autentické a správne označené. Problematika autentizácie existuje vo všetkých
oblastiach potravinárskeho priemyslu. Existuje veľa analytických metód, ktoré môžu
odhaliť falšovanie. Referenčná metóda detekcie falšovania kravského mlieka je
založená na izoelektrickej fokusácií γ-kazeínu. Detekčné limity pre všetky nové testy
musia byť rovnaké alebo nižšie ako 1 obj. % kravského mlieka. Stále viac metód
využíva genetické rozdiely medzi druhmi pomocou analýzy DNA alebo
imunologických testov. PCR metódy boli úspešne aplikované na detekciu falšovania
mlieka a syrov. Hoci kvantifikácie sa dosiahlo iba v jednom prípade. Väčšina
imunologických testov využíva na detekciu mliečnych bielkovín (kazeíny,
α-laktoalbumíny, imunoglobulíny IgG) protilátky (Hurley et al., 2006).
3.5 Analytické metódy detekcie falšovania syrov
3.5.1 ELISA
Imunologicko-enzýmový test ELISA ma značné využitie v klinickej diagnostike.
Na začiatku objavu nemali ELISA testy využitie v potravinárskom priemysle. V roku
31
1990 sa ELISA metóda začala používať v environmentálnej oblasti. Najmä ako
detekcia cudzorodých látok v potravinách. V tejto dobe ELISA nebola ešte
prepracovaná pre detekciu alergénov. V nasledujúcom období sa odohrala séria úmrtí
v dôsledku potravinovej anafylaxie. V tomto období alergické reakcie na potraviny
neboli považované za významné riziko pre verejné zdravie. Začalo sa zvyšovať
povedomie obyvateľstva a sledovať alergény v potravinách. Pred zavedením ELISA
testov do bežnej praxe sa potraviny hodnotili na základe organoleptických vlastností
a na základe subjektívneho hodnotenia pozorovateľa. Taktiež sa používali aj
chromatografické metódy, ktoré neboli schopné detegovať alergény bielkovín v malých
množstvách. V súčasnosti sú ELISA testy prepracované a optimalizované na jednotlivé
alergény. Sú komerčné dostupné (Yeung, 2006).
3.5.1.1 Princíp ELISA
ELISA patrí do skupiny heterogénnych imunochemických metód. Súbežne
s rozvojom techniky EIA boli ostatné imunochemické metódy preskúmané a prekonali
obmedzenia používania rádioaktívnych markerov. ELISA metódu možno považovať
za najúspešnejší výsledok skúmania. Štandardný antigén je označený enzýmom
namiesto rádioizotopu a zmeny v enzymatickej činnosti sa považujú za kvantitatívnu
analýzu. Voľné a viazané frakcie musia byť oddelené počas analytického procesu,
pričom toto oddelenie je uľahčené použitím pevnej fázy. Protilátka je kovalentne
viazaná na stene reakčnej jamky. Oddelenie zložky možno dosiahnuť umývaním
jamiek kitu pufrom alebo destilovanou vodou. ELISA technika je založená na troch
hlavných metódach: 1. kompetetívna ELISA, 2. nepriama ELISA, 3. sandwich ELISA.
Na podobnom princípe pracuje aj metóda RIA. Počas priebehu testu sa vytvára súťaž
medzi antigénmi o obmedzený počet väzobných miest protilátky na stenách jamiek. Po
umytí vhodným enzýmovým substrátom „pufrom” sa všetok nenaviazaný materiál
odstráni z jamiek. Prebehne predpísaná doba inkubácie. Po inkubácii sa reakcia zastaví
a aktivita enzýmov je stanovená spektrofotometricky, zmeraním absorbancie. Enzým
zostáva aktívny aj po naviazaní. Antigén pripojený k enzýmu v štandarde sa používa len
na naviazanie protilátok a neblokuje aktivitu enzýmu. Čím je menej analytu vo vzorke,
tým menej analytu súťaží s pridaným enzýmom, ktorý sa naviaže na protilátky na
stenách jamiek. Aktivita enzýmu je vyššia, pretože viacej enzýmu je finálne viazaného
na protilátky. Nepriama ELISA a sandwich ELISA sú nesúťažné metódy. Všetok analyt
32
vo vzorke je viazaný počas testu. Nepriama ELISA sa používa pre kvantitatívnu
a kvalitatívnu analýzu imunoglobulínov alebo veľkých proteínových molekúl. Test je
považovaný za nepriamy. Analyt vo vzorke pôsobí ako protilátka a viaže sa na
imobilizovaný antigén na povrchu reakčnej jamky. Pre kvantifikáciu je enzýmom
značená protilátka pridávaná v nadbytku. Stáva sa citlivou na antigén. Enzým označí
antigén naviazaný na protilátkach na stene reakčnej jamky. Roztok s enzýmom sa
následne odplaví enzýmovým substrátom. Koncentrácia analytu sa zmeria fotometricky.
Následne sa vyhodnotí pomocou kalibračnej krivky zostavenej na základe štandardov,
ktoré sú spracované paralelne. Protilátky špecifické pre analyzovaný antigén sú na
povrchu reakčnej jamky. Jednou z hlavných výhod ELISA je jej univerzálnosť. Môže
byť použitá pre analýzu veľkých a malých molekúl, na rozdiel od homogénnej EIA,
ktorá je obmedzená na zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou. ELISA si
vyžaduje menšiu manipuláciu, ľahšiu skladovateľnosť. Patrí medzi ekonomicky
nenáročné metódy. ELISA je prispôsobená pre rutinné rýchle analýzy vzoriek
(Walczyk, 2005).
Protilátky na báze imunoglobulínov sú štruktúrou podobné glykoproteínom.
Pozostávajú z 82 % až 96 % bielkovín a 4 – 18 % sacharidov. Bielkovina je
produkovaná imunitným systémom za prítomnosti antigénu. Protilátky existujú ako
jedna alebo viacej kópií v Y-tvare, je zložená zo štyroch polypeptidových reťazcov.
Každá protilátka obsahuje dve identické kópie ťažkého reťazca (H) a dve identické
kópie ľahkého reťazca (L). Sú pomenované na základe ich molekulovej hmotnosti. Sú
navzájom poprepájané disulfidovými väzbami. Väzby sú zodpovedné za tvorbu slučiek,
vedú ku kompaktnosti štruktúry molekuly. Koniec ťažkého a ľahkého reťazca, ktorý sa
vyznačuje vysokou variabilitou aminokyselín v rôznych protilátkach, sú označované
ako variabilná doména ťažkého reťazca VH a variabilná doména ľahkého reťazca VL.
Konštantné časti ľahkého reťazca sú označované ako CL, zatiaľčo konštantná časť
ťažkého reťazca sa ďalej delí do troch odlišných subjednotiek CH1, CH2 a CH3. Funkčná
V doména sa podieľa na viazaní antigénu. H doména drží molekulu pohromade a je
zapojený do niekoľkých biologických aktivít ako je komplementarita väzieb a väzba na
bunkovú membránu. Protilátky sú rozdelené do piatich hlavných tried: IgM, IgG, IgA,
IgD a IgE. Najpoužívanejšie protilátky sú IgG (Yeung, 2006).
33
Obr. 2 Štruktúra protilátky (URL 2)
3.5.1.2 Sandwich ELISA
Sandwich ELISA test je citlivý test, ktorý dokáže detegovať a kvantifikovať
koncentráciu špecifických rozpustných proteínov. Sandwich ELISA test môže byť
presnejší, pretože obsahuje protilátky namierené proti dvom alebo viac epitopom
antigénu. Základná Sandwich ELISA metóda používa viac než vysoko koncentrované
protilátky, ktoré sú absorbované alebo potiahnuté na plast jamiek kitu. Imobilné
protilátky slúžia k zachyteniu špecifických antigénov, ako sú potravinové alergény,
ktoré sú prítomné vo vzorkách. Po umytí pufrom, nenaviazaný materiál je vyplavený,
zachytené antigény sú detegované pomocou enzýmovo-konjugovaných protilátok.
Následným pridaním chromogénneho substrátového roztoku sa zvyšuje úroveň
zafarbenia. Táto hodnota sa dá odčítať spektrofotometricky, nastavením správnej
vlnovej dĺžky. Intenzita zmeny farby sa zvyšuje koncentráciou antigénu v jamke kitu.
Výsledky testu je možné vyhodnotiť na základe zostavenej kalibračnej krivky pomocou
štandardov (Yeung, 2006).
34
Obr. 3 Schéma Sandwich ELISA (Yeung, 2006)
3.5.1.3 Kompetetívna ELISA
Metóda začína prichytením antigénu na povrch jamky. Táto nešpecifická
adsorpcia prebieha spontánne. Antigén je samovoľne naviazaný. Väzba je nekovalentná,
ale v podstate nezvratná. Adsorbovaný antigén sa zriedkakedy uvoľňuje v nasledovnom
umývacom kroku. Po vypláchnutí jamiek je pridaný koncentrovaný roztok bielkovín
(serový albumín), ktorý pokryje plastové steny jamky. Bráni neskoršej adsorpcii
protilátok na steny jamky. Doska sa premyje neutrálnym pufrom. Do jednotlivých
jamiek a štandardov známej koncentrácie antigenu sa pridá konjugát.
Konjugát sa viaže na imobilný antigén. Nekonjugované protilátky sa vzájomne
vylučujú. To znamená, že čím vyššia koncentrácia nekonjugovaných protilátok, tým
menšie je množstvo imobilizovaného enzýmu. Potom čo protilátka z konjugátu sa
naviaže na antigén, je doska premytá. Následne sa pridá posledný konjugát, ktorý
vyvolá farebnú zmenu. Reakcia, pri ktorej sa na steny jamky v prvej fáze nenaviaže
žiaden antigén, bude mať najväčšiu absorbanciu a bude braná ako 100 %. V jamkách
s rastúcou koncentráciou antigénu budú klesať namerané hodnoty absorbancie. Jamka,
do ktorej sa pridal štandard s najvyššou koncentráciou antigénu, bude mať najnižšiu
absorbanciu. Výsledky sa následne vyhodnotia na kalibračnej krivke zostavenej zo
štandardov (Creighton, 1999).
35
Obr. 4 Schéma kompetetívnej ELISA (Yeung, 2006)
3.5.2 Izoelektrická fokusácia
Izoelektická fokusácia (IEF) je elektroforetická metóda, ktorá amfoterické
zlúčeniny separuje podľa izoelektrického bodu (pl) pomocou kontinuálneho pH
gradientu. Na rozdiel od zónovej elektroforézy, kde je konštantné pH separačného
média. Vzniká konštantná hustota náboja na povrchu molekuly. Migrácia molekúl má
konštantnú pohyblivosť (v prípade neprítomnosti molekulového sita). Povrchový náboj
amfoterických zlúčenín sa neustále mení a klesá podľa jeho titračnej krivky. Pohybuje
sa pozdĺž pH gradientu až dosiahne rovnovážnu polohu. Miesto, v ktorom pH
zodpovedá hodnote pl. Pohyblivosť sa rovná nule a molekula sa zastaví. Existujú 2 typy
pH gradientov. V prvom prípade je gradient vytvorený a udržuje sa prechodom
elektrického prúdu do roztoku amfoterickej zlúčeniny, ktorá je bližšie k pl hodnote.
Príčinou elektroforetického transportu amfolytov (CAs) je vzájomný pomer hodnoty pl
a pH gradientu, ktorý stúpa v smere od anódy ku katóde. Na začiatku procesu, médium
má stále pH, ktoré sa rovná priemernej hodnote pl transportovaných amfolytov CAs.
Väčšina kyslých amfolytov sa pohybuje k anóde, kde je koncentrácia pH v rovnováhe
s hodnotou pl, zatiaľčo zásadité amfolyty sú poháňané ku katóde. Niektoré amfolyty
vstupujú do oblastí s vyšším alebo nižším pH, kde nie sú už v izoelektrickej rovnováhe.
Akonáhle sa do týchto miest nahrnie veľké množstvo amfolytov, na základe napätia sa
36
amfolyty vracajú do rovnovážnej pozície. Tento kyvadlový pohyb, difúzia verzus
elektroforéza, je hlavnou príčinou zvyškového prúdu pozorovaného pri izoelektrickom
rovnovážnom stave. Molekula proteínu vzorky postupne dosahuje izoelektický bod.
Hodnota pH sa rovná pl hodnote (Righetti, 2004).
3.5.2.1 Voľná prietoková elektroforéza (FFE)
Oddeľuje nabité častice, ktoré sú nepretržite vnášané do transportného filmu
tečúceho medzi dvomi rovnobežnými platňami. Elektrické pole pôsobí kolmo na smer
toku. Vzorka sa v dôsledku elektroforetickej mobility alebo izoelektrického bodu
separuje a vytvára špecifický obraz. FFE metóda je vhodná na separáciu biopolymérov
(Zhan et al., 2009).
3.5.3 Chromatografické metódy
3.5.3.1 Hydrofóbna interakčná chromatografia (HIC)
Pomocou tejto metódy bol separovaný a stanovený denaturovaný αs1-kazeín,
αs2-kazeín, β-kazeín a κ-kazeín v kravskom ovčom kozom mlieku, mliečnej zmesi
a syroch. Použil sa Propyl stĺpec v prítomnosti močoviny 8,0 M v mobilnej fáze.
Metóda je založená na rýchlom a ľahkom rozpúšťaní vzoriek v 4,0 M guanidázovom
tiokyanáte bez akejkoľvek predbežnej manipulácie alebo separácie kazeínovej frakcie.
Podmienky boli optimalizované na základe komerčných bovínnych štandardov kazeínu
a ich zmesí. V optimalizovaných chromatografických podmienkach boli 4 kazeínové
frakcie separované za menej ako 45 minút. Lineárny vzťah medzi koncentráciou
kazeínu a plochou piku pri vlnovej dĺžke 280 nm bol získaný v koncentračnom
rozmedzí od 0,5 do 40 µM. Detekčný limit pre α-, β-, κ-kazeín bol medzi
0,37 a 0,7 µM. Presnosť metódy bola vyhodnotená ako koeficient variácie stanovený
v rozmedzí 3,0 až 6,0 %. Metóda je overená, referenčnou analýzou sušeného
odstredeného mlieka (BCR-063R). Metóda sa aplikovala aj na kvalitatívnu
a kvantitatívnu analýzu kazeínovej frakcie v nespracovanom surovom kravskom, ovčom
a kozom mlieku. HIC chromatogram bol navrhovaný a analyzovaný s cieľom
vyhodnotiť možné použitie metódy na detekciu falšovania mlieka a syrov (Bramanti et
al., 2002).
37
3.5.4 PCR metóda
3.5.4.1 Charakteristika PCR
PCR je polymerázová reťazová reakcia prebiehajúca v podmienkach „in vitro”.
PCR bola vynajdená Kary Mullis v 1986. PCR metóda má najväčšie zásluhy vo
výskume v oblasti molekulárnej biológie, v diagnostike a súdnom lekárstve. Postupne
sa vyvíjali a špecifikovali rady aplikácií: priame klonovanie z génovej DNA a cDNA,
genetické skúmanie súdnych vzoriek, analýza sekvenčných variacií (HLA-typov),
klinická diagnóza vírusových infekcií, prenatálna diagnostika dedičných chorôb,
mutagenéza a genómové mapovanie. Spôsoby využitia stále pribúdajú.
3.5.4.2 Princíp PCR
Jeden PCR cyklus pozostáva z troch krokov. V prvom kroku sa vzorka zahreje
na 93 ºC až 96 ºC, aby úplne denaturovala templátová DNA. V druhom kroku jedno
vlákno DNA vzorky je ochladené na vhodnú teplotu a primery sa hybridizujú
s príslušnými komplementárnymi sekvenciami cieľovej DNA. Táto hybridná molekula
slúži ako šablóna a miesto začatia pre DNA polymerázu, ktorá rozrušuje základnú
sekvenciu DNA molekuly od 3’konca. V prvom cykle rozšírenie DNA polymerázy
presahuje komplementárnu sekvenciu ostatných primerov. Syntetizovaná DNA slúži
ako väzobné miesto pre ďalší primer v nasledujúcich PCR cykloch. Každým cyklom sa
zdvojnásobí množstvo cieľovej DNA sekvencie, čo vedie k exponenciálnemu
hromadeniu amplikón. Tieto tri kroky sa opakujú, pokiaľ nie je dosiahnutá požadovaná
koncentrácia. Používaním termostabilnej DNA polymerázy sa otvorila cesta
k automatizácii. Všetky komponenty sú pridané do reakcie na začiatku. Celý proces
prebieha v uzavretom termocykléri. Prístroj zodpovedá za zmenu teploty v jednotlivých
cykloch.
Reakčné komponenty
DNA Polymeráza
Na začiatku sa používala DNA polymeráza získaná z Escherichie coli. Tento
enzým nebol termostabilný. Musel byť dopĺňaný po každom cykle. Optimálna teplota
enzýmu je 37 ºC. Pre kvalitný priebeh amplifikácie je teplota príliš nízka. Zavedením
termostabilnej DNA polymerázy sa zvýšila citlivosť, špecifickosť, výťažok reakcie
a zjednodušil sa postup. Najčastejšie používanou DNA polymerázou je Taq polymeráza,
ktorá bola izolovaná z Thermus aquaticus. Táto termofilná baktéria žije v horúcich
prameňoch Yellowstonského parku. Teplota vody dosahuje 96 ºC. Enzým obsahuje
38
približne 200 nukleotidov za optimálnych podmienok. Syntetická rýchlosť dramaticky
znižuje teplotu. Enzým je stále aktívny pri izbovej teplote. Aktivita enzýmu je značne
ovplyvnená koncentráciou iónov Mg2+. Aktivita enzýmu klesne na polovicu pri 95 ºC za
40 minút.
Primery
Primery sú 15 – 30 bp dlhé oligonukleotidy. Ohraničujú DNA sekvenciu
z oboch strán. Sekvencia primerov a ich kombinácia sú najviac rozhodujúce faktory
špecifickosti, efektívnosti a zaručenia celkového úspechu PCR. Fyzikálne vlastnosti
primerov musia spĺňať nasledovné požiadavky: mali by obsahovať G-C kombináciu
nukleotidov, optimálnu dĺžku, teplotu denaturácie, atď. Opakovaným úsekom
nukleotidov je potrebné sa vyvarovať. Primer by nemal mať formu sekundárnej
štruktúry, ktorá môže brániť priľnutiu na cieľovú DNA. 3’konce primerov by sa mali
vyhýbať komplementarite, aby sa zabránilo tvorbe diméru primerov. Primerová
štruktúra sa tvorí pomocou počítačového softvéru, ktoré berú do úvahy všetky tieto
faktory a vyberú najlepšie možné sekvencie. Môže sa stať, že DNA sekvencia
cieľového génu nie je známa, iba sekvencie proteínu sú k dispozícii. Vzhľadom na
kódovanie aminokyselín môže nastať situácia, keď správnu sekvenciu DNA nie je
možné určiť z bielkovinovej databázy. V tomto prípade nešpecifické PCR primery sú
použité. Sú to zmesi oligonukleotidov, ktoré reprezentujú všetky možné kódovania
sekvencií.
Taq polymeráza
Taq polymeráza vyžaduje prítomnosť dvojmocných katiónov Mg2+, Mn2+
v reakčnej zmesi. Optimálna koncentrácia Mg2+ je približne 1,5 mM. Táto hodnota musí
byť prepočítaná pre každý pár primerov. Presnosť enzýmu je tiež závislá na
koncentrácii Mg2+. Taq polymeráza vyžaduje pH 8,2 až 9,0 v 10-mM Tris pufer. Taktiež
je potrebný prebytok všetkých štyroch deoxynukleotidov. Optimálna koncentrácia
dNTP je závislá na dĺžke produktu, koncentrácií primerov a reakčnej presnosti. DNTP
roztok redukuje voľné Mg2+.
DNA pre PCR môže byť izolovaná z krvi, tkaniva, bunkových kultúr, forenznej vzorky.
Základnou požiadavkou je neporušenosť vzorky bez chemických látok, ktoré inhibujú
PCR. V klinických vzorkách sú najčastejšími inhibitórmi porfyríny a heparíny.
39
Kontaminanty
Vzhľadom k extrémnej citlivosti PCR je kontaminácia veľkým problémom.
Najčastejším problémom je prenos kontaminácie, keď produkt predchádzajúcej PCR
kontaminuje reakciu. Majú byť prijaté bezpečnostné opatrenia, aby sa minimalizovalo
riziko kontaminácie (napr. vyhradená sada pipiet). Pre sledovanie kontaminácie sa vždy
vykonávajú kontrolné experimenty, ktoré neobsahujú templátovú DNA.
Termocykler
Základne požiadavky na prístroj sú: vysoká presnosť teplôt a opakovateľnosť,
vysoká rýchla a presná opakovateľnosť cyklov. Prvé termocykléry používali tri vodné
kúpele, ktoré mali nastavenú teplotu pre jednotlivé cykly. To si vyžadovalo veľký
priestor pre zariadenie. Vzorky sa prekladali ručne alebo pomocou robotickej ruky.
Dnes používa termocyklér na riadenie teploty inkubačné hliníkové bloky. Rýchla
zmena teploty a opakovanosť v cykloch je najnáročnejší technický proces termocykléra.
Hliníkový blok je schopný pojať veľké množstvo vzoriek. Moderný termocyklér až 384
vzoriek. Zohrievanie a chladenie hliníkového bloku prebieha rýchlosťou 1 ºC až 2 ºC za
sekundu. Vzorky musia byť inkubované dlhšiu dobu počas PCR, aby bola zaistená
rovnomernosť. Konvenčné termocykléry nedokážu zmeniť teplotu dostatočne rýchlo,
aby využili kinetickú energiu PCR. Kapilárne PCR stroje využívajú sklenené kapiláry
ako stojany na vzorky. Povrch kapilár je podstatne väčší ako povrch plastových rúrok.
Prístroj využíva vzduch ako prenosné médium pri odvádzaní tepla. Sklenené kapiláry
majú niekoľko krát menšiu tepelnú kapacitu, preto je zmena teploty rýchlejšia. Tepelný
výkon môže dosiahnuť 5 ºC až 10 ºC/s-1. To má niekoľko výhod. Znižuje celkový čas
potrebný pre priebeh celej PCR reakcie. PCR s 35 cyklami trvá priemerne asi 15 minút
(Kiss, 2002).
3.5.4.3 Imuno-PCR (IPCR)
Imuno-PCR je veľmi sľubná metóda pre ultrasenzitívnu analýzu proteínov
a ďalších antigénov. IPCR kombinuje ELISA metódu a PCR. V dôsledku toho IPCR je
asi 1000 až 10000-krát citlivejšia ako ELISA. Taktiež odhaľuje veľmi dynamický
lineárny rozsah. Boli vypracované postupy pre kompetetívnu IPCR, multiplex-IPCR.
Súčasný nedostatok v oblasti optimalizácie IPCR je spojený s vysokou citlivosťou na
kontaminanty a falošne pozitívne signály. IPCR ako rutinná metóda si vyžaduje vysoko
štandardizované protokoly a dobre vyškolený personál (Adler et al., 2003).
40
Záver
Falšovanie mlieka predstavuje najvýznamnejší problém pri výrobe ovčieho
hrudkového syra. Nízka a sezónna produkcia ovčieho mlieka zapríčiňuje vysokú cenu
základnej suroviny pre výrobu produktov. Snaha výrobcov o redukciu nákladov na
výrobu vedie k pridávaniu kravského mlieka do kvalitnejšieho ovčieho. Hlavným
cieľom výrobcu je finančný zisk. Bryndza vyrábaná na Slovensku musí obsahovať
minimálne 50 % ovčieho hrudkového syra. Slovenský trh je zaplavený bryndzou
dovážanou z Poľska. V takejto bryndze je podiel OHS menší. Dovoľuje to legislatíva
danej krajiny.
Pridávanie mlieka vyvoláva radu komplikácií. Hlavným problémom je klamlivá
reklama. Zdravie spotrebiteľa môže byť takýmto počínaním ohrozené. Určitá skupina
ľudí je intolerantná na zložky kravského mlieka, ako je kazeín alebo laktóza.
Odhaľovanie falšovania syrov sa uplatňuje pomocou imunologických
a neimunologických metód. K najpoužívanejším metódam patria imunologické a to
PCR a ELISA. Štátna veterinárna a potravinová správa pravidelne odoberá vzorky
syrov. Referenčné laboratórium sa nachádza v Dolnom Kubíne. Zníženie množstva
falšovaných syrov by sa mohlo dosiahnuť dôkladnejšími kontrolami výrobcov.
41
Zoznam použitej literatúry
1 ADLER, M. – WACKER, R. NIEMEYER, CH. M. 2003. A real-time immuno-
PCR assay for routine ultrasensitive quantification of proteins. In Biochemical and
Biophysical Research Communications. 2003, s. 240-250.
2 BRAMANTI, E. – SORTINO, CH. – RASPI, G. 2002. New chromatographic
method for separation and determination of denatured αs1-, αs2-, β- and κ-caseins by
hydrophobic interaction chromatogramy. In Journal of Chromatography A, 2002, s.
157-166.
3 BUCHOWSKI, M. S. – SOWIZRAL, K. C. – LENGEMANN, F. W. – VAN
CAMPEN, D. –MILLER, D. D. 1989. A comparison of intrinsic and extrinsic tracer
methods for estimating calcium bioavailability to rats from dairy foods. In Journal
of Nutrition [online], 1989, s. 228-234 [cit. 2011-02-19]. Dostupné na: <
http://jn.nutrition.org/content/119/2/228.full.pdf>.
4 CREIGHTON, T. C. 1999. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
In Encyclopedia of Molecular Biology, Volumes 1-4. B. m. : John Wiley & Sons,
1999. ISBN 978-0-471-15302-3.
5 FOX, P. F. 2009. Milk: an overview. In Milk Proteins: From Expression to Food. B.
m. : Elsevier, 2009. s. 1-26. ISBN 978-0-12-374039-7.
6 FOX, P. F. – McSWEENEY, P.L.H. 1998. Dairy Chemistry and Biochemistry. B. m. : Springer - Verlag, 1998. 478 s. 978-0-412-72000-0.
7 FOX, P. F. – KELLY, A. L. 2004. The caseins. In Proteins in Food Processing. B.
m. : Woodhead Publishing, 2004. s. 27-71. ISBN 978-1-85573-723-5.
8 GUÉGUEN, L. – POINTILLART, A. 2000. The bioavailability of dietary calcium.
In Journal of the American College of Nutrition, roč. 19, 2000, č. 2, s. 119-136.
9 HAENLEIN, G.F.W. – WENDORFF, W.L., 2006. Sheep milk – production and
utilization of sheep milk. In Handbook of Milk of Non-Bovine Mammals. Iowa :
Blackwell Publishing Professional, 2006. S. 137-194. ISBN 0-8131-2051-0.
10 HAMR. K – CUHRA, P. 2004. Falšovaní potravin a jeho prokazování, zajímavé
prípady. In Výživa a potraviny, roč. 59, 2004, č. 4, s. 92-93. ISSN 1211-846X.
11 HOLT, C. – JENNESS, R. 1984. Interrelationships of constituents and partition of
salts in milk samples from eight species. In Comparative Biochemistry and
Physiology Part A: Physiolog, roč. 77, 1984, č. 2, s. 275-282.
42
12 HUPPERTZ, T. – KELLY, A. L. 2009. Properties and Constituents of Cow’s Milk.
In Milk Processing and Quality Management. B. m. : John Wiley & Sons, 2009. s.
23-47. ISBN 978-1-4051-4530-5.
13 HURTLEY, P. I. – COLEMAN, R.C. – IRELAND, H. I. – WILLIAMS, J. H.H.
2006. Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of
adulteration of milk and soft cheese. In International Dairy Journal, roč. 16, 2006,
s. 805-812.
14 KAILASAPATHY, K. 2008. Chemical Composition, Physical and Functional
Properties of Milk and Milk Ingredients. In Dairy Processing and Quality
Assurance. B. m. : John Wiley & Sons, 2008. s. 75-103. ISBN 978-0-8138-2756-8.
15 KIRA, C. S. – MAIO, F. D. 2004. Comparison of partial digestion procedures for
determination of Ca, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, and Zn in milk by inductively
coupled plasma optical emission spectrometry. In Journal of AOAC International,
roč. 87, 2004, č. 1, s. 151-156.
16 KISS, C. 2002 PCR (Polymerase Chain Reaction). In Wiley Encyclopedia of
Molecular Medicine, Volumes 1-5. B. m. : John Wiley & Sons, 2002. ISBN 978-0-
471-37494-7.
17 KONTOVÁ, Marcela. 2003. Zmeny bielkovín a tuku u kravského a ovčieho syra
Roquefortoveho typu. In Výživa a potraviny pre tretie tisícročie „Funkčné
potraviny” 2003 : 4. ročník vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou. Nitra :
Slovenská Poľnohospodárska Univerzita v Nitre, 2003, s. 207-211. ISBN 80-8069-
249-174-6.
18 MACGIBBON, A.K.H. – TAYLOR, M.W. 2006. Composition and Structure of
Bovine Milk Lipids. In Advanced Dairy Chemistry, volume 2. B. m. : Springer –
Verlag, 2006. s. 1-42. ISBN 978-0-387-26364-9
19 Nariadenie (ES) č. 178/2002 Európskeho parlamentu a Rady z 28. Januára 2002.
20 PARK, Y. W. – HAENLEIN, G. F. W., 2006. Goat milk, its products and nutrition.
In Handbook of Food Products Manufacturing. New York : John Wiley & Sons,
2007. s. 447-486.
21 PARK, Y.W. – JUÁREZ, M. – RAMOS, M. – HAENLEIN, G.F.W. 2007.
Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. In Small Ruminant
Research, roč. 68, 2007, s. 88-113.
43
22 POPELKA, P. – HORSKÁ, D. – GOLIAN, J. – MARCINČAK, S. 2002. Detekcia
falšovania ovčieho mlieka a syrov pomocou enzýmovej imunoanalýzy (ELISA). In
Slovenský veterinársky časopis, roč. 3, 2002 s. 36-37. ISSN 1335-0099.
23 RAMOS, M. – JUAREZ, M. 2003. Sheep milk. In Encyclopedia of Dairy Sciences,
vol. 4. Amsterdam : Academic Press, 2003 s. 2539-2545. ISBN 0-12-227239-0.
24 RAYNAL–LJUTOVAC, K. – LAGRIFFOUL, G. – PACCARD, P. – GUILLET, I.
– CHILLIARD, Y. 2008. Composition of goat and sheep milk products: An update.
In Small Ruminant Research, roč. 79, 2008, č.1, s. 57-72.
25 RIGHETTI, P. G. 2004. Determination of the isoelectric point of proteins by
capillary isoelectric focusing. In Journal of Chromatography A, 2004, s. 491-499.
26 SANTOS, J. – FERNANDES, P. – BARDSLEY, R. 2003. Portuguese „PDO“
cheese and species origin of Milk. In Electronic Journal of Environmental,
Agricultural and Food Chemistry, roč. 2, 2003, s. 476-479. ISSN 1579-4377.
27 SAWYER, J. – WOOD, C. – SHANAHAN, D. – GOUT, S. 2003. Real-time PCR
for quantitative meat species testing. In Food Control, roč. 14, 2003, s. 549-583.
28 SHEN, L. – ROBBERECHT, H. – VAN DAEL, P. – DEELSTRA, H. 1995.
Estimation of the bioavailability of Zinc and Calcium fromhuman, cow’s, goat and
sheep milk by an in vitro method. In Biological Trace Element, roč . 49, 1995, s.
107-118.
29 SCHLIMME, E. – MARTIN, D. – MEISEL, H., 2000. Nucleosides and nucleotides:
natural bioactive substances in milk and colostrums. In British Journal of Nutrition,
roč. 84, 2000, č. 1, s. 59–68.
30 HALKEN, S. 2003. Early sensitisation and development of allergic airway
diseaserisk factors and predictors. In Paediatr. Respir. Rev. vol. 4 , 2003, no. 4, p.
128-134.
31 Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva
zdravotníctva Slovenskej republiky z 28. Apríla 2004 č. 1187/2004-100.
32 Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva
zdravotníctva Slovenskej republiky zo 14. Augusta 2006 č. 2143/2006-100.
33 WALCZYK, T. 2005. Iron Speciation in Biomedicine. In Handbook of Elemental
Speciation II - Species in the Environment, Food, Medicine and Occupational
Health. B. m. : John Wiley & Sons, 2005. s. 218-238. ISBN 978-0-470-85598-0.
44
34 YEUNG, J. 2006. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for detecting
allergens in foods. In Detecting Allergens in Food. B. m. : Woodhead Publishing,
2006. s. 109-124. ISBN 978-1-85573-728-0.
35 ZHAN, Y. – LEMMA, T. – MUSTEATA, M. F. – PAWLISZYN, J. 2009.
Development of a simple ampholyte-free isoelectric focusing slab electrophoresis
for protein fractionation. In Journal of Chromatography A, 2009, s. 2928-2933.
36 ZELEŇÁKOVÁ, Lucia – GOLIAN, Jozef – ZAJÁC, Peter 2010. Nové trendy
v detekcií falšovania mlieka a syrov . In Mléko a sýry 2010. Praha : Vysoká škola
chemicko-technologická v Praze, 2010, s. 161-167. ISBN 978-80-7080-760-6.
37 ZELEŇÁKOVÁ, L. – GOLIAN, J. 2008. Application of ELISA tests for detection
of milk and cheese adulteration. Monograph. In Slovak agricultural university in
Nitra. Nitra : Vydavateľstvo SPU, 2008. 98 p. ISBN 978-80-552-0075-0.
38 ZELEŇÁKOVÁ, L. – ŽIDEK, R. – ČANIGOVÁ, M. – PAULOV, J. –
GALLISOVÁ, T. 2010b. Evalution of Elisa method to detection of cow
β-laktoglobulin in sheep milk and sheep cheese. In Potravinárstvo [online], roč. 4,
2010, č. 4, s. 80-84 [cit. 2011-02-10]. Dostupné na :
<http://www.potravinarstvo.com/journal1/index.php/potravinarstvo/article/view/
78/81>. ISSN 1337-0960.
Internetové zdroje:
URL 1: http://laktoza.navajo.cz/ [cit. 2011-05-10]. Dostupné na:
<http://laktoza.navajo.cz/>.
URL 2: http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Chorismate5.html [cit. 2011-05-
08]. Dostupné na: <http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Chorismate5.html>.
45
46