NUOVE ANALISI DI COAGULAZIONE PER UNA MIGLIORE … · emofilia A (per la cui diagnosi è necessaria...

Scuola Superiore Medico Tecnica di Locarno

Formazione tecnico in analisi biomediche

NUOVE ANALISI DI COAGULAZIONE PER UNA

MIGLIORE DIAGNOSTICA DELLE COAGULOPATIE

Ramona Scolari

Responsabile Dr. Mauro Imperiali

Ospedale Regionale di Lugano

2012‐2013

Scolari Ramona TAB 3 2012‐2013

2

ABSTRACT

INTRODUZIONE

Negli ospedali dell’Ente Ospedaliero Cantonale

(EOC) per approfondirne la causa di un tempo

di protrombina (PT) patologico il clinico

richiedeva l’analisi dei singoli fattori della via

estrinseca che, assieme ai casi di sospetta

emofilia A (per la cui diagnosi è necessaria

l’analisi del fattore VIII), venivano inviati al

laboratorio Synlab di Savosa. Per ottenere più

rapidamente il risultato si è deciso d’introdurre

l’analisi dei fattori II, V, VII, VIII e X presso

l’Ospedale Regionale di Lugano (ORL).

MATERIALI E METODI

Sono stati analizzati venti campioni in plasma

citrato forniti dal laboratorio

dell’Universitätspital di Zurigo, i controlli di

qualità “normale” e “patologico” con due

controlli esterni sull’apparecchio CS2100i della

ditta Sysmex (distribuito in Svizzera dalla ditta

Siemens). Questi risultati sono stati confrontati

con quelli di Zurigo. Entrambi i laboratori usano

la stessa metodica.

RISULTATI

I CV intraserie ed interserie dei controlli di

qualità normale e patologico risultano inferiori

al 10 % ed i risultati dei controlli esterni

rientrano negli ambiti dichiarati dalla ditta.

Tramite l’analisi statistica eseguita con il

programma informatico Analyse‐it sono stati

analizzati i dati dei campioni mediante Altman‐

Bland e la regressione di Passing‐Bablok la

quale indica che i risultati dei due apparecchi

non hanno una differenza significativa.

CONCLUSIONE

Dopo i risultati ottenuti con l’analisi statistica

dal 15 marzo 2013 sono state introdotte le

analisi per i fattori II, V, VII, VIII e X presso

l’Ospedale Regionale di Lugano.

INTRODUCTION

In the hospitals of Ente Ospedaliero Cantonale

(EOC), in order to explore the cause of a

pathological prothrombin time (PT), the

clinician required the analysis of the individual

factors of the extrinsic pathway which along

with suspected haemophilia A (for which

diagnosis analysis of the factor VIII is needed)

were sent to the laboratory of Synlab in Savosa.

To reduce the time needed to get the result it

was decided to introduce an analysis of factors

II, V, VII, VIII and X at the Regional Hospital in

Lugano (ORL).

MATERIALS AND METHODS

Twenty samples of citrate plasma provided by

the laboratory of the university hospital of

Zurich, one "normal" and another

"pathological" quality control, with two

external controls, were analyzed using

apparatus from Sysmex CS2100i (distributed in

Switzerland by Siemens). These results were

compared with those of Zurich. Both

laboratories use the same methodology.

RESULTS

The CVs intraassay and interassay of normal

and pathological quality controls result lower

than 10% and external controls are in the

range. Through the statistical analysis

performed with the computer program

Analyze‐it was decided to analyze the sample

data obtained using the Altman‐Bland

regression and the Passing‐Bablok regression.

These show that the two machineries do not

have a significant difference in the

measurement.

CONCLUSION

After the results obtained with the statistical

analysis from March 15, 2013 analyzes for

factors II, V, VII, VIII and X have been

introduced at the Regional Hospital of Lugano

(ORL).

Ramona Scolari 2012‐2013

3

SOMMARIO

1. INTRODUZIONE .................................................................................................................................. 4

1.1 EMOSTASI ................................................................................................................................... 4

1.1.1 Emostasi primaria ...................................................................................................................... 4

1.1.2 La coagulazione plasmatica ....................................................................................................... 5

1.1.3 Fibrinolisi ................................................................................................................................... 5

1.2 VITAMINA K ................................................................................................................................ 5

1.3 FATTORI DELLA COAGULAZIONE ................................................................................................ 6

1.3.1 Via estrinseca/via comune ........................................................................................................ 6

1.3.2 Via intrinseca ............................................................................................................................. 8

1.4 OBIETTIVO .................................................................................................................................. 9

2. MATERIALI E METODI ....................................................................................................................... 10

2.1 PREANALITICA .......................................................................................................................... 10

2.2 ANALITICA ................................................................................................................................. 10

2.2.1 Tempo di protrombina ............................................................................................................ 10

2.2.2 Metodo per la determinazione dei fattori II, V, VII e X ........................................................... 10

2.2.3 Tempo di tromboplastina parziale attivata ............................................................................. 11

2.2.4 Metodo per la determinazione del F VIII ................................................................................ 11

3. RISULTATI ......................................................................................................................................... 12

3.1 CONTROLLI DI QUALITÀ INTRASERIE ........................................................................................ 12

3.2 CONTROLLI DI QUALITÀ INTERSERIE ........................................................................................ 13

3.3 CONTROLLO DI QUALITÀ ESTERNO .......................................................................................... 13

3.4 CAMPIONI ANALIZZATI ............................................................................................................. 14

4. DISCUSSIONE .................................................................................................................................... 21

5. CONCLUSIONE .................................................................................................................................. 23

6. RINGRAZIAMENTI ............................................................................................................................. 24

7. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA ............................................................................................................ 25

8. ALLEGATI .......................................................................................................................................... 26


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1. INTRODUZIONE

Con il termine emostasi s’intende il complesso processo fisiologico che interviene in caso di lesione dei

vasi sanguigni impedendo la fuoriuscita di sangue dagli stessi attraverso la formazione di un coagulo.

Un punto fondamentale che porta alla formazione di un coagulo stabile è la coagulazione plasmatica

che può essere valutata in laboratorio tramite diversi test come per esempio il tempo di protrombina

(Quick o TP) o il tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT). Grazie al TP si ha la possibilità di

valutare la via estrinseca della coagulazione.

Valori di riferimento: 70‐130 % (EOLAB)

Quick spontanei patologici, in assenza di terapia anticoagulante dichiarata, vanno ulteriormente

indagati per il potenziale pericolo di sanguinamento. A questo scopo, è di grande utilità l’analisi dei

fattori II, V, VII e X anche in urgenza.

Un altro test che permette di valutare la coagulazione plasmatica è l’aPTT, ossia la valutazione del

tempo di coagulazione della via intrinseca, in particolare del fattore VIII nel caso di sospetta emofilia A.

Valori di riferimento: < 35 secondi (EOLAB)

Attualmente presso i laboratori dell’Ente Ospedaliero Cantonale (EOLAB) però, la determinazione

singola di questi fattori viene fatta tramite un laboratorio esterno (Synlab a Savosa). Vista l’importanza

di queste analisi speciali, è utile poterle introdurre presso l’Ospedale Regionale di Lugano (ORL).

1.1 EMOSTASI

L’emostasi è un processo particolarmente articolato il cui scopo è di garantire il flusso sanguigno nei

vasi e di impedire la fuoriuscita di sangue in caso di lesione. Questo processo è reso possibile

dall’azione combinata di diversi fattori: vascolari, piastrinici, plasmatici e meccanismi regolatori che

modulano l’emostasi. Si può dividere in tre fasi:

1.1.1 Emostasi primaria

Nel momento in cui un vaso sanguigno viene leso (es. ferita, infiammazione, arteriosclerosi…) lo scopo

dell’emostasi primaria è di riparare la lesione e preparare il terreno per la coagulazione plasmatica. In

questo primo momento vengono coinvolti endotelio, subendotelio e trombociti.

L’attivazione dei trombociti si può suddividere in quattro fasi susseguenti:

contatto dei trombociti con il subendotelio;

adesione tramite il F VIII con il recettore GP I dei trombociti al subendotelio. I trombociti si

appiattiscono formando una prima barriera;

secrezione di ioni calcio, serotonina, ADP, trombossano (accelera la secrezione di ADP con

funzione aggregante), PGI2 (modula l’aggregazione), PGD2 (inibitrice dell’aggregazione);

aggregazione di diversi trombociti tramite il ricettore GP IIb/IIIa, ioni calcio e fibrinogeno. Viene

liberata ADP che attiva altri trombociti presenti nel sangue che formeranno pseudopodi e

parteciperanno alla risposta.


5

1.1.2 La coagulazione plasmatica

Cascata che comprende varie reazioni enzimatiche il cui

scopo è la trasformazione di fibrinogeno in fibrina.

Nel modello della coagulazione plasmatica in vitro

possiamo distinguere due vie d’attivazione tra di loro

interdipendenti.

VIA INTRINSECA: attivazione sulla superficie dei

trombociti attivati.

Sulla membrana dei trombociti è presente il fattore P3

(tromboplastina parziale) che crea sulla superficie una

carica elettrica negativa che attiva i fattori della via

intrinseca.

VIA ESTRINSECA: attivazione dalle cellule tessutali con

rilascio di tromboplastina che andrà ad attivare il F VII.

Entrambe le vie si congiungono nella via comune con l’attivazione del F X che, con l’aiuto dei F V e F

VIII, attivano il F II. Dopo di che si prosegue con la formazione di fibrina dal fibrinogeno.

1.1.3 Fibrinolisi

Parte dall’attivazione del plasminogeno che porta allo scioglimento della fibrina permettendo

l’apertura di vasi occlusi o impedendo la formazione di un trombo.

Questa fase dell’emostasi non viene approfondita ulteriormente poiché non è tema di questo lavoro di

diploma.

1.2 VITAMINA K

La vitamina K, come tutte le vitamine, deve essere assunta tramite la dieta. È una vitamina liposolubile

distinguibile in due forme:

vitamina K1: si trova nei vegetali verdi come spinaci o broccoli;

vitamina K2: prodotti dalla flora intestinale.

BIOCHIMICA E FISIOLOGIA

È necessaria al fegato per produrre i fattori II, VII, IX e X della coagulazione. Questi fattori sono dei

proenzimi di proteasi a serina che contengono acido ‐carbossiglutammico contenente due gruppi

carbossilici legati al ‐carbonio dell’acido glutammico. Questo legame è possibile con l’intervento della

vitamina K che permette alla carbossilasi di aggiungere un gruppo carbossilico all’estremità

glutammina del fattore. Il gruppo carbossilico permette poi il legame con ioni di calcio e alla

tromboplastina. Il fattore viene cosi attivato. In assenza di vitamina K non è più possibile legare il calcio

interferendo quindi con il normale funzionamento della coagulazione (in laboratorio troviamo un TP

allungato).

Figura 1: schema della coagulazione plasmatica


6

CARENZA DI VITAMINA K

La carenza di questa vitamina è rara nell’adulto poiché anche se non fosse possibile assumerla con la

dieta, la flora intestinale sarebbe in grado di produrla e sarebbe facilmente riassorbita nelle cellule.

Una carenza acquisita può avvenire in seguito, per esempio, ad un prolungato trattamento con

antibiotici. Essendo una vitamina liposolubile, in caso di malassorbimento dei grassi, si può avere una

carenza di vitamina K. Anche epatopatie possono portare ad una carenza di vitamina K. Nei casi di

epatopatie gravi e disturbi nella coagulazione l’analisi dei fattori II, V e VII possono aiutare nel

distinguere un problema epatico da un malassorbimento della vitamina stessa.

1.3 FATTORI DELLA COAGULAZIONE

1.3.1 Via estrinseca/via comune

1.3.1.1Tempodiprotrombina

In laboratorio viene eseguito di routine il TP per valutare la via estrinseca nelle seguenti situazioni:

nella fase preoperatoria;

per valutare la funzionalità epatica;

sospetta carenza di vitamina K;

per monitorare una terapia anticoagulante con inibitori della vitamina K;

nel caso di un deficit congenito o acquisito dei fattori II, V, VII e X.

L’organizzazione mondiale della sanità (OMS) nel 1983 ha deciso di introdurre il valore di INR per

confrontare i risultati dei pazienti con terapia anticoagulante monitorandone l’andamento. Viene

calcolata la ratio del tempo di protrombina (PR) dividendo il TP del plasma del paziente con il TP di un

pool di plasma normali. Perché le tromboplastine utilizzate per l’analisi del TP sono diverse nei vari

laboratori si è deciso di creare International Sensitivity Index (ISI) che permette di confrontare la

tromboplastina del laboratorio con quella standard di riferimento proposta dalla OMS. L’ISI della

tromboplastina ricombinante umana è molto vicino a 1. Ogni laboratorio per determinare l’ISI deve

comparare il suo lotto di reagente con un master lot calibrato in base alla tromboplastina di

riferimento. Si otterrà quindi un valore di INR tenendo conto del lotto e del metodo.

Tempi di protrombina prolungati possono essere causati da:

terapie anticoagulanti con antagonisti della vitamina K;

deficit di vitamina K;

epatopatie.

L’analisi dei fattori II, V, VII e X permette di comprendere se il risultato del TP patologico è causato da

un problema epatico, da un problema legato alla vitamina K (terapia anticoagulante, malnutrizione,

malassorbimento,…) o una combinazione dei due fattori. Infatti, la sintesi di questi fattori è legata ad

una produzione epatica, da un lato, e dalla presenza di vitamina K dall’altro (fattori II, VII e X). Sono

presenti in grande quantità nel plasma in forma inattiva.


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Tabella 1: caratteristiche principali dei fattori della via estrinseca

F II F V F VII F X

definizione proenzima

protrombina glicoproteina glicoproteina proenzima

forma attiva FIIa trombina FVa FVIIa FXa

coagulazione plasmatica Via comune Via comune Via estrinseca Via comune

cromosoma 11 1 13 13

peso molecolare 72000 Da 330000 Da 50000 Da 59000 Da

emivita 57 ore 13 ore 3‐5 ore 43 ore

prodotto fegato

fegato

trombociti fegato fegato

vitamina K dipendente dipendente dipendente

1.3.1.2FattoreII(FII)

La protrombina è un proenzima, dipendente dalla vitamina K e viene prodotta dal fegato. Una sua

diminuzione porta ad un aumentato rischio di sanguinamento.

DIMINUZIONE

Una carenza congenita isolata della protrombina è molto rara con una prevalenza di 1:1‐2’000’000.

Le cause di carenza acquisita sono epatopatie o carenza di vitamina K (anche nei casi di terapie

anticoagulanti con antagonisti della vitamina K).

AUMENTO

Un aumento della concentrazione della protrombina può essere un indicatore di rischio per

tromboembolie venose evidenziata in studi e osservazioni cliniche qui di seguito riportate:

in situazioni di aumento dell’emostasi primaria (es. dopo operazioni) o dopo emorragia;

nelle iperlipidemie di tipo IIa, IIb e V secondo la classificazione di Fredrickson;

nei casi di provette contenenti coaguli;

nei casi di pazienti con la variante della protrombina 20210 G>A che porta ad un maggior

rischio di trombosi familiare. Questa mutazione si trova in una regione che regola l’espressione

del gene che causa un’aumentata produzione della protrombina. La prevalenza nella

popolazione caucasica è del 2‐4%.

1.3.1.3FattoreV(FV)

Glicoproteina non dipendente dalla vitamina K sintetizzata nel fegato ed in parte nei trombociti.

DIMINUZIONE

Una carenza congenita è molto rara, mentre una carenza acquisita è più frequente.

La carenza congenita è molto rara in forma omozigote, mentre nella forma eterozigote è più frequente

La diminuzione del F V possiamo trovarla nelle epatopatie e quando viene consumato massicciamente

come nella coagulazione intravasale disseminata (DIC).

AUMENTO

L’aumento della concentrazione del F V si trova in varie situazioni cliniche:

dopo operazioni chirurgiche;


8

nelle coagulopatie, esclusivamente nella fase iniziale;

come artefatto nei prelievi in cui viene attivata involontariamente la coagulazione.

Un’anomalia importante del F V è la mutazione del fattore V Leiden che è causata per il 95% dei casi da

una mutazione puntiforme 1691 G>A nell’esone 10 (1q21‐25) che sostituisce l’arginina con la

glutammina. Questa mutazione autosomica dominante impedisce alla proteina C di inattivare il F V

poiché non riesce a riconoscere la glutammina. Questa mutazione aumenta il rischio di trombosi

giovanile familiare.

1.3.1.4FattoreVII(FVII)

Proenzima dipendente dalla vitamina K sintetizzato nel fegato.

DIMINUZIONE

Una carenza congenita in forma omozigote è rara, mentre in forma eterozigote risulta più frequente.

Una carenza acquisita e spesso associata con la diminuzione di altri fattori a causa della carenza di

vitamina K, oppure problemi epatici oppure ancora ad una terapia con antagonisti della vitamina K.

AUMENTO

Un aumento del F VII non ha probabilmente significato come fattore di rischio. Vi sono però alcuni

studi che mostrerebbero una leggera correlazione con lo sviluppo di malattie cardio‐vascolari.

1.3.1.5FattoreX(FX)

Proenzima dipendente dalla vitamina K sintetizzato dal fegato.

DIMINUZIONE

Una carenza congenita nella forma omozigote ha una prevalenza di 1:1’000’000, mentre nella forma

eterozigote è la causa più frequente di TP patologici (tenendo conto che rimane comunque rara).

AUMENTO

Aumenti del F X non sono fattori di rischio di rilevanza clinica.

1.3.2 Via intrinseca

1.3.2.1Tempoditromboplastinaparzialeattivata

Questo test serve per valutare la via intrinseca della coagulazione e viene eseguito quando:

si ricerca in casi di problemi di coagulazione congeniti o acquisiti (esempio per l’emofilia A o B);

valutazione della via intrinseca;

si sospetta la presenza di inibitori patologici;

monitoraggio della terapia con eparina.

Tempi di aPTT allungati possono indicare:

pericolo di emorragia;

pericolo di trombosi.


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1.3.2.2FattoreVIII(FVIII)

F VIII è una proteina della fase acuta prodotta dal fegato ed in parte dalle cellule endoteliali (possiamo

trovarlo anche in altri organi come ad esempio nella milza). È codificato sul cromosoma X e la sua

sequenza primaria per il 40% è simile a quella del F V. Per questo motivo entrambi i fattori hanno la

stessa funzione di accelerare la cascata enzimatica. Nel sangue il F VIII trasporta il fattore von‐

Willebrand (vWF). Se manca il vWF l’emivita del F VIII diminuisce da 10 a 2 ore. Con l’attivazione del

F VIII il vWF si stacca. In questo modo il sito di legame sul FVIII è libero di legarsi con i fosfolipidi. Viene

poi eliminato legato al recettore della lipoproteina a basso peso molecolare (LRP) dalla circolazione

sanguigna. La sua struttura può essere tagliata dalla proteina C, dalla plasmina o dai neutrofili.

Il F VIII ha diverse caratteristiche:

precipita a freddo con la conseguente separazione dal vWF;

è labile al calore;

aumenta in caso di somministrazione di adrenalina.

DIMINUZIONE

Diminuzioni del F VIII le possiamo riscontrare:

nella coagulazione intravasale disseminata (consumo del fattore);

dopo emorragie gravi;

dopo trasfusioni massicce;

emofilia A.

Mutazioni del gene che codifica per il F VIII sul cromosoma X può portare all’emofilia A. L’emofilia A è

una malattia legata al cromosoma X recessiva che porta ad una diminuzione dell’attività del F VIII.

Poiché la mutazione si trova sul cromosoma X di regola gli uomini sono ammalati mentre le donne ne

sono portatrici. A seconda della diminuzione dell’attività del fattore possiamo distinguere tre gradi di

gravità:

emofilia leggera: attività del F VIII >5‐40%;

media gravità: attività del F VIII 1‐5%;

grave: attività del FVIII <1%.

Questa mutazione porta come conseguenza un rischio maggiore di emorragia.

AUMENTO

Aumento del F VIII si trova nei seguenti casi:

prelievi in cui è attiva la coagulazione involontariamente;

in varie malattie acute o croniche in quanto proteina della fase acuta;

nei danni epatici (come le transaminasi);

nelle coagulopatie;

nelle patologie dei vasi sanguigni (es. nel diabete mellito).

Barthels, M. (s.d.). Das Gerinnungskompendium (2. Auflage). Thieme, 2012.

Labormedizin Diagnostiche Hämatologie Universitätsspital Basel. (s.d.). Die Hämostase‐einfach und verständlich.

Marie‐Christine Trzeciak, M.‐H. D. (s.d.). L'hémostase en question. Biomériuex 2004.

dispense ematologia TAB Dr. Scali 2010‐2011

1.4 OBIETTIVO

Introduzione dei fattori II, V, VII e X della coagulazione all’Ospedale Regionale di Lugano per meglio

esplorare la causa di un tempo di protrombina spontaneo patologico e del fattore VIII per meglio

supportare la diagnostica di emofilia A.


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2. MATERIALI E METODI

2.1 PREANALITICA

Per tutte le analisi di coagulazione viene scelto di usare come anticoagulante il citrato in quanto,

chelando i cationi bivalenti come il calcio, blocca l’attivazione della coagulazione.

Per questo lavoro sono stati raccolti 40 campioni di pazienti presso l’EOC i cui medici avevano richiesto

l’analisi di uno di questi fattori. Da questi pazienti è stata fatta un’aliquota di plasma citrato

centrifugato e conservato a ‐30°C (stabilità a temperatura ambiente 4 ore, ‐20°C 4 settimane, ‐70°C 6

mesi).

In seguito sono stati richiesti altri 20 campioni da un laboratorio di Zurigo. Anch’essi sono stati

conservati in aliquote di plasma citrato a ‐80°C. Per la validazione delle analisi di questi fattori sono

stati presi in considerazioni i campioni provenienti dal laboratorio di emostasi dell’ospedale

universitario di Zurigo perché la conservazione, il tempo intercorso tra il congelamento e l’analisi è

uguale per tutti i campioni. L’analisi viene eseguita su apparecchi diversi ma che usano gli stessi

reagenti utilizzati all’ORL.

2.2 ANALITICA

2.2.1 Tempo di protrombina

Al plasma citrato del paziente viene aggiungo il fattore III (tromboplastina tissutale) e ioni calcio.

L’apparecchio misura, in secondi, il tempo impiegato alla formazione del coagulo di fibrina. Il risultato

ottenuto viene convertito in percentuale assieme al valore di INR (rapporto internazionale

normalizzato).

2.2.2 Metodo per la determinazione dei fattori II, V, VII e X

REAGENTI (ditta Siemens)

Plasma carente del FII/V/VII/X

Dade®Innovin®

Dade® Tampone Veronal di Owren

Plasma umano standard

Plasma di controllo N

Plasma di controllo P

METODO

L’analisi dei quattro fattori II, V, VII e X viene eseguita con lo stesso metodo del TP. Viene eseguita una

misurazione del TP del plasma citrato del paziente combinato con del plasma carente del fattore di cui

vogliamo conoscere l’attività. Viene aggiunta della tromboplastina (Dade®Innovin®), incubato a 37°C e

poi viene aggiunto del cloruro di calcio. A questo momento l’apparecchio misura il tempo necessario

alla formazione del coagulo tramite un coagulometro a principio di misura ottico. Il risultato ottenuto

viene estrapolato da una curva di calibrazione eseguita con diluizioni di plasma umano standard.

L’apparecchio impiegato per analizzare i fattori in modo automatico è il CS2100i della ditta Sysmex. Nel

caso in cui il paziente avesse una carenza per il fattore in analisi otterremo un TP allungato poiché il

plasma carente non riesce a compensare quello del paziente.


11

2.2.3 Tempo di tromboplastina parziale attivata

Il plasma citrato del paziente viene incubato a 37°C con un reattivo Actin FS e viene poi aggiunto del

cloruro di calcio. Dopo di che si misura il tempo necessario alla formazione del coagulo.

2.2.4 Metodo per la determinazione del F VIII

REAGENTI (ditta Siemens)

Plasma carente del FX

Dade® Actin® FS

Soluzione di cloruro di calcio

Dade® Tampone Veronal di Owren

Plasma umano standard

Plasma di controllo N

Plasma di controllo P

METODO

In questa analisi viene aggiunto al plasma citrato del paziente del plasma carente per il FVIII, del

reattivo Actin FS, viene poi incubato a 37°C e poi si aggiunge cloruro di calcio. A questo momento viene

misurato il tempo impiegato dal plasma per formare il coagulo. L’apparecchio impiegato per analizzare

i fattori in modo automatico è il CS2100i della ditta Sysmex.


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3. RISULTATI

Nelle tabelle 2 e 3 sono stati riportati i valori della ditta per il controllo di qualità normale, ossia con

risultati che rientrano nei valori di riferimento, e quelli per il controllo di qualità patologico, ossia con

valori inferiori al 70%.

Tabella 2: valori della ditta per il controllo di qualità normale

F II F V F VII F VIII F X

range % 78‐118 78‐116 76‐114 79‐119 78‐116

target % 98 97 95 99 97

Tabella 3: valori della ditta per il controllo di qualità patologico


range % 25‐43 23‐39 29‐49 17‐29 28‐46

target % 34 31 39 23 37

Come prima analisi dei risultati ottenuti per i controlli di qualità è stato il calcolo del coefficiente di

variazione (CV) in percentuale. Il CV ci da l’informazione della precisione dell’analisi in esecuzione,

ossia la riproducibilità di un risultato utilizzando lo stesso campione misurato con gli stessi reagenti

sullo stesso apparecchio. Sono stati misurati i controlli di qualità normale e patologico varie volte di fila

lo stesso giorno ed in giorni diversi. Normalmente nelle analisi di chimica clinica si vuole ottenere un CV

attorno al 10%. Il CV viene calcolato dividendo la deviazione standard con la media e moltiplicando il

risultato per cento.

CV=(DS/media).100

La deviazione standard (DS) è calcolata come la radice quadrata della varianza, e ci dice quale è la

dispersione dei valori rispetto alla media.

Per tutti i cinque i fattori è stata calcolata l’accuratezza tramite la divisione della media con il valore

dichiarato, il tutto moltiplicato per cento.

3.1 CONTROLLI DI QUALITÀ INTRASERIE

Nelle seguenti tabelle sono riportati i valori misurati del controllo di qualità normale e quelli per il

controllo di qualità patologico intraserie eseguiti nello stesso giorno per dieci misurazioni consecutive

per tutti i cinque fattori.

Tabella 4: valori ottenuti per il controllo normale


media 105 96 92 95 93

DS 2.7 4.3 1.8 2.4 2.1

CV % 2.6 4.4 1.9 2.5 2.3

accuratezza 107 99 97 96 96


13

Tabella 5: valori ottenuti per il controllo patologico


media 36 26 42 20 39

DS 1.0 1.1 1 0.9 0.8

CV % 2.9 4.3 2.4 4.5 1.9

accuratezza 105 83 108 88 105

3.2 CONTROLLI DI QUALITÀ INTERSERIE

In queste due tabelle sono riportati i valori misurati per il controllo di qualità normale e per quello

patologico analizzati in giorni diversi con dieci misurazioni per i fattori II, V e VII. Per il fattore VIII sono

state eseguite nove misurazioni per il controllo normale e otto per il controllo patologico in giorni

diversi. Per il fattore X sono stati misurati sette volte sia il controllo normale che quello patologico in

giorni diversi.

Tabella 6: valori ottenuti per il controllo normale


media 99 95 91 91 94

DS 7.4 11.9 5 5.6 7.2

CV 7.5 12.5 5.5 6.2 7.7

accuratezza 101 98 96 92 96

Tabella 7: valori ottenuti per il controllo patologico


media 35 28 41 22 37

DS 1.8 3.2 2.7 1.6 2.9

CV % 5.1 11.4 6.5 7.1 8.1

accuratezza 104 90 104 95 100

3.3 CONTROLLO DI QUALITÀ ESTERNO

Per avere ulteriori campioni sono stati misurati anche due controlli di qualità esterni dai Ringversuch di

Instand ottenendo i risultati riportati nelle tabelle 8 e 9.

Tabella 8: valori del controllo esterno

CQ 61 target range risultato ORL

F II 23.5 17.50‐29.50 22.9

F V 81.5 65.5‐97.5 99.8

F VII 23.5 17.50‐29.50 21.2

F VIII 18 12‐24 16

F X 10 7.50‐12.50 8.8


14

Tabella 9: valori del controllo esterno

CQ 62 target range risultato ORL

F II 107 86‐128 115.2

F V 91 73.5‐108.5 106

F VII 108 90‐126 125.7

F VIII 88 72‐104 85.5

F X 101 85‐117 113.2

3.4 CAMPIONI ANALIZZATI

I venti campioni provenienti dal laboratorio di Zurigo sono stati conservati a ‐80°C per poi essere

analizzati in parallelo lo stesso giorno. I dati ottenuti per tutti e cinque i fattori sono stati analizzati per

vedere se la distribuzione fosse normale o meno con il programma statistico Analyse‐it.

La curva di Gauss viene utilizzata in statistica per valutare la distribuzione normale dei dati. Dalla curva

Gaussiana a campana sappiamo che il 68.3% dei dati si troverà nell’intervallo media ± DS, il 95,5%

nell’intervallo media ± 2 DS e il 99,7 % dei dati tra l’intervallo media ± 3 DS. Nei grafici riportati

possiamo notare che i dati ottenuti per i cinque fattori non sono perfettamente distribuiti come la

curva di Gauss e la causa è da implicare allo scarso numero di campioni analizzati.

Figura 2: distribuzione dei dati del F II rispetto alla curva di Gauss

Figura 3: distribuzione dei dati del F V rispetto alla curva di Gauss


15

La prima analisi che è stata scelta è quella di Altman‐Bland (AB). Questa analisi si basa non sui dati

originali ma sulle loro differenze e ci da un’informazione su una possibile presenza di un bias

(scostamento) tra i dati misurati nel laboratorio di Zurigo rispetto all’ORL. Ci indica anche il suo

intervallo di confidenza del 95% dello scostamento rispetto alla media (vedi tabella 10).

Sono qui di seguito riportati i due grafici del plot e del difference plot per ogni fattore che viene fatto

da Analyze‐it.


bias ‐0.53 ‐5.97 ‐3.67 ‐30.561 ‐9.69

95 % CI ‐5.08

4.02

‐13.58

1.4

‐7.05

‐0.29

‐54.081

‐7.04

‐14

‐5.39

Figura 4: distribuzione dei dati del F VII rispetto alla curva di Gauss

Figura 5: distribuzione dei dati del F VIII rispetto alla curva di Gauss

Figura 6: distribuzione dei dati del F X rispetto alla curva di Gauss

. Tabella 10: valore dello scostamento della media dato da Altman‐Bland


16

Nel grafico del plot sull’ascissa troviamo i dati misurati nel laboratorio di Zurigo, mentre sull’asse

dell’ordinata troviamo i dati misurati all’ORL. Sono distribuiti attorno ad una retta bisettrice (identity)

che mostra come dovrebbe essere la distribuzione dei dati in un confronto tra due laboratori i cui

apparecchi misurano uguale.

Assieme a questi grafici ci sono quelli che mostrano la differenza di misurazione tra i due laboratori

rispetto alla media per ogni fattore.

Figura 7: plot di AB per il F II Figura 8: difference plot di AB per il F II

Figura 9: plot di AB per il F V Figura 10: difference plot di AB per il F V

Figura 11: plot di AB per il F VII Figura 12: difference plot di AB per il F VII


17

Per tutti e cinque i fattori il metodo di BA ci mostra che mediamente il laboratorio ORL ottiene risultati

più bassi rispetto al laboratorio di Zurigo. Bisogna anche dire però che l’intervallo di confidenza

contiene sempre lo zero ed è quindi accetta l’ipotesi che i due apparecchi non hanno una differenza

significativa nella misurazione.

La seconda analisi scelta è quella di Passing‐Bablok (PB). Questo tipo di regressione non prende a

confronto i dati ottenuti ma assegna ad ogni valore un rango. Per non escludere che i nostri dati

rispetto a quelli del laboratorio di Zurigo siano uguali poniamo come ipotesi iniziale che l’intercetta sia

uguale a 0 e la pendenza sia uguale a 1 ottenendo una retta di regressione x=y. Per valutare se le

ipotesi sono confermate si devono guardare gli intervalli di confidenza al 95% che ci danno tutte le

possibili rette per i dati in analisi. Gli intervalli per l’intercetta devono contenere lo 0 e quelli per la

pendenza 1.

Nel grafico della Passing‐Bablok possiamo vedere sull’asse dell’ascissa i valori ottenuti al laboratorio di

Zurigo, mentre sull’asse dell’ordinata si trovano quelli misurati all’ORL. La bisettrice (identity) mostra la

retta nel caso in cui i due apparecchi misurano perfettamente nello stesso modo. La retta di colore blu

è quella dei dati ottenuti che assieme agli intervalli di confidenza (rette tratteggiate) possono essere

comparate con la bisettrice.

Tabella 11: valori ottenuti con la PB per il FII

FII INTERCETTA PENDENZA

PB 8.97 (‐4.90‐28.32) 0.91 (0.72‐1.09)

Figura 13: plot di AB per il F VIII Figura 14: difference plot di AB per il F VIII

Figura 15: plot di AB per il F X Figura 16: difference plot di AB per il F X


18

Tabella 12: valori ottenuti con la PB per il FV

FV INTERCETTA PENDENZA

PB ‐12.82(‐42.56‐8.37) 1.07(0.83‐1.38)

Tabella 13: valori ottenuti con la PB per il FVII

FVII INTERCETTA PENDENZA

PB 0.72 (‐3.10‐5.03) 0.94(0.85‐1.02)

Figura 17: grafico con PB per il F II

Figura 18: grafico con PB per il F V

Figura 19: grafico con la PB per il F VII


19

F VIII INTERCETTA PENDENZA

PB ‐2.49 (‐14.29‐8.85) 0.86 (0.73‐0.98)

Tabella 15: valori ottenuti con la PB per il FX

FX INTERCETTA PENDENZA

PB 0.82 (‐7.47‐6.28) 0.83 (0.76‐0.98)

Secondo l’analisi statistica di PB per tutti e cinque i fattori non possiamo quindi escludere che i risultati

ottenuti dall’apparecchio dell’ORL confrontati con quelli ottenuti nel laboratorio di Zurigo siano uguali.

Per quanto riguarda l’analisi statistica il metodo utilizzato non è l’unica possibilità in quanto i dati

possono essere analizzati in altri modi. In un’altra statisica utile è quella dei box‐plot, anche chiamati

grafico a scatola. Questo tipo di grafici è utile per verificare la presenza di outliers nei dati. Tramite

questa analisi viene messa in evidenza degli outliers per il F II e il F VIII.

Figura 21: grafico con la PB per il F X

Tabella 14: valori ottenuti con la PB per il F VIII

Figura 20: grafico con la PB per il F VIII

Figura 22: box‐plot per il F II


20

Per il F II; V; VII non ci sono outliers.

Figura 23: box‐plot per il F VIII

Figura 24: box‐plot per il F V

Figura 25: box‐plot per il F VII

Figura 26: box‐plot per il F X

Ramona Scolari 2012‐2013

21

4. DISCUSSIONE

I campioni raccolti nei laboratori di EOLAB sono stati scartati poiché dal momento del prelievo

all’analisi il tempo trascorso varia molto da campione a campione e la stabilità per le analisi di

coagulazione è molto limitata e vanno rispettate alla lettera le condizioni di conservazione. Per questo

motivo i risultati di questi campioni non sono stati presi in considerazione poiché c’è il rischio di avere

dei risultati non riproducibili ed accurati. Importante ricordare che i campioni analizzati sono solo venti

e per questo motivo sarebbe stato meglio raccoglierne ulteriori ma per vari motivi come la necessità di

validare queste analisi, la quantità a disposizione dei reattivi e il buon andamento dei controlli di

qualità è stato deciso di introdurla. Uno scostamento del 10% può essere ricondotto a un problema di

pre‐analitica e di analitica. Il confronto viene comunque accettato in quanto discusso con un

ematologo e ritenuto non rilevante clinicamente. Inoltre i controlli di qualità sono nel range di

accettabilità (esterni). Si è dunque deciso di accettare la differenza che verrà meglio paragonata con i

futuri controlli di qualità.

F II

I CV intraserie ed interserie sia del controllo normale sia di quello patologico per il FII sono accettabili

perché inferiore al 10 %.

I valori misurati del controllo esterno rientrano negli ambiti.

I campioni analizzati hanno una distribuzione dei valori simile alla curva di Gauss. Si è deciso di

procedere con un’analisi statistica di BA e la PB. Lo scostamento dell’analisi di BA tra i valori misurati

all’ORL rispetto al laboratorio di Zurigo mostra che l’apparecchio misura leggermente meno. Questa

differenza potrebbe essere riconducibile ad un problema pre‐analitico come per esempio la

preparazione del campione alla spedizione. Inoltre, anche se i reattivi sono gli stessi, l’apparecchio per

la misurazione dei fattori è diverso. La seconda analisi statistica è quella di PB mostra che sia gli

intervalli di confidenza dell’intercetta sia quelli della pendenza contengono l’ipotesi iniziale 0 e

rispettivamente 1. Ciò sta ad indicare che non possiamo escludere che i due apparecchi a confronto

misurano uguale.

F VII

CV intraserie dei controlli patologico e normale sono inferiori al 10% . I CV interserie di entrambi i

controlli sono superiori al 10% ma sono stati ritenuti accettabili poiché sia i controlli esterni sia i

controlli intraserie vanno bene. I controlli esterni vanno bene perché rientrano negli ambiti. Si è deciso

di procedere con un’analisi statistica di BA e la PB. Lo scostamento dell’analisi di BA tra i valori misurati

all’ORL rispetto al laboratorio di Zurigo mostra che l’apparecchio misura leggermente meno. Questa

differenza potrebbe essere riconducibile ad un problema pre‐analitico come per esempio la

preparazione del campione alla spedizione. Inoltre, anche se i reattivi sono gli stessi, l’apparecchio per

la misurazione dei fattori è diverso. La seconda analisi statistica di PB mostra che sia gli intervalli di

confidenza dell’intercetta sia quelli della pendenza contengono l’ipotesi iniziale 0 e rispettivamente 1.

Ciò sta ad indicare che non possiamo escludere che i due apparecchi a confronto misurano uguale.

F VII

I CV intraserie e interserie dei controlli patologico e normale sono inferiori al 10.

I controlli di qualità esterni rientrano negli ambiti.


22

Si è deciso di procedere con un’analisi statistica di BA e PB. Lo scostamento tra i valori misurati all’ORL

rispetto al laboratorio di Zurigo mostra che l’apparecchio misura leggermente meno. Questa differenza

potrebbe essere riconducibile ad un problema pre‐analitico come per esempio la preparazione del

campione alla spedizione. . Inoltre, anche se i reattivi sono gli stessi, l’apparecchio per la misurazione

dei fattori è diverso. La seconda analisi statistica e quella di PB mostra che sia gli intervalli di confidenza

dell’intercetta sia quelli della pendenza contengono l’ipotesi iniziale 0 e rispettivamente 1. Ciò sta ad

indicare che non possiamo escludere che i due apparecchi a confronto misurano uguale.

F VIII

I CV intraserie dei controlli patologico e normale sono inferiori al 10%. Sono ritenuti accettabili. I CV

interserie sono inferiori al 10% e sono quindi accettabili. Controlli esterni rientrano nei valori bersaglio.

Si è però deciso di procedere con un’analisi statistica di BA e PB. Lo scostamento dell’analisi di BA tra i

valori misurati all’ORL rispetto al laboratorio di Zurigo mostra che l’apparecchio misura leggermente

meno. Questa differenza potrebbe essere riconducibile a un problema pre‐analitico come per esempio

la preparazione del campione alla spedizione. Inoltre, anche se i reattivi sono gli stessi, l’apparecchio

per la misurazione dei fattori è diverso. La seconda analisi statistica è quella di PB mostra che sia gli



misurano uguale.

F VIII laboratorio Zurigo ORL 1:3 1:9

Campione 6 % 186 94.2 129.9 115.2

Campione 10 % 358 147.1 187.8 437.4

La probabile causa di questi risultati è la curva di calibrazione il cui ultimo punto arriva a 124.5%.

Tenendo conto che nel grafico abbiamo sull’asse della x il logaritmo e sull’asse delle y i secondi

misurati, questi due valori presentano dei risultati fuori dalla curva di calibrazione e danno dei risultati

molto inferiori rispetto al valore vero rimanendo comunque nei valori di riferimento. I campioni diluiti

invece danno un risultato più vicino a quello del laboratorio di Zurigo, rientrando nel range di

misurazione dell’apparecchio. Per il clinico è molto importante che il valore che validiamo sia il più

possibile preciso ed accurato in particolare modo quando l’attività del fattore è inferiore al 70 %

perché sotto questo valore anche delle differenze minime cambiano molto l’approccio terapeutico del

paziente.

F X

I CV intraserie dei controlli patologico e normale sono inferiori al 10%. I CV interserie dei due controlli

sono inferiori al 10% e sono ritenuti accettabili.

Si è deciso di procedere con un’analisi statistica di BA. Lo scostamento (bias) tra i valori misurati all’ORL

rispetto al laboratorio di Zurigo mostra che misura leggermente meno. L’analisi di PB mostra che sia gli



misurano uguale.

Tabella 15: valori anomali ottenuti per il F VIII


23

5. CONCLUSIONE

Il primo obiettivo di questo lavoro di diploma era di introdurre l’analisi dei F II, V e VII presso l’ORL per

gennaio 2013 ma la difficile raccolta di campioni ha ritardato la loro validazione. L’obiettivo è stato

postposto di un paio di mesi ed è stato deciso di ampliarlo aggiungendo l’analisi del F X e il F VIII per la

diagnostica dell’emofilia A.

È stata effettuata una prima raccolta di aliquote di campioni di plasma citrato di pazienti i cui medici

avevano richiesto uno dei cinque fattori. In totale sono stati raccolti 40 campioni in tutti gli ospedali

dell’EOC e dovevano essere conservati a ‐80°C. Sono stati analizzati tutti assieme lo stesso giorno

sull’apparecchio CS2100i dopo aver effettuato le calibrazioni necessarie per ogni fattore e i controlli

normale e patologico. Dopo aver fatto un primo confronto tra i dati ottenuti presso l’ORL e quelli del

laboratorio Synlab è stato deciso di richiedere altri campioni al laboratorio dell’Universitätspital di

Zurigo ottenendo dei campioni raccolti tutti assieme, conservati alla stessa temperatura e per la stessa

durata. La prima raccolta è stata quindi esclusa dell’analisi statistica. Dal laboratorio di Zurigo sono

arrivati 20 campioni di plasma citrato per i F II, V, VII e X e altri 20 campioni di plasma citrato per il F VIII

tutti conservati a ‐80°C. L’analisi statistica dei fattori ha mostrato che l’apparecchio dell’ORL misura

meno per tutti i cinque fattori rispetto a quello dell’apparecchio del laboratorio di Zurigo. La causa di

questa differenza la si può ricercare nella difficile pre‐analitica per le analisi di coagulazione. Non si può

escludere che ci siano delle differenze significative nella misura dell’attività dei cinque fattori tra i due

apparecchi. I box plot per il F II e il F VIII mostrano degli outliers riconducibili ai problemi di pre‐

analitica. Era possibile analizzare l’omoschedasticità dei dati tramite il test di Levene ma visto che la

validazione è stata fatta utilizzando la regressione di AB e quella di PB (analisi statistiche utilizzate

presso l’EOC) si è deciso di non aggiungere ulteriori analisi statistiche.

I risultati dei controlli normale, patologico e esterni sono risultati nei valori di riferimento e negli ambiti

predefiniti.

Da lunedì 15 marzo 2013 le analisi dei fattori II, V, VII, VIII e X sono state introdotte all’ORL.

I valori di riferimento per i fattori sono stati ripresi da quelli usati nel laboratorio di Zurigo visto che i

risultati dei campioni sono stati confrontati con questo laboratorio e i reagenti utilizzati sono gli stessi.

Tutti i fattori, tranne il F X, si possono eseguire anche in urgenza su richiesta medica.

Tabella 16: valori di riferimento dei fattori e loro frequenza

FATTORE RANGE % FREQUENZA

F II 60‐150 Lunedi – venerdì

F V 50‐150 Lunedì – venerdì

F VII 60‐150 Lunedì – venerdì

F VIII 50‐200 Martedi e giovedì

F X 60‐150 Martedì e giovedì


24

6. RINGRAZIAMENTI

Desidero ringraziare tutte le persone che mi hanno aiutato a svolgere questo lavoro di diploma, in

particolare:

Dr. Mauro Imperiali per la stesura del lavoro e l’aiuto nell’analisi statistica;

Elia Cattani per il prezioso aiuto nella parte pratica;

Il laboratorio dell’ORL ed in particolare il capo laboratorio Giorgio Dal Bò per avermi messo a

disposizione l’apparecchio e per la raccolta dei campioni;

Il laboratorio dell’Universitätsspital di Zurigo per aver fornito i campioni, i loro risultati e le

informazioni sulla metodica da loro usata;

tutti i laboratori dell’EOC per la raccolta dei campioni;

i docenti Andrea Boffini, Mauro Gola e Sonja Marci per gli insegnamenti di metodologia;

Dr. Phil, II Giovanni Togni per le correzioni del lavoro di diploma.


25

7. BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA

Barthels, M. (s.d.). Das Gerinnungskompendium (2. Auflage). Thieme, 2012.

Labormedizin Diagnostiche Hämatologie Universitätsspital Basel. (s.d.). Die Hämostase‐einfach und

verständlich.

Marie‐Christine Trzeciak, M.‐H. D. (s.d.). L'hémostase en question. Biomériuex 2004.

Dipartimento di medicina di laboratorio EOC, D‐08‐002/H, controlli di qualità, 17.12.2012

Dipartimento di medicina di laboratorio EOC, D‐10‐303/D, tempo di protrombina, 05.09.2011

Dipartimento di medicina di laboratorio EOC, D10‐305/E, tempo di tromboplastina parziale attivata,

18.08.2011

dispense ematologia TAB Dr. Scali 2010‐2011

dispense di statistica TAB Dr. Balerna 2013

dispense introduzione statistica Dr. Togni 2012‐2013

Emostasi e test di laboratorio, consultato l’ultima volta il 05.05.2013

http://www.msd‐italia.it/altre/manuale/sez11/1310973.html

Tempo di protrombina, consultato l’ultima volta il 05.05.2013

http://www.coaguchek.com/it/index.php?target=/it/patients/info_point/faq/0


26

8. ALLEGATI

Tabella 17: controllo normale intraserie


risultati 100.4 101.8 93.4 99 97.4

104.1 97.8 93.4 97.1 93.6

106.8 94 91.1 96.1 92.5

106.8 95.9 90 94.2 93.6

100.4 103.9 94.5 90.6 92.5

105.4 94 94.5 90.6 90.2

102.9 95.9 90 93.3 92.5

108.1 95.9 90 97.1 92.5

105.4 94 92.2 96.1 94.8

106.8 88.7 91.1 95.2 90.2

Totale misurazioni 10 10 10 10 10

Tabella 18: controllo patologico intraserie

F II F V F VII F VIII FX

risultati 36.1 22.8 42.8 19.7 39.9

37.5 25.6 41.6 19.9 37.9

34.7 25.9 42.2 20.5 38.1

37.1 26.8 42.5 19.7 38.4

35 26.5 41.9 22.7 38.7

35.8 26.2 42.8 20 38.1

34.5 25.6 39.7 20.4 38.7

35.6 25.3 41.9 20 39.9

35.8 26.2 41.1 20.7 39

34.5 25.3 43.1 19.7 37.9


Tabella 19: controllo normale interserie


risultati 106.8 110.4 96.9 95.2 97.4

106.8 94 91.1 91.5 98.9

93.7 94 91.1 99 100.3

86.6 79.2 84.7 85.5 85.9

89.7 79.2 83.1 95.2 84.9

100.4 103.9 96.9 85.5 86.9

102.9 101.8 96 81.4 100.3


27

99.2 99.8 94.4 92.4

93.7 80.7 86.9 91.5

106.8 108.2 90


Tabella 20: controllo patologico interserie

FII FV FVII FVIII FX

risultati 37.3 30.3 44.4 22.7 39.3

34.5 25.3 43.1 24.2 39.9

34.8 27.1 39.4 19.7 39.3

31.5 26.5 37.6 22.5 33.4

33.4 22.5 37.1 19.7 32.5

35.9 29.9 44.4 21.8 36.3

34.7 31.8 41 21.3 37.6

36.1 28.8 40.6 22.7

36.3 24.1 38.4

37.3 31.4 41.3


NUOVE ANALISI DI COAGULAZIONE PER UNA MIGLIORE … · emofilia A (per la cui diagnosi è necessaria...

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