Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
Transcript of Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 1/24
CHƯƠ NG 2:
ĐẠI CƯƠ NG VỀ MÔI TRƯỜ NG DINH DƯỠ NG – GENERAL
ABOUT NUTRITIONAL MEDIUMMôi trườ ng là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưở ng và phát triển của mô tế
bào, là nguồn cung cấp các dưỡ ng chất cần thiết nhằm duy trì sự sống, sinh trưở ng
và phát triển của tế bào trong quá trình nuôi cấy. Sở d ĩ Haberlandt, ngườ i đầu tiên
đề xướ ng phươ ng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật (1902), không thành công
trong các thí nghiệm của mình vì lúc bấy giờ những hiểu biết về nhu cầu dinh
dưỡ ng khoáng của tế bào thực vật còn hạn chế và đặc biệt là vai trò của các chất
điều khiển sinh trưở ng đối vớ i quá trình phân chia và phân hóa của tế bào còn chưa
đượ c biết đầy đủ. Đến nay, theo thống kê các k ết quả nghiên cứu thì hầu hết các
môi trườ ng dinh dưỡ ng nhân tạo đượ c sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật
đều bao gồm những thành phần sau:
2.1. Các nguyên tố muối khoáng (mineral element)
Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác nhau cần thiết cho đờ i sống thực
vật đượ c cung cấp dướ i dạng đa lượ ng và vi lượ ng. Các nguyên tố đa lượ ng là các
nguyên tố đượ c sử dụng ở nồng độ lớ n hơ n 0,5 mmol/L, còn các nguyên tố vi
lượ ng là các nguyên tố đượ c sử dụng ở nồng độ nhỏ hơ n 0,05 mmol/L. Khi các
muối khoáng đượ c hòa tan trong nướ c, chúng trải qua quá trình phân ly
(dissociation) và ion hóa (ionisation). Trong môi trườ ng dinh dưỡ ng, một loại ion
có thể đượ c tạo ra bở i một hoặc nhiều loại muối khác nhau. Ví dụ: trong môi
trườ ng MS, ion đượ c k ết hợ p bở i KNO3 và NH4NO3, ion K+ bở i KNO3 và
KH2PO4. Do đó, đây là điều quan trọng để so sánh các môi trườ ng khác nhau bằng
cách đánh giá nồng độ tổng số của các ion hiện diện trong chúng nhằm có đượ c
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 2/24
một ý tưở ng về sự thích hợ p của môi trườ ng cho các mô hoặc các hệ thống nuôi
cấy đặc biệt.
2.1.1. Các nguyên tố đa lượ ng
Các chất dinh dưỡ ng đa lượ ng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N),
phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn
tại dướ i dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trườ ng dinh dưỡ ng khác
nhau. Tất cả các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưở ng của mô và tế bào
thực vật. Môi trườ ng nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium.
Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi
trườ ng dướ i cả 2 dạng nitrate và ammonium (2-20 mmol/L) là tốt hơ n cả. Trong
trườ ng hợ p chỉ dùng ammonium, thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch
vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như:
citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưở ng độc do nồng độ của
ammonium vượ t quá 8 mmol/L trong môi trườ ng đượ c giảm bớ t. Khi các ion
nitrate và cùng hiện diện trong môi trườ ng nuôi cấy, thì ion ammonium đượ c sử
dụng nhanh hơ n. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thườ ng
dùng trong khoảng 1-3 mmol/L.
2.1.2. Các nguyên tố vi lượ ng
Các nguyên tố vô cơ cần một lượ ng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh
trưở ng của mô và tế bào thực vật đượ c gọi là các nguyên tố vi lượ ng (nồng độ sử
dụng nhỏ hơ n 0,05 mmol/L). Đó là các ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn),
boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo). Fe dườ ng như thích hợ p hơ n khi
đượ c cung cấp dướ i dạng chelate Fe, và Zn đượ c dùng bình thườ ng trong các môi
trườ ng nuôi cấy. Các dạng muối tatrate và citrate Fe khó hòa tan và thườ ng hay k ết
tủa trong môi trườ ng. Vấn đề này có thể khắc phục bằng cách dùng
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 3/24
diaminetetraacetic acid (EDTA)-chelate Fe thay cho citrate Fe, đặc biệt đối vớ i quá
trình tạo phôi. Tuy nhiên, các dạng chelate EDTA không hoàn toàn ổn định trong
môi trườ ng nuôi cấy dạng lỏng.
Một số môi trườ ng nuôi cấy đượ c làm giàu bằng cobalt (Co), iodine (I) và
sodium (Na), nhưng các yêu cầu nghiêm ngặt về các nguyên tố này cho sinh
trưở ng của tế bào đã không đượ c thiết lập. Nói chung, nồng độ thườ ng đượ c sử
dụng đối vớ i Cu và Co là 0,1 µmol/L, Fe và Mo là 1 µmol/L, I là 5 µmol/L, Zn là
5-30 µmol/L, Mn là 20-90 µmol/L và B là 2-5100 µmol/L đượ c bổ sung vào môi
trườ ng nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm.
Nhu cầu của cây đối vớ i nguyên tố vi lượ ng là rất thấp. Do vậy những
nguyên tố này cũng có mặt trong môi trườ ng ở các nồng độ tươ ng ứng. Hầu hết các
nguyên tố vi lượ ng sử dụng ở lượ ng nmol. Một số nguyên tố vi lượ ng có nhu cầu
nhỏ hơ n có thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu nhiên của chúng trong các
thành phần của môi trườ ng như agar, các chất bổ sung như nướ c dừa, dịch chiết
nấm men (yeast extract), các muối và nướ c. Tầm quan trọng của một số nguyên tố
vi lượ ng trong thành phần môi trườ ng còn chưa đượ c hiểu một cách rõ ràng. Co,
Al, Ni... có thể có lợ i đối vớ i thực vật nhưng cũng có thể là không cần thiết. Trong
thực tế, hầu hết các nguyên tố vi lượ ng chỉ có phần khoáng của muối (cation) là
quan trọng, còn vai trò các anion có thể là không cần thiết
2.2. Nguồn cacbon (Cacbon source)
Do cấu trúc không hoàn chỉnh như cá thể thực vật trong tự nhiên nên hầu hết
các mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phươ ng thức dị
dưỡ ng, mặc dù ở nhiều trườ ng hợ p chúng có thể sống bán dị dưỡ ng nhờ điều kiện
ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợ p. Vì vậy, việc đưa vào môi
trườ ng nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc để cung cấp năng lượ ng.
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 4/24
Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dướ i các điều kiện
đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡ ng carbon. Việc bổ sung
nguồn carbon bên ngoài vào môi trườ ng làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các
chồi xanh.
Nguồn carbon thông dụng nhất đã đượ c kiểm chứng là sucrose, nồng độ
thích hợ p phổ biến là 2-5%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà
thay đổi có khi giảm xuống tớ i 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm
ứng stress nướ c). Sự thủy phân từng phần sucrose xuất hiện khi môi trườ ng đượ c
khử trùng. Các tế bào và mô nuôi cấy đã sinh trưở ng trên môi trườ ng có sucrose
đượ c khử trùng bằng autoclave tốt hơ n trên môi trườ ng có sucrose đượ c khử trùng
bằng màng lọc (filter). Điều này cho thấy các tế bào thích hợ p vớ i nguồn dự trữ có
sẳn của glucose và fructose do thủy phân sucrose khi khử trùng bằng autoclave.
Glucose cũng thườ ng đượ c bổ sung vào môi trườ ng nuôi cấy và cho
hiệu quả tươ ng đươ ng sucrose (glucose thườ ng dùng cho nuôi cấy
protoplast), còn fructose cho hiệu quả kém hơ n. Sucrose, trong khi khử trùng
môi trườ ng, bị biến đổi thành glucose và fructose. Trong quá trình sống cảu
tế bào, đầu tiên glucose sẽ đượ c sử dụng và sau đó là fructose. Các
carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,
melibiose và trehalose cũng đã đượ c thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả
và chỉ đượ c dùng trong những trườ ng hợ p đặc biệt.
Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể
dùng cho nuôi cấy, tuy nhiên những loại tế bào đượ c nuôi trên môi trườ ng có
chứa một trong các polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng
thủy phân thông qua các enzyme chẳng hạn như amylase. Trong thực tế, có
những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trườ ng chứa tinh bột khá
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 5/24
nhiều amylase. Chuyển chúng lên môi trườ ng chỉ chứa sucrose lượ ng
amylase thải ra sẽ giảm ngay.
Glycerin cũng có thể đượ c tế bào sử dụng. Mannitol hoặc sorbitol hoàn
toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng đượ c
sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast vớ i chức
năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu, hoặc tươ ng tự sucrose chúng cũng
đượ c dùng để cảm ứng stress nướ c. Các loại rượ u như ethanol, methanol ít
hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc.
Acid hữu cơ thườ ng không phải là nguồn carbon thích hợ p cho tế bàonuôi cấy. Thí nghiệm vớ i các acid: folic, succinic, pyruvic và keto-glutaric
chỉ đạt 15% sinh trưở ng so vớ i sucrose.
2.3. Các vitamin (vitamines)
Thực vật tự tổng hợ p các vitamin và chúng đượ c sử dụng như những
chất xúc tác trong các quá trình trao đổi chất khác nhau. Khi các tế bào và mô
thực vật sinh trưở ng trong điều kiện in vitro, một số vitamin không thể thay
thế đượ c tổng hợ p nhưng thườ ng không đủ về lượ ng, do đó phải bổ sung
thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B (B1, B2, B6).
2.3.1 Vitamin B1 (Thiamin)
Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưở ng của tất cả
các tế bào. Thiamin thườ ng đượ c sử dụng vớ i nồng độ biến thiên từ 0,1-10
mg/l. Là một chất bổ sung rất cần cho môi trườ ng nuôi cấy. Khi khử trùng
bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1 bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol
là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợ p lại
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 6/24
chúng thành phân tử vit B1. Vì vậy có thể khử trùng môi trườ ng chứa vit B1
bằng autoclauve.
2.3.2. Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin)
Có thể khử trùng bằng nhiệt, nhưng lại dễ bị ánh sáng phân huỷ. Đối vớ i
nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng đối vớ i nuôi cấy trong tối có
thể tăng lên 10-50 ppm.
2.3.3. Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin)
Pyridoxine thườ ng đượ c bổ sung vào môi trườ ng nuôi cấy nhưng cũng
không cần thiết cho sự tăng trưở ng của tế bào nhiều loài thực vật. Là tiền chất
của pyridoxal-phosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và
transaminase. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau:
Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate
2.3.4. Myo-Inositol (Bios I)
Mặc dù đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó đã đượ c
chứng minh có tác dụng kích thích cho sự tăng trưở ng của tế bào đa số loài
thực vật. Ngườ i ta cho rằng myo-inositol đượ c phân tách ra thành acid
ascorbic và peptine và đượ c đồng hóa thành phosphoinositide và
phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia và tổng hợ p
thành tế bào tế bào. Myo-inositol thườ ng đượ c sử dụng trong môi trườ ng nuôi
cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l. Inosit là chất bền vững
khi khử trùng. Myo-inositol thườ ng đượ c pha chung vớ i dung dịch mẹ của
vitamin. Khi phân tích thành phần của nướ c dừa ngườ i ta thấy sự có mặt của
phân tử inosit.
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 7/24
2.3.5. Biotin (Bios II)
Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô. Chỉ sử dụng ở nồng độ rất
thấp từ 0,001-0,01 ppm.
2.3.6. Acid pantothenic (Bios III, Vit B5)
Đượ c tế bào thực vật sử dụng trong thành phần của coenzyme A. Trong nuôi
cấy một số tế bào thì việc bổ sung vit B5 là không cần thiết.
2.3.7. Các vitamin khác
Nicotinic acid và pyridoxine thườ ng đượ c bổ sung vào môi trườ ng nuôi cấy
nhưng có thể thay thế bằng các vitamin khác cho sự sinh trưở ng của tế bào ở nhiều
loài. Các vitamin khác như folic acid, ascorbic acid, vitamin E (tocophenol), và ρ-
aminobenzoic acid cũng đượ c sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào, đặc biệt khi tế
bào sinh trưở ng ở mật độ quần thể rất thấp. Nói chung, các vitamin này đượ c bổ
sung trong khoảng 0,1-10,0 ppm.
2.4. Các chất hữ u cơ bổ sung (additional organics)
2.4.1. Các amino acid
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợ p tất cả các amino acid cần thiết
nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trườ ng nuôi cấy là để kích thích sự
tăng trưở ng của tế bào trong nuôi cấy protoplast và để hình thành các dòng tế
bào. Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trườ ng nuôi cấy
tế bào và nuôi cấy tế bào trần. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vậtnguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này
đượ c tế bào hấp thu nhanh hơ n nitrogen vô cơ .
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 8/24
Các nguồn nitrogen hữu cơ thườ ng sử dụng trong môi trườ ng nuôi cấy
tế bào thực vật là hỗn hợ p amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine,
L-asparagine và adenine. Khi amino acid đượ c cung cấp riêng rẽ thì cần phải
cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưở ng của tế bào. Một ví dụ về amino
acid trong môi trườ ng nuôi cấy làm tăng sự tăng trưở ng của tế bào là glysine
2 mg/l, glutamine đến 8 mM, asparagine 100 mg/l, L-arginine và cysteine 10
mg/l và L-tyrosine 100 mg/l. Tyrosine cũng đượ c sử dụng để kích thích sự
phát sinh hình thái trong nuôi cấy tế bào nhưng chỉ nên sử dụng trong môi
trườ ng có agar. Cung cấp adenine sulfate vào môi trườ ng nuôi cấy có thể kích
sự tăng trưở ng của tế bào nuôi cấy và kích thích mạnh sự tạo chồi.
Dựa vào những k ết quả phân tích các hỗn hợ p chất tự nhiên nói trên
nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợ p amino acid nhân tạo
để bổ sung vào môi trườ ng dinh dưỡ ng. Kết quả sử dụng các hỗn hợ p này còn
rất khác nhau, có thể do yêu cầu amino acid của từng loại tế bào là không
giống nhau. Trong môi trườ ng lỏng để nuôi callus lúa và môi trườ ng tái sinh
cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng
2.4.2. Các chất hữu cơ bổ sung có thành phần không xác định (undetermined)
a/ Nướ c dừ a
Công bố đầu tiên về sử dụng nướ c dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van
Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941,1942). Sau đó, tác dụng tích
cực của nướ c dừa trong môi trườ ng nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã đượ c
nhiều tác giả ghi nhận. Nướ c dừa đã đượ c xác định là rất giàu các hợ p chất
hữu cơ , chất khoáng và chất kích thích sinh trưở ng (George, 1993; George,
1996). Nướ c dừa đã đượ c sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 9/24
ở nhiều loài cây. Nướ c dừa thườ ng đượ c lấy từ quả của các giống và cây
chọn lọc để sử dụng tươ i hoặc sau bảo quản. Nướ c dừa đượ c một số công ty
hoá chất bán dướ i dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông thườ ng
nướ c dừa đượ c xử lý để loại trừ các protein, sau đó đượ c lọc qua màng lọc để
khử trùng trướ c khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nướ c dừa không gây
ảnh hưở ng đến sinh trưở ng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn tớ i
k ết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể đượ c lọc bỏ hoặc để
lắng dướ i đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn.
Phân tích thành phần của nướ c dừa từ non đến già cho thấy trong nướ c
dừa có:
- Amino acid tự do từ 190,5-685,0 ppm trong nướ c dừa từ non
đến già. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao còn lại khoảng 70 ppm.
- Amino acid trong protein.
- Acid hữu cơ .
- Đườ ng.
- RNA và DNA .
Ngoài ra, nướ c dừa còn chứa các hợ p chất quan trọng đối vớ i tế
bào nuôi phân lập như:
- myo-inositol.
- Các hợ p chất có hoạt tính auxin.
- Các cytokinin dạng glycoside.
Nướ c dừa thườ ng đượ c sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v).
b/ Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 10/24
Vớ i dịch nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua
trong ống nghiệm kéo dài vô thờ i hạn. Thành phần hóa học của dịch nấm men ít
đượ c chú ý phân tích. Chủ yếu chứa: đườ ng, nucleic acid, amino acid, vitamin,
auxin, muối khoáng. Tác dụng của YE vớ i rễ rất tốt nhưng vớ i callus thì không
rõ ràng.
c/ Bột chuối
Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh đượ c sử dụng trong
nuôi cấy mô một số cây trồng như phong lan, dứa. Hàm lượ ng sử dụng vào
khoảng 40g bột khô/l. Để tránh đóng cục, cần bổ sung bột vào dung dịch một
cách từ từ rồi khuấy đều. Nướ c chiết từ khoảng 100 g thịt quả chuối xanh
cũng đượ c sử dụng bổ sung vào môi trườ ng.
d/ Một số hỗn hợ p dinh dưỡ ng hữ u cơ phứ c tạp khác
Nướ c cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha,
casein thuỷ phân (casein hydrolysate, thườ ng đượ c sử dụng vớ i nồng độ 0,05-
0,1%) cũng đượ c sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan
nuôi cấy. Ảnh hưở ng rõ rệt của các hợ p chất này tùy thuộc vào đối tượ ng.
2.4.3. Than hoạt tính (active choral)
Than hoạt tính nói chung ảnh hưở ng trên 3 mặt: hút các hợ p chất độc,
hút các chất điều hòa sinh trưở ng hoặc tạo độ tối cho môi trườ ng. Ngườ i ta
cho rằng tác dụng cản sự tăng trưở ng của mô cấy khi có sự hiện diện của than
hoạt tính trong môi trườ ng là do nó hút chất điều hòa sinh trưở ng có trong
môi trườ ng. NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP liên k ết vớ i than hoạt tính. Khả
năng kích thích sự tăng trưở ng của than hoạt tính là do nó k ết hợ p vớ i các
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 11/24
hợ p chất phenol độc tiết ra trong thờ i gian nuôi cấy. Than hoạt tính thườ ng
đượ c bổ sung vào môi trườ ng vớ i nồng độ 0,5-3% (w/v). Bổ sung AC vào
môi trườ ng nuôi cấy đã kích thích sinh trưở ng và phân hóa ở các loài hoa lan,
cà rốt, dây thườ ng xuân và cà chua. Tuy nhiên, nó lại gây ức chế ở thuốc lá,
đậu tươ ng và các loài thuộc chi Camellia. Nói chung AC đượ c rửa acid và
trung hòa trướ c khi bổ sung vào môi trườ ng.
2.4.4. Chất làm rắn môi trườ ng (soliding)
Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel đượ c sử dụng phổ biến để chuẩn bị
các môi trườ ng nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid).Trong nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trườ ng và chết do
thiếu oxy. Các gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưở ng trong điều kiện t ĩ nh
(static conditions). Điều thuận lợ i khi làm việc vớ i các hợ p chất tạo gel nhân
tạo là chúng tạo ra các gel sạch ở các nồng độ tươ ng đối thấp (1,25-2,5 g/L)
và nó có thể giúp phát hiện sự nhiễm bẩn đượ c phát triển trong suốt thờ i gian
nuôi cấy. Các mẫu vật sinh trưở ng tốt hơ n trên agar hoặc các tác nhân tạo giá
thể khác phụ thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau.
Agar là một loại polysaccharide thu đượ c từ một số loài tảo (ngành tảo
đỏ-Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơ n các tác nhân tạo gel khác. Trướ c
tiên, gel của agar không phản ứng vớ i các thành phần của môi trườ ng. Thứ
hai, chúng không bị thủy phân bở i các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định
ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy đượ c tiến hành. Bình thườ ng, từ 0,5-1% agar
đượ c dùng trong môi trườ ng để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi
trườ ng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trong những nghiên cứu về dinh
dưỡ ng, việc sử dụng agar đượ c tránh bở i vì agar thươ ng phẩm không sạch do
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 12/24
có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy
nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể đượ c loại bỏ bằng cách rửa agar vớ i
nướ c cất hai lần ít nhất là 24 giờ , tráng trong cồn và làm khô ở 60oC trong 24
giờ . Nói chung, ở 80oC agar ngậm nướ c chuyển sang trạng thái sol và ở 40oC
trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nướ c của agar cao từ 6-12 g/L nướ c.
Gelatin ở nồng độ cao (8-10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn
chế sử dụng bở i vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC). Các hợ p chất khác
đã đượ c thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và gel-
rite. Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một loại agarose đượ c tinh
sạch cao gọi là Sea Plaque(k), loại này có thể đượ c dùng để phục hồi các
protoplast đơ n (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ
(perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge), bấc giấy lọc (filter
paper wick), bọt polyurethane (polyurethane foam) và xốp polyester
(polyester fleece) là các phươ ng thức thay đổi giá thể đượ c dùng trong môi
trườ ng nuôi cấy mô hoặc tế bào.
2.4.5. Các chất kháng sinh (antibiotics)
Bổ sung các kháng sinh vào môi trườ ng nuôi cấy nói chung thườ ng
đượ c tránh do sự hiện diện của chúng trong môi trườ ng làm chậm sinh trưở ng
của mô và tế bào. Tuy nhiên, một số tế bào thực vật bị nhiễm một cách hệ
Cellophane đục lỗ Gelatin thươ ng mại Agar thươ ng mại
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 13/24
thống các vi sinh vật. Để ngăn chặn sinh trưở ng của bọn vi sinh vật này, điều
không thể thay thế là làm giàu môi trườ ng bằng kháng sinh. Streptomycin
hoặc kanamycin ở nồng độ thấp kiểm soát hiệu quả hiện tượ ng nhiễm có tính
hệ thống và môi trườ ng đượ c bổ sung các kháng sinh này không gây bất lợ i
cho sự sinh trưở ng của tế bào nuôi cấy.
2.5. Các chất điều khiển sinh trưở ng thự c vật (Plant growth regular)
Trong môi trườ ng nuôi cấy mô và tế bào thực vật thành phần phụ gia
quan trọng nhất quyết định k ết quả nuôi cấy là các chất điều khiển sinh
trưở ng. Có bốn nhóm chất điều khiển sinh trưở ng chung đó là auxin,cytokinin, gibberellin và abscisic acid, những chất này có vai trò quan trọng
trong nuôi cấy mô. Sự sinh trưở ng, phân hóa và phát sinh cơ quan của mô
nuôi cấy trở nên thuận lợ i chỉ khi bổ sung một hoặc một số chất thuộc bốn
nhóm trên vào môi trườ ng nuôi cấy. Tuy vậy, yêu cầu đối vớ i những chất này
thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượ ng chất điều hòa sinh trưở ng
nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưở ng thực vật đượ c chia thànhcác nhóm chính sau đây:
2.5.1. Auxin (hormone sinh trưở ng)
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưở ng thực vật đượ c sử dụng thườ ng
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các auxin khác nhau thườ ng sử
dụng trong nuôi cấy mô tế bào là: 1H- indole-3-acetic acid (IAA), 1-
naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA). IAA là
auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các
auxin nhân tạo, thườ ng thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơ n vì do
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 14/24
đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase)
không có tác dụng. Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào
thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p-chlorophenoxyacetic
acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4-
chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid
(picloram), và 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba).
Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia và kéo dài tế bào.
Đối vớ i nuôi cấy mô tế bào, auxin đã đượ c sử dụng cho việc phân chia, phân
hóa tế bào và phân hóa rễ. Trong số các auxin, IAA, IBA và NAA chủ yếu sử
dụng cho môi trườ ng ra rễ và phối hợ p vớ i cytokinin sử dụng cho môi trườ ng
ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối vớ i môi trườ ng tạo và phát triển
callus, phát sinh phôi vô tính.
Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn
chưa đượ c biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử đã
cung cấp những k ết quả mớ i thú vị. Trong những năm qua, một số gen mã
hóa cho các protein liên k ết auxin (auxin binding proteins) đã đượ c tạo dòng
(cloning) và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mớ i về gen cảm
ứng auxin (auxin-induced gene) cũng đã thu đượ c. Auxin có tác dụng hoạt
hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưở ng lên các
enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào
trong phản ứng vớ i áp suất trươ ng. Auxin cũng có ảnh hưở ng ở mức độ biểu
hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ.
Việc quyết định sử dụng loại và nồng độ auxin trong môi trườ ng nuôi
cấy phụ thuộc vào:
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 15/24
- Kiểu tăng trưở ng hoặc phát triển cần nghiên cứu
- Hàm lượ ng auxin nội sinh của mẫu cấy
- Khả năng tổng hợ p auxin tự nhiên của mẫu cấy
- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh
- Đặc tính của auxin
Nói chung, các auxin đượ c hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong
NaOH loãng.
2.5.2. Cytokin (hormone phân bào)
Cytokinin là các dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan
chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi
trong nuôi cấy mô. Các cytokinin đượ c sử dụng thườ ng xuyên nhất là 6-
benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6---dimethyl-
aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-
(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là
các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Một số
hợ p chất đượ c phát hiện trong thờ i gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin
là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl
urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea. Cytokinin liên quan
tớ i sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v…
Trong môi trườ ng nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào
và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, tạo chồi bất định, gây tạo
phôi vô tính, tăng cườ ng phát sinh chồi phụ, ức chế sự hình thành rễ,…Cơ
chế hoạt động của cytokinin là chưa đượ c biết rõ ràng mặc dù có một số k ết
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 16/24
quả về sự có mặt của các hợ p chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận
chuyển (transfer RNA). Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợ p RNA, tăng
hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định.
Tươ ng tự như auxin, việc bố sung cytokine vào môi trườ ng nuôi cấy phụ
thuộc vào: kiểu tăng trưở ng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượ ng auxin nội
sinh của mẫu cấy, khả năng tổng hợ p auxin tự nhiên của mẫu cấy, sự tác động qua
lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh, đặc tính của auxin. Tuy nhiên, cần chú
ý tỉ lệ cytokin/auxin. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối vớ i sự phát sinh hình
thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy. Đối vớ i sự phát sinh phôi
(embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trườ ng hợ p ngượ c lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn đề quan trọng
không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưở ng này. Chẳng hạn
2,4-D cùng vớ i BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis
nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2
trườ ng hợ p tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1.
Đặc tính của một số cytokine thườ ng sử dụng:
Điều khiển nuôi cấy in vitro
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 17/24
- Kinetin đượ c phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mớ i sau
khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống không có kinetin
tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy,
nhưng nếu phối hợ p xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợ p thì sẽ kích thích
quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa.
- Tươ ng tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin.
Letham là ngườ i đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho k ết tinh thành công
hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Trong
thực tiễn nuôi cấy mô ngườ i ta chỉ dùng zeatin trong những trườ ng hợ p đặc biệt
vì giá thành rất đắt, thườ ng thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm
tổng hợ p nhân tạo khác.
- 6-Benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-Benzylamino (BAP): Hoạt lực của
BAP cao hơ n nhiều so vớ i kinetin và bản thân BAP bền vững hơ n zeatin dướ i
tác động của nhiệt độ cao. BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm
thứ cấp và tăng kích thướ c của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của
hạt và quá trình trao đổi chất. Nồng độ thườ ng sử dụng (0.5-10mg/l) cho các
mục đích khác nhau.
2.5.3. Giberillin
Gibberellin đượ c phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện
nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi ngườ i Nhật nói về bệnh lúa von. Năm
1926, xác định đượ c bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến
những năm 30, mớ i phân lập và tinh chế đượ c hoạt chất, đượ c gọi là
gibberellin. Mãi sau chiến tranh thế giớ i thứ II năm 1950, ngườ i Anh và
ngườ i Mỹ mớ i biết đến công trình này của ngườ i Nhật. Tớ i nay, ngườ i ta đã
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 18/24
Ảnh hưở ng kéo dài chồi của Gebberellin
phát hiện đượ c trên 120 loại thuộc nhóm gibberellic acid, nhưng chỉ có một
số loại gibberellic acid là có hoạt tính sinh lí như: GA1, GA3, GA4, GA7
Trong đờ i sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối
vớ i nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát
triển của hoa, làm tăng sinh trưở ng chiều dài của thực vật. Trong nuôi cấy mô
và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác
giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi
trườ ng chuyên dụng nào đó. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của
phôi vô tính. So vớ i auxin và cytokinin, gibberellin ít khi đượ c sử dụng hơ n.
GA3 có tính hoà tan trong nướ c.
Leaf buds of Japanese pear were collected in early June and early
November and regarded as summer and winter dormant buds, respectively.
Bud explants with and without scales were prepared from each of them, and
cultured in vitro for 75 days at 25°C with 14 h photoperiod, on a medium
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 19/24
either without growth regulators, or supplied with BA and GAs (GA3 and
GA4+7), singly or in combination.
When either BA or GA4+7 was contained in the medium, bud
expansion occurred. Thereafter, summer dormant buds grew into shoots in
the presence of BA, while winter dormant buds, although they swelled
profusely, remained in a rosette. In the presence of BA, GA4+7 markedly
stimulated shoot elongation of summer dormant buds, but GA3 did not. In
winter dormant buds, GA4+7 not only failed to stimulate shoot elongation,
but also interfered with the BA-induced swelling described above.
The presence of bud scales delayed expansion of summer dormant
buds, while it had little effect on winter dormant buds. The delaying effect of
scales on expansion of summer buds was effectively removed by application
of GA4+7 to the medium.( Teruhisa Yotsuya1 et al, Department of
Agriculture, Kobe University, Kobe, Japan.
2.5.5. Absicis acid
ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưở ng tự nhiên gây ra sự ngủ
nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng.
ABA còn có tác dụng tăng cườ ng khả năng chống chịu của tế bào thực vật
đối vớ i điều kiện ngoại cảnh bất lợ i, vì vậy ABA đượ c đưa vào môi trườ ng
nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định. Trong một số nghiên cứu, khi bổ
sung ABA vào môi trườ ng nuôi cấy mô và tế bào, ngườ i ta nhận thấy rằng
ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của phôi, kích thích sự
phát sinh chồi ở nhiều loài thực vât.
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 20/24
Abscisic acid (ABA) inhibits in vitro growth of cotton (Gossypium
hirsutum L.) fiber and is effective only when applied during the first four
days of culture started on the day of anthesis. Abscisic acid causes a small
increase in potassium uptake by the ovules and also enhances leakage of
potassium from them. During their period of rapid growth, fibers produced by
ABA-treated ovules have a higher potassium content and a lower malate
content as compared to fibers on untreated control ovules. Results are
discussed in the light of earlier reports on the in vitro growth of cotton fiber
and effects of abscisic acid on other plant tissues. It is suggested that ABA
inhibits fiber growth, in part, by interfering with malate metabolism.( R. S.
Dhindsa et al)
2.6. Độ pH của môi trườ ng
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưở ng và phát triển trong
nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trườ ng, pH có thể đượ c điều chỉnh đến giá trị cần
thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưở ng đến sự độ linh động của các ion và ảnhhưở ng trực tiếp tớ i quá trình thu nhận các chất dinh dưỡ ng từ môi trườ ng vào tế
bào. Đối vớ i hầu hết các môi trườ ng nuôi cấy pH = 5,0-6,0 trướ c khi khử trùng
đượ c xem là tối ưu. Độ pH cao hơ n sẽ làm cho môi trườ ng rất rắn trong khi pH
thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trườ ng nuôi cấy nghèo
đệm, vì thế chúng làm dao động giá trị pH, sự dao động này có thể gây bất lợ i cho
thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưở ng của các tế bào đơ n hoặc các quần
thể tế bào ở mật độ thấp. Nuôi cấy callus của nhiều loài cây, pH ban đầu thườ ng là
5,5-6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt đượ c giá trị từ 6,0-6,5. Đặc biệt khi sử dụng các
loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định
phải phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trườ ng về từ 5,5-6,5.
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 21/24
Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơ n hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH
là bắt buộc.
2.7. Một số loại môi trườ ng cơ bản
Thành phần cơ bản của một số loại môi trườ ng nuôi cấy mô và tế bào thực
vật đượ c trình bày trong bảng 2.1. Môi trườ ng Murashige-Skoog (MS) là một trong
những loại môi trườ ng đượ c sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào
thực vật. Môi trườ ng MS thích hợ p cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm.
Tớ i nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trườ ng MS trên cơ sở công thức gốc
do Murashige và Skoog công bố năm 1962. Môi trườ ng B5 đượ c thiết k ế đầu tiên
cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó đượ c cải tiến và
trở thành môi trườ ng thích hợ p cho nuôi cấy protoplast. Môi trườ ng này cũng đượ c
sử dụng để tái sinh cây từ protoplast. Môi trườ ng Chu (N6) là loại môi trườ ng rất
hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa, đượ c phát triển đặc biệt cho nuôi cấy
bao phấn các loài hòa thảo, mặc dù trong các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi
trườ ng đượ c phát minh bở i Nitsch (1969) vẫn đượ c dùng phổ biến hơ n. Môi trườ ng
Nitsch ngày càng thích hợ p và phổ biến trong nuôi cấy cây đậu tươ ng, cỏ ba lá đỏ
(red clover) và các loài legume khác. Thành phần dinh dưỡ ng của môi trườ ng này
đã giúp tăng sinh trưở ng của tế bào trong quá trình phát sinh phôi và nuôi cấy
protoplast.
Thành phần hoá học của môi trườ ng đóng vai trò quyết định đối vớ i thành
công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu gen, các
kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn,
hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trườ ng. Khi bắt đầu
nuôi cấy mô một loài mớ i hoặc một giống mớ i, cần phải lựa chọn cho đối tượ ng
nghiên cứu một loại môi trườ ng cơ bản phù hợ p. Cho đến nay, các nhà khoa học đã
tạo ra một số lượ ng rất lớ n các môi trườ ng thích hợ p vớ i từng đối tượ ng và mục
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 22/24
tiêu nghiên cứu. Để thuận tiện cho việc sử dụng môi trườ ng trong nuôi cấy, căn cứ
trên nguồn gốc khoáng dinh dưỡ ng ngườ i ta chia môi trườ ng nuôi cấy thành 3
nhóm: giàu dinh dươ ng, dinh dưỡ ng trung bình và nghèo dinh dưỡ ng. Đối vớ i các
nuôi cấy khở i đầu cho các đối tượ ng mớ i thì lờ i khuyên đượ c đưa ra là nên lựa
chọn môi trườ ng giàu dinh dưỡ ng.
Bảng….: M ột số môi tr ườ ng cơ bản thườ ng đượ c sử d ụng trong nuôi cấ y mô và t ế
bào thự c vật.
Thành phần Murashige
& Skoog
(1962)
White
(1963)
Gamborg
(1968)
Nitsch
(1951)
Heller
(1953)
Schenk
&
Hildeb
(1972)
Nitsch
&
Nitsch
(1967)
Kohlenb
ach &
Schmidt
(1975)
Knop
(1865)
(NH4)
2SO
4 - - 134 - - - - - -
MgSO4.7H2O 370 720 500 250 250 400 125 185 250
Na2SO
4 - 200 - - - - - - -
KC1 - 65 - 1,500 750 - - - -
CaC122H
2O 440 - 150 25 75 200 - 166 -
NaNO3 - - - - 600 - - - -
KNO3 1,900 80 3,000 2,000 - 2,500 125 950 250
Ca(NO3)
2.4H
2O - 300 - - - - 500 - 1,000
NH4NO
3 1,650 - - - - - - 720 -
NaH2PO
4.1H
2O - 16.5 150 250 125 - - - -
NH4H
2PO
4 - - - - - 300 - - -
KH2PO
4 170 - - - _ - 125 68 250
FeSO4.7H
20) 27.8 - 27.8 - - 15 27.85 27.85 -
Na2EDTA 1 - 37.3 - - 20 37.25 37.25 -
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 23/24
MnSO4.4H
2O 22.3 7 10 (1 H
2O) 3 0.1 10 25 25 -
ZnSO4ì
7H2O 8.6 3 2 0.5 1 0.1 10 10 -
CuSO4ì
5H2O 0.025 - 0.025 0.025 0.03 0.2 0.025 0.025 -
H2SO
4 - - - 0.5 - - - - -
Fe2(SO
4)3 - 2.5 - - - - - - -
NiC12ì
6H2O - - - - 0.03 - - - -
CoC12ì
6H2O 0.025 - 0.025 - - 0.1 0.025 - -
A1C13 - - - - 0.03 - - - -
FeC13ì
6H2
O - - - - 1 - - - -
FeC6O
5H
7ì5H
2O - - - 10 - - - - -
K1 0.83 0.75 0.75 0.5 0.01 1.0 - - -
H3BO
3 6.2 1.5 3 0.5 1 5 10 10 -
Na2M
0O
4ì2H
2O 0.25 - 0.25 0.25 - 0.1 0.25 0.25 -
TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Nguyễ n Đứ c Thành, 2000, Nuôi cấ y mô tế bào thự c vậ t nghiên cứ u và ứ ng
d ụ ng , Nhà xuấ t bản nông nghiệ p Hà N ội
2. Lê V ăn Hoàng, 2005. Công nghệ nuôi cấ y mô tế bào thự c vậ t , Nhà xuấ t bản
Khoa học k ĩ thuật Hà N ội
7/31/2019 Nuoi Cay Mo Te Bao Thuc Vat
http://slidepdf.com/reader/full/nuoi-cay-mo-te-bao-thuc-vat 24/24
3. Hobbie L, Timpte C, Estelle M. 1994. Molecular Genetics of Auxin and
Cytokinin. Plant Molecular Biology, 26: 1499- 1519.
4. Razan MK. 1994. An Introduction to Plant Tissue Culture. Oxford & IBH
Publishing Co. Pvt. Ltd. New Delhi.
5. Trigiano RN and Gray DJ. 2000. Plant tissue culture concepts and laboratory
exercises. CRC Press, New York.
6. T. Dennis Thomas,2008 . The role of activated charcoal in plant tissue culture ,
Research Department of Botany, St. Thomas College, Pala, Arunapuram (P.O),
PIN-686574, Kottayam (Dt), Kerala, India
7. Nguyễ n Thị Kim Thanh và cs, 2005. Giáo trình Sinh lý thự c vậ t , NXB Hà N ội
8. Blizzard, W. E., and Boyer, J. S.,1980. Comparative resistance of the
soil and the plant to water transport. Plant Physiol.
9. Bohnert, H. J., Ostrem, J. A., and Schmitt, J. M., 1989. Changes in
gene expression elicited by salt stress in Mesembryanthemum
crystallinum. In Environmental Stress in Plants, J. H. Cherry, ed.,
Springer, Berlin.