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Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos
LaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. . CâmpusCâmpus Rio Rio PretoPreto..www.www.biocristalografiabiocristalografia..dfdf..ibilceibilce..unespunesp..brbr
DraDra. . FernandaFernanda CanduriCanduriLaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares..DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. UNESP. UNESPSãoSão José do Rio José do Rio PretoPreto -- SP.SP.
IntroduçãoIntrodução à à BioquímicaBioquímica
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Tópicos
! Estrutura e função dos nucleotídeos
! Estrutura dos ácidos nucléicos
! Visão geral da função dos ácidos
nucléicos
! Sequenciamento dos ácidos nucléicos
! Tecnologia do DNA recombinante
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Métodos para sequenciar ácidos nucléicos
• Sequenciamento manual
: 2´,3´-dideoxinucleosídeo-trifosfato – ddNTP
• Sequenciamento automático
: Marcadores fluorescentes
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Sequenciamento pelo método de terminação de cadeia – seq. manual
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Uso de marcadores fluorescentes -Sequenciamento automático
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Tecnologia do DNA Tecnologia do DNA recombinanterecombinante
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! Técnicas de clonagem
! Bibliotecas genômicas
! Amplificação de DNA por PCR
! Aplicações da Tecnologia do DNA
recombinante
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Tecnologia do DNATecnologia do DNA recombinanterecombinante
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Como genes são isolados dafita de DNA ??
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As nucleases de restrição
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A endonuclease cliva um ácido nucléico no interior de uma fita polinucleotídica
A exonuclease cliva um ácido nucléico por meio da remoção de um dos seus resíduos terminais
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Técnicas de clonagem
" Amplificação de um segmento de DNA
1. Um fragmento de DNA de tamanho apropriado é produzido por meio de endonucleases de restrição, e isolado
2. O fragmento é incorporado em uma outra molécula de DNA (vetor), que contém as seqüências necessárias para dirigir a replicação do DNA
3. O vetor recombinado é introduzido em células, onde é replicado
4. As células que contém o DNA desejado são identificadas, ou selecionadas
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Clonagem
Produção de múltiplos organismos idênticos, derivados de um ancestral comum
Em um organismo hospedeiro (como E. coli) podem ser produzidas grandes quantidades do
DNA
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Uso da DNA-ligase naclonagem
! A DNA-ligase une fragmentos de DNA paraproduzir uma molécula de DNA-recombinante
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Plasmídeos bacterianos podemser usados para clonar DNA
! Plasmídeo: DNA circular
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Genes humanos são isolados pela clonagem de DNA
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Plasmídeorecombinante
Vetor de clonagem -plasmídeo
+
fragmento de DNA
(inserto)
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Os plasmídeos recombinantes são geralmente clonados em células
bacterianas
Processo denominado transformação
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Bibliotecas genômicas
Bibliotecas de cDNArepresentam o RNAmproduzido por determinadotecido
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A hibridização permite que mesmo genes poucorelacionados possam ser identificados – relação com a função de proteínas conhecidas
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Amplificação de DNA por PCR
! A reação em cadeia da polimerase amplificasequências selecionadas de DNA
↓Iniciadores
! Proteínas celulares raras podem ser produzidas em grandes quantidades usandoDNA clonado
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PCR
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Aplicações da Tecnologia do DNA recombinante
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Expressar a proteína quinase (CDK9), purificá-la, para então resolver sua estrutura cristalográfica a
alta resolução.
Usar as informações estruturais para desenhar drogas específicas.
Objetivos
Estudo estrutural da CDK9
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Principal função das CDKs
O ciclo celular
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Ciclo de divisão celular: processo básico da gênese de novas células
Mitose
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O sistema controle do ciclo celular está baseado em duas famílias de proteínas que são chaves para o seu funcionamento:
1) quinases dependentes de ciclinas (“cyclin-dependent kinase” – CDKs),
2) ciclinas, denominadas proteínas ativadoras.
A regulação da divisão celular é crucial para o desenvolvimento normal de organismos multicelulares
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Cada subunidade catalítica da CDK pode associar-se a diferentes ciclinas
Existem ao todo 13 CDKs (CDK1-CDK13).
CDKs1-8 estão envolvidas no controle do ciclo celular.CDKs 9 e 10 são importantes reguladores transcricionais.CDKs 11-13 – suas funções não estão bem claras
Ciclinas A - T
Existem 15 Existem 15 ciclinasciclinas::
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CDKs e ciclinas
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A formação, ativação e a separação dos complexosciclinas-CDKs são os eventos fundamentais que coordenam o ciclo celular
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Proteínas regulatórias – envolvidas em neoplasias
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Quinase dependente de ciclina 9
(CDK9)
CDK9 é uma subunidade catalítica da P-TEFb, um fator de transcrição que estimula a elongação da RNA polimerase II
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Complexo de pré-iniciação para a transcrição da RNA polimerase II do HIV (Fackler et al., 2001).
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Ex.: Replicação do vírus HIV
O estudo estrutural de proteínas envolvidas na sua replicação são importantes para o desenvolvimento de novos inibidores da sua transcrição.
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Clonando o gene da CDK9
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Sequenciamento
Transformação
Purificação do vetor
cDNA total + iniciadoresPCR
Reação com ligase
Amplificação do fragmento de cDNA
Extração e purificação do gene da CDK9
Inserção do gene da CDK9 no vetor pET23a
Clonagem do vetor em Escherichia coli (DH10B)
Clonagem e expressão em E. coli (BL21-DE3)
plasmídeo →→→→
Solubilização!!
Purificação da CDK9LaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. . CâmpusCâmpus Rio Rio PretoPreto..
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5´
3´
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Mapa do vetor pET23a, mostrando os sítios de restrição no (MCS) sítio múltiplo de clonagem (flecha em preto).
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Desenho dos primers
Primer S: 5´ CGC GAA TTC ATG GCA AAG CAG TAC GAC 3´Primer A: 5´ CCG GAA TTC TCA GAA GAC GCG CTC AAA C 3´
ssíítio da enzima de restritio da enzima de restriçãção Eco RIo Eco RI
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pET23a + fragmento da CDK9
Vetor pET23a linearizado com enzima de restrição, mostrando a inserção do gene da CDK9 com T4 DNA ligase.
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IntervenIntervençãção da atividade de o da atividade de CDKsCDKs
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ConseqConseqüêüências da inibincias da inibiçãção deo de CDKsCDKs
Interrupção do ciclo celularApoptose DiferenciaçãoEfeitos transcricionais
Moduladores diretos de Moduladores diretos de CDKsCDKs
Flavopiridol UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina)OlomoucinaRoscovitinaPurvanalol
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Inibidores de Inibidores de CDKsCDKs
Ligam-se ao sítio de ligação do ATP, com o benzopirano ocupando a mesma região do anel de purina do ATP
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Por estar envolvida na proliferação celular, apoptose, funções neuronais e transcrição, inibidores farmacológicos de CDKs são usados em múltiplas áreas terapêuticas.
Potenciais aplicações dos inibidores de CDKs
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Elementos de estrutura secundária da CDK9 complexada com o inibidor flavopiridol, obtida por modelagem molecular por homologia (MODELLER).
Modelagem da CDK9 com flavopiridol
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Situação atual do projeto
Purificar em grande quantidade e tentar cristalizar a CDK9 para resolver sua
estrutura cristalográfica
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