Biochemia Stryer - 4. DNA, RNA i Przepływ Informacji Genetycznej
Nowoczesne systemy ekspresji genów - pg.gda.pl · GEN - pojęcia podstawowe Sekwencje regulatorowe...
Transcript of Nowoczesne systemy ekspresji genów - pg.gda.pl · GEN - pojęcia podstawowe Sekwencje regulatorowe...
GEN - pojęcia podstawowe
Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą
do wytworzenia jednego rodzaju białka (definicja jest prawdziwa w
odniesieniu do większości genów komórki, ale istnieją też geny, które
kodują na przykład cząsteczki rRNA i tRNA)
Cistron - sekwencja kodująca RNA, której ekspresja prowadzi do
powstania pojedynczego łańcucha polipeptydowego
promotor sekwencja kodująca RNA terminator
gen
GEN - pojęcia podstawowe
Promotor
Część genu, do której przyłączają się czynniki
transkrypcyjne i polimeraza RNA. Jest jedną z części
regulatorowych genu. Od przyłączenia polimerazy
RNA do promotora rozpoczyna się transkrypcja
Terminator
Odcinek genu, na którym kończy się transkrypcja
GEN - pojęcia podstawowe
Sekwencje regulatorowe – części genu, które nie zawierają informacji genetycznej, ale kierują jej odczytywaniem
wzmacniacze ekspresji (Wz)
wygaszacze ekspresji (Wy)
inne - niezwiązane z działaniem czynników transkrypcyjnych, np. sekwencje liderowe DNA
Ekspresja genów
Ekspresja genów może zachodzić z różną wydajnością w
zależności od środowiska i warunków
AA AA A A B
gen a gen b
Ekspresja genów w organizmach
prokariotycznych i eukariotycznych
Prokariota
Transkrypcja Transkrypcja jest połączona z
translacją
Geny transkrybowane są przez jeden rodzaj polimerazy RNA
Pod kontrolą jednego promotora może znajdować się więcej niż jeden cistron – taką jednostkę ekspresyjną nazywamy operonem
Eukariota
Transkrypcja Transkrypcja jest rozdzielona
od translacji
Geny są transkrybowane przez trzy różne polimerazy RNA
Pod kontrolą jednego promotora znajduje się jeden cistron
Nadekspresja białek - sens zastosowania
Eksperyment – badanie represora lac
10 cząstek białka w jednej komórce
1 μmol cząsteczek potrzebny do badań biochemicznych
1 μmol = 6x1017 cząsteczek białka
Czyli do eksperymentu potrzeba 6x1016 komórek
1 litr hodowli E. coli w fazie stacjonarnej zawiera ~4x1011
komórek
Czyli (zakładając 100% wydajność procesu oczyszczania)
1 μmol represora lac
= 150000 litrów hodowli E. coli
Zastosowanie
Badania podstawowe:
określenie struktury białek (NMR, krystalografia)
enzymologia
manipulacje genetyczne (mutageneza)
badanie oddziaływań międzycząsteczkowych
Zastosowania terapeutyczne i komercyjne:
medycyna
diagnostyka
przemysł chemiczny
przemysł spożywczy
Schemat postępowania
Klonowanie eukariotycznego cDNA lub genu
prokariotycznego
(Przeklonowanie sekwencji do wektora ekspresyjnego)
Przeniesienie konstruktu do komórek
gospodarza/komórek
Charakterystyka produktu (białka):
oczyszczanie
testy enzymatyczne
Przygotowanie do eksperymentu
Wybór gospodarza
systemy in vivo (przykłady)
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Pichia pastoris
hodowla tkankowa komórek ssaczych
organizmy transgeniczne
wyspecjalizowane systemy in vitro
Przygotowanie do eksperymentu
Wybór wektora
wydajność
sposób oczyszczania
modyfikacje potranslacyjne
konieczność przeprowadzenia modyfikacji genu/cDNA
koszt
stopień trudności
http://www.biotech-
nantes.com/Conferences/Business%201/Jeudi/14h00/02%20Thiry.pdf#search=%22protein%20expression%20systems%20ppt%22
http://www.biotech-
nantes.com/Conferences/Business%201/Jeudi/14h00/02%20Thiry.pdf#search=%22protein%20expression%20systems%20ppt%22
Przygotowanie do eksperymentu
wybór protokołu klonowania/ekspresji
rodzaj białka
rozpuszczalność i stabilność białka
miejsce produkcji białka (cytoplazma, pożywka)
sposób oczyszczania białka
Źródła informacji gdy sekwencja genu
jest znana
1. Publikacje naukowe
― zawierają informacje o systemach ekspresyjnych użytych do
ekspresji danego genu
― powinny zawierać odnośnik do sekwencji genu w postaci
tzw. „Accession No.” dla wybranej bazy danych dostępnej w
internecie np. NCBI (www.ncbi.nih.gov)
Źródła informacji gdy sekwencja genu
jest znana
2. Bazy sekwencji nukleotydowych
― NCBI: National Centre for Biotechnology Information (Rockville Pike, Bethesda)
― Dostęp do sekwencji genów można uzyskiwać poprzez:
podanie accession no. uzyskany z publikacji (Vonakis et al. J. Biol. Chem. 272 (38), 24072-24080 (1997))
Accession No: AF000301
Jak zdobyć informacje o genie jeśli sekwencja
jego nie jest znana –
ale znana jest sekwencja białka lub jej fragmenty
Sekwencję białka mozna poznać dysponując jego
czystym preparatem dzięki ograniczonej
proteolizie i sekwencjonowaniu uzyskanych
peptydów
Jak zdobyć informacje o genie jeśli jego
sekwencja nie jest znana
W oparciu o sekwencje białka można zaprojektować
zdegenerowane startery, które użyjemy w reakcji PCR i
uzyskamy:
Który prążek wybrać do
sekwencjonowania???
Należy oprzeć się o
przybliżenie: 1 kD
białka – 333 par zasad
DNA i znaną masę
białka (w kD)
Jak zdobyć informacje o genie jeśli sekwencja jego nie
jest znana i nie jest znana sekwencja białka ale:
Znamy właściwości fizykochemiczne białka, przede
wszystkim jego Mw:
W przypadku Prokariota możemy stworzyć bibliotekę
DNA genomowego w celu uzyskania sekwencji
W przypadku Eukariota możemy stworzyć bibliotekę DNA
genomowego w celu uzyskania sekwencji
Jak zdobyć informacje o genie jeśli nie jest
znana jego sekwencja, ani sekwencja
kodowanego przez niego białka
Wykorzystując dane uzyskane z bibliotek cDNA
możemy uzyskać sekwencję genów interesujących nas
białek
Jak zdobyć informacje o genie, jeśli znamy
tylko jego źródło?
Istnieje możliwość zastosowania zasady genomiki porównawczej:
Odnalezienie informacji o dostępności sekwencji analogicznych genów z najbliższych „taksonomicznie” krewnych
Porównanie sekwencji nukleotydowych wybranych genów z organizmów pokrewnych do organizmu źródłowego
AlignX
1 14010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130(1)
-------------------------------ATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC-MfAJ252337 (1)
--------TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC-McAY213657 (1)
-------------------------------ATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC-MeAJ252330 (1)
ACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCNGGCCG--GAGGCTGGCCCCCCACGAT---A------------GGGACCGACGTTCA--TCAGGGGTGAGCAGACGT-GCGCCGGCCGTACGCCCCrubrumAJ270808 (1)
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCC Consensus (1)
255 394260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380(255)
CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAMfAJ252337(222)
CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAMcAY213657(245)
CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG---AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAMeAJ252330(222)
CGCCCGCCGGAGGACAGACACCAAGAAAAAATTCTCTGAAGAGCTGTCAGTCTGAGCGTTTAGCAAGCACAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATArubrumAJ270808(219)
CGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCG AGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAConsensus(255)