Nové typy očkovacích látek

pro prevenci infekcí a

imunoterapii nádorů

P. Šebo

Toto ustálené souţití s mikroflórou občas naruší vetřelci

– patogenní infekční mikroorganismy -

speciálně vybavené pro přeţití v hostiteli

nějakou dobu odolávají imunitnímu systému

po přemnoţení vyvolají poškození a přenos

Mikrobiální orgán člověkanosíme si sebou cca. 1013 našich vlastních buněk a na 1014 mikroorganismů

nos 108

Staph. aureusStaph. epidermidisDiphtheroidsStreptococci

kůţe 1012

Staph. aureusStaph. epidermidisPs. aeruginosaPropionibacterium acnesAnaerobes

nosohltan, hrtan a jícen 1010

Staph. epidermidisHaem. influenzaeNeisseria spp.Strep. PneumoniaeStrep. pyogenes

močová trubice a vagína 108

Staph. epidermidisStreptococciLactobacilliVeillonellaetc.

ţaludek 104

Hel. pylori

ústní dutina 1010

Strep. mutansPor. Gingivalis pluscca. 700 druhů

střeva 1014 ~220gBacteroides spp.Bifidobacter spp.Bacillus spp.EubacteriaRuminococcus albuscca. 1000 druhů

(Wilson et al, 2002)

Toto souţití s mikroflórou občas naruší vetřelci

patogenní mikroorganismy

vybavené pro manipulaci s imunitou hostitele

po přemnoţení vyvolají poškození a případný přenos

Nejefektivnější je infekcím předcházet

• Zlepšením ţivotních podmínek a hygienických návyků

• Čištění vody, odpadové hospodářství, výživa, bydlení

• Bezpečnějšími potravinami

• Chladový řetězec, pasteurizace, omezení kontaminace

• Kontrolou přenašečů

• Komárů, vší, much a přenašečů zoonos

• Omezením promiskuity a pouţitím kondomů…

• Léčbou a prevencí infekcí

– Chemoterapie infekcí (antibiotika)

– Očkovací látky

Cílem očkování je manipulace adaptivního

imunitního systému• zaloţený na obrovském repertoáru individuálních klonů B a T lymfocytů,

vzniklých reorganizací genů a somatickými mutacemi, z nichţ kaţdý receptor

nese unikátní, specifický receptor (BCR or TCR)

• Rozpustnými receptory adaptivního systému jsou protilátky

• Adaptivní systém je “předvídavý”, klonální, “předimenzovaný”

klonální expanze B lymfocytů Aktivace T lymfocytů

peptid

jádro

endocytóza kříţová

prezentace

lymfocyt

lymfocyt

Nebyl první, ale první pochopil a vědecky ukázal, ţe oslabené

nebo zabité mikroorganismy lze pouţít pro prevetivní očkování

( s cílem předejít infekci nebo omezit její dopad)

„Otec“ dnešních očkovacích látek

Louis Pasteur(1822 – 1895)

• Pasteur nebyl první - po tisíciletí bylo známo, ţe ti co přeţili infekci se zřídka nakazili znovu.

• variolizace – vdechování prášku z usušených puchýřů pravých (černých) neštovic v Indii

doloţeno jiţ cca. 1000 let před n. l., v Číně vpichování hnisu z puchýřků do kůţe…

• 1796 – Edward Jenner, pouţil kravské neštovice (virus vakcínie) pro očkování proti

pravým neštovicím, kráva = vacca latinsky >>> Vaccine – vakcína

• L. Pasteur - 1880 vakcína proti slepičí choleře, 1881 antrax, 1885 – vzteklina

• 1927 – BCG – Bacillus Calmette-Guérin – M. bovis pasáţované na bramborovém médiu

• Po 2. světové válce – spalničky, příušnice, zarděnky, Adenovirus, plané neštovice ,tyfus

• 1957 – ţivá atenuovaná vakcína proti poliomyelitidě – Sabin

• Československo byla první země světa kde byla vymýcena poliomyelitida - doc. Slonim

(USOL)

První vakcíny byly ţivé atenuované mikroorganismy:

Stojíme na ramenou velikánů

(1843 – 1910) (1863 – 1933) (1872 – 1961)

Ţivá vakcína z oslabeného Mycobacterium bovis

(BCG Pasteur) pro kalmetizaci

Zavedení kalmetizace umoţnilo ve vyspělejších zemích vymýtit miliární

(systemickou formu) tuberkulózy u dětí a významně omezilo šíření TB

Jonas Salk Albert Sabin

Československo se v roce 1961 stalo první zemí na světě, kde byl

přerušen proces šíření divokých poliovirů v populaci a poliomyelitida zde

byla eradikována vakcínou vyvinutou týmem doc. Slonima v ÚSOL Praha

Orální vakcína Alberta Sabina byla masivně testována v SSSR kolem roku 1960

Chumakovem a poté masově nasazena po celém světě v kampani SZO

Vakcína proti poliomyelitídě

1955 inaktivovaná Salkova a 1960 atenuovaná Sabinova vakcína

• 1896 - Tyfus, Cholera, 1897 - Mor

• 1926 – černý kašel 1936 – chřipka

• Po 2. světové válce – poliomyelitida (1952 Salk ), vzteklina, encephalitis, hepatitis A

• 1960s-1970s – eradikace pravých neštovic – program pro SZO vymýšlel prof. Karel Raška

Purifikované proteiny, konjugované a rekombinantní vakcíny

• 1923 – záškrt, 1927 tetanus (difterický a tetanický toxoid)

• po 1940 - DPT vakcína – první kombinovaná očkovací látka – záškrt, tetanus, pertuse)

Velkou roli sehrály téţ inaktivované a

podjednotkové vakcíny

Klíčový úspěch vakcinačních programů eradikace neštovic (virem vakcínie) – podíl prof. Karla Rašky ve SZO

200 – 300 milionů mrtvých

~10% úmrtnostbiologická zbraň pro hubení indiánů

odolnějšími dobyvateli z Evropy

Pokles počtu zemí s výskytem

pravých neštovic mezi lety

1950-1976

počátek

eradikační

kampaně SZO

rok

počet zem

í s v

ýskyte

m p

ravých n

ešto

vic

Očkování inaktivovanou celobuněčnou pertusovou

vakcínou bývalo velmi účinné…

masově nasazena

celobuněčná vakcína

pokles skupinové imunity

a zhoršení kvality

používané vakcíny

zavedena

bezbuněčná

vakcína

Klasické vakcíny předběhly

poznání imunitního systému:

• Připraveny čistě empiricky z celých bakteriálních buněk a virů

• Dodnes patří k nejúčinnějším vakcínám díky spektru obsažených

antigenů

• Jistá míra vedlejších účinků vedlejších a mnohdy zveličovaných účinků

(obsah endotoxinu, reverze poliovirů, automunita?).

Individuální bezpečnost na úkor ochrany populace???

Aktuální výzvy ve vývoji vakcín

• Malárie - P. falciparum – nová generace vakcín v klinických testech

• Tuberkulóza - 2 mld. latentně infikovaných – běţí klinické testy

• AIDS – 35 milionů HIV-pozitivních – zatím beznadějné?

• Chlamydia pneumoniae

• infekční mononukleóza – EBV a téţ CMV………………………………………………………………………………………………………

• Imunoterapeutické vakcíny proti alergiím,

autoimunitě

• T-buněčné vakcíny pro imunoterapii rakoviny slibné, první vakcína na léčbu nádorů prostaty registrovaná v USA

Nové vakcíny staví na pokroku

molekulární biologie,

genomiky

a

buněčné imunologie

Nové koncepty (1):

• Nová adjuvans – soli hliníku, MPL, olejové suspenze PolyICLC – aktivují

inflamasom anebo signalizují přes TLR ligandy (poly I:C + polylysin)

• konjugace málo imunogenního kapsulárního polysacharidu s proteiny

(Hemophilus, Neisseria meningitidis C, Streptococcus pneumonieae)

• rekombinantní pseudovirové částice (HPV, HBV)

• orální a intranasální atenuované a enkapsulované vakcíny (rotavirus,

Salmonella, Shigella, poxvirus, adenovirus, intranasální chřipková vakcína)

• rekombinantní podjednotky vakcín, např. gdPT pouţitý v italské vakcíně

Toxoidy (chemicky nebo geneticky inaktivované bakteriální toxiny

Cholerový toxin

LT

Pertusový toxin

Difterický Toxin

Typické podjednotky polyvalentních vakcín

Tetanový toxin

např:

• rekombinantní pseudovirální částice (HPV, HBV)

• směs purifikovaných antigenů v pediatrické hexavakcíně (DTPH + polio + HBV)

Podjednotkové vakcíny

VLP = pseudovirální (virus-like particle) částice

lidského papiloma viru 16 (HPV16)

Nové koncepty (2):

- polyvalentní vakcíny –

- od 1.1. 2009: INFANRIX hexa™ - Diftérie, Tetanus, Pertuse, Hepatitis B,

Polio, a Haemophilus influenzae typ b

• reverzní vakcinologie – ochranné antigeny hledány v genomových

sekvencích

• DNA vakcíny a genetická, aţ genomická vakcinace

• Systémy pro cílenou prezentaci antigenů na dendritických buňkách

pro detekci latentních infekcí a imunoterapii nádorových

onemocnění

Genomika umoţnila vznik reverzní vakcinologie

(R. Rappuoli et al. – Chiron/Novartis Vaccines, Siena)

Reverzní vakcinologie

Neisseria meningitidisséroskupiny B

exprese

a

purifikace

Purifikované

proteiny

imunizace

~350 proteinů produkováno v E.coli,

a pouţito k imunizaci myší

570 ORFs, potenciálně kódujících

povrchové proteiny

Reverzní vakcinologie

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000

600,000

700,000

800,000

900,000

1,000,000

1,100,0001,200,000

1,300,000

1,400,000

1,500,000

1,600,000

1,700,000

1,800,000

1,900,000

2,000,000

2,100,000

2,200,000IHT-A

IHT-B

IHT-C

1

Objeveno 91 nových

povrchových proteinů

Identifikováno28 nových antigenů indukujících baktericidní protilátky

Polysacharidová kapsula

Vnější membrána

Periplasmatický prostor

Cytoplasmatická membr.

Cytolasmatický prostor

Kapsula

PorA

PorB

Opa

Opc

LPS

Pili

T-buněčné vakcíny pro prevenci

infekcí a terapii nádorů

Dvě dráhy prezentace antigenů:

cesta k protinádorovým vakcínám

endogenní proteiny

antigeny virů, intraculárních bakterií a parazitů

Nádorové antigeny

Endoplazmatické

ReritkulumTCR

aktivovaný

pomocný

CD4+

T lymfocyt

maturace B lymfocytů

Zabíjení

infikovaných

a nádorových buněk

aktivovaný

cytotoxický

CD8+

T lymfocyt

produkce protilátek

a

cytokinů

Jak dopravit antigen do cytosolu prezentujících buněk a

stimulovat CD8+ cytoxické T lymfocyty?

• DNA a RNA vakcíny – i.d./s.c./i.m. nebo

ex vivo aplikace na APC a transfer do těla

(zatím jenom pro zvířata)

• dendritické buňky maturované a nabité antigeny in vitro pro imunoterapii

nádorů (Provenge = první registrovaná vakcína na rakovinu prostaty – 2010)

• Intracelulární baktérie - uvolňující rekombinantní antigeny (atenuovaná Listerie,

Salmonella, BCG…)

• Atenuované rekombinantní viry produkující antigeny (např. vakcínie, adenovirus)

• Liposomové preparace peptidů

• Proteiny pronikající do buněk (Tat, bakteriální toxoidy - dCyaA (Procervix)

• protilátky s geneticky (nebo chemicky) připojeným antigenem, které rozeznávající

endocytické receptory dendritických buněk (R. Steinman – Celldex Therapeutics)

antigenní fuze se streptavidinem (v komplexu s biotinylovanou směřovací protilátkou?)

mRNA

transfekce

dendritické

buňky

DNA/RNA aplikace in vivo

adoptivní

přenos

DNA vakcíny

DNA vakcíny byly objeveny náhodou

kontrolním pokusem. Fungují na principu

produkce a prezentace antigenu vlastními buňkami

příjemce. Výborně fungují u myší. U lidí zatím není

ţádná schválená a vývoj stál firmy cca.

1 mld. USD…

například virová RNA je přeloţena do

cDNA a sekvenována, klonována

podle

sekvence jsou

syntetizovány

geny pro

antigeny

a ty jsou

vloţeny do

plazmidu

plazmidová

DNA je

purifikovaná

chromatografií

purifikovaná DNA

tvoří vakcínu

Rekombinantní: mohou být multivalentní (Ulmer et al. Science 259, 1745-48, 1993)

Dendritické buňky maturované a nabité antigeny z

lyzátu nádorových buněk in vitro

endocytický receptor

raný /pozdní

endosom

endocytóza of

mAb-SA-Ag

komplexů

Lysosom

dissociace

Recyklující

receptory

endoplazmatické

retikulum

štěpení SA-Ag

Golgi

CD4+

T

buňkaCD8+

T

buňka

kříţově

prezentační

organela

MHC II MHC I

MHC II

peptid

komplex mAb-SA-Ag

signalizace

MHC I

+

peptid

Staněk et al. 2012, Mol. Biotechnol. 51:221-232, WO/2011/077258

Vyuţití antigenních fuzí se sreptavidinem pro dopravu

antigenů ke prezentaci na MHC molekulách

ProteazómEndozóm

MHC-II

glykoprotein

CD4+

T lymfocyt

Transportér peptidů vyštěpených

proteazómem z antigenů

MHC-I

glykoprotein

MHC II

Golgi

Endoplazmatické

retikulum

MHC-I peptid

AC

AC

Repeats

CD8+

T lymfocyt

Repeats

?

?

M2 integrin

CD11b/CD18

Ag

Ag

AgAg

Ag

Vložený antigen(z viru, bakterie,parazita, nádoru)

dCyaA toxoid jako nástroj pro dopravu antigenů do cytosolu prezentujících buněk

translokaceendocytóza

buňka prezentující antigeny

Immunotherapie nádorů vyvolaných u myší buňkami

transformovanými E6 a E7 onkogeny HPV16:

kombinovaná terapie dCyaA-E7 and MVA-E7 vakcínami

Macková et al. (2006) Cancer Immun. Immunother. 55, 39-46

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

2/8MVA-SigE7LAMP +

CyaA336/E7 ***P=0.0006

5/8CyaA336/E7 + PBS

*P=0.03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

50

100

150

200

0/8CyaA336/E7 +

MVA-SigE7LAMP ***P<0.0001

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

2/8CyaA336/E7 +

CyaA336/E7 **P=0.003

7/8PBS + CyaA336/E7

n.s. P=0.2

0

50

100

150

200

7/7PBS + PBS

Days after administration of 6x104TC-1 cells

Tu

mo

r are

a [

mm

2]

veliko

st

nád

oru

(m

m2)

dny po injekci 6 x 104 TC-1 nádorových buněk

www.genticel.com

Společnost Genticel Sarl z Toulouse vyvíjí na bázi toxoidu CyaA vakcíny pro

imunoterapii nádorů děloţního čípku (nyní probíhá klinická fáze I.)

the adenylate cyclase CyaA

Děkuji za pozornost !

rád zodpovím Vaše dotazy

Stav ‘technologie’ po 20-ti letech práce

• ověření konceptu v myších– specifické CTL CD8+ and CD4+ T buněčné odpovědi

• Ochranná imunita proti virům (LCMV)

– Ochranná imunita proti Plasmodium berghei (myší malárie)

– Imunoterapie experimentálních nádorů vyvolaných HPV16

– polyvalentní buněčná imunitní odpověď - několik antigenů v různých místech

(US Patent No. 5,503,829, No. 5,679,784, No. 5,935,580

EU Patent application No. 03291486.3, US Prov 03495, 6094 (2003) )

• Mnoho preklinických dat z in vitro a in vivo modelů

• Připravená toxikologická studie

• Běţí fáze I&II klinické testy na pacientech s:

– melanomy – the 6th EU RP projekt THERAVAC (Ludwig Institute)

– nádory děloţního čípku (HPV16) - BT Pharma S.A. Toulouse France

• Vylepšení detekce latentní infekce Mycobacterium tuberculosis u lidí a skotu

• Další diagnostické moţnosti u jiných infekcí a rakoviny

přehled: Šimšova et al. (2004). Int. J. Med. Microbiol., 293, 571-576.

dACT umoţňuje indukci buněčných imunitních

odpovědí proti cizorodým antigenům

Antigeny CD8+ Antigeny CD4+

OVA MalE

LCMV MAGE

Apa, Cfp ESAT-6, CFP10

gp120 TB-10.4

E7 Ag85A

CSP

Melanomy

ESAT-6, CFP10

TB-10.4

Sebo et al., 1995, Infect. Immun. HIV, LCMV in vitroFayolle et al., 1996, J. Immunol. HIVSaron et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Ochrana před LCMV in vivoOsicka et al., 2000, Infect. Immun. Mapování permisivních místFayolle et al., 2001, J. Virol. polyvalentní CTL opdpověďLoucka et al., 2002, Infect. Immun. CD4+ T odpovědiSchlecht et al., 2004, J. Immunol. MechanismusMackova et al., 2006, Cancer Immunol. Immunother. Imunoterapie nádorůTartz et al., 2006, Infect. Immun., očkování proti malárii (myší)Wilkinson et al. 2005 Infect Immun. Vylepšení tuberkulosního testuAnderson et al. 2006 Am. J. Crit. Care Resp. Med. Vylepšení tuberkulosního testuMajlessi et al., 2006, Infect. Immun., IFN a imunita proti MTBHervas-Stubs et al., 2006, Infect Immun IFN a imunita proti MTB

Slušně nás to živí….

Nedávno registrované nové vakcíny

Hexavalentní pediatrická vakcína - od 1.1. 2009: INFANRIX hexa™- Diftérie, Tetanus, Pertuse, Hepatitis B, Polio, a Haemophilus influenzae typ b- pro imunizaci kojenců ve 2., 4. a 6. měsíci ţivota

Rotavirová vakcína (orální), intranasální chřipková vakcína- RotaTeq™, Rotarix™, FluMist

MMR-Varicella- zarděnky, příušnice, spalničky + plané nešovice

Pneumokoková konjugovaná vakcína- Prevenar™ (heptavalentní, různé serotypy)

Meningokoková kojugovaná vakcína- MENVEO™ (serotypy A, C, Y and W135)

s poněkud spornou nákladovou efektivitou:

Vylepšení diagnostiky pomocí stanovení uvoňovaného IFN (IGRA) detekce paměťových T lymfocytů zbylých po latentní infekci

Cílená doprava antigenů do prezentujících buněk

• Pomocí:

derivátů adenylátcyklázového toxoidu

antigenů fúzovaných se streptavidinem

v komplexech s biotinylovanou směřující protilátkou

Účel:• sníţit potřebný objem krve

• zkrátit čas stanovení

• eliminovat neurčité výsledky

• sníţit detekční limit

Detekce IFN-γ

• ELISA

• cytometrií

• qPCR

buňka

prezentující

antigen

paměťová

T buňka

specifická

pro daný

antigenbuňka

prezentující

antigen

APC buňky

prezentují

antigen T

buňkám

aktivovaná T

buňka

produkuje

IFN

předchozí asymptomatická infekce (LTBI nebo CMV)

jsou přítomny specifické T lymfocyty – jejich detekce ve vzorku krve

pokud dotyčný byl infikován má antigen-specifické

T buňky, takţe dojde k imunologické synapsi a aktivaci

Habilitační řízení Ing. Petra Šeba, CSc., 12.04.2012, FPBT VŠCHT Praha

Odpovědi oponentům habilitační práce:

Doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc. nevznesl žádný dotaz.

Prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc.: „Jaký je současný stav v metodologii produkce cizorodých rekombinantních proteinů bakteriální

buňkou z hlediska poměru produkt - výtěžek v denaturovaném a „nativním“ stavu; skutečnost, která sehrála centrální úlohu

v experimentální práci autora?”

Odpověď: Od roku 1990, kdy byl rekombinantní AC toxin poprvé produkován v bakterii Escherichia coli, došlo k velmi významnému

rozvoji metod produkce rekombinantních proteinů v bakteriích. Kromě E. coli je veřejně dostupných, nebo na výběr u

specializovaných dodavatelských firem, i široká škála produkčních kmenů Gram-negativních i Gram-pozitivních bakterií. Tyto kmeny

byly zpravidla upraveny pomocí genové manipulace tak, aby v nich bylo možno produkovat rekombinantní proteiny jak velmi

majoritně v rozpustné frakci v cytosolu, tak vystavené na bakteriálním povrchu, posttranslačně modifikované například glykozylací ,

či přímo sekretované do média kmeny deficientními v produkci proteáz.

Přesto zůstává nejoblíbenějším, tradičním a mnohdy i ekonomicky nejvýhodnějším expresním organismem pořád bakterie E. coli. K dispozici jsou dnes především osvědčené kmeny E. coli ze skupiny B, například BL21(λDE3), které lze dále upravovat vkládáním genů pro expresi chaperonů.Nejjednodušší pak je nadprodukovat rekombinantní protein do nerozpustných inkluzních tělísek ve výtěžcích dosahujících někdy až 70% celkového buněčného proteinu (v průmyslově optimalizovaných kmenech a médiích). Tato technologie velmi usnadňuje následnou purifikaci proteinu po separaci a promytí inkluzních tělísek. Po jejich solubilizaci denaturačním činidlem a optimalizovaném refoldování produkovaného proteinu, lze takové proteiny poté purifikovat do vysoké čistoty s velmi vysokým výtěžkem. Tento způsob přípravy používáme i v případě našeho toxinu s výhodou již 20 let. Lepší způsob přípravy toxinu schopnéhopronikat do buněk zatím vynalezen nebyl. Jeho výhodou je, že tím získáváme formu rozvinutého proteinu analogického sekrečnímuintermediátu toxinu, který je v denaturačním roztoku velmi stabilní při skladování ve zmraženém stavu po mnoho let. Vyředění denaturačního roztoku s toxinem do buněčné suspenze pak vede k svinutí aspoň části molekul toxinu do funkční konformace, podobně jako po sekreci toxinu z bakteriální buňky kanálem o průměru pouhého 1 nm, kterým toxin musí procházet v rozvinuté "lineární" formě.Pokud je potřeba některý rekombinantní protein produkovat do rozpustné cytosolické frakce bakteriálních buněk, protože jej například nelze úspěšně refoldovat do biologicky nebo enzymaticky aktivní podoby, lze toho dnes již zpravidla dosáhnout ko-expresí vhodného chaperonu v bakteriálních buňkách a především snížením kultivační teploty. Dále může pomoci i přídavek různých činidel do kultivačního média, například betainu.Asi nejúspěšnější rutinní strategií v tomto směru je použití kmene E. coli BL21 Gold, jeho varianty Arctic Express, ve kterém jsou po indukci IPTG spolu s produkovaným proteinem syntetizovány též chaperony Cpn60 a Cpn10, produkované přirozeně při chladovém šoku bakteriálních buněk. Ty pak umožňují zpravidla úspěšně produkovat v rozpustné formě i velmi “obtížné” proteiny při kultivačních teplotách 4-12 °C, byť někdy s nepříliš vysokým výtěžkem.

Doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D. -3 dotazy:

1. Podle habilitační práce usuzuji, že v podstatě veškerá práce byla vykonána s ACT exprimovaným v E. coli, včetně

připravených mutantů s definovanými bodovými mutacemi. Zkoušeli jste se někdy vrátit k Bordetella sp., tedy připravit

stejné mutanty v původním hostiteli sledovat vliv těchto mutací na virulenci tohoto patogena?

Odpověď: Ano, tento typ experimentů jsme zahájili před 1,5 rokem a jsou předmětem disertační práce Ing. Karolíny

Baslerové. Tyto experimenty začaly být technicky schůdné poté, co jsme v roce 2006 získali velmi efektivní genetický

systém pro alelickou výměnu na chromozomu B. pertussis, vyvinutý dr. Scottem Stibitzem z CEBR FDA. Daný systém

umoţňuje efektivně vnášet do genomu B. pertussis bodové neznačené (marker-less) mutace, takţe nyní můţeme otestovat

vliv aminokyselinových záměn v proteinu CyaA na virulenci bakterie. Dalším, hlavním důvodem bylo, ţe jsme v roce 2009

popsali první kombinaci substitucí E570Q+K860R v proteinu CyaA (Osičková et al., 2010), která vede k zásadnímu sníţení

póro-tvorné (hemolytické) aktivity CyaA, aniţ by došlo k ovlivnění kapacity toxinu translokovat AC doménu do CD11b+

buněk a zvyšovat v nich hladinu intracelulárního cAMP. Doposud totiţ veškeré dostupné mutanty postrádali buďto jenom

enzymatickou AC aktivitu, nebo jak enzymatickou, tak hemolytickou aktivitu. To nám umoţnilo nyní jako prvním otestovat

příspěvek hemolytické aktivity CyaA k virulenci B. pertussis. Sledovali jsme rovněţ kolonizační schopnosti v myším modelu.

Výsledky, které budeme brzy publikovat, ukazují, ţe selektivní odstranění hemolytické aktivity vede ke sníţení virulence

bakterie, tedy ke sníţení LD50 o jeden řád, zatímco nehemolytické bakterie podané v niţších dávkách, kolonizují myši

stejně úspěšně jako nemutované bakterie. Hemolytická aktivita tedy nehraje roli v kolonizaci a ovlivňuje pouze

prozánětlivou reakci myšího imunitního systému.

2. K poznatkům, které nakonec vedou k aplikaci základního výzkumu do farmaceutické praxe došlo během pobytu

habilitanta ve Francii. Z toho vyplývá, ţe v případě komerční realizace by podíly z prodeje šly do Francie, nikoli do České

republiky. Je to tak pravda?

Odpověď: Je to pravda částečně, neb oponent správně konstatuje, ţe primární patentová přihláška na pouţitý systém

dopravy antigenů, ze které pak vycházely další aplikace, byla podaná v roce 1993, kdy jsem byl zaměstnancem Institut

Pasteur. Veškerá práva a výnosy z této přihlášky tak patří Institut Pasteur, který následně technologii licencoval firmě

Genticel Sarl. Nicméně, od mého návratu do MBÚ v roce 1995 jsme podali společně s francouzskou laboratoří Dr. Leclerc

další 4 mezinárodní patentové přihlášky. Jedna z nich, z roku 2003, je nyní součástí patentového portfolia licencovaného

firmou Genticel a pokud bude jimi vyvíjený preparát uveden na trh, budou mít MBÚ a čeští spoluautoři nárok na příslušné

podíly na čistých výnosech z prodeje preparátu. Čili, doufejme, ţe něco přijde i do ČR. Zatím v tomhle ohledu vypadá

slibněji situace u jiné společné patentové přihlášky, rovněţ se týkající studovaného toxinu.

3. Habilitant uvádí, že testování ACT při nádorové terapii bylo zahájeno v lednu 2011. Jsou po prvním roce

testování k dispozici již nějaké předběžné výsledky? Jak se připravuje ACT pro aplikaci lidem když autor uvádí,

že po expresi v E. coli se musí solubilizovat v 8M močovině?

Odpověď: Solubilizace, purifikace a skladování ACT v 8 M močovině nepředstavuje problém z hlediska

klinické aplikace. Naopak umoţňuje dosáhnout vysokou koncentraci proteinu, aniţ by došlo k jeho precipitaci a

následně jej z 8 M roztoku močoviny lyofilizovat a skladovat v podobě prášku ve stabilní formě i při pokojové

teplotě. Před injekci do kůţe nebo subkutánně se pak ředěním fyziologickým roztokem zředí močovina pod

denaturační koncentraci na méně neţ 0,8 M, ale typicky aţ na 80 mM a takový roztok se injikuje. Močovina je

biogenní látka, je netoxická, ve tkáních se rychle vyředí a je vyloučen z organismu. Kaţdopádně pro regulační

autoritu povolující klinické testy tento postup nepředstavoval ţádný problém.

Pokud jde o klinické studie, v současnosti probíhají dvě studie:

První je organizovaná firmou Genticel, s preparátem určeným pro imunoterapii nádorů děloţního čípku,

respektive eradikaci HPV-infikovaných epiteliálních buněk čípku. Zatím se jedná o čistou studii bezpečnosti

preparátu ve fázi I., která je prováděna na zdravých neinfikovaných dobrovolnicích a zároveň je sledováno

navození imunitní odpovědi na úrovni protilátek a buněčné imunity. Po roce lze sdělit pouze to, ţe preparát

vyrobený ve schématu cGMP jiţ byl podán několika desítkám dobrovolnic. Jakékoliv další informace jsou

předmětem obchodního tajemství firmy Genticel a do doby zveřejnění oficiálních, vyhodnocených a

validovaných výsledků klinické studie firmou Genticel, nelze je nijak komentovat.

Druhá klinická studie probíhá na klinice St. Luc v Bruselu. Z etických důvodů jde o sloučenou studii fáze I. a

IIa., s preparátem určeným pro imunoterapii metastazujícího melanomu u terminálně nemocných pacientů s

haplotypem HLA.A2., u kterých selhala jakákoliv předchozí léčba. V této studii se ověřuje jak bezpečnost, tak

imunitní odpověď navozená daným preparátem, tak jeho případný terapeutický uţitek pro pacienta. Studie byla

zahájená v lednu roku 2011 a postupně jsou do ní zařazováni indikovaní pacienti, kterých je ovšem relativně

málo a tak zařazení všech plánovaných 27 pacientů do studie potrvá několik let. Ve studii bude testováno

opakované podávání i postupné zvyšování dávky. Ohledne dosud získaných výsledků platí totéţ co u

předchozí studie. Do ukončení celé studie a kompletního vyhodnocení všech získaných dat, nelze sdělovat

ţádné dílčí výsledky a nemám souhlas sponzora klinické studie k tomu, abych mohl k probíhající studii cokoliv

dalšího veřejně říct.