NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek...
Transcript of NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek...
![Page 1: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/1.jpg)
NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ
“NAAT”
Dr. Dilek Çolak
![Page 2: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/2.jpg)
NAAT⇓
Mikroorganizmalara ait spesifik nükleik asit dizilerinin araştırılması
“İnsanlardaki parmak izi gibi”
![Page 3: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/3.jpg)
DNA YAPISI• Monoton yapıların peşpeşe
dizilmesi ile oluşmuş dünyanın belki de en sıkıcı molekülü
• Herhangi bir reaksiyonkatalize etmez
• Depolama ve kopyalama yapar:Basit kurallarla biraraya gelentamamlayıcı bazlardan oluşançift iplikli molekül!
![Page 4: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/4.jpg)
DNA Yapısı – 1953 James Watson and Francis Crick 1962 Nobel Ödülü (Fizyoloji/Tıp)
![Page 5: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/5.jpg)
DNA YAPISI
pürin pirimidin
![Page 6: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/6.jpg)
DNA hidrojen bağları ile birleşmiş iki uzun nükleotid zincirinden oluşur
A Nucleotide
![Page 7: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/7.jpg)
Çift iplikli DNA yapısı
![Page 8: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/8.jpg)
Tamamlayıcı baz çiftleri replikasyonda her ipliğin kalıp olmasını sağlar
DNA Replikasyonu
![Page 9: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/9.jpg)
DNA Replikasyonu
![Page 10: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/10.jpg)
DNA replikasyonundapek çok enzim görev alır
-DNA polimeraz
![Page 11: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/11.jpg)
Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı’nda NAAT Kullanımı
• Hedef Amplifikasyonu (Çoğaltma)Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)Ligaz zincir reaksiyonu (LCR)Strand displacement amplification (SDA)Transkripsiyon temelli amplifikasyon (TMA, NASBA)
• Sinyal amplifikasyonu (Çoğaltma)bDNADirekt hibridizasyon
![Page 12: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/12.jpg)
Hedef Çoğaltma
![Page 13: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/13.jpg)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
• 1983 Kary Mullis1993’de Nobel ödülü (kimya)
• Milyon kopya DNA!
![Page 14: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/14.jpg)
PCR:1. Nükleik asit ekstraksiyonu2. Amplifikasyon (Çoğaltma=PCR)
DenatürasyonBağlanmaUzama
3. PCR ürününün saptanmasıJel elektroforeziHibridizasyonDiğer
![Page 15: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/15.jpg)
1) DNA örneği2) Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer3) dNTP'ler (A,T,C,G),4) Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi
Taq polimeraz (Thermus aquaticus)5) Uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
![Page 16: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/16.jpg)
PCR94oC
55oC
72oC
![Page 17: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/17.jpg)
PCR
![Page 18: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/18.jpg)
• Thermal cycler
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Eski Yeni
![Page 19: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/19.jpg)
Polimeraz Zincir ReaksiyonuÇoğaltma sonrası saptama
![Page 20: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/20.jpg)
Cobas Amplicor CMV Monitor
Negatif
Pozitif
Polimeraz Zincir ReaksiyonuÇoğaltma sonrası saptama
![Page 21: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/21.jpg)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu:
•Multiplex PCR•Nested PCR•RT-PCR (RNA için cDNA sentezi)
Riboz şekerA=UG=C
•Real-Time PCR
![Page 22: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/22.jpg)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu:Real-Time PCR
![Page 23: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/23.jpg)
LCR
![Page 24: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/24.jpg)
SDA
![Page 25: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/25.jpg)
TMA
![Page 26: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/26.jpg)
1- Tam kandan nükleik asit izolasyonu1- Tam kandan nükleik asit izolasyonu
3- Hibridizasyon elekt.kemilumin.
saptama (CMV, IC)
3- Hibridizasyon elekt.kemilumin.
saptama (CMV, IC)
lineer faz
Primer 1Primer 1Revers TranskriptazRevers Transkriptaz
RNaRNazz HHPrimer 2Primer 2Revers TranskriptazRevers Transkriptaz
T7 RNA polT7 RNA poliimeramerazzPrimer 2Primer 2
Revers TranskriptazRevers Transkriptaz Revers TranskriptazRevers TranskriptazRNaRNazz H H Primer 1Primer 1
• sense RNA• antisense RNA• sense DNA• antisense DNA
amplifikasyon fazı
Nuclisens pp67 (NASBA) testiNuclisens pp67 (NASBA) testi
2- İzotermal amplifikasyon(41°)
2- İzotermal amplifikasyon(41°)
4. Duyarlılık: 700 RNA molekülü
Nuclisens pp67 mRNA NASBA
![Page 27: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/27.jpg)
Sinyal Çoğaltma
![Page 28: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/28.jpg)
DNA ekstraksiyonu vedenatürasyon
Hibridizasyon-1
Spesifik prob ilehibridizasyon
![Page 29: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/29.jpg)
Oluşan hibridinantikorla kaplıtüplerde yakalanması
Hibridizasyon-2
![Page 30: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/30.jpg)
Ortama enzimle işaretliantikorların eklenmesi
Hibridizasyon-3
Ortama substrateklenmesi ve renklenme
![Page 31: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/31.jpg)
Hybrid capture CMV DNA testi1-DNA
ekstraksiyonu(tam kan)
2-Hibridizasyon(CMV prob)
3-DNA: RNA hibridlerininyakalanması
4- Konjugateklenmesi
5- Saptama (kemilum.)
Duyarlılık: 2.1-830 pg DNA
![Page 32: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/32.jpg)
Quantiplex (bDNA) CMV testi
1-DNA izolasyonu ve denatürasyonu
2-HibridizasyonCMV gB/UL 56
solid faz
3-Hibridizasyon(bDNA)
4-bDNA hibridizasyonu
5-Substrat
İşaretli probO O OOH2
OPO-2
Duyarlılık: 900 kopya/106 lökosit
![Page 33: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/33.jpg)
bDNA
![Page 34: NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ.Dilek Çolaktip.akdeniz.edu.tr/wp-content/uploads/2016/10/N... · “İnsanlardaki parmak izi gibi ... Basit kurallarla biraraya gelen tamamlayıcı](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040221/5e39a5ba09884349ef624fd2/html5/thumbnails/34.jpg)
NAAT’ın mikrobiyolojide kullanım alanları:
1. Kültürü yapılamayan veya çok geç üreyen mikroorganizmaların araştırılması2. Kısa sürede, duyarlılığı ve özgüllüğüyüksek testlerle tanı konulması3.Antibiyotik direnç genlerinin araştırılması4. Mutant mikroorganizmaların araştırılması
Analitik duyarlılık = Klinik duyarlılık?