Noções básicas de citometria .1
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Noes bsicas de Citometria de Fluxo
O que um Citometro de Fluxo?
um aparelho que permite analisar parmetros (celulares?)
vrios
Capta e digitaliza a disperso de fotes, provocada pela passagem de partculas em suspenso alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz.
Princpio Fazer passar as partculas em suspenso, de uma forma alinhada, por um feixe de luz A interao das partculas com o feixe gera sinais que so captados por detectores apropriados A informao produzida pode ser gerada: - Pela disperso do feixe de luz - Pela luz emitida por fluorocromos aps excitao pelo feixe de luz
CITMETRO DE FLUXOCITMETRO DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
SISTEMA TICO
SISTEMA ELETRNICO
Componentes Bsicos de um Citmetro de FluxoFludico Fludico Suspenso de partculas Fluxo laminar Fonte de iluminao Captao da disperso da luz e da fluorescncia Filtrao da disperso e da fluorescncia
tica tica
Eletrnico Eletrnico
Converso do sinal em valores analgico-digitais Aquisio, Processamento, Anlise Armazenamento por computador
e
Fludos Injeco da amostra no lquido de envolvimento (sheath fluid), passando por um pequeno orifcio central do fluxo (50-300 m) As partculas fluem no centro, no se misturando com o restante lquido de envolvimento A injeo da amostra em fluxo laminar e a regulao da presso so conseguidas atravs: - Presso Diferencial - Velocidade de Fluxo - Fluxo Contnuo
Cmara de FluxoAgulha de injeco Lquido deenvolvimento
Laser
Disperso laser
Ponto de Hidrofocagem
FILTRO DE AR GERA PRESSO AO FLUIDO ENVOLVENTE SHEATH
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
Low Sample Pressure 12l/minLaminar Flow
High Sample Pressure 60l/minLaminar Flow
Sheath Sample
Sheath
Sheath
Sample
Sheath
tica Fontes de iluminao: Lmpadas de Mercrio
Lasers Emite num comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), monocromtico. Produz um feixe de luz coerente
SISTEMA PTICOSISTEMA COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER. A COLEO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER. UM SISTEMA DE ESPELHOS PTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES PTICOS ESPECFICOS.
Laser
Fotosensor de Disperso Frontal (FS) Capta a intensidade da disperso frontal A.
intensidade
da
disperso
frontal
proporcional ao tamanho e forma das partculasLaserSensor de FS
Fotosensor de Disperso Lateral (SS) Capta a intensidade e luz dispersa a 90o A intensidade dessa disperso proporcional ao tamanho, granularidade e forma das partculasLaserSensor de FS
Sensor SS 900
O que a Fluorescncia?
Laser
Intensidade de FluorescnciaEmitted Fluorescence IntensityFITC
Binding SitesFITC FITC FITC FITC FITC
FITC FITC FITC FITC
Numero de eventos
Intensidade de Fluorescncia
Disperso da Fluorescncia A fluorescncia emitida detectada por fotosensores que recebem o comprimento de onda seleccionado A especificidade da deteco de cada sensor controlada pela seleco do comprimento de onda, atravs de uma conjugao de filtros e de espelhos.LaserSensor de FS
Detectores de Fluorescncia (PMT1, PMT4 etc.)
Filtros pticos coletar sinais de luzEspelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu nmero deixado passar e menor que seu nmero refletido. Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu nmero deixado passar e acima de seu nmero refletido. Espelhos BP (bandpass) = s deixa passar o comprimento de onda especfico. Longpass460 500 540
Shortpass460 500 540 460
Bandpass500 540
FiltroLP 500 SP 500 BP500/30
Detector clula fotoeltrica
Filtro ou Espelho Dicrnico Colocado a 45o
Fonte de Luz
Luz Transmitida
Luz Refletida
Captao dos ParmetrosPMT4
Cmara de Fluxo
Filtros DicricosPMT2 PMT 1
PMT3
Filtros Bandpass
Fotosensores
Laser
Eletrnica Processamento electrnico do sinal gerado nos sensores que traduzido num histograma ou scatter plot
SISTEMA ELETRNICOA medida proveniente de cada detector denominada Parmetro Parmetro 1 Parmetro 2 Parmetro 3 Parmetro 4 Parmetro 5 FSC SSC FL1 FL2 FL3
FLUORESCNCIAS O detector de FL-1 (Fluorescncia 1) capta luz de comprimento de onda 530 nm, que corresponde luz verde. O detector de FL-2 (Fluorescncia 2) capta luz de comprimento de onda 570 nm, o que corresponde luz laranja. O detector de FL-3 (Fluorescncia 3) capta luz de comprimento de onda 650 nm, o que corresponde luz vermelha.
DISPERSOBLASTOS
VOLUME (FS)
POLIMORFONUCLEARES MONCITOS
LINFCITOS DEBRIS/HEMCIAS/PLAQUETASGRANULARIDADE (SS)
O que pode ento dizer um citmetro de fluxo de uma clula? Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Fluorescncia relativa. (FL1, FL2, FL3, Complexidade Antgenos celulares Tamanho Metabolismos Enzimas Receptores ADN Citoquinas
nfection of microvascular endothelial cells with ExoU-producing Control PA103 PA103DexoU udomonas aeruginosa triggers the release of von Willebrand fac and platelet adhesion
Controle
PA103
PA103exo U
Superfcie
Intracelular
Citometria de Fluxo Citometria de Fluxo
Contr ol
PA1 03
PA103ex oU
Agregao plaquetria