ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG VÀ KÍCH THÍCH SINH ...
Transcript of ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG VÀ KÍCH THÍCH SINH ...
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Đào Thùy Dương
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG
VÀ KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA
CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội, 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Đào Thùy Dương
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG
VÀ KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA
CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà
Hà Nội, 2020
i
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do tôi trực tiếp thực hiện.
Các số liệu và kết quả là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất
kỳ một công trình nghiên cứu nào.
.
Tác giả
Đào Thùy Dương
ii
Lời cảm ơn
Trong quá trình học tập, thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của các đoàn thể, cá nhân trong và ngoài
trường. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy
giáo PGS.TS. Chu Hoàng Hà cùng các cán bộ, nghiên cứu sinh của Phòng
Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa
học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được
học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc
trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm
vi sinh CAFE-HTD01 và HOTIEU-HTD03 và sử dụng tích hợp các chế phẩm
sinh, hóa học nhằm phát triển hiệu quả và bền vững cây cà phê và hồ tiêu ở
Tây Nguyên” mã số KHCN-TN/16-20, thuộc Chương trình Tây Nguyên 3 do
TS. Hà Việt Sơn làm Chủ nhiệm.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân
trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và
khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả
Đào Thùy Dương
iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Chữ viết tắt/ký hiệu Giải nghĩa đầy đủ
B. megaterium 18 Bacillus megaterium 18
CMC Carboxymethyl Cellulose
IU International Unit
ICO International Coffee Organization
IAA Indole-3-acetic acid
PTSH Phòng trừ sinh học
Gr Gram
OD Optical Density (Mật độ quang học của dung dịch)
VSV Vi sinh vật
VSVNS Vi sinh vật nội sinh
VK Vi khuẩn
M Molar
DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid
- Không có hiệu lực
+ Có hiệu lực
ĐC Đối chứng
TN Thí nghiệm
TN1 Thí nghiệm 1
TN2 Thí nghiệm 2
iv
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần các loài tuyến trùng ký sinh hại cà phê 8
Bảng 3.1. Khả năng lên men sinh axit từ các nguồn cơ chất của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium 18 dựa trên kít
chuẩn API 50CHB
33
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của
chủng Bacillus megaterium 18 theo thời gian
36
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp
enzym của chủng Bacillus megaterium 18
37
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng
của chủng vi khuẩn
38
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng
của chủng vi khuẩn
39
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ đến khả năng sinh
chất kháng sinh của chủng Bacillus megaterium 18
39
Bảng 3.7. Khả năng kháng tuyến trùng sau 24 giờ nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm
41
Bảng 3.8. Sinh trưởng của thuốc lá K326 sau lây nhiễm vi sinh vật 44
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều cao và
số cặp lá của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm vi
khuẩn nội sinh
46
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều dài rễ
chính và số rễ nhánh của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây
nhiễm
48
Bảng 3.11. Sinh trưởng của cây cà phê tại vườn ươm sau 3,6 và 9
tháng
49
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh tới khả năng sinh trưởng và phát triển của cây cà phê
50
v
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Tác dụng của vi khuẩn nội sinh thực vật và ứng dụng 13
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld 27
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng Bacillus megaterium
18
32
Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của chủng vi khuẩn 34
Hình 3.3. Khả năng làm loãng gelatin của chủng Bacillus megaterium
18
35
Hình 3.4. Ảnh thử nghiệm khả năng ức chế trứng nở sau 7 ngày của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ
10%
42
Hình 3.5. Ảnh thử nghiệm khả năng giết chết ấu trùng sau 7 ngày của
chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ
10%
42
Hình 3.6. Cây thuốc lá ở các công thức sau 15 ngày lây nhiễm 45
Hình 3.7 Cây thuốc lá ở các công thức sau 30 ngày lây nhiễm 45
Hình 3.8. Cây cà phê ở công thức ĐC, TN1 và TN2 sau 28 ngày lây
nhiễm
47
Hình 3.8. Cà phê tại vườn ươm sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng 50
vi
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ ........................................................... 3
1.1.1. Lịch sử phát triển của cây cà phê......................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây cà phê ....................................................................... 4
1.1.3. Một số bệnh thường gặp ở cây cà phê ................................................................ 5
1.2. TUYẾN TRÙNG THỰC VẬT VÀ TUYẾN TRÙNG HẠI CÂY CÀ PHÊ
....................................................................................................................... 7
1.2.1. Cấu tạo và phân loại tuyến trùng thực vật .......................................................... 7
1.2.2. Thành phần các loài tuyến trùng gây hại cây cà phê ......................................... 8
1.2.3. Tình hình tuyến trùng hại cây cà phê ở Việt Nam ............................................. 9
1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN NỘI SINH THỰC VẬT ...................... 11
1.3.1. Vi khuẩn nội sinh thực vật ................................................................................. 11
1.3.1.1. Định nghĩa ........................................................................................................ 11
1.3.1.2. Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh thực vật ........................................................... 11
1.3.2. Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật .............................................................. 12
1.3.2. Một số ứng dụng của vi sinh vật trong phòng trừ tuyến trùng ....................... 14
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ PHÊ ...... 18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ..................................................................... 18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ...................................................................... 21
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 23
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 23
2.2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................. 23
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................. 23
vii
2.4. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT................................................................... 24
2.4.1. Thiết bị chính....................................................................................................... 24
2.4.2. Hóa chất chính..................................................................................................... 24
2.4.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................... 24
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 24
2.5.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật [53]......................................................... 24
2.5.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn . 24
2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi
khuẩn [53] ...................................................................................................................... 26
2.5.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym ...................................................... 27
2.5.2. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với thực vật của chủng
Bacillus megaterium 18 ................................................................................................ 28
2.5.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng
cây thuốc lá .................................................................................................................... 28
2.5.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium
18 đến sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vườn ươm. ................................ 28
2.5.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh
trưởng cây cà phê giai đoạn cây con và giai đoạn cây 1,5 tuổi ........................... 29
2.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU................................................................................... 31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 32
3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NGHIÊN CỨU ................. 32
3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào ............................................................ 32
3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................................................. 32
3.1.3. Khả năng phân giải cơ chất của chủng nghiên cứu ......................................... 34
3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus
megaterium 18 ............................................................................................................... 35
viii
3.1.4.1. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của
chủng vi khuẩn nghiên cứu .......................................................................................... 35
3.1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp chitinase của chủng vi khuẩn ................................................................................ 37
3.1.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
chitinase của chủng vi khuẩn........................................................................................ 38
3.1.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng của các chủng vi
khuẩn .............................................................................................................................. 39
3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG CỦA CHỦNG
Bacillus megaterium 18 Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM ....................... 40
3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY
CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium 18 ..... 44
3.3.1. Kết quả thử nghiệm trên cây thuốc lá in vitro .................................................. 44
3.3.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 lên sinh trưởng của cây
cà phê ở giai đoạn vườn ươm ....................................................................................... 46
3.3.2.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 đến sinh trưởng của
cây cà phê sau 1 tháng theo dõi .................................................................................... 46
3.3.2.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium đến sinh trưởng của cây
cà phê sau 3,6,9 tháng theo dõi. ................................................................................... 49
3.3.2.3. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. Megaterium 18 đến sinh trưởng của
cây cà phê 1,5 tuổi ......................................................................................................... 51
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................. 53
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 53
4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 54
1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, sự phát triển của ngành nông nghiệp đang đi vào mức độ
thâm canh, với việc sử dụng ngày càng nhiều phân hóa học, thuốc bảo vệ thực
vật hóa học, phá rừng canh tác cây công nghiệp chạy theo năng suất, sản
lượng…đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối,
mất cân bằng hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các
chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh trong đất ngày càng tích
lũy….Ðể đối phó với vấn đề này, việc kiểm soát sâu, bệnh hại bằng biện pháp
sinh học ngày càng được chú ý đến và đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện
trong thời gian gần đây [1].
Cà phê là một trong những mặt hàng nông sản chiến lược, đóng góp
hơn 3,5 tỷ USD cho ngân sách nhà nước [2]. Chủ trương của Nhà nước là
hình thành các vùng trồng cà phê lớn, sản xuất bền vững, đạt các tiêu chuẩn
của cà phê chứng chỉ quốc tế đáp ứng nhu cầu xuất khẩu và mang lại giá trị
lợi nhuận cao [3]. Tuy nhiên, sản xuất cà phê Việt Nam nói chung hiện đang
phải đối mặt với nhiều thách thức, trong đó có vấn đề lạm dụng phân bón hóa
học [4]. Điều này chẳng những làm gia tăng chi phí sản xuất mà còn đã và
đang làm giảm khả năng chống chịu của cây cà phê dẫn đến bùng nổ dịch
bệnh, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng cà phê Việt Nam trên thị trường
thế giới và cũng là nguyên nhân có thể dẫn đến thoái hóa đất canh tác, ô
nhiễm nguồn nước và môi trường sống. Ngoài ra, dư lượng hóa học còn làm
giảm chất lượng hạt cà phê nhân, làm sản phẩm khó có thể đi vào các thị
trường đòi hỏi chất lượng cao. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các giải pháp
thay thế một phần phân bón và thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong sản xuất
cà phê hiện đang là vấn đề quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Một trong những bệnh điển hình của cây cà phê đang phải đối mặt đó là
bệnh sần rễ gây vàng lá rồi chết, bệnh chủ yếu do tuyến trùng gây sần rễ gây
ra. Tuyến trùng Meloidogyne incognita là một trong những tuyến trùng gây
sần rễ, là tác nhân chủ yếu gây hại cho cây trồng trong đó có cây cà phê.
Vi sinh vật nội sinh được xem là một trong những đối tượng quan
trọng, được phân lập và sàng lọc để làm chế phẩm sinh học dùng cho việc
2
phòng trừ các loại nấm bệnh. Lợi dụng đặc tính vi sinh vật sống nội sinh
trong tế bào mô thực vật đã rút ngắn được thời gian thích nghi của chế phẩm
sinh học. Vi sinh vật nội sinh có thể đối kháng với nấm bệnh, kích thích sự
sinh trưởng cho cây và đồng thời không ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe
cộng đồng [5]. Khảo sát về vi sinh vật nội sinh đã được nghiên cứu trong
nhiều loại cây trồng quan trọng như lúa mỳ, chuối, đậu nành và cà chua,
nhưng phần lớn vi sinh vật nội sinh trên cây cà phê vẫn còn chưa nhiều
nghiên cứu sâu [6].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá khả
năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng
vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium”
Mục đích, yêu cầu:
- Mục đích: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh
trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium.
- Yêu cầu: Sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh và hóa sinh để
thử nghiệm và đánh giá: khả năng diệt tuyến trùng, khả năng sinh tổng hợp
enzyme chitinase và cellulase cao, sinh tổng hợp hàm lượng IAA.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ
1.1.1. Lịch sử phát triển của cây cà phê
Cà phê thuộc bộ Rubiales, họ Rubiacea, chi Coffea. Theo phân loại
thực vật học cà phê có khoảng 500 loài với trên 6.000 loại. Tất cả các loại cà
phê đều có nguồn gốc từ Châu Phi, loại sống hoang dại đã nổi tiếng và lâu đời
nhất là cà phê chè (Coffea arabica). Cây cà phê chè mọc hoang dại được biết
đến đầu tiên ở vùng biên giới giáp cao nguyên Boma và Sudan. Năm 1889 đã
tìm thấy cà phê vối (Coffea canephora) mọc hoang dại ở vùng thuộc Công Gô
và mọc rải rác ở một số vùng khác thuộc Tây Phi gần xích đạo. Cây cà phê
được trồng trọt từ thế kỷ XIV tại vùng Arabica (Yêmen). Theo Vesling, quả
cà phê được đem từ Yêmen sang bán ở vùng Ai Cập duới dạng quả khô và coi
đây là thứ hàng rất xa xỉ. Vào thế kỷ XVII người ta đã lấy cà phê đã rang xay
trộn vào dầu mỡ được chứa trong các túi làm thực phẩm để vuợt sa mạc.
Hiện nay trên thế giới đang trồng các loài cà phê có giá trị kinh tế sau:
Cà phê chè (Coffea arabica Line): Ðược trồng có hệ thống đầu tiên vào
khoảng thế kỷ XV tại các khu vườn ở miền nam Yêmen. Từ giữa thế kỷ XVII
người Ả-rập mất vị trí độc tôn trong việc trồng cà phê và cà phê chè được lan
rộng khắp thế giới. Nguồn gốc từ Ethiopia đến Yêmen sang Yava (1960) đến
Amsterdam (Hà Lan) năm 1706, sang Trung Mỹ Năm 1724, đến Colombia
năm 1724, từ Yêmen sang Brazil năm 1715 và từ Yava sang Papua New
Guinea vào năm 1770. Hiện nay cà phê chè được trồng tập trung chủ yếu tại
Brazil, Colombia, Mêhicô và các nước Trung Phi. Cà phê chè bao gồm các
chủng phổ biến như: Coffea arabica L. var. Typica, Coffea arabica L. var.
Bourbon, Coffea arabica L. var. Amarello chev, Coffea arabica L. var.
Caturra, Coffea arabica L. var. Mokka, Coffea arabica L. var. Mundonovo,
Coffea arabica L. var. Catuai, Coffea arabica L. var. Catimor [7].
Cà phê vối (Coffea canephora Piere): Cà phê vối từ Tây Phi và
Madagascar đưa sang Nam Mỹ và Amsterdam, Hà Lan vào năm 1899. Cà phê
vối không chịu được lạnh như cà phê chè vì vậy việc gieo trồng chỉ hạn chế
tại một số vùng có điều kiện sinh thái đặc trưng, đồn điền cà phê vối đầu tiên
4
xuất hiện tại Java năm 1900. Cà phê vối chủ yếu được trồng nhiều ở một số
nước là Indonesia, Bờ Biển Nga, Uganda, Việt Nam. Cây cà phê vối chịu
được nhiệt độ nóng ẩm, năng suất cao nhưng hương vị nước uống kém hơn cà
phê chè. Khác với cây cà phê chè, cà phê vối là cây thụ phấn chéo và chỉ ra
hoa một lần trên nách của cành ngang.
Cà phê mít (Coffea excelsa Chev): Cà phê mít dâu da (Coffea liberica
Bull in Hiern). Hai loại cà phê này chỉ được trồng tại các nước Châu Phi như
Liberia, Sierra Leon, Cộng Hòa Trung Phi, Benin và các nước Châu Á như
Philipin, Indonesia, Việt Nam. Hai loại cà phê này sinh trưởng khỏe, khả năng
thích ứng rộng, ít sâu bệnh, nhưng chất lượng nước uống kém, hàm lượng
caffein thấp. So với cà phê chè và cà phê vối thì sản lượng của hai loại cà phê
này không đáng kể [8].
1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây cà phê
Thân: Cây cà phê chè có thể cao tới 6 m, cà phê vối tới 10 m. Tuy
nhiên ở các trang trại cà phê người ta thường phải cắt tỉa để giữ được độ cao
từ 2-4 m, thuận lợi cho việc thu hoạch. Cây cà phê có cành thon dài, lá cuống
ngắn, xanh đậm, hình ovan. Mặt trên lá có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh
nhạt hơn. Chiều dài của lá khoảng 8-15 cm, rộng 4-6 cm. Rễ cây cà phê là
loại rễ cọc, cắm sâu vào lòng đất từ 1 - 2,5 m với rất nhiều rễ phụ tỏa ra xung
quanh làm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng nuôi cây [6].
Hoa: Hoa cà phê màu trắng, có năm cánh, thường nở thành chùm đôi
hoặc chùm ba. Màu hoa và hương hoa dễ làm ta liên tưởng tới hoa nhài. Hoa
chỉ nở trong vòng 3 đến 4 ngày và thời gian thụ phấn chỉ vài ba tiếng. Một
cây cà phê trưởng thành có từ 30.000 đến 40.000 bông hoa. Ngay từ khi cây
cà phê ra hoa kết quả người ta đã có những đánh giá đầu tiên về vụ mùa cà
phê. Ở các nước sản xuất cà phê lớn điều này đặc biệt quan trọng trong việc
đưa ra những nhận định về giá cả và thị trường. Tuy vậy những đợt rét đậm
hoặc hạn hán có thể làm đảo lộn mọi sự tính toán và đẩy thị trường vào tình
thế hoàn toàn khác [6].
Quả: Cà phê là loài cây tự thụ phấn, do đó gió và côn trùng có ảnh
hưởng lớn tới quá trình sinh sản của cây. Sau khi thụ phấn quả sẽ phát triển
5
trong 7 đến 9 tháng và có hình bầu dục, bề ngoài giống như quả anh đào.
Trong thời gian chín, màu sắc của quả thay đổi từ xanh sang vàng rồi cuối
cùng là đỏ. Quả có màu đen khi đã chín nẫu. Do thời gian đâm hoa kết trái lâu
như vậy mà một vụ cà phê kéo dài gần một năm trời và có thể xảy ra trường
hợp trên một cây vừa có hoa, vừa có quả. Thông thường một quả cà phê chứa
hai hạt. Chúng được bao bọc bởi lớp thịt quả bên ngoài [6].
1.1.3. Một số bệnh thường gặp ở cây cà phê
Một vấn đề đáng quan tâm trong những năm qua là tình hình phát sinh
sâu bệnh trên cây cà phê đang diễn biến hết sức phức tạp, việc áp dụng các
biện pháp phòng trừ sâu bệnh vẫn còn nhiều hạn chế, nhiều loại bệnh chưa có
thuốc đặc trị, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên cây cà phê cũng có
nhiều vấn đề đáng bàn…
Một ví dụ cụ thể như sự xuất hiện của loại ve sầu gây hại cà phê mới đây
đã huỷ diệt trên diện rộng đến hàng chục ngàn ha cà phê tại nhiều tỉnh thành trên
cả nước, trong đó đặc biệt là ở các vùng chuyên canh cây cà phê như Đắk Lắk,
Lâm Đồng, Gia Lai, Đắk Nông… gây thiệt hại lớn cho người dân và làm cho sự
phát triển của cây cà phê trong thời gian tới chưa được bền vững. Cho nên, để
cho cây cà phê phát triển ổn định và bền vững thì vấn đề bảo vệ thực vật cho cây
cà phê là hết sức cần thiết và đáng quan tâm nhất hiện nay [9].
Theo kinh nghiệm thực tế thì sâu bệnh thường sẽ xuất hiện sau khi thu
hoạch xong cà phê cho đến cuối mùa nắng, đầu mùa mưa. Đây là giai đoạn
phát triển khá nhanh và khá nhiều loại sâu bệnh trên cây cà phê.
Theo Cục Bảo vệ thực vật cho biết, tập đoàn sâu bệnh hại trên cây cà
phê rất phong phú và đa dạng gồm 18 loại sâu bệnh chính. Các loài sâu hại
quan trọng thuộc 6 họ của 3 bộ gồm: bộ cánh cứng, bộ cánh đều, bộ cánh vảy.
Trong đó xuất hiện phổ biến nhất là các loại bệnh sau: rệp sáp, ve sầu hại rễ,
sâu đục thân, đục cành, đục quả; bệnh gỉ sắt và các loại bệnh nấm…[10]. Một
trong số những bệnh gây hậu quả nghiêm trọng trên cây cà phê đó là 2 loại
bệnh sau:
a, Bệnh rễ do tuyến trùng (Nematodes)
Một số loại tuyến trùng gây hại đối với cà phê ở Việt Nam là:
6
- Tuyến trùng gây vết thương: Pratylenchus coffea.
- Tuyến trùng gây nốt sần: Meloidogyne spp.
- Tuyến trùng nội sinh và nửa nội sinh là: Tylenchus và Pratylenchus,…
Tuyến trùng có thể gây tác hại trong thời kỳ vườn ươm nhưng chủ yếu
là ở trên vườn trồng. Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa
khô thường bị vàng héo, cây bị nặng có thể chết khô ngay ở trên lô trồng.
Triệu chứng của tuyến trùng gây vết thương là làm cho rễ bị sưng u, có những
đường nứt nẻ. Còn tuyến trùng gây nốt sần chỉ ở trên các rễ phụ có những u
dạng nốt sần.
Biện pháp phòng trừ:
Những cây bị bệnh nặng nhổ đem đi đốt. Những vùng đã bị bệnh nặng
cần luân canh với cây trồng khác, hoặc cải tạo đất bằng cây phân xanh ít nhất từ
2 - 3 năm sau mới trồng lại cà phê. Con đường chọn lọc giống chống bệnh dùng
gốc ghép chống bệnh cũng thường được chú ý để phòng chống bệnh này. Những
cây bị bệnh nhẹ tăng cường bón phân hữu cơ, có thể dùng một số loại thuốc sau
đây để bơm vào đất xử lý: Nemaphos, Teracur, Nemagon, Methylbromid. Cây
cúc vạn thọ cũng là cây có khả năng diệt tuyến trùng. Trồng cây này trong vùng
cây bị bệnh hoặc xung quanh gốc cây cà phê để chúng tiết ra các chất diệt tuyến
trùng trong đất hoặc ở vùng xung quanh bộ rễ của nó. Có thể đem băm thân và
rễ cây cúc vạn thọ sau đem vùi vào gốc cà phê.
b, Bệnh thối rễ
Một số loại nấm ở trong đất thuộc chi Rhizoctonia, Fusarium... tấn
công gây tác hại vào bộ rễ của cây cà phê. Triệu chứng: Trên các rễ ngang,
chóp rễ, phần rễ đuôi chuột xuất hiện những vết thối mềm có màu thâm đen.
Cây bị bệnh sinh trưởng cằn cỗi, lá vàng, héo, cây bị nặng sẽ bị chết [19].
Biện pháp phòng trừ: Chú ý tới biện pháp thâm canh, tăng cường bón
phân hữu cơ, cải thiện đặc điểm lý và hóa tính của đất đặc biệt là giảm độ
chua của đất. Hiện nay chưa có những loại thuốc hóa học để phòng trừ bệnh
thối rễ có hiệu quả [11].
7
1.2. TUYẾN TRÙNG THỰC VẬT VÀ TUYẾN TRÙNG HẠI CÂY CÀ PHÊ
1.2.1. Cấu tạo và phân loại tuyến trùng thực vật
Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống có đặc điểm
sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có
một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm
sinh thái khác, như có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút
chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước
của trứng lớn hơn kích thước của cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt
buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút
chuyển hóa là khác biệt quan trọng nhất. Về mặt phân loại học, tuyến trùng ký
sinh thực vật gồm 4 nhóm liên quan đến 4 bộ tuyến trùng là: Bộ Tylenchida
(chỉ trừ một số loài tuyến trùng họ Tylenchidae); Bộ Aphelenchida; Các loài
tuyến trùng họ Longidoridae của bộ Dorylaimida; Các loài tuyến trùng họ
Trichodoridae thuộc bộ Triplonchida. Trong các nhóm ký sinh trên thì nhóm
loài thuộc bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng ký sinh đông đảo nhất và có
tầm quan trọng nhất đối với sản xuất nông nghiệp.
Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật
đang phát triển, hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm
tuyến trùng ký sinh nhất. Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán
dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của
thực vật, một số khác thâm nhập vào các mô sâu hơn, và một số khác có thể
làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng đặc biệt tại nơi chúng ký
sinh. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ,
tuy nhiên khi mật độ lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng
có thể gây chết thực vật. Ngoài ra, một vài tuyến trùng có thể làm giảm khả
năng của thực vật trong việc kháng lại sự xâm nhập của các tác nhân vi sinh
vật gây bệnh khác và làm cho tác hại của chúng đối với thực vật càng trầm
trọng thêm. Một số tuyến trùng ký sinh chuyển hóa có khả năng lan truyền
virus gây bệnh cho thực vật. Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5% sản
lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng ký sinh đối với cây trồng nông
nghiệp ước tính hàng trăm tỷ đô la Mỹ mỗi năm.
8
Về hình thức ký sinh trên thực vật, tuyến trùng có thể phân thành 3
nhóm ký sinh như sau:
- Ngoại ký sinh: tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong mô thực
vật mà bám bên ngoài bề mặt của rễ, dinh dưỡng của tuyến trùng bằng việc sử
dụng kim chích châm chích và hút chất dinh dưỡng trong tế bào thực vật.
- Bán nội ký sinh: chỉ phần đầu của tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ,
còn phần sau cơ thể tuyến trùng vẫn ở ngoài đất.
- Nội ký sinh: toàn bộ tuyến trùng xâm nhập vào bên trong rễ. Nhóm
này được chia thành 2 nhóm nhỏ:
+ Nội ký sinh di chuyển: tuyến trùng vẫn giữ khả năng di chuyển trong
mô thực vật và chúng chuyển động từ mô này đến mô khác để hút dinh dưỡng.
+ Nội ký sinh cố định: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh
dưỡng tại một nơi cố định tạo nên các tế bào dinh dưỡng, chúng mất khả năng
di chuyển và trở nên phình to ra (béo phì).
1.2.2. Thành phần các loài tuyến trùng gây hại cây cà phê
Theo White T., thì thành phần tuyến trùng kí sinh hại cà phê gồm các loài
như sau:
Bảng 1.1. Thành phần các loài tuyến trùng ký sinh hại cà phê [12].
Loài Cà phê chè
(Coffea arabica Line)
Cà phê vối
(Coffea canephora Line)
Nội kí sinh
(endoparasit) ∗Meloidogyne sp. , M.africana,
M. exigua, M. coffeicola,
M. decalineata, M. megadora.
∗Pratylenchus sp., P. coffea. ∗ Radopholus similis ∗ Rotylenchulus reniformis
∗Meloidogyne sp., M. megadora.
∗Pratylenchus sp., P. brachyurus,
P. coffea.
∗Radopholus similis
Bán ký sinh
(semi – ectoparasit) và
ngoại sinh
(ectoparasit)
∗Ditylenchus procerus. ∗ Helicotylenchus erythrinea.
∗ Paratylenchus besoekianus, Paratylenchus acrophallus.
∗ Trichodorus christiae, T. monchystera .
∗ Xiphinema mericantum, X.brevicola, X.insigne, X.radicicola
* Ditylenchus procerus.
∗Helicotylenchus erythrinea.
9
1.2.3. Tình hình tuyến trùng hại cây cà phê ở Việt Nam
Việc đẩy mạnh tái canh, thay thế vườn cây già cỗi đang đứng trước
không ít trở ngại cho ngành cà phê Việt Nam do chi phí trong quá trình tái
canh cao, tỷ lệ sâu bệnh nhiều, đặc biệt nghiêm trọng là bệnh tuyến trùng hại
rễ - một trong những khó khăn chính ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất cà
phê trên thế giới. Các nhóm tuyến trùng phổ biến nhất và gây hại nhiều nhất
trên cà phê là Meloidogyne và Pratylenchus. Tại Việt Nam các loài tuyến
trùng Pratylenchus coffea, Meloidogyne spp. và Radopholus arabocoffea
được biết đến là tác nhân chính gây hại cho 24%, 9% and 12% các mẫu rễ cà
phê được phân tích. Tại Việt Nam vào những năm 1970, tuyến trùng
Pratylenchus coffeae đã làm suy yếu và chết hàng loạt các vườn cà phê chè tại
Phủ Quỳ - Nghệ An. Đến năm 1994, hiện tượng vàng lá do các bệnh hại rễ
xuất hiện phổ biến tại một số tỉnh trồng cà phê của tỉnh Đăk Lăk và sau đó là
các vùng trồng khác của Tây Nguyên, gây hại hàng trăm ha cà phê tại Đăk
Lăk. Năm 1997, ở Đăk Lăk có trên 3.000 ha cà phê bị vàng lá, trong đó có
gần 50% diện tích vàng lá do các bệnh hại rễ. Gần đây nhất, trong năm 2008
tại vùng Phủ Quỳ - Nghệ An đã có gần 100ha cà phê chè Catimor được trồng
lại trên đất cà phê được thanh lý cũng đã bị tuyến trùng gây hại và chết hàng
loạt. Tuyến trùng có thể gây tác hại trong thời kỳ vườn ươm nhưng chủ yếu là
ở trên đồng ruộng. Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa
khô thường bị vàng héo, cây bị nặng có thể chết khô ngay ở trên lô trồng.
Triệu chứng của tuyến trùng gây vết thương là làm cho rễ bị sưng u, có những
đường nứt nẻ. Còn tuyến trùng gây nốt sần chỉ ở trên các rễ phụ có những u
dạng nốt sần [13].
Việc phòng trừ nhóm tuyến trùng gây hại rất khó khăn ngay cả khi sử
dụng các biện pháp hóa học, sinh học. Ngoài ra các biện pháp canh tác để hạn
chế nhóm tuyến trùng được sử dụng như việc để đất hoang hóa một thời gian
dài trước khi canh tác mới hay luân canh đều không mang lại hiệu quả cao do
ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập kinh tế của người trồng cà phê. Đây là vấn
đề nan giải đòi hỏi các biện pháp giải quyết triệt để nhằm đảm bảo sự phát
triển ổn định và bền vững của ngành cà phê Việt Nam [14].
10
Các nghiên cứu gần đây cho thấy chất đất và hệ vi sinh vật tồn tại trong
đất là một trong những nguyên nhân cơ bản tác động đến sự phân bố của
tuyến trùng. Số lượng và thành phần của tuyến trùng khác nhau trong các mẫu
đất có đặc điểm khác nhau P. Q. Trinh và đồng sự [15] đã xác định rằng tuyến
trùng thuộc nhóm Meloidogyne spp. được tìm thấy nhiều trong đất sét, trong
khi nhóm tuyến trùng R. Arabocoffeae tập trung chủ yếu trong đất cát và đất
mùn và Pratylenchus spp. tồn tại với số lượng lớn trong đất cát. Nhóm tác giả
này cũng chỉ ra rằng trong điều kiện nhà kính vi khuẩn Pasteuria penetrans
có khả năng hạn chế đáng kể số lượng tuyến trùng trong đất trồng cà phê.
Theo thống kê của Viện Khoa học kỹ thuật nông- lâm nghiệp Tây
Nguyên hiện có khoảng 30% diện tích trồng cà phê đang già cỗi cần phải tái
canh, tập trung chủ yếu tại Đắk Lắk và Lâm Đồng. Đắk Lắk hiện có trên
185.000 ha cà phê, sản lượng hàng năm đạt 380.000 tấn cà phê nhân. Tuy
nhiên, 51% diện tích cà phê ở tỉnh này có độ tuổi trên 15 năm, nên trong 5-10
năm nữa, cây sẽ bị “lão hóa”, hết chu kỳ kinh doanh cho hiệu quả, phải cưa
đốn, phục hồi, hoặc tái canh. Diện tích cà phê già cỗi cần phải trồng thay thế
và chuyển đổi trong 5 - 10 năm tới nếu không sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới năng
suất và chất lượng của cà phê Việt Nam.
Thực tế đã được chứng minh trong thực tiễn sản xuất cà phê ở Đắk
Lắk: Một số diện tích cà phê đã già cỗi hoặc bị sâu bệnh hại đã hủy đi để
trồng lại. Các diện tích này do không được luân canh với những cây trồng
khác mà sau khi nhổ cây cày bừa làm đất lại đem trồng mới cà phê ngay. Hậu
quả là các diện tích này khi bước sang năm thứ 2 thì đã có một số cây vàng
héo rồi chết, sang năm thứ 3 tỷ lệ cây chết tăng lên và cuối cùng phải hủy cả
vườn cây. Một số vườn cây chỉ hủy bỏ một vài cây xấu, bị sâu bệnh đem
trồng cây con cà phê ngay nhưng sau từ 2 đến 3 năm những cây trồng lại này
cũng già cỗi, vàng héo rồi chết.
Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nhiều loại sinh
vật gây hại cho cà phê như tuyến trùng, nấm, rệp sáp, mối…Ngoài ra chế độ
dinh dưỡng và chế độ canh tác cũng ảnh hưởng đến cây cà phê. Để có thể tái
canh bền vững phải phòng trừ được các yếu tố này. Theo Nguyễn Văn Tuất
và cộng sự [16], khi nghiên cứu nguyên nhân gây vàng lá, chết cây ở nhóm cà
11
phê tái canh ở Tây Nguyên đã xác định được tuyến trùng và nấm là nguyên
nhân chủ yếu gây ra bệnh vàng lá, thối rễ ở cây cà phê [16]. Trong đó hai loài
tuyến trùng gây bệnh Paratylenchus cofeae và Meloidogyne sp. là nguyên
nhân đầu tiên xâm nhiễm, sau đó nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani xâm nhập làm bệnh trầm trọng thêm [17].
1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN NỘI SINH THỰC VẬT
1.3.1. Vi khuẩn nội sinh thực vật
1.3.1.1. Định nghĩa
Vi khuẩn nội sinh thực vật ("Endophytic bacteria") hiểu theo nghĩa đen
là vi khuẩn cư trú bên trong cây ("endon" = bên trong; "phyton" = cây). Kể từ
khi phát hiện ra các vi sinh vật nội sinh ở Đức vào năm 1904, các nhà nghiên
cứu đã định nghĩa vi sinh vật nội sinh theo nhiều cách khác nhau, thường là
tuỳ thuộc phương pháp vi sinh vật nội sinh được phân lập và đánh giá.
Hallmann et al. (1997) [18] mô tả vi khuẩn nội sinh là những sinh vật có thể
phân lập được từ các bộ phận đã khử trùng bề mặt của cây hoặc được chiết
xuất từ các nội mô thực vật và không gây thiệt hại cho cây chủ.
Kado (1992) [19] định nghĩa vi khuẩn nội sinh là những "vi khuẩn cư
trú trong mô thực vật sống mà không làm tổn hại đáng kể hoặc đạt được lợi
ích khác ngoài việc đảm bảo cư trú". Định nghĩa này được xem là quá hạn
chế, vì nó loại trừ khả năng các vi khuẩn nội sinh có thể hình thành các mối
quan hệ cộng sinh với kí chủ.
Bacon và White (2000) [20] đã đưa ra một định nghĩa về vi khuẩn nội
sinh thực vật toàn diện hơn và được chấp nhận rộng rãi như sau: "Vi khuẩn
nội sinh thực vật là những vi khuẩn xâm chiếm các mô sống và cư trú ở bên
trong thực vật mà không gây ra bất kỳ tác động tiêu cực tức thời rõ ràng nào".
Khái niệm này sẽ loại trừ các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật.
1.3.1.2. Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh thực vật
Vi khuẩn nội sinh thực vật hiện diện phổ biến trong hầu hết tất cả các
loài thực vật, chúng sống tiềm ẩn hoặc tích cực xâm chiếm nội mô thực vật
một cách cục bộ hoặc hệ thống (Hallmann et al., 1997) [18]. Vi khuẩn nội
12
sinh bắt nguồn từ các cộng đồng vi khuẩn biểu sinh vùng rễ và lá, cũng như từ
hạt hoặc các vật liệu nhân giống vô tính. Nhiều nghiên cứu cho rằng vùng rễ
là nguồn vi khuẩn nội sinh chính, từ đó chúng xâm chiếm vào bên trong mô tế
bào thực vật (Verma et al., 2001 [21], Bressan và Borges, 2004 [22]). Vì vậy,
vi khuẩn nội sinh thường được phát hiện ở rễ với mật độ cao ngay từ những
giai đoạn đầu của sự phát triển (McInroy và Kloepper, 1995) [23].
Rễ được xem là vị trí ưa thích nhất, từ đó vi khuẩn xâm nhập vào bên
trong cơ thể thực vật. Vi khuẩn nội sinh xâm chiếm tế bào nội mô từ các vị trí
như bề mặt rễ, lông hút, chóp rễ và điểm phát sinh rễ bên (Verma et al., 2001)
[21]. Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào cây thông qua các khe hở
tự nhiên như: khí khổng, thủy khổng (hydathode) và các lỗ xốp nhỏ trên mô
thực vật. Hơn nữa, chúng có thể di chuyển một cách hệ thống bên trong cây,
do đó, về mặt lý thuyết có thể dẫn đến tình trạng cân bằng mật độ vi khuẩn
bên trong cây. Sự thật là vi khuẩn nội sinh thường 7 tập trung với mật độ thấp
ở các bộ phận khí sinh có thể là một chỉ thị cho biết điều kiện môi trường ở
các mô này ít thích hợp hơn cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh do sự biến
động trong ngày lớn về nhiệt độ, hàm lượng nước, dinh dưỡng và tia UV.
Ngược lại, hệ thống rễ dường như tạo ra một môi trường sống ổn định hơn
nơi mà nhiệt độ và hàm lượng nước ổn định cho vi khuẩn cư trú (McInroy và
Kloepper, 1995) [23].
Sau khi xâm nhập được vào bên trong cây chủ, vi khuẩn nội sinh sẽ cư
trú ở các ổ nội sinh (endophytic niche). Các ổ nội sinh sẽ bảo vệ vi khuẩn nội
sinh khỏi các tác động xấu từ môi trường, đồng thời giúp chúng xâm chiếm và
thiết lập bên trong tế bào, mô thực vật. Những vi khuẩn nội sinh thường xâm
chiếm khoảng gian bào và được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây như rễ,
thân, lá, quả và kể cả hạt (Oliveira et al., 2013) [24].
1.3.2. Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật
Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật đã được ghi nhận trong nhiều
nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước. Tác dụng và ứng dụng của vi
khuẩn nội sinh thực vật được trình bày tóm tắt trong hình 1.1.
13
Hình 1.1. Tác dụng của vi khuẩn nội sinh thực vật và ứng dụng
(Ryan et al., 2008) [25]
Cơ chế của những tác động có lợi của vi khuẩn nội sinh đối với cây chủ
tương tự như của các vi khuẩn vùng rễ có khả năng thúc đẩy sinh trưởng thực
vật (Compant et al., 2010) [26]. Điều này là do hầu hết các vi khuẩn nội sinh
được phân lập từ nội mô các loài thực vật khỏe mạnh và có thể được xem như
nội sinh không bắt buộc và có khả năng sống bên ngoài mô thực vật như
những vi khuẩn vùng rễ (Di Fiori và Del Gallo, 1995, dẫn theo Lodewyckx et
al., 2002 [27]). Ngoài ra, nhiều chủng vi khuẩn nội sinh cây ngô ngọt và cây
bông vải được ghi nhận là những chủng vi khuẩn vùng rễ phổ biến (McInroy
và Kloepper, 1994) [23]. Vi khuẩn nội sinh thực vật thúc đẩy sinh trưởng của
cây chủ một cách trực tiếp thông qua tăng cường tổng hợp kích thích tố sinh
trưởng thực vật auxin (IAA), tăng hàm lượng các chất khoáng, giúp cố định
đạm sinh học, phân giải lân khó tan, (Jasim et al., 2013 [28], Nguyễn Thị
Huỳnh Như và cs., 2013 [29], Milca et al., 2014 [30]) hoặc gián tiếp thông qua
tăng Nuôi cấy Công nghiệp & y học Tăng trưởng & năng suất Bảo vệ cây trồng
Kiểm soát ô nhiễm & phân hủy sinh học Sản xuất chất kháng bệnh
Pseudomonas sp. Serratia sp. Clavibacter sp. Bacillus sp. Kích thích sinh
14
trưởng cây trồng Hòa tan & hấp thu dinh dưỡng Pseudomonas sp. Enterobacter
sp. Staphylococcus sp. Azotobacter sp. Azopirillum sp. Phenols Chlorophenols
MTBE TCE 2,4 D TNT BTEX Cupriavidus sp. Burkholderia sp.
Herbaspirillum sp. Pseudomonas sp. Kháng sinh, kháng virus, hợp chất miễn
dịch & chống ung thư, thuốc trừ sâu sinh học Serratia sp. Phomopsis sp.
Pseudomonas sp. VSV hữu ích 15 khả năng đối kháng với các tác nhân gây
bệnh, giảm sự thay đổi của thời tiết gây tổn hại cho cây (Ryan et al., 2008)
[25]. Ngoài ra, chúng còn có thể giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm
(Rosenblueth và Martínez-Romero, 2006 [31], Ryan et al., 2008 [25]. Trong
một số trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm của hạt, thúc đẩy
sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi (Chanway, 1997) [32]. Ngoài ra,
vi khuẩn nội sinh còn có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng
hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa
và các hợp chất hữu cơ mới. Vi khuẩn nội sinh cũng có thể có một số tác dụng
có lợi khác như sản sinh siderophore, giúp phần nào thoả mãn nhu cầu về sắt
của cây chủ, giúp cây phòng chống lây nhiễm các mầm bệnh (Murugappan et
al., 2013) [33]. Như vậy, có thể thấy rằng tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn
nội sinh trong sản xuất nông nghệp bền vững là rất lớn.
Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong các loài cây ở Việt
Nam như hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng,
Nguyễn Thị Thu Hà đã phân lập được vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ
chăn nuôi [34], phân lập tuyển chọn chủng Bacillus cho sản xuất phân bón vi
sinh vật chức năng [35]; Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp đã phân
lập được vi khuẩn nội sinh trong cúc xuyến chi (Wedelia Trilobata (L.)
Hitche) bằng kỹ thuật PCR [36]; Văn Thị Phương Như và cộng sư đã phân lập
vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất của tỉnh Phú Yên [37]; Cao
Ngọc Điệp và cộng sự đã phân lập và đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây
Khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh
Thuận, tỉnh Kiên Giang [38,39].
1.3.2. Một số ứng dụng của vi sinh vật trong phòng trừ tuyến trùng
Cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch, bền vững thì các
loại phân bón - thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh học đang
15
được đề cao nghiên cứu và phát triển. Để phòng trừ tuyến trùng gây hại trên cây
trồng có rất nhiều biện pháp như cơ giới, canh tác, hóa học và biện pháp sinh
học. Trong đó, biện pháp sinh học được xem là mang lại hiệu quả, thân thiện, an
toàn với môi trường. Có 2 dạng phòng trừ sinh học (PTSH): (a) PTSH nhân tạo
bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để đưa ra đồng ruộng; (b) PTSH tự
nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch sẵn có trong tự nhiên để hạn chế sự
sinh sản của tuyến trùng mà không cần nhân thả chuyên hóa nào.
Sử dụng thiên định như tác nhân trong phòng trừ sinh học ví dụ như vi
khuẩn Pasteuria penetrans và sinh vật đối kháng. Vi khuẩn Pasteuria
penetrans là loại vi khuẩn ký sinh bắt buộc ở một số tuyến trùng ký sinh
thực vật như các loại ấu trùng của Melodogyne spp., Pratylenchus spp.vv.,
ngoài ra chúng cũng ký sinh ở một số nhóm tuyến trùng sống tự do trong
đất. Tuyến trùng dễ dàng bị nhiễm với vi khuẩn này ở trong đất khi chúng
tiếp xúc với nội bào tử, những nội bào này bám dính trên bề mặt vỏ cutin
của tuyến trùng. Khi đã bị nhiễm vi khuẩn, ấu trùng tuổi 2 của
Meloidogyne xâm nhập vào rễ cây và bắt đầu dinh dưỡng trước khi bào tử
nảy mầm. Khi bào tử nảy mầm thì ống mầm sẽ xâm nhập qua vỏ cutin và
giải phóng các khuẩn lạc dinh dưỡng, các khuẩn lạc này tiếp tục vỡ ra, sinh
sôi nảy nở khắp toàn bộ xoang cơ thể tuyến trùng. Con cái cuối cùng trở
nên chứa đầy bào tử vi khuẩn và trứng. Vi khuẩn Pasteuria penetrans rất
độc và có thể giảm mật độ quần thể tuyến trùng Melodogyne trong chậu
đến 99% trong vòng 3 tuần. Vi khuẩn Pasteuria penetrans có thể tồn tại
một số năm trong đất được làm khô bằng khí mà không hề suy giảm khả
năng sống và bị ảnh hưởng rất ít bởi các điều kiện đất hoặc thuốc phòng trừ
tuyến trùng. Các bào tử dính bám ở nhiều loài tuyến trùng ký sinh thực vật
và thường chỉ 20-30% tạo mầm bệnh và sự dính bám không nhất thiết dẫn
đến nhiễm bệnh. Khi bổ sung đất đã nhiễm bào tử Pasteuria penetrans vào
đất chứa Pratylenchus scribneri làm giảm mật độ quần thể tuyến trùng
bằng 53% trong đất và 63% trong rễ đậu. Nồng độ bào tử và thời kỳ hoạt
động của tuyến trùng trong đất sẽ xác định bằng số lượng tuyến trùng bị
giết. Bào tử vi khuẩn không vận chuyển mà phát tán trong đất nhờ nước
hoặc bằng việc canh tác, làm đất để trồng trọt. Loại vi khuẩn này được xem
16
như một tác nhân sinh học có tiềm năng trong phòng trừ sinh học, nhưng
khả năng thương mại hiện gặp phải khó khăn do chưa có phương pháp sản
xuất sinh khối lớn. Hiệu quả phòng trừ với Pasteuria penetrans chỉ có thể
thành công sau khi làm chậm đáng kể sự phân bố bào tử. Hiện nay danh
sách các loài tuyến trùng bị nhiễm Pasteuria penetrans trên toàn thế giới
đã lên tới 300 loài. Một số kết quả điều tra bước đầu ở Việt Nam cũng cho
thấy có hơn 20 loài tuyến trùng trong tự nhiên bị nhiễm vi khuẩn Pasteuria
penetrans như Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Helicotylenchus spp.,
Rotylenchus reniformis, Tylenchorhynchus dalatensis, Xiphinema spp..
Vi sinh vật đối kháng (antagonist) là các loại nấm và vi khuẩn có khả
năng cạnh tranh chỗ ở hoặc thức ăn (cùng cây chủ) với tuyến trùng và như
vậy chúng có khả năng hạn chế hoạt động và sinh sản của tuyến trùng. Các vi
sinh vật đối kháng đã và đang được nghiên cứu trong PTSH như Trichoderma
viridae gây bệnh thực vật và có khả năng đối kháng hoặc tương hợp với tuyến
trùng tùy loài tuyến trùng, vi khuẩn Pseudomonas fluoresence có khả năng đối
kháng với một số tuyến trùng ký sinh. Thực tế, nhóm vsv đối kháng hiện nay
còn ít được nghiên cứu và chủ yếu còn nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà
chưa có kết quả áp dụng trong sản xuất.
Hiệu quả phòng trừ sinh học phụ thuộc vào các yếu tố sau: Các tác
nhân sinh học bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố môi trường. Mỗi tác
nhân thường có những điều kiện tối ưu về các điều kiện môi trường riêng
biệt như: pH, nhiệt độ, độ ẩm v.v. Vì vậy, việc áp dụng các chế phẩm sinh
học cần thỏa mãn các điều kiện môi trường phù hợp mới đạt hiệu quả.
Ngoài ra, biện pháp phòng trừ sinh học cần có điều kiện bởi sự sinh sản
của tuyến trùng và thời gian tuyến trùng có thể dễ dàng tiếp xúc với tác
nhân sinh học. Tuyến trùng nội ký sinh là đối tượng khó phòng trừ sinh học
do phần lớn thời gian chúng sống bên trong mô thực vật. Hạn chế chính lên
sự phát triển của phòng trừ sinh học là kết cấu đất đảm bảo cho sự tiếp xúc
giữa tác nhân sinh học và tuyến trùng. Các yếu tố nấm sợi được tạo ra bằng
các quần thể vi sinh có thể cản trở sự sinh trưởng và phát triển của các tác
nhân sinh học khi đưa vào đất.
Các chế phẩm sinh học: Các chế phẩm sinh học như vi sinh vật
17
Trichoderma và Nema Săn Tuyến Trùng. Chitosan là hoạt chất được chiết
xuất từ vỏ tôm cua, không độc với người và môi trường. Ngoài tác dụng diệt
tuyến trùng, Chitosan còn cung cấp cho cây một số dưỡng chất, giúp cây
phát triển,kích kháng cho cây trồng.
Vi sinh vật Trichoderma: có tác dụng kháng, làm giảm sự sinh sản
trứng của tuyến trùng, vì thế cần bón nhiều phân chuồng hoại mục có bổ
sung Trichoderma hay Pseudomonas thường xuyên sẽ làm giảm được đáng
kể lượng tuyến trùng.
NEMA Săn Tuyến Trùng: là loại chế phẩm sinh học mới nhất chống
lại tuyến trùng, có khả năng tìm và tiêu diệt tuyến trùng hại cây trồng, sản
phẩm được phối hợp 5 chủng vi nấm Arthrobotrys oligospora, Verticillium
sp, Peacilomyces sp, Paenibacillus chitinolyticus, Bacillus sp. Tác dụng
chính của 5 chủng trong sản phẩm NEMA là chuyên săn mồi, mỗi chủng
được huấn luyện và thích nghi ở 1 điều kiện khác nhau. Nên ở bất kỳ thời
tiết nào vẫn đảm bảo NEMA hoạt động tốt. NEMA Săn tuyến trùng không
gây hại bộ rễ, nó sẽ bảo vệ được sự phát triển tự nhiên của bộ rễ và làm cho
rễ phát triển dài hơn, sâu hơn.
Các enzyme tái tổ hợp có khả năng ức chế tuyến trùng: Một số
enzyme liên quan đến quá trình ký sinh của nấm vào tuyến trùng như
collagenase và protease đóng vai trò quan trọng. Proteases, chitinases và
lysosymes là enzyme sản xuất và tiết ra bởi nấm kí sinh tuyến trùng. Trong
đó vai trò tiềm năng của chitinase trong nấm kí sinh trứng tuyến trùng đầu
tiên được nghiên cứu. Nhiều nghiên cứu cho thấy enzyme chitinase đóng vai
trò rất quan trọng trong đấu tranh sinh học, Chitinase ngoại bào từ các loài
nấm kí sinh tuyến trùng có khả năng phân hủy màng trứng tuyến trùng và
phân hủy vách tế bào của các loài vi nấm gây hại. Nấm kí sinh côn trùng có
khả năng vượt qua hàng rào bảo vệ của côn trùng bằng cách sản xuất ra
nhiều enzyme ngoại bào nhằm phân giải protein và chitin tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình xâm nhập vào lớp biểu bì và gây nhiễm trùng. Ở
tuyến trùng Brugia malayi sử dụng chitinase để phá vỡ lớp vỏ chitin bảo vệ
và lớp niêm mạc để xâm nhập vào cơ thể muỗi kí sinh [7].
18
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ PHÊ
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Mặc dù vi khuẩn nội sinh thực vật đã được nghiên cứu từ rất lâu
nhưng gần đây, chúng mới được chú ý trên cây cà phê và đã thu được những
kết quả ban đầu rất khả quan. Vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở hầu hết các
bộ phận của cây cà phê ở khắp nơi trên thế giới với thành phần rất đa dạng: 87
dòng nội sinh cây cà phê chè ở Colombia, Hawaii và Mexico (Vega et al.,
2005) [40], 200 dòng vi khuẩn nội sinh rễ cà phê vối tại Ethiopia (Mekete et
al., 2009) [41], 18 dòng vi khuẩn nội sinh quả tại Brazil (Miguel et al., 2013)
[42], 217 dòng vi khuẩn nội sinh lá, cành và rễ cà phê chè và cà phê vối ở
Pedreira, Mococa, Pindorama và Brazil (Silva et al., 2012) [43]. Các dòng vi
khuẩn nội sinh phân lập được từ cây cà phê chủ yếu thuộc các chi:
Pseudomonas, Enterobacter, Agrobacterium, Stenotrophomonas và Bacillus,
trong đó chủ yếu là các vi khuẩn Gram (-) (Mekete et al., 2009) [41].
Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh cây cà phê tuỳ thuộc vào chế độ
canh tác của vườn cà phê. Những vườn cà phê thâm canh cao, sử dụng nhiều
phân hoá học và thuốc bảo vệ thực vật hoá học thì tính đa dạng của nhóm vi
khuẩn nội sinh giảm. Ngoài ra, các yếu tố vô sinh như: nhiệt độ, lượng mưa,
hàm lượng hữu cơ trong đất, kỹ thuật canh tác và cải tạo đất cũng ảnh hưởng
đến thành phần và mật độ vi khuẩn nội sinh (Hallmann et al., 1997 [18],
Garbeva et al., 2004 [44], Berg and Hallmann, 2006 [45], Mekete et al.,
2009 [41]. Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh trong quả còn tuỳ thuộc vào
các giai đoạn phát triển khác nhau của quả, đạt cao nhất vào giai đoạn quả
xanh và thấp nhất vào giai đoạn quả chín (Miguel et al., 2013) [42]. Trong
mùa mưa, mật độ vi khuẩn nội sinh cao hơn, đạt 5,2 x 103 - 2,07 x 106
CFU/g rễ tươi) với thành phần đa dạng lên đến 201 dòng; trong khi đó ở
mùa khô, mật độ chỉ đạt 2,7 x 103 - 1,23 x 104 CFU/g rễ tươi và chỉ có 114
dòng (Mekete et al., 2009) [41].
Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh còn phụ thuộc vào hình thức canh
tác, với chỉ số đa dạng Shannon (H) giảm dần theo các hình thức canh tác cà
phê như sau: canh tác tự nhiên, bán tự nhiên, canh tác bán thâm canh và
19
thâm canh cao. Sự khác biệt này chủ yếu là do những khác nhau về các kỹ
thuật canh tác. Nhìn chung, với hình thức canh tác đồn điền lớn, cây cà phê
được thâm canh, tăng cường sử dụng phân và thuốc hóa học, máy móc cơ
giới, do đó ảnh hưởng tiêu cực đến tính đa dạng của nhóm vi khuẩn nội sinh
(Mekete et al., 2009) [41].
Một số chủng vi khuẩn nội sinh đã thể hiện khả năng thúc đẩy sinh
trưởng cây cà phê như Acinetobacter calcoaceticus 161G, 163G, 160G,
150G và Salmonella enteric 109G. Chủng thể hiện khả năng thúc đẩy sinh
trưởng cây cà phê tốt nhất (Escherichia fergusonii 85G) có hoạt tính phân
giải phosphat, tổng hợp siderophores và IAA trong điều kiện in vitro. Những
đặc tính này hứa hẹn tiềm năng của chủng Escherichia fergusonii 85G trong
việc thúc đẩy sinh trưởng phát triển của cây cà phê vì sự hiện diện của các
siderophores (đại thực bào chứa sắt) làm gia tăng hàm lượng sắt dễ tiêu để rễ
hấp thu còn IAA ảnh hưởng trực tiếp đến các bộ phận trên không của cây
(Silva et al., 2012) [43].
Phần lớn các loài vi khuẩn nội sinh quả cà phê phân lập và tái thiết lập
được quần thể bên trong cây cà phê vối đều thuộc chi Bacillus, bao gồm: B.
subtilis, B. megaterium, B. licheniformis, B. cereus và B. thuringiensis.
Đáng chú ý là B. thuringiensis, loài vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất
hiện nay để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, cũng được ghi nhận nội sinh quả
cà phê (Miguel et al., 2013) [42].
Khi nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh rễ cây cà phê, Mekete et al.
(2009) [41] cho biết 33% số chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ rễ cây
cà phê có hoạt tính đối kháng với tuyến trùng nốt sưng M. incognita, trong
đó, đáng chú ý là các loài Bacillus pumilus và B. mycoides có khả năng làm
giảm 39% khả năng sinh sản của tuyến trùng và giảm 33% số bướu rễ gây ra
bởi tuyến trùng Meloidogyne incognita (Mekete et al., 2009) [41]. Những
kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy một số loài vi khuẩn nội sinh cây cà
phê (Bacillus lentimorbus và Bacillus cereus) có tiềm năng trong việc ức chế
khả năng nảy mầm và phát triển của bào tử hạ nấm Hemileia vastatrix gây
bệnh gỉ sắt cà phê (Shiomi et al., 2006 [46], Silva et al., 2012) [43]).
20
Thời điểm chủng vi khuẩn nội sinh cũng là một yếu tố quan trọng ảnh
hưởng đến hiệu quả ức chế các tác nhân gây bệnh. Chủng các vi khuẩn nội
sinh Brevibacillus choshinensis 64R và 137G vào cây cà phê ở thời điểm
72h hoặc 24h trước khi chủng nấm H. vastatrix gây bệnh gỉ sắt đã làm giảm
chỉ số bệnh gỉ sắt lần lượt là 100% và 97% nhưng nếu chủng đồng thời cả vi
khuẩn nội sinh và tác nhân gây bệnh, chỉ số bệnh không giảm (Shiomi et al.,
2006 [46], Silva et al., 2012 [43]). Việc chủng các vi khuẩn nội sinh trước
khi chủng các tác nhân gây bệnh sẽ đảm bảo khả năng xâm chiếm tế bào
biểu mô và nội mô của các chủng thích hợp kích thích tính kháng hệ thống
cảm ứng ISR nhờ làm nhạy cảm các mô, tăng cường cạnh tranh không gian
và dinh dưỡng trên bề mặt lá. Vi khuẩn nội sinh tiêu diệt các tác nhân gây
bệnh thông qua quá trình phân huỷ hoặc ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm
nhờ các chất kháng sinh do vi khuẩn sản sinh.
Trong điều kiện in vitro , ở 24oC, các chủng B. megaterium, A.
radiobacter và C. davisae cho hiệu quả diệt tuyến trùng tuổi 2
Meloidogyne incognita trên 90%. Các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê
như: Agrobacterium radiobacter, Bacillus l icheniform is, B. pumilus, B.
mycoides, B. megaterium, Pseudomonas syringae, Pantoea agglomerans,
Paenibacillus pabuli, Cellulomonas fimi và Pseudomonas coronafaciens
khi được chủng vào cây cà chua đã làm giảm hơn 54% số lượng u sưng trên
rễ gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne incognita. Tuy nhiên, các chủng này
lại không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh trưởng của cây, ngoại trừ P.
coronafaciens có khả năng làm tăng khối lượng thân tươi 51%.
Hiệu quả diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita của các chủng vi
khuẩn nội sinh trong cây cà phê dao động từ 38 - 98%. Trong đó, các chủng
Agrobacterium radiobacter, Bacillus pumilus, B. brevis, B. megaterium, B.
mycoides, B. licheniformis, Chryseobacterium balustinum, Cedecea davisae,
Cytophaga johnsonae, Lactobacillus paracasei, Micrococcus luteus,
Pseudomonas syringae và Stenotrophomonas maltophilia, M. halobius cho
hiệu quả diệt tuyến trùng > 80% trong điều kiện in vitro (Mekete et al.,
2009) [41]. Trong số các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê phân lập được,
chủng Bacillus spp. được coi là tác nhân sinh học tiềm năng để kiểm soát
21
tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. vì chúng sản sinh nội bào tử có khả
năng chịu được điều kiện nóng và khô (Kloepper et al., 2004) [47]. Chủng
Bacillus pumilus và B. mycoides hiệu quả nhất trong việc làm giảm số lượng
khối trứng và u sưng do tuyến trùng M. incognita gây ra trên cây cà chua
trồng trong nhà lưới (33 và 39%, một cách tương ứng) (Mekete et al., 2009)
[41]. Bacillus cereus làm giảm đến hơn 50% số lượng khối trứng và u sưng
gây ra bởi M. incognita, M. javanica và M. arenaria (Mahdy et al., 2000,
dẫn theo Mekete et al., 2009) [41].
Cơ chế đối kháng tuyến trùng của vi khuẩn nội sinh B. pumilus và B.
mycoides được cho là tương tự như đối với các vi khuẩn vùng rễ và nội
sinh khác, bao gồm: giảm khả năng xâm nhập, sản sinh chất kháng sinh
trực tiếp hoặc kháng hệ thống cảm ứng ISR (Sikora et al., 2007) [48].
Trong một tổng hợp gần đây, Kloepper và Ryu (2006) [49] đánh giá B.
pumilus là một trong những vi khuẩn nội sinh quan trọng nhất gây ra kháng
hệ thống cảm ứng đối với nhiều loại bệnh khác nhau. Vi khuẩn nội sinh
kích kháng hệ thống cảm ứng để kiểm soát hiệu quả một số tuyến trùng kí
sinh thực vật như G. pallida và M. incognita (Mekete et al., 2009) [41].
Trong một nghiên cứu khác, B. cereus được ghi nhận là có hiệu quả trong
việc kiểm soát bệnh gỉ sắt cà phê (Vega et al., 2005) [40].
Tuy nhiên, các tác giả chưa ghi nhận được bất kì sự liên hệ nào giữa
các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê có khả năng thúc đẩy sinh trưởng với
các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng đối kháng các tác nhân gây bệnh
(Silva et al., 2012) [43]. Do đó, việc nghiên cứu chủng có đặc tính tốt để sử
dụng là cần thiết nhằm vừa giúp cây sinh trưởng, phát triển tốt vừa khồng
chế tác hại của bệnh.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại
học Tây Nguyên trong những năm qua đã tiến hành nghiên cứu và phân lập
các chủng vi khuẩn nội sinh trên cả cà phê chè và cà phê vối. Trên cà phê
chè ở Lâm Đồng, Nguyễn Ngọc Mỹ (2012) [50] đã phân lập được 30 chủng
vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ và tuyển chọn được chủng B. cereus
22
M15 là chủng có hoạt tính cố định N và phân giải P cao nhất. Hàm lượng N
và P trong lá cây con cà phê chè khi được xử lý với chủng này tăng 52% và
33,3% so với đối chứng. Kết quả nghiên cứu bước đầu khi chủng nhiễm
chủng vi khuẩn này vào hạt cà phê rồi trồng trong nhà lưới cho thấy các chỉ
tiêu sinh trưởng của cây cà phê chè giai đoạn vườn ươm như: chiều cao cây,
đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với đối chứng.
Trong rễ cây cà phê vối tại Đắk Lắk, 37 chủng vi khuẩn nội sinh cũng
đã được phân lập, trong các đó chủng B. subtilis EK17 và Enterobacter
cloace EK19 được tuyển chọn có khả năng cố định đạm và phân giải lân cao
nhất. Kết quả thử nghiệm bước đầu của các chủng này trên cây con cà phê
vối TR4 cho thấy hàm lượng đạm và lân trong lá cà phê đều cao hơn gấp 1,5
lần so với đối chứng. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cà phê con như: chiều
cao cây, đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với
đối chứng (Trương Vĩnh Thới, 2012) [51]. Ngô Văn Anh và cs. (2017) [52]
đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây cà phê vối. Trong
điều kiện invitro, các dòng Bacillus sp. BMT11 (1,574 μg/ml), B. pumilus
BMT4 (1,493 μg/ml), Bacillus sp. BMT8 (1,474 μg/ml), BH8 (1,434 μg/ml),
Bacillus cereus BMT7 (1,399 μgm/l) và Bacillus sp. Cư8 (1,372 μg/ml) có
hoạt tính cố định đạm cao nhất. Các dòng có hoạt tính phân giải lân cao nhất
là Bacillus sp. BMT11 (12,25 μg/ml), Bacillus sp. Cư8 (11,46 μg/ml) và
Cư2 (11,25 μg/ml). Ngoài ra, các chủng này còn có khả năng sinh tổng hợp
IAA khá cao: Bacillus sp. BMT11 (9,048 μg/ml), BH8 (8,876 μg/ml),
Bacillus sp. Cư8 (8,153 μg/ml), B. pumilus BMT4 (5,624 μg/ml).
Tóm lại, vi khuẩn nội sinh đóng vai trò quan trọng đối với sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật do chúng có những đặc tính tốt như có khả
năng cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ
tốt chất dinh dưỡng, sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng, tăng hàm
lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất
gây ô nhiễm môi trường. Do đó, việc nghiên cứu chúng để sản xuất phân vi
sinh ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp bền vững là vấn đề đang được
quan tâm hiện nay.
23
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 nằm trong bộ sưu tập
của phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Đây là
chủng vi sinh vật nội sinh được phân lập từ rễ cây cà phê thu tại tỉnh Đăk Lăk,
đã được định danh bằng 16S (là kết quả nghiên cứu của đề tài mã số
TN16/C02 thuộc chương trình Tây Nguyên giai đoạn 2016-2020).
- Cây cà phê in vitro do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công
nghệ sinh học cung cấp
- Tuyến trùng Meloidogyne incognita ký sinh gây hại trên cây cà phê
2.2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian nghiên cứu: Từ 15/08/2018 đến 30/08/2020
- Địa điểm thu mẫu: Các mẫu đất, rễ, tuyến trùng đã được thu thập tại
vùng trồng cà phê bao gồm: Lô 8, vùng 36, đội 4 Eapok; Lô 3 vùng 51, đội 3
Eapok; Lô 4 vùng 19, đội 4 Eapok, Lô 2 vùng 51, đội 3 Eapok; Lô 1, vùng 6,
tái canh 2012 Eapok, Đăk Lăk.
- Địa điểm tiến hành thí nghiệm trồng cà phê ngoài đồng ruộng: Thí
nghiệm được tiến hành tại hộ gia đình ông: Nguyễn Quốc Bình, số CMND:
250568156. Địa chỉ: Tổ 7, xóm Sóc Sơn, xã Nam Hà, huyện Lâm Hà, tỉnh
Lâm Đồng.
- Thí nghiệm phân lập, đánh giá khả năng diệt tuyến trùng, đánh giá
hoạt tính: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy,
Hà Nội.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nội dung 1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn nội sinh
Bacillus megaterium 18
24
- Nội dung 2: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng trên cây cà phê của
chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18
- Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với cây cà
phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18
2.4. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.4.1. Thiết bị chính
Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo
pH, Metter Toledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ);
máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng
ướt (Trung Quốc); tủ sấy khô (Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD;
lò vi sóng; ống đong: 100 ml, 500 ml, 1000 ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml,
1000 ml, 2000 ml; máy sục khí; các dụng cụ khác …
2.4.2. Hóa chất chính
Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merch -
Đức); thạch (Merck- Đức); bột xenluloza (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại
đường: D-glucoza, saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô
cơ khác: NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3 …
+ Bộ kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB
2.4.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất
1.000ml.
Môi trường gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở
121oC trong 20 phút.
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật [53]
2.5.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa cua các chung vi
khuẩn
Đặc điểm hình thái
25
Đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi
điện tử và được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh bảo vệ
Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.
Nhuộm Gram vi khuẩn [53]
Xác định xem các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ
vào màu thuốc nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn bắt màu
hồng là Gr (-), màu tím là Gr (+).
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Kha năng sinh tổng hợp enzym
Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ
sung thêm 1% tinh bột. Nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc
thử Lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng
phân giải xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh trưởng [6].
Thủy phân xenluloza: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1%
bột giấy. Nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu
vi khuẩn có khả năng thủy phân xenluloza chúng sẽ tạo vòng phân giải
xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh trưởng.
Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng,
nuôi ở nhiệt độ 30oC, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4oC để trong 2 giờ.
Sau 2 giờ môi trường trong ống nghiệm không bị đông lại chứng tỏ chủng đó
có khả năng làm loãng gelatin.
Kha năng sư dung các nguồn đương, cacbon [5].
Nuôi vi sinh vật trên môi trường có bổ sung 1% nguồn đường, cacbon.
Xác định khả năng phát triển của chúng bằng chỉ số OD620 nm.
Kha năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH
Thay đổi nồng độ NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ, pH khác nhau.
Theo dõi khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số OD620 nm.
26
2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố anh hưởng đến sinh trưởng cua
vi khuẩn [53]
+ Ảnh hưởng cua thơi gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay
đổi môi trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sự thay đổi của các tế bào vi
sinh vật. Vì vậy, sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng
thời điểm lượng enzym sinh ra cũng khác nhau. Tiến hành thí nghiệm bằng
cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MPA, nuôi ở 37oC, điều kiện lắc
200 vòng/phút trong 60 giờ. Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng
sinh trưởng (OD620 nm).
+ Ảnh hưởng cua nhiệt độ: Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể.
Sau đó, cấy các chủng vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã
vô trùng và để ở các thang nhiệt độ: 25; 30; 35; 45; 55. Sau 48 giờ nuôi cấy,
xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm).
+ Ảnh hưởng cua pH: Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3;
4; 5; 6; 7; 8; và 9. Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37oC, sau 48 giờ xác định khả năng
sinh trưởng bằng cách đo OD620 nm.
+ Ảnh hưởng cua nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường
MPA sau đó bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1;
3; 5; 7; 9 và 11 nuôi ở 37 oC trong 48 giờ. Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số
(OD620nm).
+ Ảnh hưởng cua nguồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên
sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của các chủng vi sinh vật được tuyển
chọn trên các nguồn cơ chất khác nhau. Trên môi trường cơ sở có bổ sung
tinh bột, CMC-Na, glucoza, saccaroza, lactoza, rỉ đường.Vi khuẩn nuôi cấy
trên môi trường MPA trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh
trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm).
+ Ảnh hưởng cua nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi
trường cơ sở có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao
thịt, KNO3 và (NH4)2SO4. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong
27
48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng
chỉ số (OD620nm).
2.5.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym
Phương pháp đường khử: Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ:
0.5; 1; 1.5; 2; 3 (mg/ml). Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ
đến khi xấp xỉ nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng
bằng 1 ml). Bổ sung 1 ml cơ chất, mix đều và ủ ở 37oC trong 10 phút, sau đó
thêm 3 ml DNSA, mix đều rồi đun sôi các mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S
cùng nhau (khoảng 30 phút). Sau đó làm lạnh bằng cách ủ vào đá rồi đo OD
(540 nm). Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu tiếp.
Công thức pha hóa chất: Spectro zero: 1 ml cơ chất, 1 ml đệm, 3 ml
DNSA. Đường chuẩn: 1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 0,5 ml đường. Enzym blank:
1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 1 ml enzym. Đệm PBS 6,8: (a): NaH2PO4 0,2 M:
cân 27,8 g và định mức đến 1.000 ml, (b) NaH2PO4.7H20 0,2 M: cân 53,05 g
và định mức đến 100 ml, dung dịch đệm bằng tổng của 51 ml (a) và 49 ml (b)
định mức đến 200 ml. DNSA: DNSA 10,6 g, NaOH 19,8, Na2S2O5 8,3 g, N-
K-tatarat 306 g, phenol 7,6 ml. Kết quả thu được áp vào đường chuẩn hình
2.1 tính hoạt độ chitinase.
y = 2.8096x + 0.1064
R2 = 0.9982
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Đồ thị đường chuẩn glucose (mg/ml)
OD
540nm
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld [54]
28
2.5.2. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với thực vật của
chủng Bacillus megaterium 18
Do thời gian sinh trưởng của cây cà phê khá dài (ít nhất 6 tháng) do vậy
tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sinh trưởng đối với thực vật của chủng
Bacillus megaterium 18 trên cây thuốc lá (thời gian sinh trưởng giai đoạn cây
con đến khi xuất vườn là từ 40-60 ngày) nhằm đảm bảo tiến độ thực hiện luận
văn.
2.5.2.1. Đánh giá anh hưởng cua chung Bacillus megaterium 18 đến sinh
trưởng cây thuốc lá
Hạt thuốc lá sau khi khử trùng được ủ nhiễm với dung dịch vi khuẩn
B.megaterium 18 mật độ quang OD đạt 0,6-1,0 trong thời gian 2 giờ. Hạt
thuốc lá sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng và đặt lên môi trường
½ MS (Murashige và Skoog, 1962) đặc có bổ sung sucrose 10 g/L [55]. Hạt
nảy mầm được quan sát hàng ngày, các chỉ tiêu về sinh trường như số lá,
chiều dài rễ, chiều dài thân được đo 2 tuần 1 lần. Mỗi công thức thí nghiệm
được thực hiện trên 5 cây cà phê.
Các chỉ tiêu theo dõi được đo đếm như sau:
+ Chiều dài thân (cm): đo từ gốc cây cà phê đến đỉnh sinh trưởng của cây
+ Số cặp lá (cặp lá/cây): đếm toàn bộ số cặp lá trên cây
+ Chiều dài rễ (cm): đo bằng thước có khắc vạch, chính xác đến mm.
2.5.2.2. Đánh giá anh hưởng cua chung vi sinh vật nội sinh Bacillus
megaterium 18 đến sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vươn ươm.
Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus
megaterium 18 đến sinh trưởng phát triển cây cà phê được triển khai tại
phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thí nghiệm được tiến hành theo phương
pháp như sau: tiến hành lây nhiễm vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium
18 vào cây cà phê in vitro (cây gieo hạt, 20 ngày tuổi) bằng cách nuôi cấy các
cà phê này trên môi trường thủy canh có bổ sung chế phẩm chủng vi sinh vật
nội sinh Bacillus megaterium 18 với nồng độ 1% trong 28 ngày. Theo dõi các
29
chỉ tiêu về chiều cao thân, số cặp lá mới mọc/cành, chiều dài rễ chính và số rễ
nhánh của cây như sau:
+ Chiều cao thân (cm): đo từ gốc cây cà phê đến đỉnh sinh trưởng của cây
+ Số cặp lá mới mọc/cành (cặp lá/cành): đếm toàn bộ số cặp lá mới
mọc/cành
+ Chiều dài rễ chính (cm): đo bằng thước có khắc vạch, chính xác đến mm
+ Số rễ nhánh (n): đếm toàn bộ số rễ nhánh trên cây.
Sau 28 ngày kiểm tra những cây cà phê nào có nồng độ vi sinh vật nội
sinh đạt 102 thì được lựa chọn để trồng vào các công thức thí nghiệm như sau:
- Công thức Đối chứng (ĐC): Cây cà phê không được lây nhiễm vi sinh
vật nội sinh Bacillus megaterium 18, sau đó được trồng trên đất và không bổ
sung phân bón;
- Công thức Thí nghiệm 1 (TN1): Cây cà phê không lây nhiễm vi sinh
vật nội sinh Bacillus megaterium 18. Sau đó được bón phân hóa học và chăm
sóc theo quy trình của ngành nông nghiệp 10TCN 478-2001 và cẩm nang
khuyến nông của sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Đắk Lắk.
- Công thức Thí nghiệm 2 (TN2): Cây cà phê đã được lây nhiễm vi sinh
vật nội sinh Bacillus megaterium 18, sau đó được trồng trên đất nhưng không
được bón phân hóa học mà sử dụng chế phẩm vi sinh vật Bacillus megaterium
18 với nồng độ 1g/100g đất và phun bổ sung chế phẩm này với nồng độ 1%,
cách phun ướt đẫm lá cây cà phê, phun trong 28 ngày.
Theo dõi các chỉ tiêu về chiều cao cây và số cặp lá/cây của cây cà phê
sau 3, 6 và 9 tháng trồng trong vườn ươm.
2.5.2.3. Đánh giá anh hưởng cua chung Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng
cây cà phê giai đoạn cây con và giai đoạn cây 1,5 tuổi
Cây cà phê
* Đối tượng nghiên cứu:
- Cây cà phê vối (Robusta); Tuổi cây cà phê 1,5 năm tuổi, cây đang
mang quả bói; tán lá cây phủ rộng > 0,5m.
30
- Thí nghiệm được thực hiện trên 20 cây cà phê/ công thức thí nghiệm,
các cây cà phê được trồng đồng đều nhau với khoảng cách 3m x 3m (tương
đương với mật độ trồng trung bình là: 1110 cây/ha).
- Chăm sóc về phân bón: Ở cả 2 công thức đều có cùng chế độ chăm
sóc bón phân hữu cơ và phân NPK như nhau theo quy trình tái canh cây cà
phê vối cụ thể như sau:
TT Phân hữu cơ ủ (kg/cây) Phân bón NPK nhả chậm
(kg/cây)
Tháng 5 - 0,3 kg/cây
Tháng 6 0,5 - 0,6kg/cây -
Tháng 7 - 0,3 kg/cây
Tháng 8 0,5 - 0,6kg/cây -
+ Đối với công thức đối chứng: Không bổ sung chế phẩm vi sinh vật nội
sinh trong suốt quá trình theo dõi thí nghiệm.
+ Đối với công thức thí nghiệm: Có sử dụng chế phẩm Vi sinh vật nội
sinh bón cho cây cà phê với lượng là: 0,5kg/cây vào tháng 7 của quá trình
theo dõi thí nghiệm.
* Địa điểm thực hiện thí nghiệm:
- Tại hộ gia đình ông: Nguyễn Quốc Bình, số CMND: 250568156;
- Địa chỉ: Tổ 7, xóm Sóc Sơn, xã Nam Hà, huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng.
+ Thời gian thực hiện thí nghiệm: 03 tháng, từ ngày 02 tháng 07 năm
2019 đến ngày 02 tháng 10 năm 2019.
* Phương pháp nghiên cứu.
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển:
Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện trên 20 cây cà phê. Các chỉ
tiêu về sinh trưởng, phát triển được theo dõi ở 15 cây cà phê trong thí nghiệm
(trừ bỏ 5 cây cà phê không thu số liệu là các cây cà phê tiếp giáp giữa công
31
thức thí nghiệm và công thức đối chứng). Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát
triển được theo dõi như: số cành/cây; chiều dài cành; số lá trên cành.
+ Số cành/cây: mỗi cây cà phê theo dõi được đếm toàn bộ số cành cấp
1 có trên cây.
+ Chiều dài cành: trên mỗi cây theo dõi đánh dấu cành số 3 và cành số
5 (tính từ ngọn xuống), tiến hành đo chiều dài cành (cm) tính từ đỉnh sinh
trưởng vào thân cây của các cây cà phê ở mỗi công thí nghiệm.
+ Số cặp lá/cành: tiến hành đếm toàn bộ số cặp lá có trên cành số 3 và
cành số 5 của các cây cà phê ở các công thức thí nghiệm.
2.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học
trên phần mềm excel năm 2017. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa
trên công thức thống kê:
Giá trị trung bình(X): X = I;
Độ lệch chuẩn (δ): δ = ; Sai số (m):
32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NGHIÊN CỨU
3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng Bacillus
megaterium 18 được xác định khi nuôi cấy trên môi trường MPA, ở nhiệt độ
37oC, sau 48 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc và hình ảnh tế bào được chụp tại
Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương.
(a) (b)
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng Bacillus megaterium 18
(a): Hình thái khuẩn lạc của chủng Bacillus megaterium 18 trên đĩa thạch
(b): Hình thái tế bào chủng Bacillus megaterium 18 ở độ phóng đại x 5000
Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Bacillus
megaterium 18 cho thấy chủng nghiên cứu có tế bào hình que dài, kích thước
từ 1 ÷ 3 µm. Hình thái tế bào có khuẩn lạc lồi, không bóng, nhầy, hơi nhăn.
Dựa trên một số đặc điểm hình thái (Hình 3.1) cho thấy chủng Bacillus
megaterium 18 trong nghiên cứu này có đặc điểm khuẩn lạc và tế bào tương
tự như trong các nghiên cứu của Holt et al. (1994) [56] và Lee et al. (2017)
[57] về đặc điểm của dòng Bacilus sp.
3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Chủng Bacillus megaterium 18 cấy sau 24 giờ trên thạch nghiêng, lấy
2÷3 vòng que cấy hoà tan vào nước muối sinh lý, dùng pipet vô trùng hút 2
33
ml từ nước muối sinh lý đã có vi sinh vật vào môi trường API 50 CHB, lắc
đều. Dùng pipet hút dịch từ môi trường API 50 CHB cho vào các chíp (vạch
1), nhỏ parafin khoảng 5÷6 giọt cho đầy. Nuôi 37oC, sau 24 giờ và 48 giờ ghi
kết quả. Trong suốt quá trình nuôi cấy, các đường lên men tạo thành axit làm
giảm pH, được nhận biết bằng sự đổi màu chất chỉ thị. Kết quả được trình bày
tại bảng 3.1
Bảng 3.1. Khả năng lên men sinh axit từ các nguồn cơ chất của chủng
vi khuẩn Bacillus megaterium 18 dựa trên kít chuẩn API 50CHB
TT Đặc điểm B. megaterium TT Đặc điểm B. megaterium
1 Glycerol + 26 Salicin +
2 Erythritol - 27 Cellobiose +
3 D-Arabinoza - 28 Maltoza +
4 L- Arabinoza + 29 Lactoza ±
5 Ribose + 30 Melibiose +
6 D-Xyloza + 31 Sucroza +
7 L-Xyloza - 32 Trehalose +
8 Adonitol - 33 Inulin ±
9 β-Methylxylosit - 34 Melezitose -
10 Galactoza + 35 D-Raffinose +
11 D-Glucoza + 36 Tinh bột +
12 D-Fructoza + 37 Glycogen +
13 D-Mantose - 38 Xylitol -
14 L-Sorbose - 39 β-Gentiobiose ±
15 Rhamnoza - 40 D-Turanose ±
16 Dulcitol - 41 D-Lyxose -
17 Inositol ± 42 D-Tagatose -
18 Mannitol + 43 D-Fucose -
19 Sorbitol - 44 L-Fucose -
20 α-Methyl-D-mannosit - 45 D- Arabitol -
21 α-Methyl-D-glucosit - 46 L- Arabitol -
22 N-Axetylglucosamin + 47 Gluconate -
34
23 Amygdalin + 48 2-Ketogluconate -
24 Arbutin + 49 5-Ketogluconate -
25 Aesculin +
Chủng Bacillus megaterium 18 có khả năng lên men 12 loại đường trên
tổng số 49 loại đường và thử nghiệm để tạo thành axit là glycerol, L-
arabinose, Galactose, D-glucose, N-Acetylglucosamine, Arbutin, Aesculin,
Cellobiose, Melibiose, Sucrose, D-Raffinose và tinh bột.
3.1.3. Khả năng phân giải cơ chất của chủng nghiên cứu
Khả năng phân giải CMC của chủng Bacillus megaterium 18
Chủng Bacillus megaterium 18 được xác định khả năng phân giải cơ
chất là CMC và tinh bột: Môi trường MPA có bổ sung CMC và tinh bột 1%
khử trùng ở 0,8 atm trong 30 phút, sau đó đổ ra đĩa petri. Sử dụng phương pháp
cấy chấm điểm trên đĩa, mẫu ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. Sau đó nhuộm màu
bằng thuốc thử Lugol. Kết quả hình 3.1 cho thấy vi khuẩn có hoạt tính thủy
phân xenluloza và tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh
trưởng và đã được đo vòng phân giải có đường kính trung bình đạt 18mm.
Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của chủng vi khuẩn
Khả năng làm loãng gelatin của chủng Bacillus megaterium 18
35
Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium 18 nghiên cứu được cấy trong môi
trường MPA lỏng bổ sung 10% gelatin, nuôi ở nhiệt độ 37oC. Sau 2 ngày,
trước khi quan sát giữ mẫu ở 20oC trong khoảng 4 giờ, kiểm tra kết quả với vi
khuẩn. Dịch môi trường loãng chứng tỏ chủng có khả năng làm loãng gelatin.
Hình 3.3. Khả năng làm loãng gelatin của chủng Bacillus megaterium18
Kết quả được trình bày ở hình 3.3 cho thấy chủng Bacillus megaterium
18 sau 2 ngày cấy lên môi trường có khả năng làm loãng hoàn toàn so với ống
nghiệm đối chứng không cấy vi sinh vật.
3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng
Bacillus megaterium 18
3.1.4.1. Ảnh hưởng cua thơi gian đến sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase
cua chung vi khuẩn nghiên cứu
* Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn
Thời gian là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của bất cứ loài vi sinh
vật nào, thời gian nào là thời điểm vi sinh vật sinh trưởng mạnh nhất tùy
thuộc vào mỗi loài. Chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường
36
MPA, nhiệt độ 37oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút. Sau khi cấy giống thu mẫu
6 giờ một lần, tiến hành xác định khả năng sinh trưởng bằng cách đo OD với
bước sóng 620 nm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của chủng
Bacillus megaterium 18 theo thời gian
Thời gian (giờ) Khả năng sinh
trưởng (OD620nm)
Khả năng sinh
enzyme(IU/ml)
6 0,59 0,12
12 0,61 0,45
18 0,99 1,14
24 1,01 1,62
30 2,89 2,2
36 2,01 2,6
42 1,85 1,6
48 1,59 1,5
Kết quả bảng 3.2 cho thấy thời gian tối ưu cho sinh trưởng của chủng
vi khuẩn là 30 giờ, OD chủng đạt 2,89. Từ 6 ÷ 30 giờ các chủng sinh trưởng
rất nhanh. Từ 30 giờ trở đi sinh trưởng của các chủng nghiên cứu giảm dần.
* Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp chitinase của các chủng
vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi trong môi trường MPA lỏng có
bổ sung 0,1% CMC, nuôi 37oC, lắc 200 vòng/phút. Lấy mẫu dịch nuôi cấy cứ
sau 6 giờ một lần, bảo quản dưới 0oC để vi khuẩn không tiếp tục sinh trưởng.
Sau khi kết thúc tiến hành làm đường khử xác định hoạt tính chitinase của các
chủng nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 cho thấy chủng vi khuẩn
sau 6 giờ nuôi cấy, lượng enzym sinh ra tăng liên tục nhưng tương đối khác
nhau. Chủng sau 6 ÷ 24 giờ khả năng sinh tổng hợp chitinase tăng, tiếp tục tăng
nhanh từ 30 ÷ 36 giờ, lượng enzym sinh ra nhiều nhất tại thời điểm sau 36 giờ,
đạt 2,6 IU/ml. Sau 36 giờ lượng enzym sinh ra của chủng giảm.
37
3.1.4.2. Ảnh hưởng cua nhiệt độ nuôi cấy đến kha năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp chitinase cua chung vi khuẩn
* Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của
vi khuẩn
Nhiệt độ là một yếu tố tác động trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn, mỗi chủng có một khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau.
Khả năng chịu được nhiệt độ cao là một trong những tiêu chí quan trọng trong
ứng dụng xử lý. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở dải nhiệt
độ: 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55 và 60oC. Các chủng vi khuẩn nuôi trên môi
trường MPA, lắc 200 vòng/phút. Sau 48 giờ nuôi cấy chúng tôi tiến hành
đánh giá sự sinh trưởng.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzym
của chủng Bacillus megaterium 18
Nhiệt độ (˚C) Khả năng sinh
trưởng (OD620nm)
Khả năng sinh
enzyme (IU/ml)
25 0,592 0,12
30 3,619 0,55
37 4,99 1,54
40 4,01 1,92
45 2,89 2,3
50 2,1
55 1,6
60 1,5
Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn có khả năng chịu được nhiệt độ khá
cao, ở nhiệt độ 25 ÷ 30oC và lớn hơn 50oC. Ở 55 ÷ 60oC chủng sinh trưởng yếu.
* Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của
chủng vi khuẩn
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng, nó quyết định sự sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzym của các chủng vi sinh vật. Thông thường ở nhiệt độ nào mà
vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất thì sẽ sinh enzym thủy phân cơ chất có trong
môi trường cao nhất. Tuy nhiên cũng có chủng vi khuẩn mặc dù ở nhiệt độ
38
sinh trưởng tốt nhưng lại không sinh tổng hợp enzym cao ở nhiệt độ đó. Vì
vậy, để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh chitinase, chủng
Bacillus megaterium 18 được nuôi trong môi trường MPA, lắc 200 vòng/phút
và nuôi ở các dải nhiệt độ 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55 và 60oC. Sau 54 giờ nuôi
cấy tiến hành lấy kết quả.
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy dải nhiệt độ sinh tổng hợp chitinase của
chủng Bacillus megaterium 18 từ 37 ÷ 50oC và nhiệt độ sinh tổng hợp
chitinase tối ưu là 45oC, chủng có hoạt tính đạt 2,3 IU/ml. Nếu nhiệt độ nuôi
cấy dưới 37oC và cao hơn 50oC thì khả năng sinh chitinase của chủng đều
giảm. Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh
tổng hợp chitinase cho thấy chủng lựa thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm.
3.1.4.3. Ảnh hưởng cua pH môi trương đến kha năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp chitinase cua chung vi khuẩn
* Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus
megaterium 18
pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của các vi sinh vật,
đặc biệt đối với vi khuẩn. Các ion H+, OH- là hai ion có tác động lớn nhất đến
hoạt động của vi sinh vật, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng
cũng có ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật. Với mục tiêu chọn chủng
có khả năng phân giải xenluloza để xử lý nước thải thì chủng vi sinh vật có
khả năng tồn tại ở dải pH rộng là rất cần thiết. Chủng nghiên cứu được nuôi
trong môi trường MPA lỏng, nhiệt độ 37oC, lắc 200 vòng/phút và dải pH môi
trường là: 3; 4; 5; 6; 7; 8 và 9., bằng cách cho thêm NaOH 1N hoặc HCl 1N
và đo bằng máy đo pH 320 pH Metter. Nuôi trong thời gian 48 giờ thu dịch
đo OD620 nm kiểm tra sinh trưởng của chủng.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của
chủng vi khuẩn
pH 3 4 5 6 7 8 9 10
Khả năng sinh
trưởng (OD620nm)
0,103 0,155 0,645 0,925 1,2 0,66 0,575 0,179
Kết quả trên cho thấy chủng Bacillus megaterium 18 có thể sinh trưởng ở
dải pH rộng 3 ÷ 9, pH tối ưu của chủng ở pH 7, khả năng sinh trưởng OD đạt 1,2
khi giá trị pH <5 và ≥ 9 thì tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn bị yếu đi.
39
3.1.4.4. Ảnh hưởng cua nồng độ NaCl đến sinh trưởng cua các chung vi khuẩn
Ba chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường MPA nhưng thay thế
nồng độ NaCl từ 0,3% bằng dải nồng độ 1, 3, 5, 7, 9 và 11%, nuôi ở 37oC, lắc
200 vòng/phút, sau 48 giờ nuôi cấy lấy mẫu xác định sinh trưởng bằng
phương pháp đo mật độ quang OD620 nm.
Bảng 3.5. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh
trưởng của chủng vi khuẩn
Nồng độ NaCl % 1 3 5 7 9 11
Khả năng sinh trưởng
(OD620mm)
3,08 2,26 1,66 0,98 0,56 0,22
Kết quả trình bày trên cho thấy ở nồng độ 1 ÷ 5% chủng sinh trưởng
tốt, từ 7% NaCl các chủng sinh trưởng yếu và gần như không sinh trưởng ở
nồng độ 9 ÷ 11%.
3.1.4.5. Ảnh hưởng cua các nồng độ cacbon, nitơ đến kha năng sinh
trưởng và phát triển cua chung vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium18
a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Trên cơ sở môi trường MPA đã lựa chọn, thay đổi nguồn cacbon khác
nhau. Glucose, rỉ đường, saccharose, CMC, đối chứng để xác định mức độ
ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh trưởng và hình thành chất
kháng nấm chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến khả năng sinh chất
kháng sinh của chủng Bacillus megaterium 18
Nguồn cacbon Khả năng sinh
trưởng (OD620nm) Nguồn nitơ
Khả năng sinh
trưởng (OD620nm)
Glucose 3,885 KNO3 7,36
Rỉ đường 3,495 (NH4)+ 4,665
Saccharose 4,34 Pepton 3,18
CMC 3,285 Cao men 5,1
Đối chứng 2,7 Cao thịt 4,86
40
Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy, trong các nguồn cacbon sử
dụng chủng Bacillus megaterium 18 nội sinh phát triển trong môi trường có
nguồn cacbon là saccharose cho các nghiên cứu tiếp theo.
b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 5 nguồn nitơ khác nhau như: KNO3.
(NH4)+, pepton, cao malt, cao thịt. Kết quả nghiên cứu thể hiện qua Bảng 3.6.
Chủng Bacillus megaterium 18 phát triển tốt nhất trên môi trường
tuyển chọn với nguồn nitơ là KNO3. Như vậy, trong các nguồn nitơ sử dụng
chủng Bacillus megaterium 18 phát triển trong môi trường có nguồn nitơ là
KNO3 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Tóm lại, chủng Bacillus megaterium 18 có thời gian sinh trưởng tối ưu
là 30 giờ, thời gian sinh tổng hợp chitinase ở 36 giờ lượng enzyme sinh ra
nhiều nhất; chủng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ từ 25-30oC, nhiệt độ sinh tổng
hợp chitinanse tối ưu ở 45oC; môi trưởng nuôi cấy thích hợp ở pH7, bổ sung
nồng độ NaCl 1%, môi trường có bổ sung nguồn cacbon là saccharose và
nguồn nito KNO3 chủng sinh trưởng tốt nhất.
3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG CỦA CHỦNG
Bacillus megaterium 18 Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Chủng Bacillus megaterium 18 được nuôi trên môi môi trường và điều
kiện lên men đã lựa chọn, sau 24 giờ, dịch nuôi cấy được thử nghiệm sơ bộ
khả năng kháng tuyến trùng.
Thí nghiệm được tiến hành ở 3 công thức với 3 nồng độ vi khuẩn khác
nhau là 10, 20, 30%. Mỗi công thức gồm 3 đĩa petri đường kính 35 cm. Mỗi
đĩa petri có 300 trứng tuyến trùng Meloidogyne incognita. Theo dõi tỷ lệ
trứng nở sau 7 ngày. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Thử nghiệm khả năng
tiêu diệt ấu trùng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18 trong
phòng thí nghiệm theo phương pháp Yoon et al. (2012) [58].
41
Bảng 3.7. Khả năng kháng tuyến trùng sau 24 giờ nuôi cấy trong phòng
thí nghiệm
Nồng
độ
VK
(%)
Số
lượng
trứng
ban
đầu
Tỷ lệ
(%)
trứng
nở sau
7 ngày
Nhận xét
Số
lượng
ấu
trùng
ban
đầu
Tỷ lệ
(%) ấu
trùng
sống
sau 7
ngày
Nhận xét
10 300 5,8 VSV phát triển,
trứng bị phân hủy
nhiều, ấu trùng nở ra cũng bị chết và
phân hủy, ấu trùng
chết kiểu bị co rút
cơ thể
250 28 Không có hiện
tượng ký sinh,
tỷ lệ ấu trùng chết cao, ấu
trùng chết
kiểu bị độc, cơ
thể bị co rút
20 300 4,2 250 22,3
30 300 5,8 250 15
ĐC 300 92,5
Ấu trùng nở ra vẫn
hoạt động bình
thường
250 100
Lượng ấu
trùng sống sót
còn nguyên
Hình 3.4. Ảnh thử nghiệm khả năng ức chế trứng nở sau 7 ngày của chủng vi
khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ 10%
42
Hình 3.5. Ảnh thử nghiệm khả năng giết chết ấu trùng sau 7 ngày của chủng vi
khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ 10%
Bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy, sau 7 ngày thí nghiệm, tỷ lệ trứng nở ở
công thức đối chứng có sự khác nhau rõ rệt so với các công thức ở các nồng
độ vi khuẩn khác nhau, nhưng ở tỷ lệ trứng ở giữa các công thức ở các nồng
độ khác nhau thì không có sự sai khác nhiều. Tỷ lệ trứng nở ở công thức đối
chứng là 92,5%, trong khi đó, ở các nồng độ vi khuẩn từ 10-30% tỷ lệ trứng
nở rất ít chỉ từ 4,2 đến 5,8%. So sánh với thử nghiệm khả năng ức chế trứng
nở của nấm Paecilomyces javanicus sau 120h, ở nồng độ 5% tỷ lệ trứng nở là
11,8%, và 3.8% ở nồng độ 20% (L. T. M. Linh và cs, 2015) [59] cho thấy vi
khuẩn có hoạt tính ức chế nở trứng tuyến trùng Meloidogyne incognita.
Bảng 3.7 và hình 3.5 cho thấy, tỷ lệ sống sót của ấu trùng giữa công
thức có vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 có sự khác nhau rất nhiều
so với đối chứng. Ở các công thức có bổ sung vi khuẩn nội sinh Bacillus
megaterium 18 ở các nồng độ từ 10-30%, tỷ lệ ấu trùng bị chết từ 72-85% và
ở nồng độ vi khuẩn B. megaterium 30% ấu trùng có hiện tượng ít hoạt động,
chuyển về trạng thái duỗi thẳng cơ thể, kiểm tra cho thấy không có hiện tượng
43
ký sinh, tỷ lệ ấu trùng chết cao, ấu trùng chết kiểu bị độc, cơ thể bị co rút. Tỷ
lệ sống sót của ấu trùng ở công thức đối chứng là 100%, lượng ấu trùng sống
sót còn nguyên.
Như vậy khi thử nghiệm ở các công thức khác nhau cho thấy có sự
phân hủy tuyến trùng Meloidogyne incognita khi bổ sung vi khuẩn B.
megaterium 18 với khả năng phân hủy trứng và ấu trùng, ở nồng độ 10-30%
tỷ lệ trứng nở còn 4,2-5,8% sau 7 ngày và chủng B. megaterium có khả năng
gây chết ấu trùng cao nhất là 85% ở nồng độ 30% sau 7 ngày.
Kết quả đạt được về khả năng phân hủy tuyến trùng Meloidogyne
incognita trong nghiên cứu này có sự tương đồng với các nghiên cứu khác về
khả năng đối kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita của các chủng vi
khuẩn thuộc chi Bacillus. Đã có nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của
các chủng thuộc chi Bacillus đến mật độ và hiệu quả diệt tuyến trùng
Meloidogyne incognita.
Kết quả nghiên cứu của Mahmoud et al. (2017) [60] cho thấy vai trò
của vi khuẩn B. pumilus trong việc hạn chế mật độ tuyến trùng Meloidogyne
incognita gây hại cây củ cải đường. Số lượng khối trứng và u sưng do tuyến
trùng Meloidogyne incognita đã giảm đến 74% và 73% khi xử lý cây cải củ
bằng B. Pumilus.
Đối với tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cây củ cải đường,
xử lý B. subtilis đã làm giảm 71% số lượng u sưng do tuyến trùng, giảm 65%
số lượng khối trứng (Mahmoud et al., 2017) [60]. Ngoài ra, B. subtilis còn
làm giảm đáng kể số lượng u sưng, giảm khả năng sinh sản cũng như mật độ
tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cây đậu xanh (Khan et al., 2007)
[55].
Trong một nghiên cứu khác, huyền phù vi khuẩn B. cereus gây chết
90,96% tuyến trùng Meloidogyne incognita trong điều kiện in vitro (Gao et
al., 2016) [61]. Với thí nghiệm trong chậu, xử lý dịch nuôi cấy vi khuẩn B.
cereus đã mang lại hiệu quả diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita lên đến
81,36% (Gao et al., 2016) [61].
44
Cơ chế của tác dụng này cũng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu
và thảo luận. Ongena và Jacques (2008) [62] cho rằng các loài vi khuẩn thuộc
chi Bacillus không những có thể ức chế sự phát triển của các tác nhân gây
bệnh mà còn có khả năng xâm chiếm bộ rễ cây trồng và kích thích khả năng
miễn dịch của cây. Đây là những loài có khả năng sản sinh một lượng lớn các
phân tử có hoạt tính sinh học ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh
thực vật (Krebs et al., 1998) [63]. Ngoài ra, enzyme protease, chitinase phân
hủy chitin sản sinh bởi các chủng vi khuẩn Bacillus cũng đóng vai trò quan
trọng trong việc cân bằng mật độ tuyến trùng trong đất (Lian et al., 2007)
[64]. Cơ chế đối kháng của chủng vi khuẩn Bacillus đối với tuyến trùng ký
sinh thực vật Meloidogyne incognita cho thấy các enzyme protease,
collagenase và chitinase sản sinh bởi chủng vi khuẩn Bacillus là nguyên nhân
gây chết tuyến trùng.
3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI
CÂY CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium 18
3.3.1. Kết quả thử nghiệm trên cây thuốc lá in vitro
Sau khi lây nhiễm vi khuẩn bằng phương pháp nhân tạo, tỉ lệ ra rễ của
các công thức có lây nhiễm quan sát cao hơn so với công thức đối chứng ở tất
cả các thời điểm theo dõi:15 ngày, 30 ngày, 45 ngày và 60 ngày sau lây
nhiễm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Sinh trưởng của cây thuốc lá K326 sau lây nhiễm vi sinh vật
Thời
gian
sau lây
nhiễm
Số lá Chiều cao thân Chiều dài rễ
Đối
chứng
B.megaterium
18 Đối chứng
B.megaterium
18 Đối chứng
B.megaterium
18
0 4,8±0,4 4,8±0,4 1,08±0,19 1,04±0,10 5,6±0,31 5,6±0,28
15 4,8±0,4 5,8±0,75 1,98±0,39 2,36±1,03 6,16±0,69 7,06±1,06
30 5,2±0,4 7,2±0,75 2,78±0,60 5,82±1,32 10,16±0,67 13,22±1,52
45 7,2±0,4 8,6±1,02 3,78±0,68 7,04±1,68 12,92±1,86 17,22±2,62
60 9,4±0,8 11,4±0,8 5,66±0,52 11,98±2,37 16,08±1,38 20,5±4,01
45
(a) (b) (c)
Hình 3.6. Cây thuốc lá ở các công thức sau 15 ngày lây nhiễm
(a): Đối chứng (Không có vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18)
(b): So sánh cây thuốc lá in vitro giữa 2 công thức sau 15 ngày lây nhiễm
(c): Công thức có bổ sung vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18
(d) (f) (g)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây thuốc lá sau 30 ngày lây nhiễm
(d): Đối chứng (Không có vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium)
(f): So sánh cây thuốc lá invitro giữa 2 công thức sau 30 ngày lây nhiễm
(g): Công thức có bổ sung vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18
Bảng 3.8 và hình 3.6, hình 3.7 cho thấy: hầu hết sau 15, 30, 45 và 60
ngày, số liệu thu được ở lô thí nghiệm đánh giá số lá, chiều cao thân và chiều dài
46
rễ có lây nhiễm vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 cho kết quả sinh trưởng tốt
hơn cho với lô đối chứng không bổ sung. Tác động lên kích thích sinh trưởng ở
thực vật thường là do sự sản sinh ra phytohormone. Trong đó, phytohormone
phổ biến nhất là Axit indole-3-acetic acid (IAA) thuộc nhóm auxin liên quan
tới quá trình phân chia và kéo dài tế bào, giúp tăng trưởng và phát triển ở thực
vật, đặc biệt là kích thích kéo dài rễ và tăng nảy mầm ở hạt.
3.3.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 lên sinh trưởng
của cây cà phê ở giai đoạn vườn ươm
3.3.2.1. Ảnh hưởng cua vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 đến sinh trưởng
cua cây cà phê sau 1 tháng theo dõi
a. Ảnh hưởng về chiều cao và số cặp lá mới mọc trên cây cà phê
Sau khi đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh trên cây thuốc lá mô
hình, chúng tôi đã tiến hành thiết kế thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của vi
khuẩn nội sinh lên sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vườn ươm.
Mỗi thí nghiệm chọn 5 mẫu có sự sinh trưởng tương đối đồng đều nhau
để theo dõi các chỉ tiêu như chiều cao thân và số cặp lá mới mọc ra của cây cà
phê, kết quả thu được trình bày tại Bảng 3.9 và hình 3.8.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều cao và số cặp lá
của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm
Thời gian
Chiều cao thân (cm) Số lá (cặp)
ĐC TN1 TN2 ĐC TN1 TN2
0 ngày 1,3±0,1 1,29±0,1 1,29±0,1 2,2±0,1 2,2±0,1 2,2±0,1
7 ngày 1,3±0,1 1,31±0,1 1,33±0,1 2,6±0,1 2,9±0,1 3,1±0,1
14 ngày 1,3±0,1 1,29±0,2 1,36±0,1 3,2±0,1 3,4±0,2 3,4±0,1
21 ngày 1,3±0,1 1,45±0,2 1,48±0,1 3,3±0,2 3,6±0,1 3,6±0,2
28 ngày 1,5±0,2 1,96±0,1 1,84±0,1 3,5±0,2 3,76±0,3 3,80±0,2
47
Hình 3.8. Cây cà phê ở công thức ĐC, TN1 và TN2 sau 28 ngày lây nhiễm
Kết quả bảng 3.9 cho thấy:
Chiều cao thân của công thức đối chứng từ 0 đến 21 ngày là 1,3cm
không có sự thay đổi trong khi số cặp lá được tăng từ 2,2 cặp lá đến 3,3 cặp
lá. Điều này là do ở các công thức thí nghiệm đều có sự lặp lại và mỗi lần đo
là ngẫu nhiên, do vậy, kết quả đo có sự không thay đổi về số liệu ở các lần đo
khác nhau.
Trong giai đoạn đầu, ở thí nghiệm 1 và 2 lá phát triển không tốt hơn so
với công thức đối chứng. Lá ở thí nghiệm 1 và 2 có màu xanh nhạt. Tuy
nhiên, vào giai đoạn sau 14 ngày, cây ở thí nghiệm 1 và 2 khỏe mạnh hơn so
với cây ở công thức đối chứng. Lá ở các thí nghiệm 1 và 2 lá có màu xanh
nhạt và sáng bóng, cây khỏe, không thể hiện triệu chứng thiếu dinh dưỡng và
bệnh hại xuất hiện, trong khi đó, ở thí nghiệm đối chứng mặc dù lá to hơn,
dầy hơn nhưng rất cứng và thô, sần sùi, thể hiện triệu chứng thiếu dinh dưỡng
b. Ảnh hưởng về chiều dài rễ và số rễ nhánh:
Không chỉ giúp các chỉ tiêu sinh trưởng của các bộ phận trên mặt đất
gia tăng mà các chủng vi khuẩn nội sinh còn thúc đẩy bộ rễ phát triển tốt, làm
48
tăng đáng kể chiều dài rễ và số rễ nhánh của cây cà phê ở giai đoạn cây con.
Tiến hành theo dõi số rễ nhánh và chiều dài rễ chính của các cây cà phê ở các
thí nghiệm nghiên cứu; mỗi thí nghiệm chọn 5 mẫu có sự sinh trưởng tương
đối đồng đều nhau để đo các chỉ tiêu theo dõi, kết quả được trình bày ở bảng
3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều dài rễ
chính và số rễ nhánh của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm
Thời gian Số rễ nhánh Chiều dài rễ chính (cm)
ĐC TN1 TN2 ĐC TN1 TN2
0 ngày 2,3±0,1 2,3±0,1 2,3±0,1 3,5±0,1 3,3±0,1 3,4±0,1
7 ngày 2,3±0,1 2,6±0,1 3,5±0,1 3,6±0,1 4,1±0,2 4,2±0,1
14 ngày 2,3±0,1 3,1±0,1 4,5±0,2 3,8±0,1 4,6±0,3 4,7±0,2
21 ngày 2,3±0,1 3,4±0,2 5,1±0,1 3,9±0,1 4,9±0,1 5,0±0,1
28 ngày 2,6±0,2 4,3±0,2 5,1±0,3 4,1±0,1 5,5±0,3 5,8±0,2
Kết quả bảng 3.10 cho thấy:
Chiều dài rễ chính ở công thức thí nghiệm 1 và 2 luôn cao hơn hơn
công thức đối chứng qua các ngày theo dõi. Chiều dài rễ chính đo được sau
28 ngày theo dõi ở công thức 1 và 2 lần lượt là 5,5 và 5,8cm còn ở công thức
đối chứng là 4,1cm.
Số rễ phụ công thức thí nghiệm 1 và 2 tăng sinh nhiều hơn so với công
thức đối chứng. Cụ thể, số rễ phụ ở công thức đối chứng hầu như không tăng
sinh trong quá trình theo dõi với số rễ là 2,3 nhưng ở các công thức thí
nghiệm 1 và 2 số rễ được tăng lần lượt từ 2,3 lên 5,1 và 4,3.
Số rễ phát triển nhanh nhất ở thời điểm từ 0 đến 7 ngày ở thí nghiệm 1
và 2 trong khi đối chứng gần như không phát triển mà chỉ bắt đầu phát triển
chậm sau 14 ngày. Điều này giúp cho cây hấp thu dinh dưỡng cũng như phát
triển khỏe nhạnh hơn trong các giai đoạn phát triển về sau.
49
3.3.2.2. Ảnh hưởng cua vi khuẩn nội sinh B. megaterium đến sinh trưởng cua cây cà
phê sau 3,6,9 tháng theo dõi.
Kết quả bảng 3.11 và hình 3.9 cho thấy:
Chiều dài thân ở công thức thí nghiệm 1 và 2 luôn cao hơn hơn công
thức đối chứng qua các tháng theo dõi.
Số cặp lá trong các công thức thí nghiệm 1 và 2 tăng sinh nhiều hơn so
với công thức đối chứng. Số cặp lá triển nhanh nhất ở thời điểm từ 6 đến 9
tháng ở thí nghiệm 1 và 2 trong khi đối chứng gần như không phát triển mà
chỉ bắt đầu phát triển chậm lại. Khi so sánh các công thức cho thấy cây hấp
thu dinh dưỡng cũng như phát triển khỏe nhạnh hơn trong các giai đoạn phát
triển về sau.
Bảng 3.11. Sinh trưởng của cây cà phê tại vườn ươm sau 3,6 và 9 tháng
Thời
gian
Chiều cao thân (cm) Số lá (cặp)
ĐC TN1 TN2 ĐC TN1 TN2
3 tháng 39,2±1,1 39,1±0,9 39,0±0,5 4,6±0,2 4,68±0,1 4,64±0,1
6 tháng 41,1±0,8 42,5±0,7 45,2±0,6 5,2±0,1 5,43±0,1 5.51±0,2
9 tháng 51,7±1,2 60,3±1,7 62.4±1,5 6,2±0,2 7,1±0,2 7.3±0,3
50
(a): Cây cà phê sau 3 tháng lây nhiễm
(b): Cây cà phê sau 6 tháng lây nhiễm
TN1 TN2 ĐC
TN2 TN1 ĐC
51
(c): Cây cà phê sau 9 tháng lây nhiễm
Hình 3.9. Cà phê tại vườn ươm sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng lây nhiễm
3.3.2.3. Ảnh hưởng cua vi khuẩn nội sinh B. Megaterium 18 đến sinh trưởng
cua cây cà phê 1,5 tuổi
Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện trên 20 cây cà phê. Các chỉ
tiêu về sinh trưởng phát triển được theo dõi ở 15 cây cà phê trong thí nghiệm
(trừ bỏ 5 cây cà phê không thu số liệu là các cây cà phê tiếp giáp giữa công
thức thí nghiệm và công thức đối chứng). Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở
bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của vi khuẩn vật nội sinh tới khả năng sinh
trưởng và phát triển của cây cà phê
TT
Số
cành/cây
Chiều dài cành
số 3 (cm)
Chiều dài
cành số 5 (cm)
Số cặp
lá/cành 3
Số cặp
lá/cành 5
TN 25,86±0,9 29,42±1,1 41,3±1,0 5,3±0,2 7,6±0,3
ĐC 22,53±1,2 22,67±0,9 32,87±0,8 3,6±0,2 6,03±0,2
TN2 TN1 ĐC
52
Bảng 3.12 cho thấy:
Số cành/cây; chiều dài cành số 3 ; số lá trên cành, số cặp lá/cành của cà
phê 1,5 tuổi ở công thức thí nghiệm nhiều hơn so với công thức đối chứng.
Cụ thể:
Số cành cấp 1 có trên cây cà phê ở công thức thí nghiệm là 25,86 cành
chênh hơn 3,33 cành so với công thức đối chứng là 22,53 cành;
Chiều dài cành số 3 và cành số 5 (tính từ ngọn xuống) của các cây cà
phê ở công thức thí nghiệm đều dài hơn so với công thức đối chứng lần lượt
là 6,75 cm và 8,67 cm;
Số cặp lá/cành có trên cành số 3 và cành số 5 của các cây cà phê ở công
thức thí nghiệm nhiều hơn so với công thức đối chứng lần lượt là 1,7cm và
0,57cm.
Tóm lại, qua các thí nghiệm trên đã đánh giá được ảnh hưởng của vi
khuẩn nội sinh Bacillus megaterium lên sinh trưởng của cây cà phê ở giai
đoạn cây con và cây cà phê tái canh 1,5 tuổi. Bước đầu cho thấy sử dụng
chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở giai đoạn vườn ươm trong
nhà lưới cây cà phê sinh trưởng tốt sau 1 tháng theo dõi; đối với cây cà phê tái
canh 1,5 tuổi bước đầu ghi nhận cây sinh trưởng phát triển tốt, số cành/cây là
25,86 cành/cây, chiều dài cành số 3 là 29,42cm, chiều dài cành số 5 là
41,3cm.
53
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
- Chủng Bacillus megaterium 18 có hình thái tế bảo có khuẩn lạc lồi,
không bóng, nhầy, hơi nhăn, khả năng phân giải cơ chất là CMC và tinh bột.
Thời gian tối ưu cho sinh trưởng của chủng vi khuẩn là 30 giờ; khả năng sinh
tổng hợp chitinase với lượng enzyme sinh ra tối đa tại thời điểm 36 giờ, nuôi
ở nhiệt độ 37oC; chủng Bacillus megaterium18 sinh trưởng tối ưu ở pH 7;
nồng độ NaCl 1%. Chủng Bacillus megaterium 18 phát triển tốt nhất trong
môi trường có nguồn cacbon là saccharose và nguồn nitơ là KNO3.
- Chủng Bacillus megaterium 18 được xác định khả năng phân hủy
trứng tuyến trùng ở nồng độ 10-30%, tỷ lệ trứng bị phân hủy từ 94,2 – 96,8%;
ấu trùng nở ra cũng bị chết và phân hủy, ấu trùng chết kiểu bị co rút cơ thể, tỷ
lệ ấu trùng bị phân hủy từ 72-85% sau 7 ngày.
- Thử nghiệm lên cây thuốc lá in vitro cho thấy chủng vi khuẩn nội sinh
Bacillus megaterium 18 giúp tăng trưởng chiều cao thân và chiều dài rễ.
- Thử nghiệm ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium
lên sinh trưởng của cây cà phê ở giai đoạn cây con trong nhà lưới cho thấy
cây sinh trưởng tốt sau một tháng theo dõi.
- Kết quả đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18
đến sinh trưởng của cây cà phê tái canh 1,5 tuổi bước đầu ghi nhận trong 3
tháng cây sinh trưởng và phát triển tốt.
4.2. KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu về khả năng phòng trừ bệnh hại do tuyến trùng
của các dòng vi khuẩn nội sinh khác trên cà phê.
- Tiếp tục đánh giá hiệu lực của chế phẩm vi sinh vật nội sinh này với
thời gian dài hơn để có được những kết quả toàn diện hơn, bởi những biện
pháp phòng trừ sinh học thường có tác dụng chậm nhưng kéo dài và bền vững
hơn.
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước KHCN-TN3/11-15 (2011-2015):
Nghiên cứu phát triển và ứng dụng một số chế phẩm có nguồn gốc sinh
học trong canh tác chè, cà phê, hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững tại
Tây Nguyên.
2. Nguyễn Thị Lài và Đỗ Thị Mỹ Hiền , 2019, Thách thức trong xuất khuẩn
cà phê tại Việt Nam hiện nay, Tạp chí Công thương, Số 9: 85-89.
3. Ủy ban nhân dân tỉnh Đắk Lắk , 2013, Báo cáo Đề án tiếp tục phát triển
cà phê bền vững tỉnh Đắk Lắk đến năm 2020, tầm nhìn 2030, Đắk Lắk.
4. Trương Hồng, Đinh Thị Nhã Trúc và Nguyễn Xuân Hòa, 2013, Nghiên
cứu biện pháp kỹ thuật tổng hợp tiết kiệm chi phí đầu vào đối với cà phê
ở Tây Nguyên, Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất,
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội: 914-922.
5. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước KHCN-TN3/11-15 (2011-2015):
Nghiên cứu hoàn thiện và chuyển giao công nghệ sản xuất sản phẩm sinh
học POLYFA-TN3 góp phần cải tạo đất cho vùng Tây Nguyên.
6. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước KHCN-TN3/11-15 (2011-2015):
Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất phân urê và NPK nhả chậm ứng
dụng triển khai cho các cây trồng trên Tây Nguyên.
7. Báo cáo tổng kết Đề tài Khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.07B (1996-
2000): Nghiên cứu công nghệ vi sinh (vi khuẩn, nấm, virut) để sản xuất
chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật trong phòng trừ sâu hại cây trồng.
8. Cục Bảo vệ thực vật và Viện Bảo vệ thực vật, 1995, Báo cáo khoa học về
cải tiến công tác BVTV ở Việt Nam (dự án VNM.8910-030, giai đoạn
1990-1995)
55
9. Nguyễn Thị Chắt, 1999, Cà phê sâu bệnh, cỏ dại và biện pháp phòng trừ.
Nhà xuất ban Nông nghiệp.
10. Nguyễn Văn Thao, Nguyễn Thị Thu, Hà Việt Hải và cộng sự , 2010, Giới
thiệu một số sản phẩm khoa học áp dụng phục vụ sản xuất nông nghiệp.
Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam (1975 - 2010). Tiểu ban các chất có hoạt tính sinh học - 10/2010.
11. Trần Kim Loang, 2002, Nghiên cứu một số nguyên nhân gây hiện tượng
vàng lá, thối rễ trên cà phê vối (Coffea canephora pierre exfroehner) tại
Đắc Lắc và khả năng phòng trừ, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp.
12. White T, T Burns, S Lee, J Taylor, 1990, Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In:
PCRprotocols. A guide to methods and applications. Academic Press,
Inc., San Diego, Calif. 315-322
13. Nguyễn Ngọc Châu, 2003, Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ, NXB
Khoa học và Kỹ thuật.
14. Nguyễn Thu Hà, Vũ Thúy Nga, Trương Thị Tú Anh, Lương Hữu Thanh,
Đặng Thị Thu Thảo, Đào Văn Thông, 2007, Nghiên cứu phát triển chế
phẩm sinh học trừ tuyến trùng, nấm bệnh vùng rễ cà phê và hồ tiêu (Tài
liệu dẫn).
15. P.Q.Trinh , Eduardo de la Peña, Chau N. Nguyen, Hoa X. Nguyen and
Maurice Moens, 2009, Plant-parasitic nematodes associated with coffee
in Vietnam.
16. Nguyễn Tất Thắng, Đỗ Tấn Dũng và Nguyễn Văn Tuất, 2011, Nghiên
cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) hại cây
khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận và biện pháp phòng trừ. Tạp chí Khoa
học và Phát triển. 9(5): 725 – 734.
56
17. Bacon CW, White JF, 2000, Microbial endophytes. New York. Marcel
Dekker.
18. Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Mahaffee WF & Kloepper JW, 1997,
Bacterial endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol 43: 895–914.
19. Kado, C. I., 1992, “Plant pathogenic bacteria”, The prokaryotes, ed.
Balows, A., et al., Springer-Verlag, New York, 660 – 662.
20. Bacon, Charles W. and White, James F., 2000, Microbial endophytes,
Marcel Dekker, New York.
21. Verma, Subhash C., Ladha, Jagdish K. and Tripathi, Anil K., 2001,
"Evaluation of plant growth promoting and colonization ability of
endophytic diazotrophs from deep water rice", Journal of Biotechnology,
Vol. 91(2): 127- 141.
22. Bressan, Wellington and Borges, Marcela T., 2004, "Delivery methods
for introducing endophytic bacteria into maize", Biocontrol, Vol. 49(3):
315-322.
23. McInroy, J.A. and Kloepper, J.W., 1994, "Novel bacterial taxa inhabiting
internal tissue of sweet corn and cotton", in Ryder, M.H., Stephens, P.M.,
and Bowen, G.D (Editors), Improving plant productivity with rhizosphere
bacteria, CSIRO, Melbourne, Australia.
24. Oliveira, Marcelo N. V., Santos, Thiago M. A., Vale, Helson M. M.,
Delvaux, Júlio C., Cordero, Alexander P., Ferreira, Alessandra B.,
Miguel, Paulo S. B., Tótola, Marcos R., Costa, Maurício D., Moraes,
Célia A. and Borges, Arnaldo C. , 2013, "Endophytic microbial diversity
in coffee cherries of Coffea arabica from Southeastern Brazil", Canadian
journal of microbiology, Vol. 59(4): 221-230.
57
25. Ryan, Robert P., Germaine, Kieran, Franks, Ashley, Ryan, David J. and
Dowling, David N. , 2008, "Bacterial endophytes: recent developments
and applications", FEMS microbiology letters, Vol. 278(1): 1-9.
26. Compant, Stéphane, Clément, Christophe and Sessitsch, Angela, 2010,
"Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants:
Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for
utilization", Soil Biology and Biochemistry, Vol. 42(5): 669-678.
27. Lodewyckx, Cindy, Taghavi, Safieh, Porteous, Fiona, Moore, Edward R.
B., Mezgeay, Max, der Lelie, Daniel van and Vangronsveld, Jaco, 2002,
"Endophytic bacteria and their potential applications", Critical Reviews in
Plant Sciences, Vol. 21(6): 583-606.
28. Jasim, B., John Jimtha, C., Jyothis, Mathew and Radhakrishnan, E. K.
(2013), "Plant growth promoting potential of endophytic bacteria isolated
from Piper nigrum", Plant Growth Regulation, Vol. 71(1): 1-11.
29. Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần
Nguyễn Nhật Khoa và Thái Trần Phương Minh, 2013, "Phân lập các dòng vi
khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA và cố định đạm trên cây chuối",
Tạp chí Khoa học, Trương Đại học Cần Thơ. Số 27 (Phần B): 24-31.
30. Milca, Rachel Costa Ribeiro Lins, Jssica, Martins Fontes, Nataliane,
Marques Vasconcelos, Danilo, Mamede Silva Santos, Ozias, Elias
Ferreira, Joo, Lcio de Azevedo, Janete, Magali Arajo and Glucia,
Manoella Souza Lima (2014), "Plant growth promoting potential of
endophytic bacteria isolated from cashew leaves", African Journal of
Biotechnology, Vol. 13(33): 3360-3365.
31. Rosenblueth, Mónica and Martínez-Romero, Esperanza (2006), "Bacterial
endophytes and their interactions with hosts", Molecular plant-microbe
interactions, Vol. 19(8): 827-837.
58
32. Chanway CP., 1997, Inoculation of tree roots with plant growth
promoting soil bacteria: an emerging technology for reforestation. Forest
Sci 43: 99–112.
33. Murugappan, R. M., Begum, S. Benazir and Roobia, R. Raja (2013),
"Symbiotic influence of endophytic Bacillus pumilus on growth
promotion and probiotic potential of the medicinal plant Ocimum
sanctum", Symbiosis, Vol. 60(2): 91-99.
34. Nguyễn Thu Hà , Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2009, Phân lập và
đặc tính các dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. Tạp
chí công nghệ sinh học, 7(2): 241-250.
35. Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản và cs., 2005, Phân lập tuyển chọn
chủng Bacillus cho sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng. Khoa học
Công nghệ và Phát triển nông thôn 20 năm đổi mới, Tập 1-Trồng trọt
BVTV, Bộ NN&PTNT, Nhà xuất bản Chính trị quốc gia.
36. Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2011, Phân lập và nhận diện vi
khuẩn nội sinh trong cúc xuyến chi (Wedelia Trilobata (L.) Hitche) bằng
kỹ thuật PCR. Tạp chí khoa học, trường Đại học Cần Thơ, 18a: 168-176.
37. Văn Thị Phương Như, Cao Ngọc Điệp, 2013, Phân lập và đặc tính vi
khuẩn nội sinh cây lúa (Oryza sativa L.) trồng trên đất của tỉnh Phú Yên,
Việt Nam, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2: 450-454.
38. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng, 2010, Đặc tính vi khuẩn nội sinh
phân lập trong cây Khóm trồng trên đất phèn Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang.
Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 15a: 54-63.
39. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009, Phân lập và đặc tính của vi
khuẩn nội sinh phân lập trong cây Khóm trồng trên đất phèn huyện Bến
Lức, tỉnh Long An, Việt Nam. Tuyển tập công trình nghiên cứu cua hội
59
nghị Công nghệ sinh học năm 2009 tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh ,
23-24, tháng 10 năm 2009.
40. Vega, Fernando E., Pava-Ripoll, Monica, Posada, Francisco and Buyer,
Jeffrey S. (2005), "Endophytic bacteria in Coffea arabica L", Journal of
Basic Microbiology, Vol. 45(5): 371.
41. Mekete, Tesfamariam, Hallmann, Johannes, Kiewnick, Sebastian and
Sikora, Richard (2009), "Endophytic bacteria from Ethiopian coffee
plants and their potential to antagonise Meloidogyne incognita",
Nematology, Vol. 11(1): 117- 117.
42. Miguel, Paulo Sérgio Balbino, Delvaux, Julio Cesar , de Oliveira,
Marcelo Nagem Valério , Monteiro, Larissa Cassemiro Pacheco , Freitas,
Fernanda de Souza, Costa, Maurício Dutra , Tótola, Marcos Rogério , de
Moraes, Célia Alencar and Borges, Arnaldo Chaer (2013), "Diversity of
endophytic bacteria in the fruits of Coffea canephora ", African Journal
of Microbiology Research, Vol. 7(7): 586-594
43. Silva, Harllen S. A., Tozzi, João P. L., Terrasan, César R. F. and Bettiol,
Wagner (2012), "Endophytic microorganisms from coffee tissues as plant
growth promoters and biocontrol agents of coffee leaf rust", Biological
Control, Vol. 63(1): 62.
44. Garbeva, P., van Veen, J. A. and van Elsas, J. D. (2004), "Microbial
diversity in soil: Selection of microbial populations by plant and soil type
and implications for disease suppressiveness", Annual Review of
Phytopathology, Vol. 42 (1): 243-270.
45. Berg, Gabriele and Hallmann, Johannes (2006), "Control of plant
pathogenic fungi with bacterial endophytes", in Schulz, Barbara J. E. ,
Boyle, Christine J. C., and Sieber, Thomas N., Editors, Microbial root
endophytes, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg: 53-69.
60
46. Shiomi, Humberto Franco, Silva, Harllen Sandro Alves, Melo, Itamar
Soares de, Nunes, Flávia Vieira and Bettiol, Wagner (2006),
"Bioprospecting endophytic bacteria for biological control of coffee leaf
rust", Scientia Agricola, Vol. 63(1)
47. Kloepper, Joseph W., Ryu, Choong-Min and Zhang, Shouan (2004),
"Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus
spp.", Phytopathology, Vol. 94(11): 1259-1266.
48. Sikora, R. A., Schäfer, K. and Dababat, A. A. (2007), "Modes of action
associated with microbially induced in planta suppression of plant-
parasitic nematodes", Australasian Plant Pathology, Vol. 36(2): 124-134.
49. Kloepper, Joseph W. and Ryu, Choong-Min, 2006, "Bacterial endophytes
as elicitors of induced systemic resistance", in Schulz, B., Boyle, C., and
Sieber, T. (Editors), Soil biology, microbial root endophytes,, Springer
Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg: 33-52.
50. Nguyễn Ngọc Mỹ, 2012, Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn một số
chung vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây cà phê chè (Coffea
arabica) ở Tây Nguyên, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Tây Nguyên.
51. Trương Vĩnh Thới, 2012, Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chung vi
khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây cà phê vối (Coffea canephora
Pierre var. robusta) ở Đắk Lắk, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại
học Tây Nguyên, Đắk Lắk.
52. Ngô Văn Anh, Nguyễn Anh Dũng và Trần Trung Dũng, 2017, "Phân lập,
tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây cà phê (Coffea
canephora Pierre var. robusta) có hoạt tính cố định đạm và sinh tổng hợp
Indole Acetic Acid (IAA) tại Đắk Lắk", Tạp chí Khoa học Trương Đại
học Tây Nguyên. 23: 59-64.
61
53. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh
Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty, 1976,
Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội.
54. Brijwal L, Aseesh P ADN Sushma T., 2013, An overview on
phytomedicinal approaches of Zanthoxylum armatum DC.; An important
magical medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research 7: 366-370.
55. Khan, M. R., Khan, S. M., Mohiddin, F. A. and Askary, T. H., 2007,
“Effect of certain phosphate-solubilizing bacteria on root-knot nematode
disease of mungbean”, First International Meeting on Microbial
Phosphate Solubilization, Springer Netherlands, Dordrecht: 341-346.
56. Holt, J. H., Sneath, P. H. and Krieg, N. R., 1994. Bergey’s Manual of
determinative bacteriology 9 th ed., Lippincott Williams and Wilkins,
New York, 192-194.
57. Lee S., Lee J., Jin, Y. I., Jeong J. C., Chang Y. H., Lee Y., Kim, M.,
2017, Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean
traditional soy sauce. LWT-Food Science and Technology, 79: 581-524.
58. Jungjoon Seough, Peter H. Yoon, 2012, Quasilinear theory of
anisotropy‐beta relations for proton cyclotron and parallel firehose
instabilities.
59. L.T.M. Linh, N.T. Duyen, T.Q. Phap, N.T.P. Anh, and P.V. Ty, 2015,
Biologycal control of Meloidogyne incognita on Coffee by Paecilomyces
javanicus, Vietnam Journal of Biotechnology 13: 421– 424 (in
Vietnamese).
60. Mahmoud, Mohamed Ahmed Youssef, Hassan, Abd-El-Khair and Wafaa,
Mohamed Abd El-Hameed El-Nagdi, 2017, "Management of root knot
nematode, Meloidogyne incognita infecting sugar beet as affected by
62
certain bacterial and fungal suspensions", CIGR Journal, Special issue:
293-301.
61. Gao, Huijuan, Qi, Gaofu, Yin, Rong, Zhang, Hongchun, Li, Chenggang
and Zhao, Xiuyun, 2016, "Bacillus cereus strain S2 shows high
nematicidal activity against Meloidogyne incognita by producing
sphingosine", Scientific Reports, Vol. 6: 1-11.
62. Ongena, M. and Jacques, P., 2008, "Bacillus lipopeptides: versatile weapons
for plant disease biocontrol", Trends Microbiol, Vol. 16(3): 115-125.
63. Krebs, Birgit, Höding, Birgit, Kübart, Sabine, Workie, Melkamu, Junge,
Helmut, Schmiedeknecht, G., Grosch, Rita, Bochow, Helmut and Hevesi,
Mária, 1998, "Use of Bacillus subtilis as biocontrol agent. I. Activities
and Characterization of Bacillus subtilis strains", Journal of Plant
Diseases and Protection, Vol. 105(2): 181-197.
64. Lian, L.H., Tian, B.Y., Xiong, R., Zhu, M.Z., Xu, J. and Zhang, K.Q.,
2007, "Proteases from Bacillus: a new insight into the mechanism of
action for rhizobacterial suppression of nematode populations", Letters in
Applied Microbiology, Vol. 45(3): 262-269.