NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH TÊNMỘT SỐ NÒI NẤM MEN TRONG QUÁ TRÌNH

LÊN MEN HẠT CACAOSTUDY ON THE SEPARATION AND NAMES OF SOME YEAST

STRAINS IN THE PROCESS OF FERMENTATION OF COCOA BEAN

TRẦN XUÂN NGẠCH – LÊ THỊ LIÊN THANHTrường Đại học Kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng

NGUYỄN THỊ HOÀI TRÂMViện Công nghiệp Thực phẩm

TÓM TẮTBài báo này trình bày một số kết quả nghiên cứu phân lập, mô tả các đặc điểm

hình thái, đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm sinh lý và bước đầu đã định tên được 4 nòi nấm men xuất hiện trong quá trình lên men tự nhiên hạt cacao tươi (ủ trong thùng). Đó là các nòi nấm men có tên lần lượt là: Hansenia spora uvarum, Galactomyces reessii, Candida sorboxylosa, Cadida fructus.

ABSTRACTThis article presents some results of a study on the separation and description of

forms, culture and physiological characteristics and first indication of the names of the 4 yeast strains which were occuring in natural fermentation processing of fresh cocoa bean (brooded in can). They are yeast strains named respectively: Hansenia sporauvarum, Galactomyces reessii, Candida Sorboxylosa, and Candida fructus.

1. Đặt vấn đềNghiên cứu khảo sát hệ vi sinh vật nói chung trong đó các nòi nấm men

nói riêng trong quá trình lên men hạt cacao đóng một vai trò quan trọng góp phần nâng cao chất lượng hạt cacao lên men. Bài báo này trình bày một số kết quả phân lập và định tên được một số nòi nấm men chủ yếu trong mùa vụ thu hoạch và chế biến cacao Quảng Ngãi năm 2002 (từ tháng 1 đến tháng 5).

2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Quả và hạt cacao lên men Các giống cacao Forastero và Trinitario được thu hái trong mùa vụ tháng

5-2002 trên địa bàn Quảng Ngãi. Tiến hành đập quả lấy hạt, ủ tự nhiên trong thùng [1], mỗi mẻ 35kg hạt tươi, thời gian ủ 6 ngày, mỗi ngày đảo hạt 2 lần và lấy mẫu để phân lập nấm men, mỗi lần 1 gam.

2.2. Môi trường phân lập nấm menDùng môi trường nước malt [2,3], làm môi trường lỏng (dịch thể), môi

trường đặc trên ống nghiệm thạch nghiêng, trên hộp petri, thanh trùng 100oC trong 30 phút.

2.3. Tiến hành phân lập Chuẩn bị dịch pha loãng để phân lập: mỗi lần lấy 1g hạt cacao đang ủ đem

nghiền nhỏ trong cối, chày sứ đã khử trùng rồi hoà vào 99ml nước cất vô trùng để hoà tan vi sinh vật trong đó, ta có độ pha loãng là 10-2. Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch pha loãng ở trên cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, ta

được dịch có độ pha loãng 10-3, cứ tiếp tục như vậy cho đến độ pha loãng 10-9. Mỗi ngày ủ hạt làm một đợt như vậy.

- Cấy, dàn đều dịch pha loãng, nuôi cấy, nhận dạng, đếm khuẩn lạc, soi kính hiển vi và chụp ảnh tế bào khuẩn lạc [3].

- Dùng pipet vô trùng hút mỗi lần 0,1ml từ các dịch pha loãng khác nhau ở trên cấy vào các hộp petri đã chuẩn bị, dàn đều rồi đem nuôi cấy trong tủ ấm vô trùng ở nhiệt độ 30oC, thời gian 3 ngày, các khuẩn lạc sẽ mọc. Quan sát nhận dạng, đếm số khuẩn lạc trên máy đếm, lấy mẫu làm vết bôi để soi kính hiển vi và chụp ảnh tế bào khuẩn lạc với vật kính chìm 40X bằng phần mềm chụp ảnh tương ứng của kính hiển vi điện tử.

2.4. Định tên nấm men2.4.1. Dựa vào đặc điểm hình thái - Quan sát khuẩn lạc bằng mắt thường, bằng kính hiển vi ở dạng tế bào

sống, tế bào chết không nhuộm và có nhuộm gram (nhuộm metylen xanh, nhuộm fucshin zield, nhuộm Lugol).

- Quan sát giả khuẩn ty.- Quan sát nang bào tử bằng cách nhuộm màu lục Malachit và Sapranin [2,3].2.4.2. Dựa vào đặc tính sinh lý. [2,3] Bằng cách xác định khả năng lên men các loại đường glucoza và saccaroza

trên môi trường nước chiết giá đậu của các nòi nấm men đã phân lập được.

3. Kết quả và thảo luận3.1. Phân lập và mô tả đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và tế bào nấm

men

Bảng 1. Hình thái, đặc điểm khuẩn lạc nấm men phân lập từ mẫu hạt cacaolên men tự nhiên

Thời gianủ, h

Nhiệt độ trung bình

khối hạt, 0C

Mật độ tế bào, CFU/g Đặc điểm khuẩn lạc trên hộp petri

0 28 0 -

24 30 5.107Tròn, màu trắng ngà, đục nhầy, bề mặt trơn, không tạo răng cưa ở mép.

48 40 6,7.107 Tròn, to, màu trắng xốp, mép có răng cưa, bề mặt khô, xù xì.

72 45 13.107 Tròn, to, màu trắng xốp, mép có răng cưa, khô, xù xì.

96 50 2.107 Màu trắng ngà, tròn, mép không tạo răng cưa, trơn, ướt.

120 48 0 -144 45 0 -

Nhận xét:Qua bảng 1 chúng tôi thấy:- Nấm men xuất hiện ngay từ đầu của quá trình ủ hạt.

- Số lượng khuẩn lạc nấm men phân lập được tăng dần từ ngày ủ thứ 1 đến ngày ủ thứ 3 và giảm dần từ ngày ủ thứ 4 đến ngày ủ thứ 6.

- Ở nhiệt độ khối hạt từ 30 (45oC), số lượng khuẩn lạc phân lập được tăng dần và mật độ tế bào đạt cao nhất ở 45oC (13.107 tế bào/g).

- Ở nhiệt độ khối hạt 500C, số lượng khuẩn lạc phân lập được giảm xuống và mật độ tế bào chỉ còn 2.107 tế bào/g chứng tỏ nấm men khó phát triển được ở nhiệt độ này. Vả lại lúc đó môi trường dinh dưỡng gần cạn lại có sự cạnh tranh dinh dưỡng và sinh tồn với các loài vi sinh vật khác, môi trường ủ ngày càng thông thoáng hơn nên mặc dù nhiệt độ có giảm xuống trong 2 ngày sau nhưng nấm men đã không còn phát triển được.

Các mẫu khuẩn lạc nấm men phân lập được ở trên theo thời gian ủ tự nhiên 24h, 48h, 72h, 96h được chúng tôi kí hiệu lần lượt là MTN24, MTN48, MTN72, MTN96. Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi (kết quả thể hiện trên bảng 2) và chụp ảnh tế bào khuẩn lạc (các hình 1, 2, 3, 4).

Bảng 2. Hình thái tế bào nấm men phát triển trên môi trường thạch đĩa (petri)

Tên khuẩn lạc Đặc điểm hình thái tế bào nấm menMTN24 Hình bầu dục, nhỏ, đều, ít tế bào sinh sản lưỡng cựcMTN48 Dạng hình trụ không đềuMTN72 Dạng hình bầu dục nhỏ, không đềuMTN96 Dạng hình cầu liên kết với nhau thành cụm (kết tụ)

Hình 1. Ảnh hiển vi điện tửtế bào khuẩn lạc MTN 24

Hình 2. Ảnh hiển vi điện tửtế bào khuẩn lạc MTN 48

Hình 3. Ảnh hiển vi điện tửtế bào khuẩn lạc MTN 72

Hình 4. Ảnh hiển vi điện tửtế bào khuẩn lạc MTN 96

3.2. Mô tả đặc điểm nuôi cấy, sinh lý của các mẫu nấm men đã phân lập được

- Nghiên cứu sự phát triển của nấm men trên môi trường mạch nha dịch thể nồng độ 10% (ống nghiệm chứa 3ml môi trường nuôi cấy), nhiệt độ 30oC, thời gian 4,5 ngày, kết quả thu được theo bảng 3.

Bảng 3. Sự phát triển của nấm men phân lập trong môi trường mạch nhadịch thể nồng độ 10%

Tên khuẩn lạcThời gian

nuôi cấy, hĐặc điểm nuôi cấy

MTN24

24Chưa phát triển trong môi trường, chưa tạo váng, chưa làm đục môi trường, có nổi bọt

48Chưa phát triển trong môi trường, chưa tạo váng, chưa làm đục môi trường, có nổi bọt

72Tạo màng nhầy kín, dịch thể hơi đục, màng mỏng, bề mặt tròn màu trắng

108 Váng kín mỏng vàng nhạt, dịch thể vàng đục

MTN48

24 Váng mỏng chưa kín, khô, màu trắng, bề mặt trơn48 Đã tạo váng kín mỏng, khô72 Váng kín mỏng, kết tủa nhầy, dịch thể hơi đục

108Váng kín mỏng, môi trường màu vàng đục có ít váng đen, trơn

MTN72

24Váng vòng ít, khô mỏng, kết tủa nhầy, dịch thể còn trong

48 tạo váng vòng dày72 Dịch thể hơi đục, kết tủa nhầy

108Váng vàng kín, váng trắng mọc quanh thành ống phía dưới bề mặt dịch thể, môi trường đục nhiều, có kết tủa nhầy

MTN96

24 Váng vòng mỏng ướt, kết tủa nhầy48 Váng kín hơn, bề mặt trơn, dịch thể hơi đục72 Dịch thể hơi đục108 Váng trắng khô mỏng, dịch thể có màu vàng đậm

- Nghiên cứu khả năng lên men một số loại đường của các nấm men đã phân lập được. Bằng cách sử dụng môi trường nước chiết giá đậu [2], nồng độ đường (glucoza, saccaroza) 1,5% trong ống nghiệm chứa 5ml môi trường. Kết quả thu được theo bảng 4.

Bảng 4. Khả năng lên men đường của các nấm men đã phân lập

Tên khuẩn lạc Đường glucoza Đường saccaroza

MTN24 Chưa lên men Chưa lên men

MTN48Tạo bọt trắng trên bề mặt, váng bám quanh ống nghiệm cách bề mặt một khoảng ngắn

Tạo bọt trắng

MTN72Váng bám quanh ống nghiệm, bề mặt cao hơn MTN24

Tạo bọt trắng

MTN96 Tạo váng ngắn hơn Tạo bọt trắng

Nhận xét:

- Nấm men MTN24 chưa có khả năng lên men hai loại đường trên, có thể do nó còn trẻ. Các nấm men còn lại có khả năng lên men đường glucoza tốt hơn đường saccaroza.

- Nghiên cứu quan sát sự tạo thành giả khuẩn ty và nang bào tử của nấm men.

Bằng cách sử dụng moi trường thạch - pepton - glucoza [2,3] trên đĩa petri, nhiệt độ nuôi cấy 25(30oC), thời gian 4,5 ngày, làm tiêu bản, nhuộm tế bào, quan sát các vết cấy dưới kính hiển vi, kết quả như sau.

Bảng 5. Sự tạo thành giả khuẩn ty ở nấm men

Tên khuẩn lạc Đặc điểm phát triển

MTN24 Tạo thành giả khuẩn ty to, rõ ràng

MTN48 Có tạo thành giả khuẩn ty

MTN72 Có tạo thành giả khuẩn ty

MTN96 Có tạo thành giả khuẩn ty

Bảng 6. Sự tạo thành nang bào tử của nấm men

Tên khuẩn lạc Đặc điểm phát triển

MTN24 Chưa có nang bào tử

MTN48 Đã xuất hiện nang bào tử hình cầu nhỏ thành từng cụm

MTN72 Một số tế bào có từ 3(5 nang bào tử hình tròn

MTN96 Có xuất hiện ít nang bào tử hình tròn

Nhận xét:

Loại nấm men phát triển vào ngày đầu của quá trình ủ (MTN24) chưa có nang bào tử nhưng lại tạo thành giả khuẩn ty rõ ràng nhất. Trong các ngày ủ tiếp theo khi nhiệt độ khối hạt càng cao thì nấm men càng có nhiều nang bào tử (MTN48, MTN72), còn khi môi trường ủ đã nghèo chất dinh dưỡng và nhiệt độ đã giảm xuống thì số nang bào tử sẽ ít đi (MTN96).

4. Kết luậnĐể phân loại và định tên các nòi nấm men thường dựa vào các đặc điểm

hình thái, đặc điểm nuôi cấy, sinh lý của khuẩn lạc và tế bào nấm men rồi so sánh với khoá phân loại nấm men [4]. Chúng tôi có thể dự đoán tên của 4 nòi nấm men lần lượt như sau:

- Đối với khuẩn lạc MTN24, nòi nấm men có tên là Hansenia spora uvarum.- Đối với khuẩn lạc MTN48, nòi nấm men có tên là Galactomyces reessii.- Đối với khuẩn lạc MTN72, nòi nấm men có tên là Candida Sorboxylosa.- Đối với khuẩn lạc MTN96, nòi nấm men có tên là Candida fructus.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Trần Xuân Ngạch, Ảnh hưởng công nghệ ủ hạt cacao Quảng Ngãi đến chất lượng hạt, Luận văn Thạc sỹ, 18, ĐHĐN, 1997.

[2] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm Văn Tỵ, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập I; 97, 303, 306, 307, 308, 312, 314, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1972.

[3] Bộ môn sinh học đất - Trường Đại học tổng hợp Maxcơva, Thực tập vi sinh vật học, 48, 53, 75, 76, 77, 78, 79, 90, 91, 92, Tài liệu dịch, NXB Đại học và THCN, Hà Nội, 1983.

[4] Descriptions of the species, 32, 171, 281, 379, New york, 1999.