Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti
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Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti
Attività elettrica dei neuroni
Voltage clamp Col metodo del “voltage clamp” la membrana viene portata ad un potenziale fisso prestabilito e si registrano le correnti necessarie a mantenerla “bloccata” (”clampata”) a quel potenziale.
Un amplificatore differenziale (A) inietta nella cellula una corrente Im, proporzionale alla differenza tra un potenziale di comando (applicato all’ingresso “+”) ed il potenziale di membrana Vm (applicato all’ingresso “-”) .
Due risultati utili:a) Vm viene quasi portato a coincidere col potenziale di comando;b) la variazione di Vm è praticamente istantanea, cosicché la corrente capacitiva
(Ic=C dV/dt), anche se molto intensa, dura per un tempo brevissimo.Da quel momento in poi verrà registrata (ad un potenziale prestabilito, che viene
mantenuto costante) solo la corrente ionica
Neurone piramidale con un elettrodo di vetro attaccato per la derivazione delle correnti ioniche transmembranarie mediante la tecnica del (patch-) voltage-clamp
amplificatore
La derivazione delle correnti ioniche transmembranarie
0 10 20 30 40-70
20
(mV
)
Tempo (ms)
0 10 20 30 40-60
-40
-20
0
20
40
60C
orre
nte
ioni
ca (n
A)
Tempo (ms)
La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche
transmembranarie generate a tale potenziale di membrana
Potenziale di riposo (Vr)
Potenziale di membrana finale (Vm) costante
Corrente transmembranaria generata dal passaggio di Vm da –70 mV a +20 mV
Vantaggi del voltage-clamp:
In genere, gm = f(V,t) ma,
1. Vm è bloccato ad un valore costante gm = f(t) soltanto e può essere dedotto dall’andamento della corrente ionica Ii
2. E’ possibile separare Ii da Ic. Infatti cm è caricata istantaneamente
0 10 20 30 40-70
20
Vol
tagg
io (m
V)
Tempo (ms)
0 10 20 30 40-60
-40
-20
0
20
40
60
Cor
rent
e io
nica
(nA
)
Tempo (ms)
INa+IK
+ TTX (IK)
+ TEA (INa)
Separazione farmacologica delle correnti IK e INa
Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating
C
O
Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da:
(1-Po)
Po
Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:
ooo PP
dtdP )1(
Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:quindi,
0)1( ooo PP
dtdP
oP
Considerazioni teoricheStudio del gating allo stato stazionario
Cor
rent
e K
+ (n
A)
0 10 20 30 40-20
0
20
40
60
80
100
120
140
Tempo (ms)
0 10 20 30 40
-70
Vol
tagg
io (m
V)
Tempo (ms)
-30-20-10
0102030405060
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60-20
0
20
40
60
80
100
120
140
I(K+ ) m
ax (n
A)
Voltaggio (mV)
Con
dutta
nza
(μS
)
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Voltaggio (mV)
IK=gK• (V-EK)
gK = IK/(V-EK)
EK=-80 mV
Voltaggio-dipendenza dei canali Kv
0 1 2 3 4
-70
Vol
tagg
io (m
V)
Tempo (ms)
-50-40-30-20-10
010203040
60
0 1 2 3 4-7-6-5-4-3-2-10
I(Na)
(nA
)
Tempo (ms)
-5-4-3-2-10
I(Na)
(nA
)
0 1 2 3 4Tempo (ms)
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 60
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
I(Na)
pic
co (n
A)
Voltaggio (mV)
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 400.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Voltaggio (mV)
Con
dutta
nza
(μS
)
INa=gNa• (V-ENa)
gNa = INa/(V-ENa)
ENa=+50 mV
Voltaggio-dipendenza dei canali Na
Separazione della fase di attivazione della corrente di Na dall’inattivazione
La pronasi rimuove l’inattivazione
-80 -60 -40 -20 0 20 40-800
-600
-400
-200
0
Cor
rent
e di
Na
(nA
)
Voltaggio (mV)
-1200
-1000
-800
-600
-400
-200
0
Cor
rent
e (n
A)
0 10 20 30 40
tempo (ms)
-90-80-70-60-50-40-30-20-10
010
203040
Vol
tagg
io (m
V)
0 10 20 30 40
tempo (ms)
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Con
dutt
anza
(S
)m
Voltaggio (mV)
0
0.5
1
Pro
b. c
anal
e ap
erto
Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta
Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario
Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto rimuovendo l’inattivazione
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Con
dutt
anza
(S
)m
Voltaggio (mV)
0
0.5
1
Pro
b. c
anal
e ap
erto
maxGgPo
oPVg )(
Ipotesi: l’attivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti.
Allora, se n∞ è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità Po di trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà:
Probabilità composta: n·n·n…. (x volte)
Quindi, dai valori di Po si può risalire ai valori di n∞:
xo nP
xoPn
Gmax
0 1 2 3 4 5 6 7-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
Vm
(mV
)
Tempo (ms)
Studio dell’inattivazione allo stato stazionario
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
I Na (
nA)
Tempo (ms)0 1 2 3 4 5 6 7
-120 -100 -80 -60 -40 -20 0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Pro
babi
lità
gate
h a
perta
Cor
rent
e di
Na
(nA
)
Potenziale di condiz. (mV)
0
1
0.5
0 mV
Se si ipotizza che il processo di inattivazione sia regolato da un’unica gate (h), i valori in grafico sono proporzionali alla probabilità di trovare tale gate aperta allo stato stazionario
Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating
C
O
Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da:
(1-Po)
Po
Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:
ooo PP
dtdP )1(
Tempo-dipendenza del gating
Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:quindi,
0)1( ooo PP
dtdP
oP
Se p particelle di gating indipendenti sono coinvolte nel gating del canale, allora il canale seguirà il seguente andamento temporale: po
channo tPtP )()(
Po(t)
Pro
b. D
i Atti
vaz.
Tempo
[Po(t)]p
0 2 4 6 8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1/()= rappresenta la costante di tempo dell’attivazione ed è un indice della velocità di attivazione della particella di gating.
Risolvendo l’equazione differenziale del 1o ordine e applicando la condizione al contorno , si ottiene:)0(0 tPP oo
toooo ePPPtP )(00 1)()(
chiuso-70mV
aperto+60mV
Ipotesi: una sola gatePo=n(t)=n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ)
0 10 20 30 40-70
60
Vol
tagg
io (m
V)
Tempo (ms)
0 10 20 30 40-20
020406080
100120140160
I(K)
Tempo (ms)
0 10 20 30 40
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Pro
b. d
i ape
rtura
(Po)
Tempo (ms)
I=g∙(V-E) ; gPo I(t)n(t)∙(V-E)
I=g∙(V-E) ; gPo=n4 I(t)n4(t)∙(V-E)
chiuso aperto
Ipotesi: quattro gates identichePo= n∙n∙n∙n = n4
n4(t)=[n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ)]4
Cinetica delle correnti di K+ del canale Kv
1 gate
4 gates
Cinetica delle correnti di Na+ voltaggio-dipendenti
0 10 20 30 40-70
20V
olt.
(mV
)
Tempo (ms)
0 10 20 30 40-25
-20
-15
-10
-5
0
I(Na)
Tempo (ms)
Chiuso-70mV
Aperto+20mV
Ipotesi: tre gates identichePo=m3(t)=[m∞-(m∞-m0)∙exp(-t/τ)]3
Chiuso-70mV
Aperto+20mV
Inattivato+20mV
Ipotesi:tre gates identiche di
attivazione+
una gate di inattivazionePo=m3(t)∙h(t)
0 10 20 30 400.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Pro
b. d
i ape
rtura
(Po)
Tempo (ms)
m(t)
m3(t)
h(t)
m3*h
Il gating dei canalivoltaggio-dipendenti
Come fa il voltaggio ad aprire i canali?
Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling
ovvero
Canali ionici voltaggio-dipendentiFamiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM)
Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunitàCiascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P)
Vi appartengono:Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+
Canali del K+ Ca2+-attivatiCanali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.
Questa è una delle 4 (pseudo)subunità
H5
I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci
Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio
S1 S2 S3 S4 S5 S6P++
++
OUTIN
N
S1 S2 S3 S4 S5 S6P++
++S1 S2 S3 S4 S5 S6
P++
++S1 S2 S3 S4 S5 S6
P++
++
C
Ca2+ channel
S1 S2 S3 S4 S5 S6P++
++
OUTIN
N
S1 S2 S3 S4 S5 S6P++
++S1 S2 S3 S4 S5 S6
P++
++S1 S2 S3 S4 S5 S6
P++
++
CNa+ channel
OUTIN
N C
S1 S2 S3 S4 S5 S6P++
++K+ channel X 4
Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa.
Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer
Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
In
V
-
- +
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-Out
Attiva la spirale
2
5
4
2
4
5
Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL420
-2-4
q/n(e- charges)
1 2 3 4 5 6 7
R KR neutral AA
R=arginina
K=lisina
ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL420
-2-4
q/n(e- charges)
1 2 3 4 5 6 7
R KR neutral AA
Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
MacKinnon_Nature01473.pdfMacKinnon_Nature01580.pdfMacKinnon_Nature01581.pdf
-60 -40 -20 0 20 40 60
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Con
dutta
nza
g
Vm (mV)
Confronto della voltaggio-dipendenza di gK e gNa