Narzędzia diagnostyki molekularnej w typowaniu genetycznym · Narzędzia diagnostyki molekularnej...
Transcript of Narzędzia diagnostyki molekularnej w typowaniu genetycznym · Narzędzia diagnostyki molekularnej...
Narzędzia Narzędzia diagnostyki molekularnej diagnostyki molekularnej w typowaniu genetycznymw typowaniu genetycznymw typowaniu genetycznymw typowaniu genetycznym
((genotypowaniugenotypowaniu) )
Dr hab. Beata Krawczyk
Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska
Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 1
Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój diagnostyki molekularnejdiagnostyki molekularnej
Data Odkrycia
1953 poznanie struktury heliakalnej dwuniciowego DNA
1958 izolacja polimerazy DNA I E. coli
1960 pierwsza technika hybrydyzacji
1969 hybrydyzacja in situ
1970odkrycie enzymów restrykcyjnych
1970y y y yj y
i odwrotnej transkryptazy
1975 Southern blotting
1977 sekwencjonowanie DNA
1983 pierwsza synteza oligonukleotydów
1985analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych
1985 wynalezienie PCR
1986zastosowanie fluorescencji w hybrydyzacji in situ(FISH)
1988odkrycie termostabilnej polimerazy DNA ‐optymalizacja PCR
1992 koncepcja real‐time PCR
1996 pierwsze aplikacje mikromacierzy DNA
2001 pierwsza wersja sekwencji ludzkiego genomu2
Wybór metody diagnostycznej zależy od blporuszanego problemu:
‐ wykrywanie‐ identyfikacja ‐ typowanie (różnicowanie)typowanie (ró nicowanie)‐ badania taksonomiczne; filogeneza
3
środowisko
Genotyp
genom
Ekspresja genu Fenotyp
genomMetody genotypowe
☺Metody wykorzystujące właściwości kwasów nukleinowych
Metody fenotypowe
Klasyczne Molekularnewłaściwości kwasów nukleinowych np. hybrydyzacja DNA‐DNA, mikromacierze oligonukleotydowe tzw. chip DNA
Klasyczne
Biotypowanie
Typowanie bakteriofagowe
Molekularne
Analiza białek‐PAGE, MLEE
Immunodiagnostyka☺Metody oparte na analizie kwasów nukleinowych
‐analizie genu
bakteriofagowe
Typowanie bakteriocynowe
Antybiogramy
Immunodiagnostyka
‐analizie fragmentu genu
‐analizie genomu
Antybiogramy
4
Wybór metody badawczej uzależniony jest od celu jaki chcemy Wybór metody badawczej uzależniony jest od celu jaki chcemy osiągnąć osiągnąć
Rodzina Rodzaj Gatunek Podgatunek Szczep
Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie 16S rDNA
Rybotypowanie w systemie ARDRARybotypowanie w systemie ARDRA
Hybrydyzacja DNA‐DNA
ITS PCR
RFLP PFGERFLP, PFGE
Multilocus Enzyme Electrophoresis‐MLEE
Analiza Profili Białkowych z całych komórek
AFLP
RAPD, AP‐PCR
Rep‐PCR
5
Typowanie mikroorganizmówTypowanie mikroorganizmówTypowanie mikroorganizmówTypowanie mikroorganizmów
Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa
li ik i óanaliza mikroorganizmów,
poniżej poziomu gatunku lub podgatunkuponiżej poziomu gatunku lub podgatunku
6
Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa analiza analiza izolatówizolatów bakteryjnych, poniżej poziomu bakteryjnych, poniżej poziomu
gatunku lub podgatunku. gatunku lub podgatunku.
stwierdzenie czy wśródbadanego zbioru izolatów istnieją grupy
wykazujące podobieństwo, świadczące o pochodzeniu klonalnym
identyfikacja obecności i opisu dynamikirozprzestrzeniania się poszczególnychszczepów bakteryjnych danego gatunku
stwierdzenie czy wśródbadanego zbioru izolatów istnieją grupy
wykazujące podobieństwo, świadczące o pochodzeniu klonalnym
identyfikacja obecności i opisu dynamikirozprzestrzeniania się poszczególnychszczepów bakteryjnych danego gatunku
identyfikacja ogniska epidemicznego i
badanie śladówbiologicznych w kryminalistyce
identyfikacja ogniska epidemicznego i
badanie śladówbiologicznych
Typowanie drobnoustrojów
epidemicznego i dostarczenia przesłanek,
co do sposobu jegowygaszenia
filogeneza
biologicznych w kryminalistyce Typowanie Typowanie
drobnoustrojówdrobnoustrojów
epidemicznego i dostarczenia przesłanek,
co do sposobu jegowygaszenia
filogeneza
biologicznych
wykrywanie i charakterystykaelementów genetycznych szukanie związków pomiędzy
filogeneza (genetyka ewolucji)
wykrywanie i charakterystykaelementów genetycznych szukanie związków pomiędzy
filogeneza (genetyka ewolucji)
Metody typowania najczęściej wykorzystywane są do badań organizmów
g y yodpowiedzialnych za
rozprzestrzenianie się, zjadliwość i lekooporność bakterii
szukanie związków pomiędzy mechanizmami wirulencji
wśród badanych szczepów;
g y yodpowiedzialnych za
rozprzestrzenianie się, zjadliwość i lekooporność bakterii
szukanie związków pomiędzy mechanizmami wirulencji
wśród badanych szczepów;
Metody typowania najczęściej wykorzystywane są do badań organizmów haploidalnych, jednak coraz częściej znajdują zastosowanie również w
badaniach organizmów diploidalnych takich jak: drożdże, grzyby parazyty. 7
W trakcie wyboru markera powinniśmy W trakcie wyboru markera powinniśmy kierować się:kierować się:
•• Poziomem zmienności organizmuPoziomem zmienności organizmu•• niektóre fragmenty genomu mutują szybciej niż inne, a pożądany stopień niektóre fragmenty genomu mutują szybciej niż inne, a pożądany stopień
polimorfizmu zależy od postawionego pytaniapolimorfizmu zależy od postawionego pytania
Markery molekularne Markery molekularne są narzędziami do są narzędziami do
uzyskiwania danychuzyskiwania danych
Organizmy blisko spokrewnione wymagają k ó b d i h
Do badania odległych genetycznie taksonów wykorzystujemy mniej
markerów bardzo zmiennych y y j y j
polimorficzne fragmenty
Markery kodominująceIdentyfikują wszystkie allele
w danym locus: RFLP, sekwencje SNP
Markery dominujące –ujawniają tylko dominującą formę alleliczną: RAPD AFLPsekwencje, SNP,
mikrosatelity np.STRformę alleliczną: RAPD, AFLP
8
Metody Metody genotypowaniagenotypowaniaMetody Metody genotypowaniagenotypowania
Metoda genotypowaniaUdział w typowaniu
szczepówPowtarzalność
wynikówPotencjał różnicujący
Typowanie plazmidowe Większość Wystarczająca Wystarczający
Hybrydyzacja (rybotypowanieoparte o Southern blot, mikromacierze)
Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobrymikromacierze)
REA‐PFGE Wszystkie Dobra Bardzo dobry
Rybotypowanie oparte o PCR Wszystkie Bardzo dobra Dobry
PCR/RFLP Wszystkie Bardzo dobra Dobry
PCR‐fingerprinting np. RAPD Wszystkie Dobra Bardzo dobry
AFLP Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobry
ADSRRS‐fingerprinting ? Bardzo dobra Bardzo dobry
PCR‐MP ? Bardzo dobra Bardzo dobry
Real‐time PCR Wszystkie Bardzo dobra ?
Sekwencjonowanie (MLST) Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobry
9
Identyfikacja szczepów bakteryjnych
Antybiogramy, klasyczne serotypowaniefagotypowanie
Pi ób d iPierwsze próby wprowadzania molekularnych
testów do typowania
H br d acja1970 PPA RFLP Hybrydyzacja Southern
Druga seria testów molekularnych Rozwój baz
1970
do typowania
PFGE Metody PCR: RAPD, AFLP, itp.
jdanych
1985
Powszechne stosowanie testów molekularnych
MLVA MLST dLST
Między ‐narodowa wymiana danych
2000‐2007R PCRMLVA MLST dLST
Innowacyjne technologie
danych
???
Rep PCR
sekwencjonowanie genomów, technologie oparte na genomice,
spektroskopia
???
10
Analiza profili plazmidowych Analiza profili plazmidowych ((angang. PPA . PPA -- PlasmidPlasmid Profile Profile AnalysisAnalysis))
•Po raz pierwszy została zastosowana w badaniach epidemiologicznych w roku 1988
•Uważa się, że szczepy izogeniczne (należące do tej samej grupy) mają identyczny zestaw plazmidów
T h ik l i d ó i d j h l id•Technika prosta, ale ograniczona do szczepów posiadających plazmidy, szczepy bezplazmidowe są nietypowalne
•Komórki niektórych gatunków bakterii, nawet szczepów, nabywają i tracą plazmidy spontanicznieplazmidy spontanicznie
Profile plazmidowe dla E.coli
11
angang. REAP . REAP –– RRestrictionestriction EEnzymenzyme AAnalysisnalysis of of PPlazmidlazmid
Liczba i wielkość uzyskanych fragmentów DNA determinowana jest przez
długość sekwencji rozpoznania dla określonego enzymu restrykcyjnego
oraz charakter trawionego DNA (% składu par zasad GC).
Statystycznie w przypadku DNA z zawartością par GC około 50%Statystycznie, w przypadku DNA z zawartością par GC około 50%,
4‐nukleotydowa sekwencja rozpoznania powinna występować co 256 pz,
6‐nukleotydowa co 4 kpz, a sekwencja 8‐nukleotydowa co 65 kpz.
12
RybotypowanieRybotypowanieRybotypowanieRybotypowanie
• Wybrane fragmenty operonu rrn stanowią cel molekularny nowoczesnych technik rybotypowania:
polimorficznego regionu pomiędzy genami rrs i rrl (ang. ITS PCR – Internal Transcribed Spacer PCR)
zmiennego regionu wewnątrz genu rrs
regionu zawierającego geny rrs i rrl oraz rozdzielający je fragment polimorficzny
regionu kodującego tRNA
Promotory
Polimorficzny region DNA
Terminatory
3’5’
rrs rrl rrf
Produkty genowe 16S RNA 23S RNA 5S RNAtRNA tRNA
13
Schemat eukariotycznego operonu Schemat eukariotycznego operonu rrnrrn
IGS 18S rDNA ITS‐1 5,8S rDNA ITS‐2 25S – 28S rDNA IGS
IGS – Intergenic Spacer, nietranskrybowany region dd i l j t j i k joddzielający powtarzające się sekwencje
ITS – Internal Transcribed Spacer
14
Komórka bakterii
METODY HYBRYDYZACYJNE METODY OPARTE NA TECHNICE PCR
Izolacja genomowego DNA
Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi.
Elektroforeza i transfer
PCR regionu zmiennegomiędzy rrs‐rrl rDNA.
RFLP produktów amplifikacji regionów
operonu rrnPCR regionu
zawierającego gen k d j 16S RNArozdzielonych fragmentów
DNA na filtr.Hybrydyzacja z sondą
komplementarną do rDNA.
kodujący 16S rRNA
p ą
RFLP zhybrydyzowanego
Polimorfizm długości produktów PCR
ITS ITS PCRPCR
ARDRA Sekwencjonowanieotrzymanych produktów
PCR.y y y g
z sondą rDNA (rrn loci)rrn RFLP
15
Wykorzystanie sekwencji Wykorzystanie sekwencji repetytywnychrepetytywnychww genotypowaniugenotypowaniu bakteriibakteriiw w genotypowaniugenotypowaniu bakteriibakterii
Różnice w wielkości oraz liczbie kopii repetytywnych fragmentów DNA są podstawą różnicowania metodą rep‐PCR.
Regiony takie najwcześniej zostały odkryte i opisane u Enterobacteriacae
• Rep PCR• Rep‐PCR
• SSR – ang. Short Sequence Repeat
• DR ang Direct Repeat• DR ang. Direct Repeat
• VNTR ang. Variable Number Tandem Repeat
17
RepRep PCRPCRRepRep‐‐PCRPCR
• Przykładem tego typu sekwencji są REP (ang. RepetitiveChromosomal Elements) o długości 38 pz i ERIC (ang.
Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długościEnterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długości 124‐127 pz, obecne u bakterii Gram ujemnych.
VNTRVNTR((angang VVariableariable NNumberumber TTandemandem RRepeatepeat))((angang. . VVariableariable NNumberumber TTandem andem RRepeatepeat))
K ótki k j kl t d t j i i l• Krótkie sekwencje nukleotydowe, powtarzające się wiele razy w danym locus, o różnej liczbie kopii w zależności od szczepu, tworząc tym samym polimorfizm długości.
18
MLVA (MLVA (angang. . MultipleMultiple‐‐LocusLocus VariableVariable NumberNumber Tandem Tandem RepeatsRepeats AnalysisAnalysis))
J d lifik j i l l i óż i j li bi• Jednoczesna amplifikacja wielu loci o zróżnicowanej liczbie tandemowych powtórzeń ‐MLVA (ang. Multiple‐LocusVariable Number Tandem Repeats Analysis) odpowiada ł ż j k ji PCR ( lti l k PCR)złożonej reakcji PCR (ang. multipleks PCR).
• Powstały obraz prążków w elektroforezie żelowej możnaPowstały obraz prążków w elektroforezie żelowej można traktować jako genetyczny „fingerprinting”, stąd metoda znana jest też pod nazwą MLVF‐ang.Multiple‐Locus VariableNumber Tandem Repeats FingerprintingNumber Tandem Repeats Fingerprinting.
19
MLVA (MLVA (angang. . MultipleMultiple‐‐LocusLocus VariableVariable NumberNumberTandemTandem RepeatsRepeats AnalysisAnalysis))Tandem Tandem RepeatsRepeats AnalysisAnalysis) ) dla dla StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus
20
TypowanieTypowanie spaspa StaphylococcusStaphylococcus aureusaureusTypowanie Typowanie spaspa StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus
U ki k j t d h tó ń i dd li i ó j• Uzyskiwane sekwencje tandemowych powtórzeń są numerowane i poddawane analizie porównawczej z
wykorzystaniem oprogramowania Ridom StaphType (dostępny na stronie http://spacerver.ridom.de).
• Powstały kod numeryczny oznacza typ spa oraz zawiera informacje na temat wykrytych zmian w regionachPowstały kod numeryc ny o nac a typ spa ora awiera informacje na temat wykrytych mian w regionach
powtarzalnych.
21
Techniki Techniki genotypowaniagenotypowania oparte na analizie całego oparte na analizie całego genomu, wykorzystujące reakcje PCRgenomu, wykorzystujące reakcje PCR
Metoda nie wymaga znajomości sekwencji genomowego DNA badanego drobnoustrojubadanego drobnoustroju
• PCR-fingerprinting (RAPD, AP-PCR, DAF)• LM PCR techniki oparte na ligacji adaptorów• LM-PCR – techniki oparte na ligacji adaptorów
22
T h ikiT h iki PCRPCR fi i tifi i tiTechnikiTechniki PCRPCR‐‐fingerprintingfingerprinting
• Technika PCR‐fingerprinting jest uniwersalną metodą wykrywania
polimorfizmu DNA – polega na przypadkowym amplifikowaniu
polimorficznego DNA poprzez dobór odpowiednich starterów
ó l kt f t d i k l ”wzór elektroforetyczny = „odcisk palca”
23
RAPD RAPD ang. ang. Random Random AmplifiedAmplified PolymorphicPolymorphic DNADNA
1 2 3
Przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA
Genom A
Genom B
1 2 3 4
A B
3
1
3
12
3
24
Rozkład produktów reakcji RAPD w rozdziale elektroforetycznym
24
TechnikiTechniki PCRPCR‐‐fingerprintingfingerprintingRAPD APRAPD AP PCR DAFPCR DAFRAPD, APRAPD, AP‐‐PCR, DAFPCR, DAF
Wymienione metody różnią się od siebie tylko długością stosowanych starterów
RAPD (ang. Random Amplified Polymorphic DNA) ‐ 9‐10 nt, temp. dołączania 30‐35°C, detekcja z BrEt;ą , j ;
AP‐PCR (ang. Arbitrarily Primed PCR) ‐18‐32 nt, temp. dołączania poniżej 45°C 5 i 40 kli d t k j t di fi45°C,5 min; 40 cykli, detekcja przez autoradiografię;
DAF ( ang. DNA Amplification Fingerprinting) ‐ 5‐8 nt, temp. dołączania ( g p g p g) , p ą30 °C, 30 sekund; BrEt lub Ag.
25
Czynniki wpływające na wyniki reakcji Czynniki wpływające na wyniki reakcji RAPDRAPDRAPDRAPD
Startery DNA Matrycowe DNA. Stężenie chlorku magnezu Stężenie deoksyrybonukletydówPolimeraza DNA i bufor reakcyjny Parametry amplifikacji.
26
Dokumentacja KM PG
Różnicowanie metodą RAPD szczepów K. pneumoniae, w reakcji PCR użyto polimerazy PwoM2 - marker wielkości DNA M2 (1008, 883, 615, 517, 466, 396 pz)K kontrola negat na reakcji PCR
Różnicowanie metodą RAPD szczepówK. pneumoniae, w reakcji PCR użyto polimerazy Taq rekombinantowejM2 - marker wielkości DNA M2 (1008, 883, 615, 517 466 396 pz);K- - kontrola negatywna reakcji PCR
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 – produkty reakcji RAPD dla kolejnych izolatów.Rozdział prowadzono w 6% żelu poliakryloamidowym.
517, 466, 396 pz);K- kontrola negatywna reakcji PCR1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 – produkty reakcji RAPD dla kolejnych izolatów.Rozdział prowadzono w 6% żelu poliakryloamidowym.
27
Parametry amplifikacjiParametry amplifikacji
Temperatura denaturacji może mieć wpływ na wzór
produktu, inne parametry są niezmienialne, wzór
produkowany w temperaturze denaturacji w 90 °C jest
podobny, ale nie identyczny co w 94 °C.
28
Parametry amplifikacjiParametry amplifikacjiNiska temperatura przyłączania startera DNA
• Przeważnie zakres stosowanych temperatur przyłączania wynosiPrzeważnie zakres stosowanych temperatur przyłączania wynosi
od 25 °C do 40°C ;
• Wraz ze wzrostem temperatury przyłączania w zakresie 25 ‐ 40 °C
następuje redukcja sygnału tła.
• Optymalna temperatura przyłączania starterów zależy od długości
zastosowanego startera np.g p
10 nt – 36 °C; 18 nt i > 35‐50 °C, przeważnie 40 °C;
k d dł l b d• rekomenduje się dłuższe startery, jeżeli będzie wytwarzana
wystarczająca ilość produktów.
29
W niektórych reakcjach stosuje się dwie fazy:I stosuje się 3 ‐ 5 początkowych cykli o relatywnie niskiejI. stosuje się 3 5 początkowych cykli, o relatywnie niskiej temperaturze przyłączania i często wydłużonym jego czasie, nawet 20 ‐ 25 °C przez 5 minut;II. następnie stosuje się 30 cykli o wyższej temperaturze przyłączania, np. 36 ‐ 40°C, trwającej 1 ‐ 2 minuty
Jednak tego typu reakcja nie zawsze jest konieczna, wystarczy zastosować niską temperaturę przyłączania,wystarczy zastosować niską temperaturę przyłączania, zwiększając tylko ilość cykli.
30
Z czego wynika polimorfizm RAPDZ czego wynika polimorfizm RAPDZ czego wynika polimorfizm RAPDZ czego wynika polimorfizm RAPD
• Jest wynikiem mutacji w obrębie sekwencji
komplementarnych do końca 3’ startera oraz delecji lubkomplementarnych do końca 3 startera oraz delecji lub
insercji w pewnej odległości od miejsca wiązania startera
• Sekwencje repetytywne
31
Zastosowanie RAPDZastosowanie RAPD
1. Do analizy porównawczej izolatów
RAPD dla szczepów Różnicowanie klinicznych szczepów k h
Candida albicanswankomycyno‐opornych
Enterococcus faeciummetodą RAPD
Dokumentacja KM PG 32
Analiza wzorów Analiza wzorów fingerprintingfingerprinting ‐‐ Interpretacja wzorów Interpretacja wzorów APAP‐‐PCRPCR, RAPD, RAPD
• Jeżeli wzór AP‐PCR( RAPD) jest identyczny, bądź różnica
dotyczy 3 i > prążków to interpretacja jest prosta natomiastdotyczy 3 i > prążków to interpretacja jest prosta, natomiast
gdy różnica dotyczy 1 prążka, lub intensywność kilku prążków
spada, konieczne staje się zmienienie warunków reakcji bądź
sekwencji starterów. sekwencji starterów.
• Tyler KD, Wang G, Tyler SD, Johnson WM. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification‐
b d DNA fi i ti f t ti b t i l th J Cli Mi bi l 1997 35 339 346based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. J Clin Microbiol 1997;35:339‐346.
33
Kolekcja izolatów
Izolacja DNA
Amplifikacja PCR fragmentów genówl k
Amplifikacja PCR fragmentów genów
Sekwencjonowanie (dideoxy)
Kolekcja danych
Określenie sekwencji nukleotydowej
Zgromadzenie danych sekwencji nukleotydowych
Profile alleliczne i identyfikacja typu sekwencji (ST)
P d i ł ST d k l k kl l
Nowe sekwencjealleli
i fik j ST
Analiza danych
Przydział ST do kompleksu klonalnegoi weryfikacja ST
Badanie populacji Badania epidemiologiczne
Analiza Sekwencji
ML
Diagram badawczy MLSTPorównuje się profile alleliczne izolatów z centralną bazą danych
www.mlst.net 34
MLSTMLSTMLSTMLSTMaiden M C J, Bygraves J A, Feil E, Morelli G, Russell J E, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant D A, Feavers I M, Achtman M and Spratt B G (1998) Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. S i USA 95 3140 3145Sci. USA, 95: 3140‐3145
Urwin R, Maiden MC. (2003) Multi‐locus sequence typing: a tool for global epidemiology Trends Microbiol Oct;11(10):479 87epidemiology. Trends Microbiol. Oct;11(10):479‐87.
David M. Aanensen* and Brian G. Spratt (2005) The multilocus sequence typing network: mlst net Nucleic Acids Research Vol 33typing network: mlst.net Nucleic Acids Research, Vol. 33,
Maiden MC. Multilocus sequence typing of bacteria.Annu Rev Microbiol. 2006;60:561‐882006;60:561 88
35
Gatunki Metody referencyjne* Metody alternatywne
Staphylococcus aureus typowanie fagowe, REA-PFGE AP-PCR, VNTR-PCR, PCR/RFLP PPA ADSRRS PCRPCR/RFLP, PPA, ADSRRS, PCR-MP
Streptococcus pneumoniae REA-PFGE Serotypowanie
Enterokoki REA-PFGE rybotypowanie, RAPD, y yp , ,ADSRRS, PCR-MP
Escherichia coli # Citrobacter, Proteus, Providencia
REA-PFGE AP-PCR, REP-PCR, ADSRRS,PCR-MP
Klebsiella Serratia REA PFGE PPA† ADSRRS PCR MPKlebsiella, Serratia REA-PFGE PPA†, ADSRRS, PCR-MP
Enterobacter REA-PFGE, rybotypowanie
Pseudomonas aeruginosa REA-PFGE Rybotypowanie, ARDRA
Acinetobacter REA-PFGE PCR/RFLP, REP-PCR, ADSRRS, PCR-MP
Clostridium difficile AP-PCR REA, PFGE‡, PCR-MP
Mycobacterium tuberculosis IS16110 RFLP, spoligotyping REP-PCR, VNTR-PCR,y p g yp gSouthern Blot
Mycobacterium avium REA-PFGE rybotypowanie
Borrelia burgdorferi sensu lato immunodiagnostyka, PFGE PPA, PCR/ RFLP, RAPD, VNTR-PCR, real-time PCR
Objaśnienia:REA‐PFGE, ang. Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową; AP‐PCR, ang. Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction; PPA, ang. Plasmid Profile Analysis – analiza profili plazmidowych (z lub bez analizy restrykcyjnej); REA, Restriction Endonuclease Analysis – analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA z użyciem konwencjonalnej elektroforezy; RFLP – ang. Restriction Fragment Length Polimorphism ; RAPD, ang. Random Amplified Polymorphic DNA, VNTR, ang. Variable Number Tandem Repeat, AFLP, ang. Amplified Fragment Length Polymorphism; ADSRRS ang. Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites; PCR MP, ang. PCR Melting Profiles; real‐time PCR – amplifikacja w czasie rzeczywistym; REP‐PCR, ang. Repetitive Element Polymerase Chain Reaction*Rekomendowane na podstawie danych publikowanych i stałych opini ekspertów# E.coli O157:H7 musi być identyfikowane przez serotypowanie†Dla bakterii gram ujemnych, analiza profili całych plazmidów, bez trawienia restrykcyjnego‡Wiele szczepów Clostridium difficile jest nietypowalna metodą PFGE z powodu problemów z degradacją DNA
36
KonkluzjaKonkluzjaKonkluzjaKonkluzja• Należy pamiętać, że w miarę upływu czasu i y p ę , ę p yrozprzestrzeniania się drobnoustrojów, różnice fenotypowe i genotypowe pomiędzy szczepami yp g yp p ę y pwzrastają.
• Powinniśmy uwzględnić pewną elastyczność wPowinniśmy uwzględnić pewną elastyczność w interpretacji danych eksperymentalnych: małe różnice nie zawsze oznaczają nowy typ genetyczny.różnice nie zawsze oznaczają nowy typ genetyczny.
• Powinniśmy również uwzględnić błąd eksperymentalny (niedokładność) nawet weksperymentalny (niedokładność), nawet w przypadku pracy z wysoce różnicującą techniką.
37