Zbl. Vet. Med. B, 25, 114-121 (1978) @ 1978 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0514-7166/ASTM-Coden: ZVRBA2

Aus dem Institut f u r Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig-Univerritat Giessen

Direktor: Prof . Dr. Th. Schliesser

Nachweis von Brucella canis mit Hilfe fluoreszierender Antikorper'

Von

ALBERT WEBER und ERIKA BALKE

Mit 2 Abbildungen und 2 Tnbellen

(Eingegangm urn 14. M a n 1977)

Hunde, die mit Brucella canis infiziert sind, zeigen aucer Verwerfen oder Sterilitat vielfach keine auffallenden klinischen Krankheitssymptome (CAR- MICHAEL u. KENNEY, 1970; MOORE u. GUPTA, 1970). Die sichere Erfassung infizierter Tiere ist nur durch serologische und bzw. oder kulturelle Unter- suchungen mijglich (CAKMICHAEL u. GEORGE, 1976). Beim kulturellen Erreger- nachwcis bereitet die Isolierung dieser Bakterienspezies wegen des langsamen Wachstums griii3te Schwierigkeiten. So konnen vor allem in Mischkulturen Br. canis-Kolonien von anderen, schneller wachsenden Bakterien uberwuchert und daher leicht ubersehen werden (WEBER u. SCHLIESSER, 1975).

In der Literatur wurde schon mehrfach uber die erfolgreiche Anwendung fluoreszierender Antikorper zum direkten Nachweis von Br. abortus, BY. meli- tensis oder BY. suis berichtet (BIEGELEISEN et al., 1962; VAN DRIMMELEN et al., 1963; KAKASEK u. JENTZSCH, 1966; CORBEL, 1973). Aus diesem Grunde war es naheliegend, die direkte Immunfluoreszenz auf seine Brauchbarkeit zum Nach- weis von BY. canis in Organmaterial infizierter Hunde zu uberprufen.

Material und Methoden Herstellung spezifischer Antiseren

Zur Herstellung des Antigens wurde Br. canis, Stamm RM 6/66' verwendet. Eine 40 bis 44 Std. alte Tryptose-Blutagar-Kultur wurde mit phys. NaC1-Losung abgeschwemmt, zum Abtoten Z'/? Std. im Wasserbad auf 56 O C erwarmt, abzentrifugiert und noch zweimal gewaschen. Der gewaschenen Bakteriensuspen5ion wurde zur Konservierung Formalin in 0,5 O/oiger Endkonzentration zugesetzt. Die Dichte der Formalin-behandelten Bakterienauf-

Die Untersuchungen wurden init finanzieller Unterstutzung der Deutschen Forschungs-

Herrn Dr. W. J. B. MORGAN, Central Veterinary Laboratory, Weybridge (England), danken gemeinschaft durchgefuhrt.

wir fur die freundlichc Uberlassung des Br. canis-Referenzstammes.

Nachweis von Brucella canis mit Hilfe fluoreszierender Antikorper 115

schwenimung wurde so eingestellt, daB ihr Triibungsgrad mit dem einer frisch hergestellten Bariumsulfatlosung von 97 : 3 ubereinstimmte (HALLMANN und BURKHARDT, 1974).

2 Kaninchen (weilk Neuseelander, 5-6 Monate alt, etwa 2 l / , kg schwer, aus der insti- tutseigenen Zucht) erhielsten in 4tagigen Intervallen das Antigen in steigenden Dosen 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,O und 5,Oml intravenos verabreicht. 10 Tage nach der letzten Injektion erfolgte die Blutentnahme zur Serumgewinnung.

Der Antikorpertiter der Kaninchenimmunseren gegen Br. canis wurde mittels Lang- samagglutination bei 37 ('C bestimmt. Durchfiihrung und Beurieilung der Rohrchenlangsam- agglutination ist bereits an anderer Stelle ausfiihrlich beschrieben worden (WEBER, 1976).

Die austitrierten Immunseren wurden bis zu ihrer Weiterverarbeitung bei -- 20 OC auf- bewahrt.

Herstellung der Konjugate Die Aufarbeitung und Konjugierung des Immunscrums wurde nach den in GOLDMAN

(1968) beschriebenen Methoden bei 4 "C durchgefiihrt. Dem Immunserum wurde unter Ruhren tropfenweise die gleiche Menge einer gesattigten

Ammoniumsulfatlosung zugesetzt und 2 Std. weitergeruhrt. AnschlieBend wurde zentrifu- giert (12 000 X g, 5 Min.), das Sediment in 0,85 Oioiger NaC1-Losung aufgenommen und noch zweimal rnit gesattigter Ammoniumsulfatlosung i n der 0. a. Weise behandelt. Danach wurde gegen Aqua bidest und aiischliefiend gegen eine Phosphat-gepufferte 0,85 O/uige NaC1-Losung (PBS, p H 7,O) dialysiert, bis keine Sulfationen mehr nachzuweisen waren. Der Proteingehalt wurde phorometrisch mit der Folinreaktion nach LOWRY et al. (1951) bestimmt und rnit 0,85 "/oiger NaC1-Losung auf 20 mg/ml eingestellt. Zu 10 Teilen dieser Losung wurde 1 Teil 0,5 M Carbonat-Puffer (pH 9,5) pipettiert und die Losung danach mit 17 p g Fluoresceiniso- thiocyanat pro mg Protein versetzt. Die Konjugierung erfolgte unter vorsichtigem Riihren uber Nacht.

Zur Entfernung ungebundenen Fluoresceinisothiocyanates wurde die Losung iiber eine mit 0,l M Phosphatpuffer (pH 8,O) aquilibrierte Sephadex G-50-Saule geschickt und die erste Fraktion des Eluates aufgefangen. Nach Aquilibrierung mit 0,0175 M Phosphatpuffer (pH 6,3) wurde das Konjugat iiber eine ebenso aquilibrierte DEAE-Cellulosesaule geschickt und rnit dem gleichcn Puffer eluier't. Das aufgefangene Eluat wurde mit Polyathylenglycol eingeengt, in kleinen Portionen von 1 ml abgefullt und bis zur Verwendung bei - 20 ' C aufbewahrt.

Pviifung auf Spezifitat a) Absattigung von Br. canis-Bakterienausstrichpraparaten mit einem nicht konjugier-

ten Anti-Br. canis-Serum (30 Min. in einer feuchten Kammer bei 37 "C) und nachfolgender Inkubation mit einem spezifischen Konjugat.

b) Prufung heterologer Bakterienausstrichpr~parate von Brucella abortus, Brucella suis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Pasteurella rnultocida, Proteus vulgaris, Staphy- lococcus aureus und u-humolysierenden Streptokokken mit Anti-BY. canis-Konjugat".

c) Absorption des Anti-Br. canis-Konjugates jeweils mit einer Bakterienaufschwemmung von Br. canis RM 6/66 sowie Bordetella bronchiseptica. Zu je 3 ml Anti-Br. canis-Konjugat wurden je 1 ml eines gewaschenen Bakteriensedimentes (Dichte etwa 1O'O Keime/ml) aus ab- getoteten Tryptose-Blutagar-Kulturabschwemmungen gegeben, 30 Min. bei 37 "C inkubiert und anschlieflend 24 Stunden bei 4 'C aufbewahrt. Nach dem Abzentrifugieren wurde der Oberstand als Konjugat weiter verwendet.

d) Abklatschpraparate von Organmaterial (Leber und Milz) nicht rnit Br. canis infizier- ter Meerschweinchen und Kaninchen.

Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung gelangten: a) Ausstrichpraparate (je 1 Use) von geometrischen Verdiinnungsstufen (lo-' bis lo-'''

eiiier phys. NaC1-Aufschwemmung von Br. canis (Stamme RM 6/66 und Nr. 233). b) Ausstrichpraparate (je 1 Use) von 24 bis 72 Std. alten Tryptose-Blut-Agar-Kulturen

von Br. canis (Sstamme RM 6/66, Nr. 233, Nr . 246, Nr. 247, Nr . 260 und Nr. 320)s. c) Ausstrichpraparate (je 1 Use) von Tryptose-Blut-Agar-Kulturen von Br. canis

(Stamme RM 6/66, Nr. 246, Nr. 247. Nr. 260 und Nr. 320), die 4 Wochen lang im Kiihl- schrank aufbewahrt worden waren.

d) Ausstrichpraparate (je 1 Use) von 24 bis 72 Std. alten Tryptose-Bouillon-Kulturen von Br. canis (Stamme RM 6/66, Nr . 246, Nr. 247, Nr. 260 und Nr . 320).

Die Bakterienstanime sind alle der Stammsammlung des Institutes fur Hygiene und Infek- tionskrankheiten der Tiere der Universitat Gienen entnommen worden.

WEBER und BALKE 116

Untersuchungsrnater ial

a . Mit nicht konjugiertem Anti - 8r. canis - Serum absorbierte 8r. canis - Bakterienausstrichpraparate

e) Organmaterial (verschiedene Korperlymphknoten und Organe, siehe Tab. 2) von 9 mit Br. canis infizierten Beagle-Hunden. Bei 2 Tieren (Nr. 8 und Nr. 14) lag eine experimen- telle Infektion vor; 7 Tiere waren naturlich infiziert.

Zu Vergleichszwecken wurden die Organproben direkt auf Tryptose-Blur-Agar aus- gestrichen. Identifizierung und Differenzierung von Br. canis erfolgte in der bereits an anderer Stelle beschriebenen Weise (WEBER u. SCHLIESSER, 1975).

Herslellung der mikroskopischen Ausstrichpraparate Das zu untersuchende Material wurde auf chromschwefelsauregereinigten Objekttragerii

diinn ausgestrichen, luftgerrocknet und anschlienend 10 Min. im kalten Aceton bei 4 OC fixiert. Die Ausstrichpraparate wurden danach mit 1 bis 2 Tropfen Konjugat uberschichtet und 60 Min. lang in einer feuchten Kammer bei 37 "C inkubiert. Nach Dekantieren des Kon- jugates wurden die Praparate vorsichtig mit PBS (pH 8,O) gespiilt und zweimal fur je 10 Min. in PBS (pH 8,O) gewaschen. Nach dem Lufttrodrnen wurden die Praparate mit einer gepufferten Glyzerinlosung (4 Teile Glyzerin und 2 Teile PBS) uberschichtet und mit einem Deckglaschen abgedeckt.

Fluoreszenzmikroskop und Photographie Die Untersuchung der Praparate erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop der Firma

Lcitz (,,Ortholux" mit ,,Orthomat"), Erregerfilter BG 12 und BG 38 in Ulimmersion mit einem 1 : 100 Objektiv. Fur Schwarz-Weii3-Aufnahmen wurde Kodak Tri-X-Pan-Film (27 DIN) verwendet, fur Farbaufnahmen Kodak Ectachrome High-speed.

Ergebnisse 1. Auswertung der Immunseren

Die 2 durch Kaninchenimmunisierung gewonnenen Antiseren wiesen in der Laiigsamagglutiiiation gegen Br. canis-Antigen jeweils einen Titer von 1 : 1600 auf. Beide Seren wurden einzeln zur Herstellung von Konjugaten ver- wendet.

Ergebnis der lmmunfluoreszenz

starke Hemmung lschwach grunlich gefarbte Stabchenl

2. Spezifitatsproben Das Ergebnis der Spezifitatsproben beider Seren fuhrte zu gleichen, in

Tabelle 1 zusammengefai3ten Ergebnissen.

d. Organmaterial nicht infizierter Meerschweinchen negativ

I b. Ausstrichpraparate verschiedener heterologer Bakterienarten I negativ I

3. Verschiedene Bakterienausstrichpraparate Usenausstrichpraparate von Suspensionen mit los und mehr Br. canis-

Keirnen pro ml waren in der fluoreszenzserologischen Untersuchung positiv, nicht dagegen Ausstrichpraparate von Suspensionen rnit lo2 und weniger Keimen pro ml.

Die immunfluoreszenzserologische Untersuchung der Osenausstrichprapa- rate von 24 bis 72 Std. alten Tryptose-Blutagar- und Tryptose-Bouillon-Kul- turen ergab bei allen uberpriiften Br. canis-Stammen eine hell strahlende gelb- grune Fluoreszenz. Vier Wochen alte Tryptose-Blutagar-Kulturen, die unter gleichen Bedingungen untersucht wurden, zeigten eine noch deutliche, aber etwas schwachere Fluoreszenz.

Nachweis von Brucella canis rnit Hilfe fluoreszierender Antikorper 117

4 . Organmaterial infizierter Beagle-Hunde Der Nachweis von BY. canis in Organproben von 2 experimentell und 7

naturlich infizierten Beagle-Hunden sowohl mittels direkter Immunfluoreszenz als auch in der Kultur ist in Tabelle 2 vergleichend gegenubergestellt.

Tabelle 2 Kulturelle und fluoreszenzserologische Untersuchungsbefunde bei Organproben von 9 mit

BY. canis infizierten Beagle-Hunden

Organmattr ial

Mandibular lnn. Tonsilltn Rttropharyngallnn. Buglnn. Achstllnn. Inguinallnn. Poplittallnn. Darmbtinlnn. Mtrtnttriallnn. BronchialLnn. Portallnn. Gehirn Lunge Ltbtr Mil2 Nitrt Uttrus Hoden Prostata Knochenmark Htrzblut

Nachw iund: Nr. 8

+ I + + I - + I + +I+ + / - + I + + I + + I + + I+ + I + - I + - I - - 1 - + I + + I + + I+ + I +

+ I + + I +

- i von , Nr. 12

+ I + + I + + I + + I + +I- + I + + I + + I + + I + + I - + I + -1- + I + + I + + I + -1- + / -

+ I+ + I +

ucclla Nr. 1L

+ I + + I - + / + + I + + I + + I + + I + + I + + I + +I+ + I + -1- + I + + I + + I + + I +

- I + + I + - I + + I+

nis (K Nr. 21

+ I + + I + +I+ + I + + I + + I + + I + +I+ + I + + I + + I+ -I- + / - + I + + I + -1-

+ I + + I + 0

+ I +

- .ur I dir Nr. 22

+I+ + I + + I + + I + + I + + I + + I + + I + + I + +I + + I - -1- -1- + I + + I + + I - + I +

-

0 +I +

te Imn Nr. 824

-1 - - I - + /+ -I- -1- - I - - /+ - I+ -1- - I - - I -

0

- I - -1- - I + + I + + I +

-

0 -1- -

i f luores Nr. 1131

-1- + I + +I+ +I+ -1- -1- +/ + + I+ - I - -1- -1- 0

-1- -1- + I + + I + -1-

-

0 -1 -

nz ) Nr. 121C

-1- - I + + I + - I+ - I - -1- -1- -1- -1- -I- -1- 0

-1- - I - - I + -1- -1-

-

0

-1 -

r(r. 1211

+ I + + I + +I+ + I + + I + + I + + I + + I + + I+ + I + + I + 0

+ I+ + I + + I + - I + + I +

-

0 - I -

Erklarung : + = Nachweis von Br. canis - = kein Nachweis von Br. canis 0 = nicht untersucht

Obereinstimmend positive Ergebnisse bei Vergleich beider Untersuchungs- verfahren lagen in 100 Fallen und ubereinstimmend negative Befunde in 44 Fallen vor. Bei 9 kulturell positiven Organproben rnit sehr geringer Keimzahl (1 -3 Kolonien pro Tryptose-Blutagar-Platte) in der Direktkultur, fie1 die Immunfluoreszenz negativ aus. Wahrend fluoreszenzserologisch bei 10 Proben auf das Vorhandensein von BY. canis zu schliei3en war, konnte in der Kultur kein Wachstum beobachtet werden.

Die Darstellung von BY. canis in Abklatschpraparaten gelang in ein- drucksvoller und uberzeugender Weise. Neben freiliegenden, fluoreszierenden Brucellen fanden sich regelmai3ig auch fluoreszierende intrazellular vorhandene Bakterien (Abb. 1 und 2 ) .

Diskussion Voraussetzung fur eine sichere Diagnose mittels direkter Immunfluores-

zenz sind hohe Spezifitat und ausreichende Titer der verwendeten Konjugate. Zur Sicherung der Spezifitat der Konjugate ist deren Oberprufung nicht nur mit homologen, sondern auch heterologen Bakterienarten notwendig, weil die Moglichkeit besteht, dai3 die uber Kaninchen gewonnen Immunseren gegen Bak- terien Antikorper enthalten, die mit BY. canis kreuzreagieren. Auf diese Weise konnte es leicht zu Fehldiagnosen kommen. Die von uns hergestellten

WERER und BALKE 118

Abb. 1. Direkter fluoreszenzserologischer Nachweis von Brucella cunis im Abklatschpraparat eincs Retropharyngeallymphknotens (780 X )

Abb. 2. Direkter fluoreszenzserologischer Nachweis von Brucella canis im Abklatschpraparat ciner Milz (780 X )

Konjugate zeigten keinerlei Aktivitat gegenuber Brucella abortus, Brucella suis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Pasteurella multocida, Proteus vulgavis, Staphylococcus aweus und (1-hamolysievenden Streptokokken. Da- gegen beobachtete HUSSEIN (1975) bei seinen Konjugaten eine Kreuzfluores- zenz mit Bovdetella bronchiseptica, die erst nach Absattigung mit dieser Bakterienart verschwand. Ober eine schwache Mitfluoreszenz von BY. canis bei BY. abortus-Konjugaten berichtet CORBEL (1973).

Im Kahmen der durchgefuhrten Untersuchungen konnte an 163 Organ- proben voii 9 mit BY. canis infizierten Beagle-Hunden die direkte Immun- fluoreszenz auf ihre Nachweissicherheit mit der kulturellen Erregerisolierung

Nachweis yon Brucella canis rnit Hilfe fluoreszierender Antikorper 119

verglichen werden. Wie die Usenausstrichpraparate gezeigt haben, sind min- destens 1 Os Keime/ml erforderlich, um auch fluoreszenzserologisch zu einer positiven Beurteilung zu kommen. Diese Untersuchungsbefunde stimmen gut rnit den Ergebnissen von MOODY et al. (1961) uberein. Diese Arbeitsgruppe fand, dai3 bei Reinkulturen mindestens 2,5 X lo3 BY. abortus-Keime pro Bakterienaufschwemmung, bei Mischkulturen sogar 1 O6 Keime/ml Unter- suchungsmaterial vorhanden sein mussen, um den Nachweis spezifisch fluores- zierender Antikorper fuhren zu konnen. Zu geringer Keimgehalt, weniger als lo? Keime/ml, kann daher als Grund fur die seltenen Diskrepanzen zwischen positiven kulturellen und negativen fluoreszenzserologischen Befunden an- gesehen werden. Bei 9 der insgesamt 163 untersuchten Organproben von infizierten Beagle-Hunden konnten mittels direkter Immunfluoreszenz keine BY. cunis-Keime gefunden werden, wahrend in der Direktkultur jeweils 1-3 Kolonien auf der Tryptose-Blutagar-Platte angingen.

Andererseits verlief die immunfluoreszenzserologische Untersuchung in 10 Organproben positiv, wahrend die Kultur negativ ausfiel. In diesen Fallen konnte eine unspezifische Fluoreszenz des Gewebes ausgeschlossen werden, da die verwendeten Konjugate an entsprechenden Organabklatschpraparaten nicht infizierter Laboratoriumstiere (Meerschweinchen, Kaninchen) keine Fluo- reszenz zeigten. Durch die chromatographische Fraktionierung des Konjugates an DEAE-Cellulose, wobei nur die erste, ohne NaCl eluierte Fraktion auf- gefangen wurde, wird eine mogliche unspezifische elektrostatische Bindung des Konjugates an basische Gewebestrukturen nahezu unterdruckt (Mc DEVITT et al., 1963; GOLDMAN, 1968). Moglicherweise wurden beim Anlegen der Kul- turen durch zu starkes Abflammen des betrefienden Organmaterials (je lmal Tonsillen, Bug-, Portal-, Darmbein-, Popliteallymphknoten, Niere, Hoden, Knochenmark, je 2mal Milz) die wenigen vorhandenen Brucellen geschadigt und gingen deshalb in der Kultur nicht mehr an. Wie die Untersuchungen von MOODY et al. (1961) sowie KARASEK (1965) gezeigt haben, fallt aber die direkte Immunfluoreszenz auch bei geschadigten und nicht mehr lebensfahigen Bakterien noch positiv aus.

Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse zeigen, dai3 rnit Hilfe fluores- zierender Antikorper BY. canis direkt nachzuweisen ist. Besonders bei bakte- riel1 verunreinigtem Untersuchungsmaterial gestattet diese Methode eine rasche (bereits nach 1-Ii/2 Std.) und zuverlassige Diagnose, die mit an einigen Organproben vergleichsweise durchgefuhrten mikroskopischen Untersuchungen von Abklatschpraparaten (nach GRAM u. STAMP gefarbt) nicht erzielt werden konnten. Die direkte Immunfluoreszenz kann deshalb als eine wertvolle Er- ganzung des kulturellen Nachweises von BY. canis angesehen werden.

Zusammenfassung 163 Organproben von mit Brucella canis infizierten Beagle-Hunden wur-

den parallel mit fluoreszierenden Antikorpern und in der Direktkultur unter- sucht.

In 144 Fallen zeigte die Anwendung fluoreszierender Antikorper und die Direktkultur hinsichtlich positiver oder negativer Befunde Obereinstimmung. Bei 10 Proben erbrachte nur die Anwendung fluoreszierender Antikorper den Hinweis auf Vorliegen von Brucella canis, wahrend in 9 Fallen nur die kultu- relle Untersuchung (Wachstum von 1-3 Kolonien) positiv verlief.

Die Anwendung spezifisch fluoreszierender Antikorper im direkten Immunfluoreszenztest stellt somit eine wertvolle Erganzung fur den kultu- rellen Nachweis von Brucella canis dar.

120 WEBER und BALKE

Summary Demonstration of Brucella canis by fluorescent antibodies

163 organs from beagles infected with Bvucella canis were examined in parallel by using fluorescent antibodies and in direct culture.

144 organs showed agreement between the results of using fluorescent antibodies and of culture, positive or negative, In 10 organs the use of fluores- cent antibodies was positive in contrast to culture. In 9 cases only the cultural examination was positive, but there were grown only 1-3 colonies.

The utilization of fluorescent antibodies in the direct immunofluorescence technique is a useful additional method for the cultural diagnosis of Bvucella canis.

Resume Mise en evidence de Brucella canis A l’aide d’anticorps fluorescents

163 kchantillons d’organes de chiens <<Beagle,> infectks avec Brucella canis ont k tk examinks paralldement avec des anticorps fluorescents et en culture d’ irecte.

L’emploi des anticorps fluorescents et de la culture directe ont montrk une concordance nkgative ou positive dans 144 cas. 10 kchantillons montrkrent la prksence de Brucella canis avec les anticorps fluorescents et 9 cas une recherche positive (croissance de 1-3 colonies) en culture directe.

L’utilisation d’anticorps fluorescents spkcifiques dans le test d’immuno- fluorescence directe reprksente ainsi un compliment valable pour la mise en kvidence de Brucella canis en culture.

Resumen Identificacih de Brucella canis con ayuda de anticuerpos fluorescentes

163 muestras de 6rganos de perros beagles, infectados con Bvucella canis, se examinaron paralelamente con anticuerpos fluorescentes y en el cultivo directo.

En 144 casos mostraba coincidencia la aplicaci6n de anticuerpos fluores- centes y el cultivo directo respecto a hallazgos positivos o negativos. En 10 muestras solo aport6 la aplicaci6n de anticuerpos fluorescentes el indicio de la presencia de Brucella canis, mientras que en 9 casos solo el examen cultural (crecimiento de 1-3 colonias) tom6 rumbo positivo.

Por tanto, el empleo de anticuerpos fluorescentes especificos en la prueba de inmunofluorescencia directa es un suplemento valioso para la identifica- ci6n cultural de Brucella canis.

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Anschrift der Verfasser : Frankfurter StraRe 89, D-6300 GieBenlLahn.

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