Asist. Mag. Tadej PajičSpec.med.biokem.

Specializirani hematološki laboratorij kliničnega oddelka za hematologijo

Interna klinikaUniverzitetni klinični center Ljubljana

Mutacijska analiza v genu ABL1

BCR-ABL1 t(9;22)(q34;q11): fuzijski gen BCR-ABL1

Kronična mieloična levkemija (KML) > 95 %

Akutna limfoblastna levkemija celic B (B-ALL) 3 % (otroci) 25 % (odrasli)

Akutna mieloična levkemija (AML) < 1 %

Zdravljenje: zdravilo kot so imatinib, nilotinib, dasanitib in druga zdravila ter drugi načini zdravljenja (presaditev krvotvornih matičnih celic)

Groffen et al. Cell, 1984; 36(1):93-9; Konopka et al. ,Cell, 1984; 37(3):1035-42.; Shtivelman et al. Nature, 1985; 315(6020):550-4

http://a0.vox.com/

Delovanje imatiniba veže se v vezavno mesto za ATP, prepreči fosforilacijo AK tirozin

http://www.dnai.org/media/bioinformatics/gleevec/gleevec_modeofaction_files/09f1.gif

Mejniki uspešnosti zdravljenja in rezistenca na zdravljenje z imatinibom pri KML

Mejnike uspešnosti zdravljenja: National Comprehensive Cancer Network (NCCN) in EuropeanLeukemiaNet.

Določen ustrezen, nezadovoljiv odgovor, neuspeh zdravljenja Čas Ustrezen odgovorPo 3 mesecih: popolni hematološki odgovor (krvna slika)

Po 6 mesecih: vsaj delni citogenetski odgovor (Ph+ ≤ 35 %)

Po 12 mesecih: popolni citogenetski odgovor (Ph+ 0 %)

Po 18 mesecih: glavni molekularni odgovor (RT-qPCR; BCR-ABL1/ABL1 (referenčni gen) ≤ 0,1 % mednarodne skale).

Primarna rezistenca: O primarni rezistenci na zdravljenje z imatinibom govorimo,če nikoli ne dosežemo želenih odgovorov.

Sekundarna rezistenca: Nekateri bolniki sprva dosežejo ustrezne odgovore na zdravljenje z imatinibom, nato doseženo stanje usahne.

Vzroki za pojav odpornosti na zdravljenje z imatinibom

Klonska evolucija (dodatne kromosomske spremembe) in pojav točkovnih mutacij v genu BCR-ABL1

Mutacije najpogosteje odkrijemo pri bolnikih v pospešenem poteku bolezni ali blastni krizi.

vplivi na farmakokinetiko IM

aktivacija alternativnih signalnih poti, ki vodijo do rasti celic neodvisno od BCR-ABL1.

Bixby D. and Talpaz M. Mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia and recent therapeutic strategies to overcome resistance. ASH Education Book. 2009: 461-472.

Pojav točkovnih mutacij

Mutacije se pojavijo v področju tirozin kinazne domene, ki pripada genu ABL1 gena BCR-ABL1.

Zmanjšajo afiniteto vezave ali preprečijo vezavo imatiniba in njemu sorodnih zdravil v aktivno mesto fuzijskega proteina.

KML Določene v približno 50 % bolnikov, ki se jim je razvila rezistenca pri zdravljenju z

imatinibom. Bolj pogosta pri bolnikih z bolj napredovalo obliko bolezni.

ALL Ph+

Določene v 80 do 90 % ob ponovitvi bolezni bolnikov zdravljenih z imatinibom. Z občutljivimi načini zaznave določili nizek nivo mutacij v levkemičnih celich pred

terapijo v 40 %.

Pogostnost pojavljanja mutacij v genu ABL1 – KML in ALL z Ph+

•pri zdravljenju z imatinibom

Blood, 2006, Vol. 108, No. 1, pp. 28-37. KML: 219 bolnikovALL Ph+: 26 bolnikov

Analiza mutacij – Kdaj?KML Priporočilo ekspertov (evropska mreža za levkemije):

v primeru neuspeha zdravljenja, neustreznega odgovora ali potrjenem porastu nivoja prepisa BCR-ABL1 (za 5 do 10x),

sprememba načina zdravljenja (drugi TKI ali drugi načini).ALL Ph+

Porast nivoja prepisa BCR-ABL1, sprememba načina zdravljenja (TKI druge generacije) (ni tako izdelanih priporočil).

Izsledki mutacijske analize pomagajo pri odločitvi o nadaljnjem zdravljenju.Pomembno: identifikacija mutacije ne pomeni vedno vzrok za rezistenco.

Niso vse mutacije klinično enako pomembne. Izbira drugega TKI lahko temelji:

na moči delovanja inhibitorja tirozinske kinaze določene v pogojih in vitro IN na osnovi kliničnih preiskav.

Mutacije v genu ABL1 in moč delovanja TKI

Haematologica 2008;93:161

IC50, relativna koncentracija substance, ki inhibira 50 % encimske aktivnosti

Mutacije v genu ABL1 in klinične preiskave

Predlagana tabela za izbiro TKI druge generacije (nilotinib, dasatinib) glede na izsledke mutacijske analize in osnovi trenutnega razumevanja iz kliničnih raziskav:

Mutacijski status Dasatinib Nilotinib

Ni mutacije DA DA

T315I NE NE

F317L/I/V NE DA

Y253H, E255K/V, F359 V/C DA NE

T315A NE DA

V288L NE DA

G250E DA DA?

Q252H ? DA

Druge mutacije DA DA

Hughes T.P. and Branford S. Monitoring disease response to tyrosine kinase inhibitor therapy in CML, ASH Education Book 2009; p: 477-487.

Analiza mutacij druga generacija TKI– Kdaj?

Ni izdelanih priporočil kot pri zdravljenju z imatinibom

Splošno: porast nivoja prepisa BCR-ABL1

Načini ugotavljanja mutacij v genu ABL1

Tehnologija Občutljivost (%)

Specifičnost

Sekvencioniranje 15 -25 ++

Kloniranje in sekvencioniranje

9 +++

Denaturirajoča visoko ločljiva te kočinska kromatografija (D -HPLC)

0.1 -10 ++

Pirosekvencioniranje 5 ++

Dvojno gradientnadenaturirajočaelektroforeza

5 ++

Flourescentni PCR 0.2 ++ Alel no -specifi čni PCR (ASO -PCR)

0.01 ++

Blood, 2006, Vol. 108, No. 1, pp. 28-37.

Klinično so verjetno pomembne le mutacije, ki se pojavljajo v 20 – 25 % levkemičnih celic.

Alelno specifični PCR (ASO-PCR) Za eno mutacijo izvedemo dve PCR: En za divji tip ( se vedno pomnoži) Drugi za mutacijo ( se pomnoži, če je

mutacija prisotna) Panel mutacij:

M244V, L248V, G250E,Y253F,Y253H, E255V, E255K M343T, Q252Ha, Q252Hb, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V, H396R Manjkajo: V299L, F317I/V, T315A, F359C

Izvedemo elektroforezo

Omejitev metode: zaznamo lahko le prisotnost določenih mutacij

Kang, H.J. et al. Haematologica 2006; 91 (5); p:659-662

ASO-PCR-rezultati, mutacija T315I

S M M M MMW W W W

K - C000 C0001 NTCV1 V2

M M M SMW W W W

K - C000 C0001 NTCK - C000 C0001 NTCV1 V2

Pozitiven vzorec – mutacija je prisotnaNegativen vzorec – mutacija ni prisotna

Negativna kontrola Negativna

kontrola

Sliko pripravila dr. Martina Fink, SHL KO za hematologijo

Sekvenčna analiza-postopek 1. Del:

- 1.PCR: uporabimo cDNA bolnika in naredimo 1. PCR, kjer pomnožimo BCR-ABL1 cDNA odsek,

- V 2.PCR damo del 1.PCR pridelka (vgnezdeni PCR) in pomnožimo regijo gena ABL1, kjer iščemo mutacije. Pridelke PCR očistimo.

2. Del:- naredimo sekvenčno reakcijo in očiščene pridelke te reakcije

ločimo z kapilarno elektroforezo,- dobimo elektroferogram z nukleotidnim zaporedjem, ki ga primerjamo z nukleotidnim zaporedjem referenčnega zaporedja v bazi podatkov na svetovnem spletu.- zazanamo spremembe v aminokislinskem zaporedju od mesta 217 do 421

Omejitev metode: za zaznavo mutacij verjetno potrebujemo raven izražanja BCR – ABL1 vsaj 5 % na IS; mutacija prisotna v 20 % levkemičnih celic.

Soverini, S et. al. Clinical Chemistry 2004; 50; p: 1205-1213.

Primer elektroferograma

Ni mutacije

Sliko pripravila dr. Martina Fink, SHL KO za hematologijo

Primer : analiza nukleotidnega zaporedja

Ni mutacije

Sliko pripravila dr. Martina Fink, SHL KO za hematologijo

ASO-PCR: pregled dosedanjih rezultatov,obdobje julij 2009 do marec 2010

KMLPanel:Neg.: 10 bolnikovPoz.: 1 bolnik M343T

1 bolnik M351T nezanesljiv rezultat

Samo T315I:Neg.: 2 bolnikaPoz.: ni

ALL Ph+

Panel:

Neg.: 2 bolnika

Poz.: 1 bolnik: 8. 10. 2009 F317L, Y253H pozitiven (potrjeno s

sekvencioniranjem); T315I nezaneslijiv,

10. 12. 2009 Y253H

03.03. 2010 T315I poz.

Samo T315I:

Neg.: ni

Poz.: 1 bolnik

ZaključekAnaliza pridobljenih mutacij v genu ABL1:1. KDAJ?IMATINIBKML

- v primeru neuspeha zdravljenja, neustreznega odgovora ali potrjenem porastu nivoja prepisa BCR-ABL1 (za 5 do 10x),

- sprememba načina zdravljenja (drugi TKI ali drugi načini).ALL Ph+

- porast nivoja prepisa BCR-ABL1, sprememba načina zdravljenjaNILOTINIB, DASATINIBKML in ALL Ph+

- porast nivoja prepisa BCR-ABL1

2. Način:-sekvencioniranje, drugi načini, kot npr. ASO-PCR.