1Poznámka• CLK – Pracovisko Laboratórnej hematológie a Hematologické oddelenie

MOŽNOSTI A LIMITÁCIE STÁLE PRESNEJŠEJ FC DIAGNOSTIKY PATOLOGICKÝCH STAVOV

V HEMATOLÓGIIÖlvecká S., Wild A.

2Poznámka

• Technický pokrok vo vývoji analyzátorov, softvérov

• Detekcia ďalších antigénov buniek (líniovo, maturačne, funkčne špecifických, ...........)

• Vývoj nových MoAb a fluorescenčných farbičiek

• Vývoj nových „prídatných“ reagencií, optimálnych pre použitie v mnohofarebných analýzach (kity pre súčas-né značenie cy- a m-znakov, šetrné lyzačné roztoky...)

Prostriedky pre zdokonaľovanie FC analýz:

3Poznámka

Zlepšenie predanalytickej fázy a prípravy vzoriek: + nové roztoky na stabilizáciu, fixáciu, ....

Likvor bez Transfixu Likvor v Transfixe

Aj v cytometrii platí: aká kvalitná je vzorka, taký bude výsledok

4Poznámka

Čo umožňuje stále presnejšia (citlivejšia) diagnostika pri onkohematologických ochoreniach?

• Presnejšie stanoviť jednotlivé typy B a T lymfopro-liferatívnych ochorení (LPO); resp. ktoré môžu pripadať do úvahy a ktoré je možné vylúčiť –nápomocné pre histologické vyšetrenia

• Viacparametrové FC umožňujú rozlíšenie fyziologic-kých buniek od patologických aj pri malých klonoch;

• ...... zachytiť každú patológiu a čím presnejšie ju definovať a diagnostikovať ....

……… a od stanovenia správnej dg. sa odvíja všetko ostatné

• Viacparametrovou analýzou šetríme čas a náklady

5Poznámka

…v čom je (zatiaľ) problém ………

• Je minimum CD antigénov, ktoré sú špecifické len pre jeden typ buniek: napr.: CD34, CD3, CD19, CD56, CD14, CD13, CD33, GlycoA, CD61

....keby každá dg. mala „svoj“ špecifický antigén...

• Stále snaha o detekciu takýchto antigénov („neosvedčili sa“: CD43, CD160, CD90, ....)

→ v rôznej lit. - rôzne varianty súborov antigénov (+/-, -/+, alebo nie sú uvedené, .....)

• Možnosti citlivejšej FC diagnostiky ponúka 8 a viacfarebná analýza, ktorá vyžaduje potrebné vybavenie

6Poznámka

Nádory zo zrelých B-bb(Klas.malígnych lymfómov-SZO 2008)

Chronická lymfocytová leukémia-CLL/malobunkový lymfóm

Lymfóm plášťových buniek (MCL)

Prolymfocytová leukémia B-pôvodu Difúzny veľkobunkový lymfóm B-pôvodu (DLBCL), (NOS) bližšie nešpecifikovaný

Splenický lymfóm marginálnej zóny B-bunkový lymfóm bohatý na T-bunky a histiocyty

Vlasatobunková leukémia (HCL) Primárny DLBCL CNS

Neklasifikovateľný splenický lymfóm/leukémia

Primárny kožný DLBCL, „končatinový“ typ

Lymfoplasmocytový lymfóm EBV pozitívny DLBCL stareckého veku

Ochorenia ťažkých reťazcov DLBCL asociovaný s chronickým zápalom

Plasmocytové nádory Lymfomatoidná granulomatózaMALT lymfóm Primárny mediastinálny (týmusový)

veľkobunkový B-lymfómNodálny lymfóm marginálnej zóny Intravaskulárny veľkobunkový B-lymfóm

Folikulový lymfóm Primárny kožný lymfóm folikulového centra

7Poznámka

Nádory zo zrelých B-bb(Klas.malígnych lymfómov-SZO 2008)

ALK pozitívny veľkobunkový B-lymfóm Burkitov lymfóm (BL)Plazmablastový lymfóm B-bunkový lymfóm, neklasifikova-

teľný, s intermediárnymi črtami medzi DLBCL a BL

Veľkobunkový B-lymfóm vznikajúci v multicentrickej Castlemanovej chorobe asociovanej s infekciou HHV8

B-bunkový lymfóm, neklasifikova-teľný, s intermediárnymi črtami medzi DLBCL a klasickým Hodgkinovým lymfómom

Primárny lymfóm asociovaný s efúziou (seróznej blany)

8Poznámka

Kazuistika A.P., muž, 1949Mikroskopicky v KD: 54% blast neurčitý

FC analýza KD – 11. 04. 2014Použitá 5-parametrová FC analýza v 1 skúmavke,MoAb so šiestimi rôznymi fluorochrómami:FITC, PE, ECD, PC5, PC7, APC-AF750

NAVIOS – Beckman Coulter

Možnosť 8-parametrovej

analýzy

9Poznámka

FS

SSCD22-PC7

CD34-A750

CD19-PC5

CD38-FITC

SS

CD19-ECD

Kappa-FITC

Lambda-PE

CD10-PE

CD7-PC7

10Poznámka

cyCD79a-PE

sIgG-FITCsIgM-FITC

CD5-PECD3-PC5

CD20-PE CD24-PE

CD23-FITC

11Poznámka

A.P., muž, 1949

FC analýza KD

CD79b-PE

CD2-FITC

CD45-PC5

FMC7-FITC

CD13-PE

HLA-DR-PC5

12Poznámka

-NIE Burkitov lymfóm (zrelá B-ALL), lebo 19+5+, sIgM--NIE CLL, lebo CD23-, FMC7+, CD79b+ -možno MCL, ale sIgM- (nebolo vyšetrené sIgD) (nevidela som daný FC obraz pri MCL)

• Aj podľa cytológie sme sa priklonili k dg. CD5+DLBCL(Difúzny veľkobunkový lymfóm B-pôvodu) – blastický variant

• Fenotyp DLBCL: CD19+ CD20+ CD22+ CD79a+CD5-/+ CD10-/+ CD45+/- sIgG+/-

• Definitívny histologický nález: „...cyklín D1+, CD30-, t.j. ide o infiltráciu KD CD20+ blastickým procesom zo spektra MCL, blastoidný typ (dg. zložitý prípad, použitý panel 11 IHC metód)

13Poznámka

Oveľa náročnejšia je požiadavka klinikov o detekciu možnej patologickej populácie: FC lab nedostane žiadne bližšie informácie o pacientovi (výsledkoch iných testov)

• Pacient ešte nebol FC analyzovaný, nemáme histológiu KD, alebo len málo výpovedný histologický nález (len z uzliny), skôr indície na možnú patológiu (B-línie)

• Ako nájsť patológiu B-línie pri prvotnom vyšetrení?- Monoklonalita Kappa alebo Lambda Ig reťazcov

Benigná (polyklonálna) B-lymfoidná populácia v PK a KDKappa : Lambda v rozmedzí 0,5 – 3,0

- Heterogénna expresia niektorých B-lymfoidných znakov (pri B-CLL slabšia CD20, silnejšia CD23)

- Koexpresia T-lymfoidných znakov (CD5 pri B-CLL+MCL)- Asynchrónna koexpresia (CD10 + sIg pri FL alebo BL)

14Poznámka

Kazuistika Č.M., žena, 1943V KO lymfocytóza; toxoplazmóza, veľké LU, .......FC analýza krvi – 19. 12. 2012

CD4

CD3

15Poznámka

CD8

CD3

Zrelé T- lymfo + NK- bunky tvoria cca 77%, zvyšok bunky B - línie

CD2-FITC

CD7-PE

CD34

HLA-DR

16Poznámka

CD20

SSFMC7

CD79b

CD10

17Poznámka

SS

CD19-ECD Kappa

Lambda

18Poznámka

19Poznámka

Kazuistika Č.M., žena, 1943

Výsledok FC analýzy:

• Koexpresia CD19+CD5+ = 13,9% (viac než 5%)• CD5 je o niečo vyššia než CD3• CD79b je o niečo vyššia než iné znaky B-línie• ! monoklonalita kappa Ig • FC nevylučuje možnosť prítomnosti malej patologickej

populácie B-línie

20Poznámka

Č.M., žena, 1943KD nebola vyšetrovaná, ale histologicky 3 lymfatické uzliny

„... detegované zmeny najskôr súvisia s toxoplazmovou infekciou; pričom v súlade s klinickým priebehom a lab nálezom v PK sa vyskytujú aj ložiskové známky procesu typu asociovanej CD20+/CD5+ malobunkovej lymfoproliferácie neistej biologickej povahy – táto nesie morfologické aj fenotypové znaky proliferácie populácie buniek marginálnej zóny: CD20+, CD5slabo+, DBA.44-/+, cyklín D1-/+(menej ako 5%bb), sIg typu K+, cyIg K+, MPO-, proliferačný Ki-67 index je nízky (cca 20%) – tento profil je identický s profilom verifikovaným v FC

Po preliečení infekcie bola odporučená rebioptizácia;pre zložitosť prípadu použitý panel 11 IHC vyšetrení“

21Poznámka

Konkrétny záver pre klinických lekárov:

• Ak histológia a/alebo FC deteguje, alebo vyjadrí predpoklad o prítomnosti aj veľmi malej patologickej populácie - klinik hodnotí „ako skôr pozitívne“ – stanoví klinické štádium (IV) a liečbu. Po liečbe sa väčšinou skontroluje dreň, prípadne sa skombinuje liečba.

• Ak nález v čase po liečbe: v prípade malobunkového lymfómu – ak vymizla ostatná choroba – nelieči sa; v prípade blastických lymfómov–ak je aj malá infiltrácia, ale jednoznačná – liečba pokračuje, v ostatných prípadoch v krátkom intervale nasledujú kontrolné analýzy: histológia, FC, cytológia, PET (CT)

22Poznámka

Kazuistika B.G., žena, 1987

FC analýza krvi – 10. 12. 2013

• ... S najväčšou pravdepodobnosťou prítomná malá, patologická populácia B-línie.... cca pod 5%; Z lymfo gatu CD19+ = 9,7%, v SS/CD19 zobrazení gate CD19+bb len 4,3%, z ktorých bunky:

- s koexpresiou CD23+CD5+ tvorili 23,5% - kappa/lambda = 68,5% / 21,2% (pomer je 3,23)

• Teoreticky: dg. B-CLL, MCL, FL ?

• Potrebné histologické vyšetrenie KD

23Poznámka

FC analýza KD: 12/2013

FS

SS

SS

CD19-ECD

Kappa

LambdaKappa

K:L = 5,62

24Poznámka

Z lymfo gatu

Z lymfo gatu

25Poznámka

Kazuistika B.G., žena, 1987

Záver FC analýzy kostnej drene – 20. 12. 2013

• „Z lymfo gatu sa expresie CD5/CD19/CD23 pohybujú pod 5%-ou, ešte fyziologickou expresiou, avšak po prepočte z gatu len CD19+ bb sa hodnota expresie dvíha. Taktiež pomer zastúpenia kappa a lambda ľahkých Ig reťazcov nezodpovedá fyziologickému rozmedziu: 0,5-3,0 .

• FC opäť nevie s istotou vylúčiť prítomnosť veľmi malej, patologickej populácie B-línie.“

• Histológia:“.... reprezentatívna vzorka,... v ktorej je v kontexte uvedeného výsledku FC analýzy prítomná málo rozsiahla lymfoproliferácia nejasného biologického významu (reaktívna?, počínajúce LPO ?)

26Poznámka

- Počet pacientov s „možnou patológiou“ stúpa- „Problémoví“ pacienti pre klinikov- Zatiaľ viac prípadov, kedy histológia nepotvrdila FC nález

Možné príčiny:- „Hodnotiace a technické“ problémy pri FC analýze- Malý počet analyzovaných buniek nemusí vydať objek-

tívny výsledok- Histologické vyšetrenie nemusí byť vždy to najobjek-

tívnejšie: nereprezentatívny materiál, použitá menšia paleta protilátok,.......

27Poznámka

Mnohopočetný myelóm: použitie 8-farebného protokoluPacientka: M.M., 1951 –FC potvrdenie diagnózy s dôkazom patologických plazmatických buniek (PC)Mikroskopické zhodnotenie náteru KD: 34% PC

488 Excitation 633 Excitation

FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC-AF700

APC-AF750

Kappa Lambda CD56 CD138 CD45 CD38 CD19 CD27

28Poznámka

SS

CD45-PC7

CD138-PC5.5

CD38-APC

CD138-PC5.5

CD38-APC

CD27-AA750

CD19-AA700

UNGATED UNGATED

29Poznámka

CD19-AA700 CD38-APC

CD56-ECD CD56-ECD

Lambda-PE

Kappa-FITC

cy-IgA

30Poznámka

Výsledný imunofenotyp: CD45- bbCD138++ CD38++ CD27++ CD19+ CD56++ cyKappa++ cyIgA++

• Najtypickejší fenotyp patologických PC45- 138+ 38+ 27- 19- 56+ cyK/L+ cyIg

• V zhode s údajmi z FN Brno (Mgr.Říhová PhD): klonálne PC s expresiou CD19 vo väčšine prípadov exprimujú aj CD27

31Poznámka

Pacientka: H.M., 1932 –1xFC, už potvrdená dg.MMcieľ: či sú v KD prítomné patologické PC a koľko Mikroskopické zhodnotenie náteru KD: 1% PC

UNGATED UNGATED

CD138

CD38

SS

CD45ALL number = 45 442

32Poznámka

CD138

CD38

CD27

CD19

CD19

CD56 KAPPA

LAMBDA

Number PC = 944

33Poznámka

Podľa výpočtu: 2,08% patologických PCImunofenotyp:45-138+38+cyK+cyIgG+19-56+27+Info na žiadanke: ELFO zo spádu: IgG/Lambda

cyIgG

Lambda

34Poznámka

Požiadavky na FC lab:

• Náš zatiaľ malý súbor pacientov s 8-farebnou FC analýzou na detekciu MRD pri dg.MM narastá

• Pri aferézach PKB... ??? ako koreluje počet detegova-ných klonálnych plazmatických buniek s dosiahnutou hĺbkou remisie; ale problémy→ prekurzory PC + nízky počet zachytených cirkulujúcich PC

• Zmeny pri príprave vzorky: lyzačný roztok + permea-bilizačný roztok

35Poznámka

FC detekcia MRD pri AL:„robí sa dlho“, detekcia sa postupne zdokonaľovala.......Eckschlager a kol. 1999: Průtoková cytometrie v klinické praxi →„ ....ako sa zachovať pri FC dôkaze MRD a či ju liečiť?....“• ALL IC-BFM 2009„A Randomized Trial of the I-BFM-SG for the Management ofChildhood non-B Acute Lymphoblastic Leukemia“Final Version of Therapy Protocol from August-14-2009Start 01.04.2010 End 31.03.2015• V deň liečby 8. aj 33. –len morfologické kritérium (nález v KD) • Deň 15. je stratifikačný v liečbe – určujúce

vzhľadom k ďalšej liečbe pacienta je flow-cytometrické stanovenie počtu reziduálnych patologických blastov

• Flow risk MRD: low risk: 0,1% intermediate risk: 0,1% - 10%high risk: 10%

U dospelých pacientov?

36Poznámka

Záver:

• Hematoonkológia „dáva FC satisfakciu“ v podobe konkrétnych dg. záverov a jednoznačných odporúčaní

• Ďalšie perspektívy sa neustále otvárajú, t.č. technické mož‐nosti stále predbiehajú klinické využitie – ďalší výskum, štúdie, tvorba protokolov a guidelines sú potrebné a prospešné

• Oprieť sa o publikované skúsenosti, doporučené protokoly (využiť odporúčané a overené kombinácie MoAb: typ fluoresenčnej farbičky, ale aj klon), o výsledky štúdií, centrá

• „Byť pripravený“ technicky, teoreticky, personálne, ... 

37Poznámka

POĎAKOVANIE:

MUDr.A.Wild – odb.garant CLK-Lab.hematológiaMgr.P.Kružík – Beckman CoulterIng.R.Vlček – Beckman Coulter