A molekuláris genetikai vizsgálatok szerepe a Landsteiner ...
Molekuláris genetikai-genomikai módszerek
description
Transcript of Molekuláris genetikai-genomikai módszerek
![Page 1: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/1.jpg)
Molekuláris genetikai-genomikai
módszerek
Falus András
![Page 2: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/2.jpg)
POLIMORFIZMUS
Egy populáción belüli
genetikailag meghatározott különbség
![Page 3: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/3.jpg)
Genomvariációk
Polimorfizmus
Deléció
Inszerció
Kromoszóma
Transzlokáció
Variációk
Gyakori szekvencia
![Page 4: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/5.jpg)
Variációs típusok
Nagyméretű: – Kromoszóma számbeli– Kromoszóma átrendeződések, kromoszómaszegment
duplikációk, és deléciókKözepes:– Szekvencia ismétlődések (repeatek)– Transzpozonok– Kis deléciók, szekvenciális és tandem repeatek
(mikroszatelliták)Kicsi:– Single Nucleotide Polymorphisms (SNP-k)– Egyetlen bázis érintő inszerciók és deléciók (indelek)
![Page 6: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/6.jpg)
SNP
![Page 7: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/7.jpg)
Mi az SNP (Single Nucleotide Polymorphism)?
ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT ATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGT snp snp
Az SNP-k replikációs hiba vagy DNS károsodás révén jönnek létre.
Ugyanahhoz a fajhoz tartozó két egyed közöttegyetlen bázis eltérése ugyanabban a DNS
pozícióban, gyakoriság >1 % .
![Page 8: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/8.jpg)
Az SNP-k típusai
• Génben lévő, kódoló SNP-k– Nem-szinoním
• Fenntartja vagy megváltoztatja a fehérje szerkezetét/funkcióját
– szinoním• Fenntartja vagy megváltoztatja a splicing-ot
• Génben lévő, nem-kódoló SNP-k– Szabályozó/Regulációs SNP-k
• Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót
– Intronban lévő SNP-k• Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót/splicing-ot
• Kapcsolt SNP-k (túlnyomó számú)– Rendszerint gének közöttiek (intergenikusak)
![Page 9: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/9.jpg)
Az SNP-k megváltoztathatják vagy változatlanul hagyhatják a fehérje szerkezetét
Fehérjeleucinról leucinra
Nincs változás a fehérje
szerkezetében
RNS kodonCUC-ról CUG-re
DNS SNPC-ről G-re
LeucinLeucin
mRNS
![Page 10: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/10.jpg)
SNP térképek
• Sok ember genomjának szekvenálása
• A bázissorrendek összehasonlítása az SNP-k
felderítése céljából
• Egy olyan humán genomtérkép elkészítése, ami az összes SNP-t tartalmazza = ez az SNP térkép
• Emberi genomban ~10.000.000 SNP (1/300)
![Page 11: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/11.jpg)
SNP térképek
Az összes szekvenált kromoszóma
Az összes regisztrált SNP
SNP pozíció
![Page 12: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/12.jpg)
SNP Profil/Mintázat
• Minden egyes ember genomja egy sajátos SNP mintázatot hordoz.
• Az emberek SNP profiljuk/mintázatuk alapján csoportosíthatók.
• Az SNP profilok fontosak a gyógyszeres terápiában a válaszkészség meghatározásában.
• Kapcsolat lehet bizonyos SNP profilok és egy bizonyos kezelésre adott meghatározott válaszreakciók között.
![Page 13: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/13.jpg)
Betegség iránt fogékony populáció
Az összes egyed genotipizálása sok ezer SNP-re
ATGATTATAG ATGTTTATAG
Az összes rezisztens személynek A van az X gén 4-es pozíciójában, míg minden fogékonynak T van ugyanabban
a pozícióban
génX
Rezisztens populáció
![Page 14: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/14.jpg)
SNP Profilok
![Page 15: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/15.jpg)
AZ SNP-k felhasználása
• Génazonosítás és –térképezés
• Diagnosztika/kockázat becslés• • A válaszreakció megbecslése
• Homogenitás vizsgálat/kísérlet tervezés
• A gén funkciójának azonosítása
![Page 16: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/16.jpg)
Az SNP adatok felhasználása
• Evolúciós vizsgálatok Különböző polpulációk evolúciós történetének felderítésére
• „DNS ujjlenyomat”készítés Apasági vizsgálatok, bűnügyek
• Markerként használhatók poligénes jellegek térképezése során• Genotípus specifikus gyógykezelés
• A legtöbb gén SNP-ket tartalmaz – A gének 93%-ának egynél több SNP-je van– 39%-uk 10-nél több SNP-t tartalmaz!
![Page 17: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/17.jpg)
Van-e összefüggés a marker megléte és a betegség között?
Betegségre hajlamosKontroll
Betegségre nem fogékony
Allél 1 Allél 2
Az A marker összefüggést mutat
a fenotípussal
A Marker :
Allél 1 =
Allél 2 =
![Page 18: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/18.jpg)
![Page 19: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/19.jpg)
Következtetés korábbi adatokból és megfigyelésekből
Patient 1Patient 2Patient 3Patient 4Patient 5Patient 6Patient 7Patient 8Patient 9Patient 10Patient 11Patient 12
Good responseNo responseNo responseGood responseNo responseNo responseGood responseGood responseGood responseGood responseNo responseNo response
ATGCTTCCCTTTTAAAATTGTTCCCTTTTAAAATTGTTGCCTTTTAAAATGGTTGCCTTTTAAAATAGTTGCCTTTTAATATAGTTGCCTTTTAATATGATTGCCTTTTAAAATGATTGGCTTTTAAAATGTTTCGCTTTTAAAATGTTTTGCTTTTAAAATTTTTTGCTTTTAAAATCTTTTGCTTTTAAA
SNP: single nucleotide polymorphism
Good response
Good responseGood responseGood responseGood response
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
![Page 20: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/20.jpg)
Következtetés előre; ki fog jól válaszolni a gyógyszerre?
From McLeod and Evans, Ann Rev of Pharmacol and Toxicol, 2001: 41,101-121
GCCCACCTC
GCCCGCCTC
![Page 21: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/21.jpg)
A farmakogenomika nagy igérete• "Pharmacogenomics will
radically change the manner in which we develop drugs."
• "Soon, we will be able to get the right drug into the right patient."
• "Applying pharmacogenomics to drug development will cut cycle times to 1.5 - 2 years."
• "Pharmacogenomics will be able to bring removed drugs back on the market, by predicting who is susceptible to adverse events."
Közel vagyunk???
![Page 22: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/22.jpg)
REPEATS
![Page 23: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/23.jpg)
TRINUKLEOTID (TRIPLET) REPEAT BETEGSÉGEK
A trinukeotid repeatek nagyon gyakori szekvenciák - a legtöbb nem kapcsolódik betegséggel - sok közülük polimorf (változik a repeatek száma)
Két fő típusuk van - Nem-kódoló eltérő mechanizmusúak
- Kódoló poliglutamin polialanin
![Page 24: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/24.jpg)
![Page 25: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/25.jpg)
Poliglutamin Polialanin betegségek
• Neurodegeneratív betegségek
• Különböző fehérjék
• Funkciónyerés
• Változó hosszúság
• Expanzió
• Replikációs csúszás
• CAG vagy CTG repeat
• Fejlődési rendellenességek • Transzkripciós faktorok • Funkcióvesztés
• +/- Konstans hossz • Állandó
• Egyenlőtlen crossing over
• GCA, GCT, GCG, GCC repeatek - nem teljesek
![Page 26: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/26.jpg)
a/ feltüntetett repeatszámok a normális tartományra jellemző értékek;b/ zárójelben az érintett fehérjék neve szerepel
(huntingtin)
= kódoló szakaszban = nem kódoló szakaszban
(Huntingtin)
![Page 27: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/28.jpg)
MATLEKLMKAFESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPPPP
PPPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHRPK
KELSATKKDRVNHCLTICENIVAQSVRNSPEFQKLLGIAHELFLLCSDD...
HUNTINGTIN
350 kD fehérje
10-11 kb transzkriptum
mindenütt expresszálódik
ismeretlen funkció összefüggés a repeat-számés a betegség kezdete között
Huntington’s DiseaseCollaborative Research
Group 1993 nyomán
![Page 29: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/29.jpg)
PCR
![Page 30: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/31.jpg)
Q-PCR
![Page 32: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/32.jpg)
![Page 33: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/34.jpg)
MICROARRAY-CHIP
![Page 35: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/35.jpg)
![Page 36: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/36.jpg)
Összehasonlító hibridizáció
Két különbözőbiológiai forrás(pl. beteg/egészséges)
![Page 37: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/37.jpg)
Microarray OverviewMicroarray Overview
Prepare FluorescentlyPrepare FluorescentlyLabeled ProbesLabeled Probes
ControlControl
TestTest
Hybridize,Hybridize,WashWash
MeasureMeasureFluorescenceFluorescencein 2 channelsin 2 channels
redred//greengreen
Analyze the dataAnalyze the datato identifyto identifypatterns ofpatterns of
gene expressiongene expression
![Page 38: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/38.jpg)
Diffúz nagysejtes B sejt lymphoma
•Szövettani•Immunológiai•PCR (egyes gének) módszerrel
Eddig nem voltdiff. diagnózisa:
![Page 39: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/39.jpg)
A melanoma máj metastasis prediktor génkészlete
Előre jelezni melyik melanomás betegnek lesz májáttétje??
![Page 40: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/40.jpg)
Az egyes betegek mintáiból készült mikroarray-k
Az adatok számítógépes csoportosítása
Minták (X-tengely)
Gének(102 -103)
Diagnózis, megelőzés, terápia meghatározása
Prediktor gének kiválasztása
A betegségre nézve szelektív mikroarray fejlesztése
A mikroarray orvosi gyakorlatban való felhasználásának elvi háttere
![Page 41: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/41.jpg)
![Page 42: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/42.jpg)
SINGLE-BASE EXTENSION
![Page 43: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/43.jpg)
3’ 5’
PCR target
SNP site
Labeled terminating NTP
TagSNP primer
5’
3’ 5’
SNP Primer
Tag complement forHybridization capture
Substrate (spot on plate)
Denature & Hybridize
Primer Extention
![Page 44: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/44.jpg)
![Page 45: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/45.jpg)
http://www.dgci.sote.hu/microarray
http://www.dgci.sote.hu/snpcore
![Page 46: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/46.jpg)
![Page 47: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/47.jpg)
![Page 48: Molekuláris genetikai-genomikai módszerek](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062513/56814e4a550346895dbbd029/html5/thumbnails/48.jpg)