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Molekularbiologischer Metastasen-
nachweis beim Prostatakarzinom (PCa)
Dr. U. Fiedler
Urologisches Forschungslabor
Klinik und Poliklinik für Urologie
Universitätsklinikum der TU-Dresden
Metastasierung beim PCa
Ansiedlung in:Ansiedlung in:
Lymphknoten 69 %
Knochen 68%
Lunge 48%
Leber 33%
Ausbreitung über:Ausbreitung über:
Lymphbahnen
peripheres Blut
Eble 1993
Diagnose der Metastasierung
Prä-operativ:Prä-operativ: Tumormarkerbestimmung (PSA)
Bildgebende Verfahren (Knochenszintigraphie, PET, CT, MRT, Immunszintigraphie)
Post-operativ:Post-operativ: Histopathologische Begutachtung (Gewebe)
Immunhistochemie (anti-PSA-Antikörper)
Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA >20 ng/ml
Wahrschein-lichkeit %
cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0
10
20
30
40
50
60
2-45
67
8-10
Gleason-Score
klinisches Tumorstadium Partin 1997
Partin-Tabelle zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls, PSA 10,1-20 ng/ml
cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0
10
20
30
40
50
2-45
67
8-10
Wahrschein-lichkeit %
Gleason-Score
klinisches Tumorstadium Partin 1997
Partin-Tabellen zur Beurteilung des Lymphknotenbefalls
Partin 1997
cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0
10
20
30
40
50
2-45
67
8-10
Wah
rschein
-lic
hkeit %
Gle
ason
-sc
ore
klinisches Tumorstadium
PSA 10-20 ng/ml PSA >20 ng/ml
cT1a cT1b cT1c cT2a cT2b cT2c cT3a0
10
20
30
40
50
60
2-45
67
8-10
PSA-Serumwerte und pathologische Skelettszintigraphie
Serum-PSA-Wert ng/ml
nossäreMetastasierungnegativ (%)
ossäreMetastasierungpositiv (%)
0,1- 4,0 89 100 0
4,1-10,0 118 100 0
10,1-20,0 99 99 1
20,1-50,0 99 93 7
50,1-100 60 62 38
>100 56 29 71
Oesterling 1993
Sensitivität des Lymphknoten-Stagings
CT 22 %
MRT 26 %
OP+SS 80 %
Beer 1992
Immunszintigraphie 52 %
62 % Lamb 1998
Entwicklung molekularbiologischer Techniken
Nachweis von Tumorzellen im Blut,Knochenmark und Lymphknoten
ZIEL:ZIEL: Verbesserte Diagnostik der Metastasierung bei unterschiedlichen PSA-Werten
Verbesserte Diagnostik des entnommenem LK- Gewebes gegenüber der Histopathologie
Verbesserte Verlaufskontrolle gegenüber der Bestimmung von Serum-PSA
Möglichkeiten des Nachweises von PCa-Zellen
NachweisebenenNachweisebenen
• DNA
• mRNA
• Proteine
Molekularbiologische Marker und Techniken für das PCa
• Cytokeratin
• PSA, PSMA
• Amplifikation von Chr. 7 Deletionen von 13q, 10q,
16q
• Immunzytologie, FACS, Immunomagnetische Separation
• RT-PCR
• FISH, Allelverlust- analysen, GCH
mRNAmRNA
ProteineProteine
DNADNA
Techniken verwendete Marker
Molekularbiologische Verfahren und Marker für das PCa
prostataspezifisch: PSA, PSM, DD3tumorspezifisch: Telomerase, PTI
chrom. Zugewinne: Chromosom 7, 8
Tumorsuppressorgene E-cadherinbeim Metastasierung: KAI-1
PTEN
Allelverluste: 8p, 10q, 16q
Verfahren
RT-PCR
FISH/GCH
LOH’s
differentielle Genexpressionsmuster
Marker
Immunomagnetische Tumorzellanreicherung
Erhöhung der Sensitivitätdes Nachweises durch Anreicherung
Positivselektion(anti-epithelialer-AK)
Negativselektion(panleukozytärer-AK CD45)
Immunzytologische Nachweistechniken
Immunzytologie FACS Immunomagn. Sepa.
FITC
S P
E
Untersuchung von chromosomalen Veränderungen von Tumorzellen im Blut
und Knochenmark (FISH, GCH)
Universitätsklinikum Dresden
bei 85% der Pca-zellen im Knochenmark wurden chromosomale Aneusomien (z. b. tri- oder tetrasomie der Chromosomen 7 und 8 nachgewiesen.
Untersuchungen zu LOH’s im Blut und Plasma
Universitätsklinikum Dresden
Nachweis von spezifischen Transkripten mittels RT-PCR
Isolierung der Mononukleären Blutzellpopulation
Dichtegradientenzentrifugation evtl.
Konzentrierung über magnetic beads
Zellaufschluß
Isolierung der Gesamt-RNA
Umschreibung in cDNA
Transkript-spezifische PCR
Universitätsklinikum Dresden
Probleme der RT-PCR
AAAmRNA
cDNA
PCR
AAAAAA
AAATTT
Kontroll-PCR: GAPDHPrimerauswahlSpezifität
Nachweis spezifischer Transkripte mittels RT-PCR
Isolierung und Aufschluß der
Leukozyten-Fraktion
Aufschluß des Lymphknoten- Gewebes
Isolierung der Gesamt-RNA
Umschreibung in cDNA
Transkript-spezifische PCR
AAAmRNA
cDNA
PCR
AAAAAA
AAATTT
Entwicklung eines Testsystems basierend auf der RT- PCR
Primerauswahl:Primerauswahl: Exonübergreifend (DNA-Verunreinigung)keine Homologien zu anderen Transkripten
Kontroll-PCR‘s:Kontroll-PCR‘s: für RNA-Qualität und -Präparation sowiecDNA-Synthese standardisierte pos. und neg. Kontrollen
Reaktionsprodukte:Reaktionsprodukte: Spezifitätsprüfung durch Sequenzierung, Hybridisierung oder Hybridisierungsproben
Quantifizierung:Quantifizierung: on line in der log. Phase der PCR
Exon Exon
Nachweis disseminierter PCa-Zellen im Blut
PSA/PSMA -RT-PCR
keine eindeutige Korrelation zwischen RT-PCR und Metastasierung
Das Prostata Spezifische Membranantigen (PSM)
extr.
cyt.
Nachweis von PCa-Zellen im Knochenmark
Stadium Patienten Mikrometastasen %
pos. Knochen-
Metastasen
14 14 100
pos. LK-Metastasen 9 7 77
organbegrenzt 31 9 29
organüberschreitend 32 20 63
gesamt 86 50 58
BPH 25 0 0
Wood 1994
Nachweis von PCa-Zellen in regionären Lymphknoten
Universitätsklinikum Dresden
Anzahl PSA-RT pos. PSA-RT neg.
Prostatatumor-
Patienten
54 17 37
pos.
Lymphknoten
16 12 4
neg.
Lymphknoten
38 5 33
Nierentumor-
Patienten
3 0 3
Sensitivität: 75 % Spezifität 87 %
Zusammenfassung
Methoden:Methoden: RT-PCR, Immunzytologie
Marker:Marker: prostata-bzw. tumorzellspezifisch
Korrelationen:Korrelationen: Histopathologie - RT-PCR (LK) Tumorstadium - RT-PCR (Knochenmark)
Probleme:Probleme: spezifische Marker
Mitarbeiter des urologischen Forschungslabors
Prof. Dr. M. P. Wirth
Dr. Ulrike FiedlerWibke EhlersBirgit NoackAscan SchindlerJörg StadeRomy KranzJana ScholzeSilke StrangfeldAstrid Bergmann
Universitätsklinikum Dresden