Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation...Späte Genexpression-allgemeine...
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Genexpression von DNA-Viren
Sommersemester 2006
Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation
Elisabeth SchwarzDKFZ
13. Juni 2006
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Erhalt eines Virus als infektiöse Einheit
> Vermehrung (Replikation)> produktive Infektion
dazu notwendig:Expression der viralen GeneReplikation des VirusgenomsBildung neuer Viruspartikel
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Phasen einer produktiven Virusinfektion
Attachment/Adsorption/Anheftung:zelluläre Rezeptorenvirale Proteine (Envelope oder Capsid)
Penetration: rezeptorvermittelte EndozytoseMembranfusion
Uncoating: Freisetzung der viralen NucleinsäureReplikation: Expression der viralen Gene
Replikation des VirusgenomsSynthese der Virionkomponenten
Assembly/Morphogenese/ReifungRelease/Freisetzung:
LyseBudding/Knospung
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Virusinfektion - verschiedene Möglichkeiten
Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtszelle entscheiden überVerlauf einer Virusinfektion
Grundvoraussetzung: suszeptible Zellen (= infizierbare Zellen)Gegensatz: nichtsuszeptible Zellen (nicht-infizierbar)
permissive Zellen - produktive Infektion (>Lyse)nicht-permissive Zellen - abortive Infektiontransient-permissive Z. - restriktive (restringierte) Infektion
Persistente (persistierende) Infektion:Latente Infektion: Persistenz des viralen Genoms, aber keine Bildung
infektiöser PartikelChronische Infektion: Viruspersistenz mit Bildung infektiöser Partikel
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Zum Aufbau der Vorlesungsstunden
· Genexpression und Genomreplikation sindvoneinander abhängige und koordiniert ablaufendeProzesse
· Trennung in zwei Vorlesungsteile: um jeweils spezifische Probleme und Problemlösungendeutlich zu machen (an Beispielen)
· damit verbinden: Beschreibung der einzelnen Familien von DNA-Viren
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DNA-Viren
© Principles of Virology, 2004
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Viren als obligate intrazelluläre Parasiten
abhängig von Faktoren der Wirtszellen:Grundbausteine (Aminosäuren, Nucleotide)
TranslationsapparatTranskriptionsapparat
Replikationsapparat
nicht alle Faktoren sind zu jeder Zeit und an jeder Stelle verfügbar
räumliche Aufteilung: WO?zeitliche Aufteilung: WANN?
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Genomreplikation und Genexpression
Zeitlicher Verlauf:Alle DNA-Viren benötigen für Genomreplikationmindestens ein virales Protein
Genexpression vor DNA-Replikation
Synthese von Capsidproteinen zur Verpackung der neusynthetisierten DNA
Genexpression während DNA-Replikation
Proteinmengen:Regulatorproteine vs. Capsidproteine
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Stufen der viralen Genexpression
früh (early, E) spät (late, L)
Early-late switch
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Genexpression von DNA-Viren- Allgemeine Betrachtungen -
• Regulation von früher und später Phase erfolgthauptsächlich auf Ebene der Transkription
• Synthese der viralen mRNAs erfolgt durch zelluläreRNA-Polymerase II
• Ausnahme: PockenvirenVoraussetzungen:virale DNA trägt Signalelemente, die von zellulärer Transkriptions-maschinerie und Regulationsfaktoren (Aktivatoren, Repressoren) erkannt werden
Studium von Viren führt zu Erkenntnissen über die WirtszellenVirusgenom im ZellkernVorhandensein der benötigten zellulären Transkriptionsfaktoren inden infizierten Zellen
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Eukaryote Transkription: Initiation
TFIID: TBP + TAFs(TBP-assoziierte Faktoren)
TFIIH: Helikase + Kinase(CTD Phosphorylierung)
Transkriptionsaktivatorenund Repressoren
Allgemeine Transkriptions-faktoren (TFIIs)
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Genexpression von DNA-Viren:Virale Transkriptionsfaktoren
• Transkription der viralen Gene erfolgt in festgelegter zeitlicher Reihenfolge
• Regulation durch virale Transkriptionsfaktoren• verstärkte Synthese viraler mRNAs• early-late switch• Autoregulation (Aktivierung, Repression)• Kooperation mit zellulären Faktoren• DNA-bindend / nicht DNA-bindend
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Späte Genexpression- allgemeine Betrachtungen -
• Späte Proteine (Capsidproteine) werden in großen Mengen benötigt zur Bildung neuer Virionen
• große Mengen fremder Proteine sind meist toxisch für Zellen• zu frühe Synthese würde Effizienz der Virusvermehrung vermindern• Problemlösung:
Kopplung der späten Genexpression an die virale DNA-Replikation– Inhibition der viralen DNA-Replikation verhindert auch späte
Genexpression• Replizierte virale DNA:
– Matrize für weitere Replikation– Matrize für Transkription– Genom zum Verpacken
• Mechanismen für DNA-replikationsgekoppelte Aktivierung der späten Transkription noch wenig bekannt
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Genexpression von DNA-Viren
Beispiele in Vorlesung:
Regulation der frühen viralen Genexpression– Polyomaviren: SV40 T-Antigen– Adenoviren: Adenovirus E1A
Early-late-switch und späte virale Genexpression– SV40– Adenovirus– Papillomviren
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Stufenweise Genexpression beiSV40, Adenovirus und Herpesvirus
SV40
Adeno
HSV
early >late
immediate early >early >late
Virion protein >immediate early >early >late
© Principles of Virology, 1999, 2004
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Polyomaviren• 12 Viren bekannt, enger Wirtsbereich• produktive Infektion nur in Zellen des natürlichen Wirts• Transformation nicht-permissiver Zellen• Genom: zirkuläre dsDNA, ca. 5000 bp• Virionen: Ikosaeder, Durchmesser ca. 40 nm
Polyomavirus• zuerst entdecktes Virus der Polyomaviren (1953, Ludwik Gross)• Arbeiten mit Mäuse-Leukämievirus: einige Mäuse entwickelten Tumoren derSpeicheldrüsen (und keine Leukämien)
• Zwei-Viren-Hypothese, Isolierung des zweiten Virus• Virus ruft viele andere Tumoren hervor: Name Polyomavirus (1958)• Tumorbildung nur bei Inokulation in neugeborene Labormäuse,
bei erwachsenen Mäusen keine Poloymavirus-Erkrankungen• Infektion von embryonalen Mauszellen (permissiv):lytische Infektion > Analyse des produktiven Infektionszyklus
• Infektion von Maus- und Hamsterzellen (semipermissiv):Zelltransformation > Analyse der Zelltransformation
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Polyomaviren: SV40SV40 = Simian virus 40• Entdeckung von SV40: Nebenprodukt bei Arbeiten mit Poliovirus (1960; Sweet and Hilleman)
• Polio-Impfstoff (Salk-Vakzine) aus Rhesus-Affennierenzellen (Verwendung von menschlichen Zellen war verboten wg. möglicher Gefahr eines nicht bekannten Tumorvirus)
• Inaktivierung der Polioviren mit Formalin• Test des Impfstoffs:
Zellkulturen: kein cytopathischer EffektInjektion in neugeborene Hamster:
Tumoren (Latenzzeit 4-10 Monaten)• neues Virus: Infektion führt in Affennierenzellen zu Bläschenbildung
> Simian vacuolating virus 40 = SV40• Transformation von Zellen• keine Erkrankungen und Tumoren im natürlichen Wirt (Affe)• keine erhöhte Tumorrate bei Polio-Geimpften
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Beiträge von Polyomaviren zur Molekularbiologie
• Struktur von superhelikaler DNA• SV40 DNA als Minichromosom: DNA + Histone,Nucleosomenstruktur
• eukaryote DNA-Replikation• eukaryote Replikationsursprünge
• Mechanismen der negativen und positivenRegulation der Genexpression
• Enhancer und Promotor• alternatives Spleißen
• Mechanismen der Onkogenese• Onkogene und Tumorsuppressorgene• Regulation des Zellzyklus
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SV40 in permissiven (A) und nicht-permissiven (B) Zellen
© Molecular Cell Biology, 1995
A BA B
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VP2
VP3
VP1
L-TAg
s-TAg
SV40
früheRegion
späteRegion
ori/Transkriptionskontrollregion
frühemRNAs
spätemRNAs
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SV40 frühe Genexpression• Frühe Transkription zunächst ausschließlich durch
zelluläre Faktoren• alternatives Spleißen der frühen mRNAs:
• L-T (708 AS) und s-T (174 AS)• N-terminale 82 AS gemeinsam
• s-T (small t-Ag, kleines t-Antigen): Wachstumsstimulation, Akkumulation von Virus-DNA im Kern, nicht notwendig für produktive Infektion in Zellkultur
• L-T (large T-Antigen, großes T-Antigen):multifunktionales Protein,DNA-Replikation, Regulation der frühen und späten Transkription, early-late switch
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SV40 L-Tintrazelluläre Lokalisation:im Kern (95 %); NLS (bei L-T erstmals identifiziert)an Plasmamembran (5 %)5-10 x 105 Moleküle pro lytisch infizierter Zelle
DNA-Bindung an GAGGCBindungsstelle I: Autoregulation der frühen viralen TranskriptionBindungsstelle II (ori): DNA-Replikation
Komplexbildung mit zellulären Proteinen•DNA-Polα/Primase: DNA-Replikation•pRB, p53, Coaktivator p300, TBP, TEF-1, AP-2
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in früher Phase (niedrige L-T-Konzentration):Aktivierungunabhängig von DNA-Bindung von L-Tunabhängig von Kernlokalisation von L-T
Regulation des frühen Promotors durch SV40 L-T
in später Phase (höhere L-T-Konzentration): Repression•Bindung an Bindungsstelle I•stört Zusammenbau des Transkriptionsinitiations-Komplexes
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SV40 Enhancer
72-bp repeat:•Enhancer für frühen Promotor (Enhancer-Konzept, 1980)•Bindungsstellen für zelluläre Transkriptionsfaktoren:TEF, AP-1, NF-κB
•ubiquitär aktiv (>Expressionsvektoren)
TATA-Box (Chambon, 1980)
21-bp repeat:GC-reich, Sp1-Bindungsstellen (CCGCCC)
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Early-late switch und späte Genexpressionbei Polyomaviren
Änderung der frühen Genexpression:• Startstellen verschieben sich von early-early-Position (EE) zu late-early (LE)
• längere 5‘-Enden• vor T-Antigen-ORF ein kleiner ORF für early-leader protein (ELP, 23 aa)
• ELP-ORF vermindert Translationsstartan T-Ag-Startcodon
Transkription der späten Gene:• Start am späten Promotor (keine TATA-Box): heterogene 5‘-Enden
Aktivierung:• Amplifikation der Genom-DNA durch DNA-Replikation• T-Antigen:
•unabhängig von DNA-Bindung von T-Ag•wahrscheinlich durch Modifikation zellulärer Faktoren•kein T-Ag in späten Transkriptionskomplexen vorhanden
• „Verdünnen“ von zellulären Repressoren
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Regulation des späten SV40-Promotors durch zellulären Repressor (Ibp-Protein)
Ibp bindet im Bereich desspäten Promotors(Ibp: initiator-binding protein,Steroid-Thyroidhormon-RezeptorFamilie)
Frühe Phase:[Ibp] > [Genom]wenige DNA-MoleküleIbp blockiert späten Promotor
Späte Phase:[Ibp] << [Genom]ansteigende Genom-Mengezu wenig IbpBlockade entfällt© Principles of Virology
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DNA-Viren:Stufenweise Genexpression
SV40
Adeno
HSV
early >late
immediate early >early >late
Virion protein >immediate early >early >late
© Principles of Virology, 1999, 2004
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Adenoviren: Genexpression• Genom ca. 35 kb
• 5 frühe Transkriptionseinheiten mit jeweils mehrerenalternativ gespleißten mRNAs: E1A, E1B, E2, E3, E4
• eine späte Transkriptionseinheit (MLTU: major late transcription unit)
• Strang und Gegenstrang enthalten kodierende Informationen
• Erhöhen der Kodierungskapazität durch differentiellesSpleißen(Spleißen entdeckt bei Studium von Adenovirus-mRNAs)
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Adenoviren: gespleißte mRNA
© Molecular Cell Biology 2004
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Adenovirenfrühe und späte mRNAs
E3
E4E2
E1
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AdenovirenZiele der frühen Genexpression
• Herstellung einer optimalen Umgebung für Virusreplikation: Induktion der S-Phase: E1A x pRBApoptoseblock:
E1B-55K: Bindung an p53E1B-19 kd (wirkt ähnlich wie Bcl-2, verhindert Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien)
• Synthese viraler Genprodukte für virale DNA-Replikation (E2)
• Synthese viraler Genprodukte, die antiviraleVerteidigungsstrategien des Organismus blockieren (E3 und E4)
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Adeno E1A-Einheit• als erste exprimiert: immediate early• konstitutiv aktiver Promotor• mehr als 20 Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren• Transkription zunächst unter Kontrolle zellulärer Transkriptionsfaktoren
• später: Autoaktivierung durch E1A (289 aa)• in späteren Phasen: Autorepression durch E1A
(289 aa und 243 aa)
E1A-mRNAs und -Proteine:• 13S-RNA (ca. 1000 b): 289 aa (CR1 + CR2 + CR3)• 12S-RNA (ca. 900 b): 243 aa (CR1 + CR2)zusätzlich:• 11S (217 aa), 10S (171 aa), 9S (55 aa)
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Adeno E1AAktivierung der Transkription aller viraler Gene
• E1B, E2, E3, E4: delayed early• ML (major late)
Induktion von S-Phase: E1A x pRB
Transkriptionsregulation durch E1A:• keine DNA-Bindung• Interaktion mit anderen Proteinen:
• TBP: Aktivierung über TATA-Box• Coaktivator p300: Repression von Enhancern• YY1: Aufhebung der YY1-vermittelten Repression• pRB: Freisetzung von Transkriptionsfaktor E2F
(Adeno E2-Promotor: Name für E2F)
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Protein-Interaktionen
von E1A• radioaktive Markierung der Proteine• Immunpräzipitation mit Antikörpern gg. SV40 T (PAb416) oder E1A(αE1A)
• Gelelektrophorese (publ. 1986)
Adeno-negativKontrolle:
Adeno-E1-transformiert
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Adenoviren: early-late switchEarly-late switch• Reduktion der frühen Genexpression
• Aktivierung der Transkription von:• IVa2, pIX• major late transcription unit(MLP)
pIX:• pIX-Gen überlagert von E1B-Transkriptionseinheit• pIX-Promotor blockiert, solange E1B transkribiert wird (promoter occlusion)• pIX-Promotor wird zugänglich, wenn [DNA] und E1B .• pIX-Protein: assoziiert mit Hexoncapsomeren.
E1A IVa2 DNA-Replikation
IVa2:• Aktivierung wahrscheinlich durch „Verdünnen“ eines zellulären Repressors
• sequenzspezifischer Transkriptions-aktivator für späten Promotor
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Adenoviren: späte GenexpressionMajor late transcription unit:• Transkriptionsstart an major late promoter (MLP)• Primärtranskript ca. 30.000 Basen (Genomlänge ca. 36 kb)
RNA-Prozessierung:diff. Spleißendiff. poly(A)-Stellendreiteilige nichtcodierende„leader“-Sequenz• 18 verschiedene mRNAs• 5 RNA-Familien L1-L5• RNAs einer Familieterminieren an gleichempoly(A)-Signal
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AdenovirenTermination der späten Transkripte
Frühe Phase:• unvollständige Elongation und frühzeitige TerminationSpäte Phase:• vollständige Elongation und Termination, abhängig von replizierter viraler DNA
• selektiver Transport der späten viralen mRNAs ins Cytoplasma(E1B-55K + E4-34K)
• selektive Translation der späten viralen mRNAs(Inaktivierung von eIF-4F, cap binding complex; noch vorhandenes aktives eIF-4F wird von dreiteiligem leader gebunden)
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Papillomaviruses• DNA viruses• icosahedral capsids(diameter 55 nm)
• circular dsDNA(6800-8400 bp)
• host species-specificity• replication in squamousepithelial cells
Animal papillomaviruses: • bovine papillomavirus (BPV)• cottontail rabbit papillomavirus (CRPV)
Human papillomaviruses (> 100 genotypes):• cutaneous HPV types: warts (papillomas)• mucosal HPV types: condylomata, carcinomas
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Human PapillomavirusesCutaneous HPV types• HPV1, 2, u.a.• Infections of keratinized epithelia = skin• Skin warts (papillomas) = benign tumors
A: Verrucae vulgares (common warts)B: Verrucae plantares (plantar warts)C: Verrucae planae (flat warts)
A B
C
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Verruca plana (links)
Condyloma acuminatum(rechts)
HPV-Virionenin infizierten Zellen
NC
HPV-infizierte Plattenepithelien
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Papillomviren und KrebsZervixkarzinom (Gebärmutterhalskrebs, cervical carcinoma)Mehrstufenprozess der Krebsentstehung:• persistierende „high-risk“ HPV-Infektion•„high risk“-HPV-Typen: HPV16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73, u.a.[„low risk“-HPV-Typen: HPV6, HPV11 (Genitalwarzen)]• Nachweis von „high-risk“ HPV-DNA in fast 100 % aller Gebärmutterhalstumoren und in Tumorzell-Linien
•„high risk“ HPV-Onkogene E6 und E7:– Expression in Krebszellen– Inaktivierung von Tumorsuppressorproteinen (pRB, p53)– Immortalisierung und Transformation von Zellen
• Aktivierung von Onkogenen• Integration der HPV-DNA in das Zellgenom• Genominstabilität, Aneuploidie
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normale ZellenKoilozyten
CIN III
Karzinom
Zytologische Untersuchung von Zellabstrichen (Papanicolau) undEpithelveränderungen bei HPV-bedingterKarzinogenese
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Papillomviren: Abhängigkeit der viralen Genexpression und DNA-Replikation
vom Differenzierungszustand der Wirtszellen
Fehrmann and Laimins, Oncogene, 22, 5201 (2003)
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Papillomavirusesearly and late genes and gene functions
E6
E7 E1 L2L1E2
pearly pAe pAl
early transcriptslate transcripts
E6: ~150 aa, transactivator, oncoprotein, p53 degradationE7: ~100 aa, oncoprotein, inactivation of pRB and p21 CDKI E1: ~650 aa, replication factor (ori binding) E2: ~360 aa, viral activator/repressor, replication factor (ori binding)
L2: ~470 aa, minor capsid proteinL1 : ~530 aa, major capsid protein
E6E7
E1
E2L2
L1URR
po
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Papillomviren(HPV31)
Frühe ProteineE6: Hemmung der Apoptose,
Onkoprotein, p53E7: Induktion S-Phase,
Onkoprotein, pRBE1: DNA-ReplikationE2: Transkriptionsfaktor,
DNA-ReplikationE5: Wachstumsfaktor
Späte ProteineL1: CapsidproteinL2: Capsidprotein
alternatives Spleißen!
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HPV16-Genexpression in infizierten Gebärmutterhalsepithelien(LSIL: low grade squamous intraepithelial lesion)
Middleton et al., J. Virol, 77, 10186 (2003)
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Productive HPV Infection
Middleton et al. (2003)J. Virol., 77, 10186-10201,
Figure 2
E6, E
7 (E
1, E
2, E
4, E
5)
E4 (E
2, E
1, E
5)
S-ph
ase
com
pete
nt
• Access to basal layer• Establishment as a low-copy-number episome• E7 expression (red circles)• uninfected/nonpermissive cells (blue circles)• E4 expression (green cells)• L1+L2 expression (orange nuclei)
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HPV-Genexpression bei produktiver HPV-Infektion
HPV-Genexpression in Krebsvorstufen
(alle HPV-Typen)
(„high-risk“ HPV-Typen)