Moleküler biyoloji
description
Transcript of Moleküler biyoloji
MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ II
UYGULAMA KİTABI
MBG603
MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK BÖLÜMÜ
Dr. Neslihan Ergen
2
GENEL KULLANIM İÇİN HAZIRLANMASI GEREKEN STOK SOLÜSYONLAR
RNase-free steril distile su (DEPC-treated water) : 2 litre
Her 100 ml su için 0.1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) eklenir ve çeker ocak altında
gece boyu karıştırılarak tamamen çözünmesi sağlanır. Daha sonra otoklavlanarak DEPC’nin
deaktive edilmesi gerekmektedir.
% 70 EtOH (v/v) : 100 ml
70 ml absulut etanole 30 ml steril RNase-free distile su eklenerek hazırlanır.
% 75 EtOH (v/v) : 100 ml
75 ml absulut etanole 25 ml steril RNase-free distile su eklenerek hazırlanır.
% 10 SDS (w/v) : 100 ml
10 gr SDS 80 ml distile su içerisinde gece boyu karıştırarak çözülür.
Hacim yine distile su kullanılarak 100 ml’ye tamamlanır.
Oda sıcaklığında saklanmalıdır.
0.5 M Tris (pH 6.8) : 100 ml
6 gr Tris bazı 60 ml distile su içerisinde çözündükten sonra 6 N HCl kullanılarak pH’sı
6.8’e ayarlanır. Hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlandıktan sonra otoklav ile steril edilerek
saklanır.
0.5 M Tris (pH 7.5) : 100 ml
6 gr Tris bazı 60 ml distile su içerisinde çözündükten sonra 6 N HCl kullanılarak pH’sı
7.5’e ayarlanır. Hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlandıktan sonra otoklav ile steril edilerek
saklanır.
1.5 M Tris (pH 8.8) : 100 ml
27.23 gr Tris bazı 80 ml distile su içerisinde çözündükten sonra 6 N HCl kullanılarak
pH’sı 8.8’e ayarlanır. Hacim distile su ile 150 ml’ye tamamlandıktan sonra otoklav ile steril
edilerek saklanır.
3
% 0.5 (w/v) Bromofenol mavisi : 10 ml
0.05 gr bromofenol mavisi 10 ml su içerisinde çözdürülür. Çözünmeyen parçacıkların
kalması durumunda filtreden geçirilerek oda sıcaklığında saklanır.
20X MOPS tamponu : 100 ml
0.4 M MOPS (8.73 gr)
0.1 M NaAc (1.36 gr)
20 mM EDTA (0.74 gr)
Yukarıda verilen gramajlar 80 ml distile su içerisinde çözüldükten sonra 5 M NaOH
kullanılarak pH 7.0’a ayarlanır. pH ayarlamasından sonra hacim 100 ml’ye tamamlanır.
Otoklav ile steril edildikten sonra ışık almayacak şekilde karanlık bir ortamda saklanır.
RNA MOPS jel yükleme tamponu : 1 ml
% 50 gliserol
1X MOPS tamponu (20X MOPS tamponundan seyreltilerek)
% 1 bromofenol mavisi (bromophenol blue)
Hücre lizis tamponu : 10 ml
150 mM NaCl
%1 NP-40
50 mM Tris-HCl
Yukarıda verilen kompozisyon distile su içerisinde çözündükten sonra pH 8.0’a
ayarlanır. Lizis tamponu -20°C’de saklanır ve kullanmadan önce içerisine 1 mM PMSF
(phenylmethanesulphonylfluoride) ve proteaz inhibitör kokteyli eklenir.
1 mM PMSF metanol içerisinde çözerek taze olarak hazırlanır ve kullanılır.
Proteaz inhibitör kokteylinin hazırlanması için her bir tablet 1 ml steril PBS veya
distile su içerisinde çözündükten sonra -20°C’de saklanır. Kullanılacak olan her 1 ml lizis
tamponu için 50µl kokteyl eklenmesi gerekmektedir.
4
Toplam protein izolasyon tamponu : 10 ml
56 mM Na2CO3
56 mM DDT
% 2 SDS
% 12 Sucrose
2 mM EDTA
Yukarıda verilen kompozisyon 6 ml distile su içerisinde çözündükten sonra SDS
eklenmesi yapılır ve çözünmesi sağlanır. Hacim distile su kullanılarak 10 ml’ye tamamlanır
ve ışık almayacak şekilde saklanır.
SDS protein indirgeme tamponu : 10 ml
3.55 ml distile su
1.25 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8
2.5 ml gliserol
2 ml % 10 (w/v) SDS
0.2 ml % 0.5 (w/v) bromofenol mavisi
Karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında saklanır. Kullanılmadan önce 950 µl indirgeme
tamponuna 50 µl β-mercaptoethanol eklenmesi gerekmektedir.
10X SDS-PAGE yürütme tamponu : 500 ml
15.2 gr Tris bazı
72 gr glisin
5 gr SDS
Yukarıda verilen gramajlar 300 ml distile su içerisinde çözündükten sonra hacim 500
ml’ye tamamlanır. Hazırlanan tamponun 4°C’de saklanması gerekmektedir. Bu sırada bir
çökme olursa kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtılması gerekmektedir.
% 10 (w/v) APS (ammonium persulfate) : 10 ml
1 gr APS 10 ml distile su içerisinde çözdürülerek hazırlanır. APS’nın taze kullanılması
gerektiği için -20°C’de saklanması ve kullanılmadan önce çözdürülmesi gerekmektedir.
5
Coomassie boyama solüsyonu : 500 ml
% 0.2 (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 % 45 (v/v) etanol ve % 10 (v/v) asetik
asit içerisinde çözdürülür. Çözünmeyen parçacıkların kalması durumunda filtreden geçirilerek
oda sıcaklığında saklanır.
10X TBST (Tris buffered saline with Tween 20) : 500 ml
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
150 mM NaCl
% 0.05 (v/v) Tween-20
Western blotlama transfer tamponu : 100 ml
48 mM Tris bazı
39 mM glisin
% 20 metanol
% 0.0375 (w/v) SDS
Western blotlama membrana aktarım sonrası boyama solüsyonu : 100 ml
% 0.1 Ponceau red
Steril distile su içerisinde hazırlanarak, ışıktan korunacak şekilde saklanır.
6
PROTOKOL: Bitkilerden Trizol Kullanılarak RNA İzolasyonu
Materyal
Bitki yaprakları
Çözelti ve Tamponlar
a. Trizol Reagent (Invitrogen)
b. Kloroform
c. % 75 EtOH (v/v)
d. İzopropanol
e. Distile su (RNase-free)
Araç ve Gereçler
Sıvı azot
Havan
2.0 ml steril mikrofüj tüpleri
1.5 ml steril mikrofüj tüpleri
Soğutmalı santrifüj
Pipet ve steril pipet uçları
Tüp karıştırıcı (vorteks)
Su banyosu (55°C)
Uygulama
1. 0.3 gram bitki dokusu sıvı azot yardımıyla toz haline getirilir ve 1.7 ml Trizol Reagent
eklenerek homojenize edilir.
2. 1 ml homojenize edilmiş örnek 2 ml mikrofüj tüpüne aktarılır. Bu aşamada kesik uç
kullanılması gerekebilir.
Tüm örnekler hazırlanana kadar mikrofüj tüpüne aktarılmış olan örnekler buzda
tutulmalıdır.
3. Örneğe 400 µl kloroform eklenir ve elde sallanarak karıştırılır.
4. Oda sıcaklığında 7 dakika bekletilen örnekler daha sonra maksimum hızda 4°C’de 15
dakika santrifüj edilirler.
5. 1.5 ml eppendorf tüpe aktarılan üst faza 500 µl izopropanol eklenir ve oda sıcaklığında 10
dakika bekletilir.
6. Maksimum hızda 4°C’de 10 dakika santrifüj edilen örneklerdeki üst faz RNA peletini
oynatmadan dikkatlice dökülür.
7
7. Örneklere 1 ml % 75’lik EtOH eklenir ve 9,000 rpm’de 4°C’de 5 dakika süre ile santrifüj
edilir.
8. Etanol RNA peletini oynatmadan dikkatlice dökülür.
Bu aşamada kalan etanolun ortamdan uzaklaştırılması için mikropipet kullanılabilir.
9. Pelet oda sıcaklığında 10 dakika, etanol kokusu gidene kadar, kurutulur.
Aşırı kurutmak RNA peletinin çözünmesini engelleyeceğinden kurutma süresine dikkat
edilmesi gereklidir.
10. Oluşan pelete 30-50 µl RNase-free distile su eklendikten sonra çözünmesini sağlamak için
55°C’de 1 saat bekletilir.
11. İzole edilen RNA örnekleri uzun süreli saklamalarda -80°C’de muhafaza edilmelidirler.
Ancak kısa süreli saklamak amaçlı -20°C de tutulabilir.
8
PROTOKOL: Memelilerden TriPure Kullanılarak RNA İzolasyonu
Materyal
Hücre kültüründen elde edilen tek tabakalı memeli hücreleri (Bir grup hücreye ilaç
uygulaması yapılmışken, diğer bir grup normal koşullarda büyütülmüştür.)
Hücrelere ilaç uygulanması:
İlaç stok konsantrasyonu: 10 mM
Uygulama için gereken konsantrasyona indirgenen ilaç, büyütme ortamı ile
seyreltilerek hazırlanır. Kuyularda büyütülen memeli hücrelerinden büyütme ortamı çekilip
atılır. Daha sonra ilaçlı büyütme ortamı ekili hücrelerin üzerine eklenerek, ilaç uygulama
süresi kadar (24 saat) büyütmeye devam edilir.
Çözelti ve Tamponlar
a. TriPure Isolation Reagent (Roche Applied Sciences)
b. Kloroform
c. % 70 EtOH (v/v)
d. Etanol
e. Distile su (RNase-free)
f. 1X PBS
Araç ve Gereçler
1.5 ml steril mikrofüj tüpleri
Soğutmalı santrifüj
Pipet ve steril pipet uçları
Tüp karıştırıcı (vorteks)
Su banyosu (55°C)
Uygulama
1. 6 kuyulu petrilere ekilmiş ve % 90’dan fazla yaygınlığa ulaştığı mikroskop ile saptanmış
olan memeli hücreleri 2 kez soğuk 1 ml 1X PBS tamponu ile yıkanır. Hücrelerin yıkanması
besiyeri içeriğinin tamamen uzaklaştırılması açısından önemlidir. Ancak yüzeye yapışan
hücrelerin yıkama esnasından kaldırılmaması için uygulama özenli bir şekilde yapılmalıdır.
2. Hücrelere 1 ml soğuk 1X PBS eklenmesinin ardından kazıyıcı yardımı ile tüm hücre
materyali kaldırılır ve 1.5 ml steril mikrofüj tüpüne aktarılır. En son kalan hücre topluluğunu
aktarmak için 0.5 ml soğuk 1X PBS 6 kuyucuklu hücre petrisine konur ve kazıyıcı yardımıyla
son hücreler de alınarak aynı 1.5 ml mikrofüj tüpünde tüm materyal toplanır.
9
3. Hücreler maksimum hızda daha önce soğutulmuş santrifüjde 4°C’de 30 saniye süre ile
çökertilir. Üst sıvı dikkatli bir şekilde yeni bir steril mikrofüj tüpüne aktarılır.
4. Örneklere 250 µl TriPure Reagent eklenir ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir.
5. Örneklere 50 µl kloroform eklenir ve 15 saniye süre ile karıştırılır.
6. Oda sıcaklığında 15 dakika bekletilen örnekler daha sonra maksimum hızda 4°C’de 15
dakika santrifüj edilirler.
7. Üst faz yeni bir mikrofüj tüpüne aktarılır ve üzerine 125 µl etanol eklenir. Mikrofüj tüp alt
üst edilerek karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir.
8. Maksimum hızda 4°C’de 10 dakika santrifüj edilen örneklerdeki üst faz RNA peletini
oynatmadan dikkatlice dökülür.
9. Örneklere 250 µl % 70’lik EtOH eklenir ve 8,000 rpm’de 4°C’de 5 dakika süre ile santrifüj
edilir.
10. Etanol RNA peletini oynatmadan dikkatlice dökülür.
Bu aşamada kalan etanolun ortamdan uzaklaştırılması için mikropipet kullanılabilir.
11. Pelet oda sıcaklığında 10 dakika, etanol kokusu gidene kadar, kurutulur.
Aşırı kurutmak RNA peletinin çözünmesini engelleyeceğinden kurutma süresine dikkat
edilmesi gereklidir.
12. Oluşan pelete 30-50 µl RNase-free distile su eklendikten sonra çözünmesini sağlamak için
55°C’de 1 saat bekletilir.
13. İzole edilen RNA örnekleri uzun süreli saklamalarda -80°C’de muhafaza edilmelidirler.
Ancak kısa süreli saklamak amaçlı -20°C de tutulabilir.
10
PROTOKOL: Spektrofotometre ile RNA Miktarının Hesaplanması
Materyal
İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli RNA örnekleri
Araç ve Gereçler
Kuartz spektrofotometri küvetleri
Spektrofotometre
Pipet ve steril pipet uçları
1.5 ml mikrofüj tüpleri
Uygulama
1. 1.5 ml’lik iki mikrofüj tüpü K (Kör, Blank) ve Ö (Örnek) şeklinde işaretlenir.
2. Örneği içeren tüpün içerisine öncelikle 98 µl distile su, daha sonra da 2 µl RNA izolatı
konularak pipet yardımıyla karıştırılır. Bu aşamada 1:50 seyreltme yapılmış olur.
3. Kör tüp sadece 100 µl distile su içermektedir.
4. Spektrofotometrede nükleik asitler için ölçüm yapılan 3 numaralı dosya açılır ve yapılan
seyreltme ve doğrulama faktörleri gibi ayarlamalar yapılır.
Kullanılan spektrofotometreye göre bu aşamanın değişeceği unutulmamalıdır.
5. Referans değerler K kodlu tüpten elde edilen ölçüm ile sıfırlanır. Bu aşamada
gerçekleştirilen solüsyondan ileri gelecek olan spektrofotometrik algılamaların
sıfırlanmasıdır. Bu şekilde örnekten yapılacak ölçümlerin sadece örnek içerisinde çözülmüş
molekülleri tespit etmesi sağlanır.
6. Ö kodlu tüpün ölçüm değerleri (260 nm, 280 nm ve saflık değerleri) laboratuar defterine
aktarılır. Alet tarafından ölçülen RNA miktarı ng/µl olarak deftere alınır.
Proteinler 280 nm’de absorbsiyon gösterdikleri için OD 260/OD 280 değeri
hesaplanır. Eğer bu değer 1.8-2.0 arasında ise elde edilen nükleik asitlerin temiz olduğu
varsayılır.
RNA konsantrasyonu (µg/ml) = (OD260 x Seyreltme katsayısı x 40 µg/ml) / 1000
Not: Absorbansın ‘1’ değeri 1 cm3’lük küvette 50 µg/ml miktarında çift zincirli DNA’yı, 33
µg/ml tek zincirli oligonükleotidleri ve 40 µg/ml ise tek zincirli RNA’yı temsil etmektedir.
11
Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlanması
Spektrofotometri ile ölçülen 260 nm ve 280 nm değerleri kullanılarak izole edilen
RNA örneklerinin konsantrasyonlarının ve saflık derecelerinin hesaplanması, karşılaştırılması
ve sonuçların deneysel uygulama aşamaları açısından değerlendirilmesi.
12
PROTOKOL: RNA’dan iScript cDNA Synthesis Kiti (Bio-Rad) ile cDNA Sentezi ve
Spektrofotometre ile cDNA Miktarının Hesaplanması
Materyal
İlaç uygulanmış ve kontrol memeli hücrelerinden izole edilen RNA örnekleri
Çözelti ve Tamponlar
iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)
Araç ve Gereçler
0.5 ml steril mikrofüj tüpleri
1.5 ml steril mikrofüj tüpleri
Su banyosu (45°C, 42°C, 85°C)
Soğutmalı santrifüj
Tüp karıştırıcı (Vorteks)
Kuartz spektrofotometri küvetleri
Spektrofotometre
Pipet ve steril pipet uçları
Uygulama
1. RT reaksiyon karışımı aşağıdaki içeriğe göre toplamda 20 µl olacak şekilde hazırlanır;
4 µl 5X iScript Reaction Mix
1 µl iScript Reverse Transcriptase
1 µl RNA örneği
14 µl Nuclease-free su
2. Hazırlanan karışım voktekslenir ve hacmin tüpün dibinde birikmesini sağlamak amacıyla
kısa süre santrifüj edilir.
3. Hazırlanan RT reaksiyon karışımı aşağıdaki sıcaklık ve sürelerde bekletilerek cDNA
sentezi gerçekleştirilir.
25°C 5 dakika
42°C 30 dakika
85°C 5 dakika
4. Spektrofotometre ile sentezlenen tek zincirli cDNA’nın kantifikasyonu yapılır. cDNA’ya
çevrilen RNA örneklerinin -20°C’de saklanması gerekmektedir.
cDNA konsantrasyonu (µg/ml) = (OD260 x Seyreltme katsayısı x 33 µg/ml) / 1000
13
Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlama
cDNA konsantrasyonlarının hesaplanması. Reaksiyona konulan RNA miktarına göre
cDNA amplifikasyon miktarının değerlendirilmesi. Sentezlenen cDNA’nın neden
spektrofotometre ile hesaplandığının ve bir jel elektroforez yöntemi ile değerlendirilmediğinin
yorumlanması.
14
PROTOKOL: İzole Edilen RNA’ların MOPS Jel Elektroforez Yöntemi ile Gösterimi
Materyal
İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli RNA örnekleri
Çözelti ve Tamponlar
a. 20X MOPS tamponu
b. RNA MOPS jel yükleme tamponu
c. MOPS jel yürütme tamponu
25 ml 20X MOPS ve 13.5 ml formaldehit 400 ml steril distile suya eklenir ve
hacim 500 ml’ye tamamlanır.
d. Formaldehit
e. Agaroz
f. Distile su (RNase-free)
g. Etidyum bromür
Araç ve Gereçler
1.5 ml steril mikrofüj tüpleri
Jel elektroforez sistemi
Güç kaynağı
UV-translüminatör
Pipet ve steril pipet uçları
Mikrodalga fırın
Su banyosu (65°C)
Uygulama
1. 50 ml MOPS agaroz jeli hazırlamak için 0.7 gram agaroz 39 ml RNase-free distile su
içerisine konulur. Mikrodalga fırında taşmamasına özen gösterilerek agaroz tamamen eriyene
kadar kaynatılır. Daha sonra oda ısısında veya musluk altında elle dokunulabilir sıcaklığa
erişene kadar soğutulur ve içerisine 2.5 ml 20X MOPS ve 8.5 ml formaldehit eklenir.
Kabarcıkların oluşmamasına dikkat ederek karıştırılır.
MOPS ve formaldehit eklenmesi zaten soğutulmuş olan agaroz jel çözeltisinin daha
fazla soğumasına neden olacağı için, dökme işleminin agaroz tamamen jel haline
dönüşmeden hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekmektedir.
15
2. Jel tarakları elektroforez tankında uygun yerlere yerleştirilir ve 3-5 mm kalınlığında bir jel
dökülür. Eğer hava kabarcığı oluşmuş ise pipet ucu veya kağıt peçete yardımıyla ortamdan
uzaklaştırılmalıdır.
3. Tamamen donduktan sonra taraklar kuyucukların bozulmamasına özen gösterilerek
çıkartılır ve jel, içerisinde MOPS jel yürütme tamponu bulunan tanka aktarılır. Tampon
çözeltisinin hazırlanan jelden 1 mm daha yüksek olması yeterlidir.
4. İzole edilen RNA örneklerinin yüklenmesi için aşağıdaki şekilde hazırlanması
gerekmektedir;
3.3 µl formaldehit
1 µl 20X MOPS tamponu
2 µl RNA MOPS jel yükleme tamponu
1µl EtBr
X µl RNA örneği (2 µg olacak hacme göre hesaplanır)
Y µl RNase-free distile su (20 µl’ye tamamlanacak şekilde hesaplanır)
1.5 ml mikrofüj tüp içerisinde hazırlanan örnekler 65°C’de 10 dakika tutulduktan
sonra hızla buza aktarılırlar. Örnekler tamamen soğuduktan sonra jel üzerindeki kuyucuklara
dikkatlice yüklenir. İlk kuyuya RNA standartı (RiboRuler RNA Ladder High Range,
Fermentas) yüklenir.
5. Elektrotların doğru olarak yerleştirildiğinden emin olduktan sonra voltaj 1-5 V/cm olacak
şekilde hesaplanır (cm pozitif ve negatif elektrot arasındaki uzaklıktır). Mini jellerde ise 10-
100 ng DNA 30-60 dakika içerisinde 5-20 V/cm olacak şekilde yürütülebilmektedir.
6. Yükleme tamponunun görülebilir boyaları jelin 2/3’üne ulaştığında yürütme durdurulur.
7. Jel transiluminatörde UV ışığı altında gözlemlenir.
Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlanması
İzole edilen toplam RNA örneklerinin jel görüntüleri ile spektrofotometrik analiz
sonucu hesaplanan konsantrasyonlarının karşılaştırılarak yorumlanması. Memeli ve bitkiden
izole edilen RNA örneklerinin konsantrasyon farklarının ve görüntülenen bantların
yorumlanması. Sonuçların deneysel uygulama aşamaları açısından değerlendirilmesi.
16
PROTOKOL: qRT-PCR ile PUMA Geninin Anlatımının Kantifikasyonu
Materyal
İlaç uygulanmış ve uygulanmamış (kontrol) memeli hücrelerinden elde edilen cDNA
örnekleri
Çözelti ve Tamponlar
a. SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad)
b. PUMA primerleri (Hedef gen)
c. GADPH primerleri (Referans, kontrol gen)
Araç ve Gereçler
0.2 ml steril mikrofüj tüpleri
Pipet ve steril pipet uçları
Mini Opticon Thermal Cycler (Bio-Rad)
Uygulama
1. Kantifikasyonun yapılabilmesi için kullanılacak olan Pfaffl metodu için gereken değerlerin
elde edilebilmesi amacıyla qRT-PCR reaksiyonlarının aşağıdaki olasılıklar için hazırlanması
gerekmektedir. Aynı şekilde standart sapmanın hesaplanması amacıyla her bir olasılıktan iki
adet PCR gerçekleştirileceği için toplamda 12 reaksiyon hazırlanması gerekmektedir.
100 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart)
300 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart)
500 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart/Referans)
500 ng kontrol cDNA PUMA primerleri (Hedef)
500 ng ilaç uygulanmış cDNA GADPH primerleri (Referans)
500 ng ilaç uygulanmış cDNA PUMA primerleri (Hedef)
2. 0.2 ml’lik PCR tüpleri içerisinde 25 µl PCR karışımı hazırlanır.
X µl steril distile su (25 µl’ye tamamlayacak hacimde)
12,5 µl 5X SYBR Green PCR Master Mix
0.25 µM Primerler
Y µl cDNA (Gerekli olan ng’ı ayarlayacak hacimde)
17
3. Örnekler polimeraz zincir reaksiyonu ile Mini Opticon Thermal Cycler’da çoğaltılır.
Amplifikasyon döngüsü;
Başlangıç denatürasyon 95°C 15 dakika
40 siklus
Denatürasyon 94°C 1 dakika
Bağlanma 54°C 1 dakika
Uzama 72°C 1 dakika
4. Sonuçlar değerlendirilerek, Pfaffl metodu ile kantifikasyon gerçekleştirilecektir. Bu amaçla
öncelikle aşağıdaki üç PCR için elde edilen değerlerden cDNA konsantrasyonuna göre CT
değeri grafiği çizilerek, R2 değeri hesaplanacaktır. Bu aşamada standart sapmaların (SD)
değerlendirilmesinin unutulmaması gerekmektedir.
Verimli bir amplifikasyon için R2 değerinin 1’e yakın olması gerekmektedir.
100 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart)
300 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart)
500 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart)
5. Aşağıda verilen PCR örnekleri için ∆∆CT denklemlerine göre kontrol grubunda ve ilaç
uygulama sonrası PUMA geninin transkript miktarı hesaplanacaktır.
R = 2-[(CT
ilaç uygulanmış-CT
ilaç uygulanmamış)PUMA
– (CT
ilaç uygulanmış-CT
ilaç uygulanmamış)GADPH
]
R = 2-[∆CT
hedef gen- ∆CT
referans gen]
R = 2-∆∆CT
500 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Referans)
500 ng ilaç uygulanmış cDNA GADPH primerleri (Referans)
500 ng kontrol cDNA PUMA primerleri (Hedef)
500 ng ilaç uygulanmış cDNA PUMA primerleri (Hedef)
18
Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor
Gerçekleştirilen PCR’ın veriminin (yani tekrarlanabilirliğinin) yorumlanması (R2 değeri göz
önünde bulundurularak). Kantifikasyon sonuçlarının hesaplanması, standart sapmaların (SD)
değerlendirilmesi. İlaç kullanımı sonucunda, PUMA geninin transkripsiyonunda gerçekleşen
değişimin yorumlanması.
Referans makaleler :
- Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in
quantitative real-time RT-PCR, S. Fleige, V. Walf, S. Huch, C. Prgomet, J. Sehm and
M. W. Pfaffl , Biotechnology Letters, 2006, 28(19), 1601-1613
- A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR, M.W. Pfaffl,
Nucleic Acids Research, 2001, 29(9), e45
19
PROTOKOL: Memeli Hücrelerinden Protein İzolasyonu
Materyal
Hücre kültüründen elde edilen tek tabakalı memeli hücreleri (Bir grup hücreye ilaç
uygulaması yapılmışken, diğer bir grup hücre normal koşullarda büyütülmüştür.)
Hücrelere ilaç uygulanması:
İlaç stok konsantrasyonu: 10 mM
Uygulama için gereken konsantrasyona indirgenen ilaç stoğu büyütme ortamı ile
seyreltilerek hazırlanır. Kuyularda büyütülen memeli hücrelerinden büyütme ortamı çekilip
atılır. Daha sonra ilaçlı büyütme ortamı ekili hücrelerin üzerine eklenerek, ilaç uygulama
süresi kadar (24 saat) büyütmeye devam edilir.
Çözelti ve Tamponlar
a. Hücre lizis tamponu
b. 1X PBS
Araç ve Gereçler
1.5 ml steril mikrofüj tüpleri
Soğutmalı santrifüj
Pipet ve steril pipet uçları
Uygulama
1. 6 kuyulu petrilere ekilmiş ve % 90’dan fazla yaygınlığa ulaştığı mikroskop ile saptanmış
olan memeli hücreleri 2 kez soğuk 1 ml 1X PBS tamponu ile yıkanır. Hücrelerin yıkanması
besiyeri içeriğinin tamamen uzaklaştırılması açısından önemlidir. Ancak yüzeye yapışan
hücrelerin yıkama esnasından kaldırılmaması için uygulama özenli bir şekilde yapılmalıdır.
2. Hücrelere 1 ml soğuk 1X PBS eklenmesinin ardından kazıyıcı yardımı ile tüm hücre
materyali kaldırılır ve 1.5 ml steril mikrofüj tüpüne aktarılır. En son kalan hücre topluluğunu
aktarmak için 0.5 ml soğuk 1X PBS 6 kuyucuklu hücre petrisine konur ve kazıyıcı yardımıyla
son hücreler de alınarak aynı 1.5 ml mikrofüj tüpünde tüm materyal toplanır.
3. Hücreler maksimum hızda daha önce soğutulmuş santrifüjde 4°C’de 30 saniye süre ile
çökertilir. Üst sıvı hücre peletine zarar vermeyecek şekilde atıldıktan sonra, pelet üzerine 1 ml
hücre lizis tamponu konulur ve buzda 40 dakika bekletilir.
4. Maksimum hızda 4°C’de 15 dakika santrifüj edildikten sonra elde edilen üst sıvı 1.5 ml’lik
steril mikrofüj tüpüne aktarılır ve örnekler -20°C’de saklanır.
20
PROTOKOL: Bitkilerden Toplam Protein İzolasyonu
Materyal
Bitki yaprakları
Çözelti ve Tamponlar
Toplam protein izolasyon tamponu
Araç ve Gereçler
Sıvı azot
Havan
1.5 ml steril mikrofüj tüpleri
Soğutmalı santrifüj
Pipet ve steril pipet uçları
Su banyosu (70°C)
Uygulama
1. 0.1 gram bitki dokusu sıvı azot yardımıyla toz haline getirilir ve 500 µl toplam protein
izolasyon tamponu eklenerek homojenize edilir.
2. Homojenize edilmiş örnek 1.5 ml mikrofüj tüpüne aktarılır. Bu aşamada kesik uç
kullanılması gerekebilir.
3. Örnekler 15 dakika 70°C’de bekletildikten sonra maksimum hızda 4°C’de 10 dakika
santrifüj edilirler.
4. Üst sıvı 1.5 ml’lik steril bir mikrofüj tüpüne aktarılır ve örnekler -20°C’de saklanır.
21
PROTOKOL: İzole Edilen Proteinlerin Bradford Yöntemi ile Kantifikasyonu
Materyal
İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli protein örnekleri
Çözelti ve Tamponlar
a. Bradford solüsyonu (Bio-Rad Protein Assay)
b. BSA (10 mg/ml stok)
Araç ve Gereçler
1.5 ml steril mikrofüj tüpleri
Tüp karıştırıcı (vorteks)
Spektrofotometri küvetleri
Spektrofotometre
Pipet ve steril pipet uçları
Uygulama
1. Bradford solüsyonu distile su kullanılarak 1:5 oranında seyreltilir. Bu aşamada vorteks
yardımıyla iyice karıştırılması gerekmektedir.
2. 10 mg/ml BSA stok solüsyonu standart eğriyi çizmeye yetecek miktarda son
konsantrasyonu 1 µg/µl olacak şekilde distile su ile seyreltilir. Hazırlanan BSA’nın iyice
karıştırıldığından emin olunmalıdır.
3. Standart eğrinin çizilmesi amacıyla :
a. 800 µl Bradford solüsyonu spektrofotometri küvetlerine konulur. Bu aşamada
spektrofotometrinin sıfırlanması amacıyla kullanılacak olan Kör (Blank) örnekler de
hazırlanır.
b. Küvetlere sırasıyla 2 µg, 4 µg, 8 µg, 12 µg ve 18 µg olacak hacimde BSA eklenir.
Karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir. Standart sapmanın (SD)
hesaplanması amacıyla her bir µg değerinden iki adet bağımsız ölçüm yapılması
gerekmektedir.
c. Spektrofotometrede 595 dalga boyunda ölçüm yapılır (OD595).
4. Örneklerin protein konsantrasyonunu hesaplayabilmek için:
a. 800 µl Bradford solüsyonu spektrofotometri küvetlerine konulur. Bu aşamada
spektrofotometrinin sıfırlanması amacıyla kullanılacak olan Kör (Blank) örnekler de
hazırlanır.
22
b. Küvetlere öncelikle 5µl örnek eklenir. Karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 5
dakika bekletilir. Standart sapmanın (SD) hesaplanması amacıyla her bir µl değerinden iki
adet bağımsız ölçüm yapılması gerekmektedir.
c. Spektrofotometrede 595 dalga boyunda ölçüm yapılır (OD595).
Ölçüm sonucu elde edilen değer standart eğrinin çizilmesi için ölçülen değer
aralığında ise yeni bir ölçüm yapılmasına gerek yoktur. Ancak BSA ölçümünde elde edilen
aralığın dışında kadar değerler için, ölçüm daha az veya daha fazla protein örnek hacmi
kullanılarak tekrarlanır.
Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlanması
BSA sonuçları kullanılarak standart eğrinin çizilmesi, R2 değerinin hesaplanması ve
standart sapmaların yorumlanması. Örneklerden elde edilen protein miktarlarının standart eğri
kullanılarak hesaplanması ve yapılan iki ölçüm arasındaki farklılıklara bağlı olarak standart
sapmaların hesaplanarak yorumlanması. Farklı hücre türlerinden ve farklı yöntemler
kullanılarak elde edilen proteinlerin miktar açısından karşılaştırılarak yorumlanması. Memeli
hücrelerinde ilaç kullanımı sonucunda elde edilen protein miktarında bir değişiklik gözlenip
gözlenmediğinin kontrolü ve yorumlanması.
23
PROTOKOL: İzole Edilen Proteinlerin SDS-PAGE Jel Elektroforez ile Yürütülmesi ve
Coomassie Boyama
Materyal
İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli protein örnekleri
Çözelti ve Tamponlar
a. SDS protein indirgeme tamponu
b. % 10 (w/v) SDS
c. Akrilamit:Bis-akrilamit çözeltisi (37.5:1)
d. TEMED
e. 10X SDS-PAGE yürütme tamponu
f. Coomassie boyama solüsyonu
g. Coomassie boyama yıkama solüsyonu
% 45 (v/v) etanol ve % 10 (v/v) asetik asit steril distile su ile karıştırılarak
hacmi 500 ml’ye tamamlanır.
h. % 10 (w/v) APS
i. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (Ayırma jel tamponu)
j. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (Yükleme jel tamponu)
Araç ve Gereçler
Poliakrilamit jel elektroforez sistemi
Güç kaynağı
Translüminatör
Pipet ve steril pipet uçları
Su banyosu (95°C)
Uygulama
1. Ayırma jeli için 50 ml % 12’lik akrilamit jel karışımı hazırlanır.
20 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi
12.5 ml Ayırma jel tamponu
0.5 ml % 10 (w/v) SDS
17 ml distile su
2. 500 µl % 10 (w/v) APS ve 25 µl TEMED eklenir ve yavaşça karıştırılır. Jel içeriye hava
kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür. Üzerine yükleme jeli de
24
döküleceği için jel kaseti tamamen doldurulmamalı, üst kısmında tarakların uzunluğunun
yaklaşık 1 cm altına denk gelecek şekilde boşluk bırakarak dökülmelidir.
3. Üst yüzeye yaklaşık 2 mm yüksekliğe gelecek kadar izopropanol dökülür ve jel oda
sıcaklığında donmaya bırakılır.
4. Ayırma jeli polimerize olduktan sonra kaset eğilerek izopropanol dökülür. Ayırma jelinin
üst tarafı distile su ile dikkatlice yıkanarak alkol kalıntılarından temizlenir ve peçete
yardımıyla dikkatlice kurutulur.
5. Yükleme jeli için 20 ml % 4’lük akrilamit jel karışımı hazırlanır.
2.6 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi
5 ml Yükleme jel tamponu
0.2 ml % 10 (w/v) SDS
12.2 ml distile su
6. 100 µl % 10 (w/v) APS ve 20 µl TEMED eklenir ve yavaşça karıştırılır. Jel içeriye hava
kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür ve jel tarakları dikkatlice
yerleştirilir.
7. Yükleme jeli yarım saat süreyle oda sıcaklığında dondurulduktan sonra 1X SDS-PAGE
yürütme tamponu ile doldurulmuş olan tanka yerleştirilir. Taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılır
ve oluşan kuyucukların içi mikropipet yardımıyla yıkanır.
8. Protein örnekleri hazırlanırken 30 µg protein içerecek hacime 1’e 1 oranında SDS protein
indirgeme tamponu eklenir, pipetleme ile karıştırılır ve 95°C’de 5 dakika kaynatıldıktan sonra
buzda soğuyana kadar bekletilir.
9. İlk kuyuya protein standartı (Full-range Rainbow, Amersham) yüklenir.
10. Hazırlanan protein örnekleri yeterince soğuduktan sonra jel üzerindeki kuyucuklara
dikkatlice yüklenir.
11. Jel yürütmesi örnekler yükleme jelini geçene kadar 100 V’da, geçtikten sonra ise 200
V’da gerçekleştirilir.
12. Yürütme tamamlandıktan sonra jel kaseti dikkatlice açılır ve ayırma jeli, yükleme jelinden
ayrılarak Coomassie boyama solüsyonuna aktarılır ve gece boyu 3D orbital çeviricide
bekletilir.
13. Ayırma jeli boyama solüsyonundan çıkartılıp, yıkama solüsyonuna aktarılır ve arka
plandaki renk açılana ve protein bantları ayırt edilene kadar yıkama solüsyonu yenilenerek 3D
orbital çeviricide yıkamaya devam edilir.
14. Jel transiluminatörde beyaz ışık altında gözlemlenir.
25
Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlanması
Bitki örneklerinden ve memeli hücrelerinden elde edilen protein izolatlarının jel
görüntüsünün izolasyon yöntemi ve hücre türü açısından karşılaştırılması. Bradford
sonuçlarına göre gerçekleştirilen yükleme miktarları ile jel görüntülerinin karşılaştırılması ve
yorumlanması.
26
PROTOKOL: Memeli Hücrelerinden İzole Edilen Protein Örnekleri ile Western
Blotlama (PUMA Proteini)
Materyal
İzolasyonu gerçekleştirilen memeli protein örnekleri
Çözelti ve Tamponlar
a. SDS protein indirgeme tamponu
b. % 10 (w/v) SDS
c. Akrilamit:Bis-akrilamit çözeltisi (37.5:1)
d. TEMED
e. 10X SDS-PAGE yürütme tamponu
f. % 10 (w/v) APS
g. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (Ayırma jel tamponu)
h. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (Yükleme jel tamponu)
i. 10X TBST
j. Western blotlama transfer tamponu
k. Western blotlama membrana aktarım sonrası boyama solüsyonu (Ponceau red)
l. Bloklama tamponu
1X TBST içerisinde çözünmüş % 5 yağsız süt tozu
m. Birincil antikor solüsyonu
1X TBST içerisinde çözünmüş % 5 yağsız süt tozuna 1:2000 oranında PUMA
antikoru eklenir.
n. İkincil antikor solüsyonu
1X TBST içerisinde çözünmüş % 5 yağsız süt tozuna 1:10000 oranında anti-
rabbit sekonder antikoru eklenir.
Araç ve Gereçler
Poliakrilamit jel elektroforez sistemi
Güç kaynağı
Pipet ve steril pipet uçları
Su banyosu (95°C)
27
Uygulama
1. Ayırma jeli için 50 ml % 12’lik akrilamit jel karışımı hazırlanır.
20 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi
12.5 ml Ayırma jel tamponu
0.5 ml % 10 (w/v) SDS
17 ml distile su
2. 500 µl % 10 (w/v) APS ve 25 µl TEMED eklenir ve yavaşça karıştırılır. Jel içeriye hava
kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür. Üzerine yükleme jeli de
döküleceği için jel kaseti tamamen doldurulmamalı, üst kısmında tarakların uzunluğunun
yaklaşık 1 cm altına denk gelecek şekilde boşluk bırakarak dökülmelidir.
3. Üst yüzeye yaklaşık 2 mm yüksekliğe gelecek kadar izopropanol dökülür ve jel oda
sıcaklığında donmaya bırakılır.
4. Ayırma jeli polimerize olduktan sonra kaset eğilerek izopropanol dökülür. Ayırma jelinin
üst tarafı distile su ile dikkatlice yıkanarak alkol kalıntılarından temizlenir ve peçete
yardımıyla dikkatlice kurutulur.
5. Yükleme jeli için 20 ml % 4’lük akrilamit jel karışımı hazırlanır.
2.6 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi
5 ml Yükleme jel tamponu
0.2 ml % 10 (w/v) SDS
12.2 ml distile su
6. 100 µl % 10 (w/v) APS ve 20 µl TEMED eklenir ve yavaşça karıştırılır. Jel içeriye hava
kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür ve jel tarakları dikkatlice
yerleştirilir.
7. Yükleme jeli yarım saat süreyle oda sıcaklığında dondurulduktan sonra 1X SDS-PAGE
yürütme tamponu ile doldurulmuş olan tanka yerleştirilir. Taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılır
ve oluşan kuyucukların içi pipet yardımıyla yıkanır.
8. Protein örnekleri hazırlanırken 30 µg protein içerecek hacime 1’e 1 oranında SDS protein
indirgeme tamponu eklenir, pipetleme ile karıştırılır ve 95°C’de 5 dakika kaynatıldıktan sonra
buzda soğuyana kadar bekletilir.
9. İlk kuyuya protein standartı (Full-range Rainbow, Amersham) yüklenir.
10. Hazırlanan protein örnekleri yeterince soğuduktan sonra jel üzerindeki kuyucuklara
dikkatlice yüklenir.
11. Jel yürütmesi örnekler yükleme jelini geçene kadar 100 V’da, geçtikten sonra ise 200
V’da gerçekleştirilir.
28
12. Yürütme tamamlandıktan sonra jel kaseti dikkatlice açılır ve ayırma jeli, yükleme jelinden
ayrılır.
13. Western blotlama ıslak emdirim (wet blotting) metodu ile PVDF membrana aktarılarak
gerçekleştirilecektir. Buna göre aktarım 75 mV’da 1 saat 15 dakika süresince veya 25 mV’da
gece boyu gerçekleştirilir. Gece boyu aktarım sırasında sistemin soğukta tutulması önemlidir.
Blotlama sonrası proteinlerin membrana aktarıldığından emin olmak amacıyla, PVDF
membranı Western blotlama membrana aktarım sonrası boyama solüsyonu (Ponceau
red) ile yarım saat oda sıcaklığında 3D orbital çeviricide boyanır. Daha sonra su ile
yıkanarak resmi veya fotokopisi çekilebilir.
14. Blotlama sonrası PVDF membran bloklama tamponu içerisinde oda sıcaklığında 2 saat
süreyle 3D orbital çeviricide bekletilir.
15. Membranın süt tozundan arındırılması için 5’er dakikalık 3 adet 1X TBST yıkama
gerçekleştirilir.
16. Membran daha sonra birincil antikor solüsyonuna aktarılır ve 2 saat süreyle oda
sıcaklığında 3D orbital çeviricide bekletilir.
17. Membran 5’er dakikalık 3 adet 1X TBST yıkama sonrası ikincil antikor solüsyonuna
aktarılır ve 2 saat oda sıcaklığında 3D orbital çeviricide bekletilir.
18. Membran 15’er dakikalık 2 adet 1X TBST yıkama sonrası oda sıcaklığına getirilmiş
kemiluminisans madde ile bir dakika süresince bekletilir.
19. Membran streç filme sarılarak, ışık geçirmez kasetlerde karanlık odaya götürülür ve
üzerine film yerleştirilir.
20. Belirli sürelerde bekletilen filmler geliştirici ve sabitleyici film (Kodak X-OMAT)
çözeltileri ile istenilen görüntü elde edilinceye kadar yıkanırlar. Filmler en son soğuk suda
yıkanarak kurumaya bırakılır.
Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlama
Membrana aktarım sonrası gerçekleştirilen Ponceau red boyaması ile elde edilen sonuçların
değerlendirilmesi ve yorumlanması. İlaç kullanımı sonucunda, PUMA proteininin translasyon
ve birikiminde gerçekleşen değişimin ve elde edilen Western blotlama sonuçlarının qRT-
PCR’da hesaplanan transkript değişimi sonuçları ile karşılaştırılarak yorumlanması.
29
RAPOR FORMATI
1. Başlık sayfası
Dersin adı
Deneyin adı
Tarih
Raporu hazırlayan kişinin adı (Tam olarak yazılmalı ve okul numarası belirtilmelidir)
2. Amaç
Deneyin yapılma amacını açıkça ortaya koymalıdır. “Bu çalışma neden
yapılmıştır?” sorusuna cevap verecek nitelikte olmalıdır.
3. Materyal ve Metod
Deney sırasında kullanılan materyal ve metod mevcut protokollerde kullanılandan
farklı olmayacaktır. Bu nedenle bu kısım protokollerden destek alınarak
hazırlanabilir. Ancak raporda beklenen detayları ile verilen protokolün,
laboratuarda uygulanan şekilde güncellenerek yazılması ve özellikle deneyde
kullanılan materyallerin, örneğin çözelti ve tamponların, kullanım amaçlarının
belirtilmesi gerekmektedir.
4. Sonuçlar
Bu bölümde deney sonuçları herhangi bir yorum yapılmadan verilmelidir.
Sonuçlar tablo, çizim, grafik, fotoğraf ve bunun gibi şekillerde verilebilir. Bütün
tabloların, grafiklerin, çizimlerin açıklayıcı isimleri olmalı, sembol veya
kısaltmalar belirtilmelidir. Çizimler, tablolar, grafikler ayrı ayrı numaralandırılmalı
ve her numara mutlaka rapor içinde belirtilmelidir.
5. Tartışma
Bu bölüm sonuçları yeniden içermemeli, sadece verileri yorumlamalıdır. Bu kısım
protokollerde mevcut bulunan “sonuçların değerlendirilmesi” başlığı altında
istenilen kriterlere dayandırılmalıdır. Deney tekniği ile ilgili sonuçlarınızı
etkileyen faktörler de bu bölümde yer almalıdır. Bir önceki bölümde verilen
sonuçların detaylı bir tartışmasının yapılması beklenmektedir.
6. Referanslar