MODULAREA ACTIVITĂŢII MEMBRANARE A UNOR PEPTIDE ... · Deşi au existat încercări de a explica...
Transcript of MODULAREA ACTIVITĂŢII MEMBRANARE A UNOR PEPTIDE ... · Deşi au existat încercări de a explica...
MODULAREA ACTIVITĂMODULAREA ACTIVITĂŢŢII MEMBRANARE A II MEMBRANARE A
UNOR PEPTIDE ANTIMICROBIENE UNOR PEPTIDE ANTIMICROBIENE ŞŞI PORINII PORINI
DE CĂTRE PROPRIETĂ DE CĂTRE PROPRIETĂŢŢILE ELECTRICE ILE ELECTRICE ŞŞI I
MECANICE ALE MATRICEI LIPIDICEMECANICE ALE MATRICEI LIPIDICE
Conducător ştiinţific:
Prof. Univ. Dr. Tudor LUCHIAN
Universitatea ‘Al. I. Cuza’ IaşiFacultatea de Fizică, Şcoala doctoralăLaboratorul de Biofizică Moleculară şi Fizică Medicală
Rezumatul tezei de doctorat
Drd. MEREUŢĂ Loredana-Cristina
2010, Iaşi
1
Universitatea “ALEXANDRU IOAN CUZA” IAŞI
În atenţia
…………………………………………………………………...
Vă facem cunoscut că în data de 7 iunie 2010., ora 12.00, în
Sala de Conferinţe a Rectoratului, domnişoara MEREUŢĂ Loredana - Cristina
va susţine, în şedinţă publică, teza de doctorat:
“Modularea activităţii membranare a unor peptide antimicrobiene şi porini de
către proprietăţile electrice şi mecanice ale matricei lipidice”
în vederea obţinerii titlului ştiinţific de doctor în domeniul fundamental Ştiinţe
Exacte, domeniul Fizică.
Comisia de examinare a tezei:
Prof. Dr. Dumitru Luca Preşedinte
Decanul Facultăţii de Fizică
Universitatea “Alexandru Ioan Cuza“ Iaşi
Prof. Dr. Tudor LUCHIAN Conducător ştiinţific
Facultatea de Fizică
Universitatea “Alexandru Ioan Cuza “ Iaşi
Prof. Dr. Dorina CREANGĂ Referent
Facultatea de Fizică
Universitatea “Alexandru Ioan Cuza “ Iaşi
Prof. Dr. Dan MIHĂILESCU Referent
Facultatea de Biologie
Universitatea din Bucuresti
Conf. Dr. Dragoş GRIGORIU Referent
Facultatea de Medicină
Universitatea de Medicină şi Farmacie
“Gr.T.Popa” Iaşi
Vă invităm pe această cale să participaţi la şedinţa publică de susţinere a tezei.
2
CUPRINSUL TEZEI
Lista de abrevieri.....................................................................................................4 I. Peptide antimicrobiene - macromolecule biologice esenţiale pentru viabilitatea organismelor pluricelulare..................................................................5 II. Elemente structurale şi funcţionale ale peptidelor antimicrobiene...............9
1. Descrierea structurală a alameticinei........................................................13 2. Descrierea structurală a magaininei 2.......................................................17 3. Descrierea structurală a melitinei..............................................................20 4. Descrierea structurală a peptidei HPA3....................................................23
III. Descrierea moleculară a interacţiunilor dintre peptidele antimicrobiene şi membrane lipidice artificiale................................................................................25
1. Tipurile de interacţiuni moleculare manifestate între peptide antimicrobiene şi biomembrane................................................................26
2. Mecanisme de destabilizare a membranelor celulare de către peptide antimicrobiene...........................................................................................30
IV. Manifestări electrice ale membranelor biologice........................................ 36
1. Potenţialul transmembranar.......................................................................37 2. Potenţialul de suprafaţă.............................................................................39 3. Potenţialul de dipol membranar................................................................43
V. Elemente de mecanica bistratului lipidic membranar.................................48
1. Contribuţii elastice ale biomembranelor implicate în descrierea proceselor de inserţie a peptidelor antimicrobiene.....................................................48
2. Energia liberă de deformare a biomembranelor asociată proceselor de inserţie membranară .................................................................................50
3. Observaţii experimentale privitoare la influenţa proprietăţilor elastice ale lipidelor membranare asupra inserţiei peptidelor antimicrobiene.............57
VI. Metode de investigaţie a interacţiunilor dintre nanopori proteici şi membrane lipidice artificiale................................................................................60
1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’. Metoda Montal-Muller de realizare a bistraturilor lipidice artificiale....................61
2. Tehnici de fluorescenţă.............................................................................67
3
3. Investigarea fluctuaţiilor de curent electric mediat de nanopori proteici iseraţi în biomembrane cu ajutorul analizei Fourier..................................70
4. Monitorizarea în timp real a diferenţei de potenţial de dipol a membranei lipidice artificiale.......................................................................................73
VII. Rezultate Experimentale. Modularea interacţiunilor dintre peptidele antimicrobiene şi membrane lipidice artificiale..................................................78
1. Influenţa alterării potenţialului de dipol membranar asupra inserţiei
alameticinei în bistraturile lipidice............................................................78 2. Studierea rolului jucat de alterarea potenţialului de dipol membranar în
procesele de inserţie membranară a magaininei 2 ...................................90 3. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de magainină 2 în
membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează controlabil sarcina electrică de suprafaţă şi în condiţii de pH diferit.........................................................................................................98
4. Cuantificarea alterării profilului de potenţial de suprafaţă şi de dipol membranar de către procesele de adsorbţie şi inserţie membranară a moleculelor de melitină în condiţii diferite de tărie ionică şi compoziţie lipidică variabilă......................................................................................102
5. Mecanisme moleculare de destabilizare a biomembranelor de către peptida antimicrobiană HPA3.................................................................111
6. Efectele induse de alterarea potenţialului de dipol membranar asupra interacţiunilor manifestate între moleculele de HPA3 şi membrane lipidice zwitterionice............................................................................................115
7. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de HPA3 în membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează gradul de împachetare a lanţurilor hidrocarbonate lipidice.....................................119
8. Determinarea coeficientului de difuzie a peptidei HPA3 prin membrana lipidică artificială.....................................................................................126
9. Modularea proceselor chimice ce au loc în interiorul porilor inseraţi în membrane artificiale, de către proprietăţile electrice ale membranei.....130
Bibliografie.........................................................................................................143 Lista de publicaţii..............................................................................................153
4
CAPITOLUL I. Peptide antimicrobiene - macromolecule biologice
esenţiale pentru viabilitatea organismelor pluricelulare
Peptidele antimicrobiene sunt macromolecule biologice sintetizate de
majoritatea organismelor vii şi sunt esenţiale în mecanismele de apărare chimică a
celulelor eucariote împotriva infecţiilor provocate de diferiţi agenţi patogeni
apăruţi în natură [1,2,3]. Printr-o abordare multidisciplinară, tema de cercetare de
faţă îşi propune să elucideze detaliile moleculare ale structurii, dinamicii şi
topologiei unor peptide antimicrobiene inserate în biomembrane, precum şi a
mecanismului de acţiune al acestora asupra membranelor celulare reconstituite. În
implementarea acestor obiective, se vor parcurge următoarele etape:
(a) investigarea prin metode de electrofiziologie a efectului litic al unor peptide
antimicrobiene cu proprietăţi citotoxice (de ex. magainină 2, melitină,) asupra
membranelor de tip bistrat reconstituit;
(b) idenţificarea mecanismelor care determină specificitatea acţiunii unor peptide
antimicrobiene asupra anumitor membrane celulare, ceea ce va permite ulterior
deducerea modului în care se poate amplifica şi lărgi spectrul proprietăţilor lor
litice (sau antimicrobiene - de distrugere a membranelor celulelor antimicrobiene);
în acest sens, se urmăreşte: (i) investigarea în detaliu a interacţiunilor moleculare
între peptidele antimicrobiene selecţionate şi membrane lipidice cu compoziţie
lipidică variabilă, ce alterează controlabil sarcina electrică de suprafaţă; (ii) efectele
induse de pH asupra interacţiunilor manifestate între peptidele antimicrobiene şi
membrane lipidice zwiterionice şi anionice; (iii) rolul jucat de modificarea
asimetrică a potenţialului de dipol membranar în procesele de inserţie membranară
a peptidelor antimicrobiene;
(c) caracterizarea electrofiziologică şi prin metode de fluorescenţă a cineticii şi a
proprietăţilor de transport ale unor peptide antimicrobiene în funcţie de
proprietăţile fizice şi mecanice ale membranelor lipidice reconstituite.
5
CAPITOLUL II. Elemente structurale şi funcţionale ale peptidelor
antimicrobiene
Între anii 1920 şi 1950, mulţi compuşi antimicrobieni au fost izolaţi,
prezentând o anumită selectivitate pentru bacterii Gram-pozitive şi Gram-negative.
În general aceste peptide antimicrobiene naturale sunt structuri bazice compuse din
12-50 de aminoacizi, existând astăzi peste 800 de asemenea compuşi descrişi în
bazele de date privind peptidele antimicrobiene (Tossi, A.
http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag2.htm).Structura primară, amfifaticitatea,
încărcarea cationică şi dimensiunile lor le permit acestora să se ataşeze şi să se
insere în membranele lipidice pentru a forma pori apoşi, ceea ce conduce la
distrugerea acestora şi lizarea celulei microbiene [4,5,6,7,8,9].
Principalele caracteristici care stau la baza activităţii şi specificităţii
peptidelor antimicrobiene sunt:
Secvenţa primară
Sarcina electrică netă
Structura secundară – majoritatea peptidelor antimicrobiene nu au o structură
secundară bine definită în soluţii apoase dar, la nivelul membranelor celulare îşi
pot asuma o varietate de structuri secundare cum ar fi structuri α-helix (cele mai
răspândite în natură), β- sheet sau structuri ciclice;
Hidrofobicitatea – reprezintă procentul de reziduuri aminoacidice hidrofobe
existente în secvenţa primară a peptidei şi în general pentru peptidele
antimicrobiene este de ~ 50%;
Amfifaticitatea – reprezintă proprietatea peptidelor antimicrobiene de a
prezenta o succesiune de aminoacizi hidrofili şi aminoacizi hidrofobi dispuşi de o
parte şi de cealaltă a structurii de α-helix;
Unghiul polar – reprezintă o măsură a proporţiei relative a părtii polare a unei
structuri α- helix, faţă de partea hidrofobă;
CAPITOLU III. Descrierea moleculară a interacţiunilor dintre peptidele
antimicrobiene şi membrane lipidice artificiale
Deşi au existat încercări de a explica mecanismul lor de acţiune prin
modele de tipul porilor transmembranari clasici, a porilor toroidali sau de inserţie
membranară şi distrugere a membranelor, există încă discuţii privind modalitatea
exactă de acţiune asupra microorganismelor în vivo. Este general acceptat faptul că
peptidele antimicrobiene ucid celula microbiană prin “invazia” membranei
celulare, deşi mecanismele care sunt implicate în acest proces nu sunt cunoscute în
detaliu. Modelul acceptat astăzi, prin care peptidele antimicrobiene îşi manifestă
funcţionalitatea, implică existenţa mai multor etape succesive cum sunt: asocierea
peptidelor pe suprafaţa membranară, asamblarea peptidelor în structuri secundare
definite la nivelul suprafeţelor membranare, inserţia peptidelor în biomembrane şi
în final, formarea porilor transmembranari, aşa cum sunt sugerate în figura III.1.
agregare pori
transmembranarinsertie
membranara asocierea
membranara
in solutie
Figura III.1. Reprezentarea schematizată a etapelor succesive de asociere, inserţie şi
formare a porilor transmembranari de către majoritatea peptidelor antimicrobiene[6].
Destabilizarea membranelor prin mecanismele enumerate anterior, poate
fi urmată de procesul de translocare al anumitor peptide pe partea internă a
membranei celulare, ceea ce permite interacţiunea acestora cu ţinte intracelulare,
alterând anumite procese intracelulare [10,11,12,13,14].
6
7
CAPITOLUL IV. Manifestări electrice ale membranelor biologice
Membranele biologice sunt structuri supramoleculare alcătuite în
principal din lipide şi proteine, cu rol esenţial în menţinerea integrităţii celulare
prin aceea că se constituie în bariere de permeaţie foarte selective între mediile
intra - şi extracelular. În general, se poate spune că profilul electric al
biomembranelor se constituie din contribuţia a trei componente majore: potenţialul
transmembranar, potenţialul de dipol şi potenţialul de suprafaţă [15,16,17]. Spre
deosebire de potenţialul transmembranar, (Ψeq.), care apare ca o consecinţă a
proprietăţii de semipermeabilitate a membranei celulare pentru difuzia pasivă a
unor specii ionice, potenţialul de suprafaţă, (Ψs), apare drept consecinţă a
existenţei unei sarcini electrice nete de încărcare a interfeţelor membrană biologică
- soluţie electrolitică [85,86]. Cea de-a treia componentă de potenţial, ce are rol în
stabilirea diferenţei de potenţial transmembranar totale pentru o membrană
biologică, se numeşte potenţial de dipol membranar, (Ψd). Studii structurale ale
biomembranelor au relevat faptul că originea potenţialului de dipol este dată de doi
factori principali şi anume: pe de o parte orientarea grupărilor dipolare localizate în
moleculele lipidice: dipolul corespunzator grupării carbonil din legatura esterică
(P~1.8 D) şi dipolul capătului terminal P—N+ (P~3.5÷9.5 D), pe de altă parte
momentele dipolare corespunzatoare moleculelor de apă situate la interfaţa
membrană-soluţie apoasă (P~1.83 D).
Parametru
electric
Ψs ( mV) Ψd (mV) Ψeq. (mV)
Membrana celulară - (15÷30) -(200÷300) -70 (≤ 200)
Bistrat lipidic ≤ - 200 -(300÷800) ≤ ± 300
Tabel IV.1. Valorile medii reprezentative pentru potenţialul de suprafaţă, Ψs,
potenţialul transmembranar, Ψeq., şi potenţialul de dipol, Ψd, în funcţie de sistemul
fizic în care se manifestă.
În concluzie, contribuţia celor trei tipuri de potenţial electric la nivelul
membranelor biologice poate fi reprezentată sugestiv în figura IV.1. În funcţie de
compoziţia membranei, natura şi tăria ionică a mediului extracelular, sistemele
biologice pot avea valori destul de diferite ale componentelor ce contribuie la
profilul electric biomembranar. În tabelul IV.1. sunt date valorile medii
reprezentative pentru potenţialul de suprafaţă, potenţialul transmembranar şi
potenţialul de dipol, în funcţie de sistemul fizic în care se manifestă, şi anume
membrană biologică şi bistrat lipidic reconstituit artificial.
8
Figura IV.1. Reprezentarea profilului electric ce caracterizează membranele celulare:
potenţialul transmembranar, Ψeq, potenţialul de dipol, Ψd, şi potenţialul de suprafaţă,
Ψs.
Astfel, se poate spune că celulele au dobândit evolutiv abilitatea de a
detecta, descifra, procesa şi genera semnale electrice periodice, ceea ce implică
faptul că acestea sunt capabile de a produce câmpuri electrice periodice şi pot
răspunde la variaţii de câmp electric sau magnetic externe.
xex 0
o
--
- -+
I II+
+
-
-
P ~ 3.5 – 9.5
P ~ 1.83
P ~ 1.8
Ψd .ln eq
II
IIII V
C
C
Fz
RTVV
CAPITOLUL V. Elemente de mecanica bistratului lipidic membranar
Un factor extrem de important pentru funcţionalitatea proteinelor
membranare, îl constituie diversitatea lipidelor ce intră în alcătuirea membranelor
biologice. Proprietăţile elastice ale membranei, influenţează susceptibilitatea
acesteia faţă de anumite peptide antimicrobiene chiar în primele etape ale
mecanismelor de asociere a acestora, întrucât inserţia unor peptide în membrana
celulară determină o modificare a proprietăţilor mecanice ale membranei [18,19].
Pentru a estima diferenţa de energie liberă asociată proceselor de partiţie a unor
peptide în membranele celulare, trebuie să luam în calcul contributia termenilor
energetici la energia liberă asociată acestor procese de inserţie membranară
[20,21].
0000 ln bilayersolvqEppartitie GGGKRTG (1)
Figura V.1. Reprezentarea alterării profilului forţelor intermoleculare manifestate în
bistratul lipidic, ca urmare a proceselor de inserţie membranară a unor
peptide; d0 ~ 30 Å, d0 reprezintă grosimea hidrofobă a bistratului lipidic
nedeformat iar l reprezintă lungimea moleculei peptidice inserate în
membrană [21].
Inserţia unei peptide în bistratul lipidic, va determina o deformare a
bistratului indusă de manifestarea unor forţe de compresie şi curbare a celor două
9
monostraturi lipidice, aşa cum este sugerat în figura V.1. Diferenţa de energie
liberă asociată deformării bistratului lipidic ca urmare a proceselor de inserţie a
unor peptide în membrana biologică, G0bilayer (kcal mol-1), depinde în mare
măsură de proprietăţile elastice ale bistratului cuantificate prin intermediul
densităţii de energie pe unitatea de suprafaţă, asociată deformării bistratului lipidic,
wdeformation.
compresionbendingndeformatiobilayer wwwG 0 (2)
Această densitate de energie de deformare membranară este dată în
principal de contribuţia a doi termeni: wbending – densitatea de energie liberă, pe
unitatea de suprafaţă, asociată proceselor de încovoiere a monostratului lipidic,
care depinde de modificarea curburii intrinseci a monostratului lipidic c0 (nm-1) şi
de modulul de încovoiere membranară, Kc (pN nm); şi wcompresion - densitatea de
energie liberă pe unitatea de suprafaţă, asociată proceselor de compresie (subţiere)
locală a bistratului lipidic, care depinde de modificarea grosimii bistratului lipidic
(u), şi de modulul de compresibilitate, Ka (pN nm-1), Studii din literatura actuală au
permis determinarea valorilor parametrilor Ka (modulul de compresibilitate
membranară) şi Kc (modulul de incovoiere membranară), pentru diferite sisteme
lipidice şi, aşa cum se observă din tabelul V.1, există diferenţe semnificative între
valorile acestora în funcţie de compoziţia lipidică a unui sistem membranar, ceea
ce indică faptul că procesele de inserţie memnbranară a unor peptide sunt
influenţate de proprietăţile elastice ale membranei.
Sistem lipidic Ka (10-3 · N/m) Kc (N · m)
SOPC 235 0.90 DOPC 265 0.85
SOPC:Chol 660 2.46
Tabel V.1. Valori ale modulelor de compresibilitate (Ka) şi încovoiere (Kc)
membranară, corespunzatoare membranelor reconstituite cu compoziţie lipidică
variabilă [21].
10
11
CAPITOLUL VI. Metode de investigaţie a interacţiunilor dintre
nanopori proteici şi membrane lipidice artificiale
În implementarea acestei teze s-au folosit tehnici recunoscute din
domeniile biofizicii, electrofiziologiei moleculare (electrofiziologia canalelor
ionice, tehnici de înregistrare la nivel de singură moleculă (un singur canal ionic) şi
metoda compensării câmpului electric intern (IFCM) pentru măsurători ale
potenţialului de dipol membranar), spectroscopiei de fluoresecenţă pentru a descrie
pe deplin mecanismele interacţiunii dintre peptide antimicrobiene selectate şi
membrane lipidice reconstituite.
În implementarea acestui proiect, am utilizat ca metodă de realizare a
membranelor lipidice artificiale, metoda Montal-Muller (1972), care are la bază
caracterul amfifatic al moleculelor fosfolipidice din care se poate reconstitui o
membrană artificială, utilizând analogi ai lipidelor întâlnite în membranele
biologice naturale. În completarea studiilor electrofiziologice au fost implementate
tehnici de spectroscopie de fluorescenţă, prin care se poate urmări cinetica
proceselor de translocare, prin membranele lipidice reconstituite, a unor peptide
antimicrobiene ce conţin în secvenţa lor primară aminoacidul triptofan.
Pentru a evalua interdependenţa dintre peptidele antimicrobiene şi
caracteristicile electrice ale membranelor lipidice (în principal potenţialele de dipol
şi de suprafaţă), am utilizat Metoda compensării câmpului electric intern (IFCM) ,
care foloseşte binecunoscuta dependenţă dintre capacitatea membranei şi diferenţa
de potenţial aplicată, prin intermediul mediului grafic LabVIEW. Un protocol
eficient pentru cuantificarea diferenţei potenţialului de dipol dintre cele două
monostraturi ale membranei lipidice este acela prin care membrana lipidică se
supune unei diferenţe de potenţial sinusoidale ce variază în timp, ce conţine şi o
componentă constantă (U0 ) ‘dc bias’:
U = U0 + U1 sin(2πυt) (1)
12
La aplicarea unei astfel de diferenţe de potenţial, este uşor de demonstrat
că valoarea curentului capacitiv rezultat prin membrana, ca răspuns la diferenţa de
potenţial aplicată (U), la care se adaugă şi diferenţa potenţialui de dipol al
biomembranei (Δp), constă în trei componente armonice periodice (i.e., având
frecvenţele ν, 2ν şi 3ν). Cu o relevanţă directă pentru implementarea metodei IFC,
este expresia ce descrie componenta celei de a doua armonici a curentului
capacitiv: I2 = 3αC0 (U1)2 (U0 +Δp) (2πυ) sin(4πυt) (2)
Din analiza acestei formule, se observă că prin variaţia continuă în sensul
corect al tensiunii dc bias (U0) aplicate, se va ajunge la situaţia în care (U0 +Δp) =
0, care va conduce la atingerea valorii nule a lui I2. Într-o asemenea situaţie, se
poate afirma că diferenţa potenţialului de dipol (Δp) a membranei lipidice studiate
este egală şi de semn contrar cu diferenţa de potenţial dc bias (-U0). Principiul de
lucru al metodei pentru monitorizarea automată, în timp real, a diferenţei
potenţialului de dipol (Δp) a membranei lipidice este descrisă în figura VI.1.
Tensiuna dc bias precum şi componenta sinusoidală a diferenţei de potenţial (U =
U0 + U1 sin (2πυt), ν = 220 Hz, U1 = 60 mV) au fost aplicate membranei lipidice
din exterior printr-un canal D/A al cartelei de achiziţie. Urmărind o analiză
spectrală în timp real, trei componente armonice, egal depărtate una de alta, au fost
vizualizate în power-spectrum-ul curentului electric înregistrat. În funcţie de
amplitudinea celei de-a doua armonice din curentul electric transmembranar,
valorii iniţiale a tensiunii bias (U0) i-au fost adăugate (sau scăzute) digital valori de
ordinul a 2 mV, urmărindu-se scăderea progresivă pentru amplitudinea celei de-a
doua armonice a curentului electric rezultat prin membrană. Imediat ce această
armonică scade sub o valoare critică, A(4πν) ≤ δ (figura VI.1), codul va opri
întreaga secvenţă de iteraţii descrisă mai sus, iar ultima valoare a deviaţiei de
potenţial inregistrată de canalul de ieşire D/A va reprezenta diferenţa de potenţial
de dipol (Δp) a membranei. Alternativ, pentru a înregistra doar modul în care
diferenţa de potenţial de dipol se comportă în timp ca rezultat al unor interacţiuni
specifice dintre biomembrană şi diferiţi compuşi chimici exogeni, valoarea bias a
semnalului de tensiune aplicat este păstrată constantă (de obicei 0 pentru
membrane simetrice formate doar din fosfatidilcolină), şi se înregistrează evoluţia
în timp a amplitudinii armonicei a doua, care devine proporţională cu valoarea
diferenţei de potenţial de dipol transmembranar.
Figura VI.1. Diagrama-bloc reprezentând instrumentul virtual folosit la monitorizarea
automată, în timp real, a diferenţei potenţialului de dipol (Δp) a membranei. Diferenţa
de potenţial (U) a fost aplicată membranei printr-un canal output D/A al unei plăci de
achiziţie, iar curentul electric rezultat (I) a fost reintrodus într-un canal A/D al
cardului PCI. Paşii simultani A/D şi D/A, analiza spectrală şi manipularea datelor au
fost implementate cu ajutorul limbajului de programare grafică LabView. Panelul (i)
reprezintă diferenţa de potenţial din interiorul membranei datorată diferenţei de
potenţial de dipol din cele două monostraturi (Δp); când deviaţia „dc” a diferenţei de
potenţial aplicată (U0) compensează (Δp), amplitudinea celei de-a doua armonice din
(I) atinge valoarea minimă.
13
14
CAPITOLUL VII. REZULTATE EXPERIMENTALE ŞI DISCUŢII
Modularea interacţiunilor dintre peptidele antimicrobiene şi
membrane lipidice artificiale
VII. 1. Influenţa alterării potenţialului de dipol membranar asupra inserţiei
alameticinei în bistraturile lipidice
Una din paradigmele considerate importante în acest studiu, a fost cea
referitoare la interacţiunile manifestate între câmpul electric dipolar membranar şi
oligomerii de alameticină inseraţi în membranele lipidice artificiale. Am încercat
astfel să monitorizez cantitativ maniera în care inserţia monomerilor de
alameticină modulează valoarea potenţialului de dipol membranar. Ţinând cont de
momentul de dipol mare al monomerilor de alameticină, şi anume (40 ÷ 80) D, am
argumentat că este foarte probabil ca momentul de dipol al monostratului lipidic
cis din partea unde a fost adăugată alameticina să sufere schimbări dependente de
timp, care pot reflecta repartizarea alameticinei între faza apoasă şi monostratul
lipidic. Pentru a explica rezultatele prezentate în figura VII.1.1, panelul a, se poate
apela la ipoteza unei continue variaţii a momentelor dipolare ale monostratului cis,
cauzată de monomerii de alameticină interfaciali. Pentru a cuantifica modificarea
momentului de dipol pentru monostratul cis, am realizat schimbări incrementale
mici (5 mV) a componentei dc a diferenţei de potenţial electric aplicată. Din figura
VII.1.1, panel b, se observă că potenţialul electric pozitiv de ~ 85 mV în partea
trans a membranei lipidice conduce la o anulare aproape completă a amplitudinii
celei de a doua componente armonice a curentului capacitiv prin membrană. Printr-
o analiza simplă, se observă că pătrunderea parţială a monomerilor de alameticină
în monostratul cis creşte momentul de dipol al acestuia. Dacă modificările
incrementale ale componentei dc au fost făcute în domeniu negativ de potenţial
electric, efectul de anulare a amplitudinii celei de a doua componete armonice nu a
mai fost observat iar peak-ul acestei componente a devenit mai mare.
Figura VII.1.1. (a) Evoluţia în timp a amplitudinii componentei celei de a doua
armonici (măsurată la 440 Hz) a curentului capacitiv mediat prin membrana
artificială, în condiţia în care diferenţa de potenţial sinusoidală aplicată dc bias este
nulă. (b) Schimbările incrementale ale componentei dc a diferenţei de potenţial
aplicată, semnal care reduce amplitudinea armonicii a doua la ~ 85 mV, arată o
creştere a momentului de dipol, corespunzătoare unei diferenţe de potenţial
de aproximativ aceeaşi magnitudine, al monostratului lipic unde au fost
adsorbiţi monomerii de alameticină.
Urmărind influenţa exercitată de scăderea potenţialului de dipol
membranar asupra activităţii alameticinei inserate într-o membrană lipidică
artificială, din datele experimentale indicate în figura VII.1.2, se observă că, prin
comparaţie cu situaţia ‘control’, interacţiunea moleculelor de phlorizin cu
membrana artificială conduce la creşterea vizibilă a activităţii cinetice a
oligomerilor de alameticină inseraţi în membrana lipidică. În aceste condiţii, am
propus ipoteza conform căreia activitatea alameticinei în membrane artificiale
creşte în prezenţa phloridzinului, datorită faptului că monomerii de alameticină ce
urmează a fi partiţionaţi în bistratul lipidic vor ‘simţi’ un câmp electric membranar
dipolar mai redus; astfel, în virtutea inserţiei lor vectoriale, concentraţia acestora în
planul membranei artificiale va fi mai mare prin comparaţie cu situaţia ‘control’, în
care nu se utilizează phlorizin.
15
Figura VII.1.2. (a) Înregistrări electrice ale activităţii alameticinei (10 nM) inserate
întro membrană lipidică artificială, în absenţa (‘control’) şi prezenţa moleculelor de
phlorizin (500 µM). Starea ‘închis’ a alameticinei este indicată de ‘C’; (b şi c)
Reprezentări ‘mărite’ ale activităţii oligomerilor de alameticină măsurate la - 80 mV,
în cazurile menţionate anterior, împreună cu histogramele de amplitudini ale
curenţilor electrici prin alameticină în absenţa şi prezenţa a 500 µM phlorizin.
Concluzii:
Procesele de adsorbtie si insertie membranara a peptidei antimicrobiene
alameticina induc alterarea potentialului de dipol membranar.
Alterarea profilului de potenţial electric membranar – cauzat în principal
de modificarea asimetrică a potenţialului de dipol membranar – conduce
la modificarea proprietăţilor de transport ionic al canalelor de alameticină.
Modificand controlabil semnul şi magnitudinea potenţialului de dipol
membranar, se poate modula gradul de inserţie membranară a peptidelor
antimicrobiene.
16
VII.2. Studierea rolului jucat de alterarea potenţialului de dipol membranar
în procesele de inserţie membranară a magaininei 2
În continuarea studiilor ce vizează influenţa potenţialului de dipol
membranar asupra activităţii membranare a unor peptide, o următoare etapă a fost
studierea inserţiei peptidei antimicrobiene magainină 2 în membrane lipidice, în
diferite condiţii fiziologice. Astfel, într-un prim set de experimente, am evaluat
calitativ influenţa exercitată de alterarea potenţialului de dipol transmembranar
asupra inserţiei magaininei 2 în bistraturi lipidice zwitterionice. formate din L - α-
Phosphatidylcholină.
Figura VII.2.1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ ce
evidenţiază creşterea fluctuaţiilor de curent electric mediat de canalele de magainină2,
în urma interacţiunii membranei lipidice cu 200 µM phloretin, la o valoare a diferenţei
de potenţial externe aplicate membranei de -190 mV.
Utilizând 200 µM phloretin, adăugat în aceeaşi cuvă în care a fost
adăugată iniţial şi soluţia peptidică, am observat o creştere accentuată a activităţii
canalelor de magainina 2 inserate în membrana artificială, cuantificată prin
fluctuaţiile de curent electric mediate de porii transmembranari de magainina 2
17
inseraţi în membrana artificială. Astfel, după cum poate fi observat în figura
VII.2.1, spre deosebire de cazul ‘control’, în absenţa moleculelor de phloretin, în
urma adăugarii phloretinului, interacţiunea dintre moleculele de phloretin şi
membrana lipidică artificială facilitează inserţia membranară a moleculelor de
magainina 2, fapt ce este reflectat de creşterea fluctuaţiilor curentului ionic
înregistrat prin canalele de magainina 2.
Un alt compus chimic care poate modula potenţialul de dipol membranar,
este agentul chimic RH 421, un compus din clasa detergenţilor, care, prin adsorbţia
şi orientarea în monostratul lipidic, conduce la creşterea potenţialului de dipol
membranar, întrucât momentul de dipol asociat acestor molecule de RH421 este de
~ 10 Debye.
Figura VII.2.2. Înregistrări electrofiziologice reprezentative care evidenţiază efectele
induse de RH421 asupra fluctuaţiilor de curent electric mediate de canalele de
magainină 2 inserate în membrana lipidică zwitterionică (phosphatidilcolină),
înregistrate la o diferenţă de potenţial aplicată extern membranei de -180 mV.
Ţinând cont de raţionamentul propus anterior, am putea face presupunerea
că, în urma adsorbţiei moleculelor de RH421 în monostratul lipidic, ceea ce ar
conduce la creşterea potenţialului de dipol membranar, inserţia magaininei2 în
18
19
membrană să fie defavorizată, fapt ce nu a fost evidenţiat din datele experimentale.
Dimpotrivă, datele experimentale din figura VII.2.2, demonstrează faptul că,
adăugarea agentului chimic RH421 în soluţia fiziologică, determină creşterea
activităţii canalelor de magainină2 inserate în membrana artificială. Un parametru
relevant din punct de vedere statistic pentru studierea activităţii canalelor de
magainină2 inserate în membrana lipidică, îl reprezintă analiza deviaţiilor standard
a fluctuaţiilor de curent ionic mediate de porii de magainină 2, σ. Astfel, deviaţia
standard a fluctuaţiilor de curent ionic avea o valoare mult mai mica σ = 8.3 pA,
înainte de adăugarea agentului chimic RH-421 în aceeaşi cuvă în care a fost
adăugată şi soluţia de peptidă, faţă de valoarea de σ = 39.1 pA, obţinută în urma
interacţiunii moleculelor de phloretin cu bistratul lipidic. O ipoteză a datelor
obţinute este aceea că intensificarea activităţii canalelor de magainină2 formate în
membrana artificială, în urma adăugării agentului chimic RH 421, este datorată în
principal de creşterea razei de curbură a monostratului lipidic în care se adsorb
moleculele de RH421, factor determinant în procesele de formare a porilor
transmembranari de tipul celor toroidali.
Este esenţial astfel mecanismul prin care peptide antimicrobiene
destabilizează membrane celulare cu diferite compoziţii, existând o
interdependenţă între structura, dinamica şi funcţia unor macromolecule şi
activitatea membranară a unor peptide antimicrobiene.
Concluzii:
Scăderea momentului de dipol membranar indusă de moleculele de
phloretin conduce la facilitarea adsorbţiei moleculelor de magainina 2 în
membrană.
Adsorbţia moleculelor de RH421 în monostratul lipidic facilitează
procesul de formare a porilor toroidali de magainina 2 în membrana
lipidică, prin mărirea razei de curbură a monostratului lipidic în care se
adsorb.
VII.3. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de magainină 2 în
membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează
controlabil sarcina electrică de suprafaţă a membranei şi
în condiţii de pH diferit
Interacţiunile electrostatice între peptidele antimicrobiene cationice şi
componentele anionice ale membranei sunt un factor major ce explică acţiunea
selectivă asupra celulelor microbiene, aşa cum a fost detaliat într-un capitol
anterior. În acest sens, un obiectiv propus a fost de a studia transportul ionic mediat
de porii de magainină2 inseraţi în membrane artificiale cu compoziţie lipidică
variabilă. Astfel, utilizând membrane artificiale formate din lipide zwiterionice PC
(L-α- Phosphatidylcholine) şi lipide anionice DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-
[Phospho-rac-(1-glycerol)]), am putut altera controlabil sarcina electrică de
suprafaţă a membranei artificiale reconstituite.
Figura VII.3.1. Date experimentale reprezentative, ce evidenţiază fluctuaţiile de curent
electric mediate de canalele de magainină 2 (0.4µM) la valori pozitive (panel b şi c) şi
respectiv negative (panel a şi c) ale diferenţei de potenţial aplicate (+100 mV,
-100 mV), în condiţiile în care bistratul lipidic este constituit din lipide neutre din
punct de vedere electric (fosfatidilcolina - panel b şi d) şi încărcate electric negativ
(DOPG - panel c şi d)
20
Următorul obiectiv abordat în acest capitol a fost studierea efectelor
exercitate de pH-ul soluţiei fiziologice asupra procesului de inserţie a magaininei2
în membrane artificiale constituite din lipide anionice.
Figura VII.3.2. Experimente de electrofiziologie la nivel de ‘singură moleculă’, ce
evidenţiază fluctuaţiile de curent electric mediate de canalele de magainină 2 la diferite
valori ale diferenţei de potenţial aplicate (+100 mV, -100 mV), în condiţii de pH diferit.
21
Astfel, scăderea tăriei interacţiunilor electrostatice dintre moleculele de
magainină 2 şi capetele polare ale lipidelor determină o acumulare a moleculelor
peptidice adsorbite pe suprafaţa membranei într-o concentraţie mult mai mică, ceea
ce defavorizează inserţia acestei peptide în membrana artificială şi implicit
formarea porilor transmembranari.
Concluzii
Membranele lipidice anionice favorizează procesul de inserţie
membranară a monomerilor de magainină 2, ceea ce indică faptul că
interacţiunile electrostatice reprezintă un factor determinant în procesele
de adsorbţie membranară a peptidelor antimicrobiene, întrucât implică
creşterea concentraţiei acestora la interfaţa membrană-mediu fiziologic.
Procesul de inserţie a magaininei 2 în membranele lipidice anionice, este
defavorizat de valori acide ale pH-ului soluţiei fiziologice.
VII.4. Cuantificarea alterarii profilului de potenţial de suprafaţă şi de dipol
membranar de către procesele de adsorbţie şi inserţie membranară a
moleculelor de melitină în condiţii diferite de tărie ionică
şi compoziţie lipidică variabilă.
În continuare, am urmărit studierea posibilei corelaţii existente, din punct
de vedere electric, între potenţialul de suprafaţă şi de dipol membranar şi peptida
antimicrobiană melitina, inserată în membrane artificiale, utilizând metoda
compensării câmpului electric intramembranar .
a) b)
Figura VII.4.1. a) Înregistrările reprezentative ale schimbărilor în timp real ale
potenţialului de suprafaţă şi de dipol (Δp) al membranei lipidice zwitterionice, care
apar ca rezultat al adăugării a 70 nM soluţie peptidică în cuva cis, în condiţii de 0.1M
NaCl; b) Schimbările negative incrementale ale componentei dc a diferenţei de
potenţial aplicată, semnal care anulează amplitudinea celei de a doua armonici la
~ - 22 mV, ceea ce arată o schimbare cantitativă comparativă a momentului de dipol al
monostratului lipidic unde au fost adsorbite moleculele peptidice.
Păstrând ‚dc bias’ (U0) a semnalului tensiunii aplicate la zero, evoluţia în
timp a amplitudinii componentei celei de a doua armonici măsurată la 440 Hz,
reflectă cu precizie dependenţa în timp a modificării termenului Δp datorată
adsorbţiei monomerilor de melitină în monostratul lipidic. Astfel se poate
concluzionă că, schimbările negative incrementale ale componentei U0 a diferenţei
22
de potenţial electric aplicată, semnal care egalează amplitudinea celei de a doua
armonici la ~ - 22 mV, arată o scădere a momentului de dipol al monostratului
lipidic unde a fost adaugată soluţia peptidică.
În continuare, am urmărit cuantificarea alterării profilului electric
membranar în urma adiţiei soluţiei de melitină cu aceeaşi concentraţie utilizată în
experimentele anterioare, 70 nM, dar în condiţiile în care tăria ionică a mediului
fiziologic a fost mai mare faţă de cazul anterior, şi anume NaCl 0.5 M.
a) b)
Figura VII.4.2. (a) Evoluţia în timp real a celei de-a doua componente spectrale a
curentului ionic capacitiv măsurat prin bistratul lipidic, după adăugarea a 70 nM
soluţie de melitină, în condiţii fiziologice de 0.5 M NaCl; (b) Dependenţa amplitudinii
celei de-a doua componente spectrale a curentului ionic măsurat prin bistratul lipidic,
în funcţie de U0, ce arată o schimbare cantitativă comparativă a momentului de dipol
al monostratului lipidic unde au fost adsorbite moleculele peptidice, de ~ - 37.5 mV.
Evoluţia în timp real a amplitudinii componentei celei de a doua armonici
(măsurată la 440 Hz) a curentului capacitiv prin membranele artificiale, în
condiţiile în care diferenţa de potenţial sinusoidală aplicată ‘dc bias’ (U0) este nulă,
după adăugarea melitinei în concentraţie de 70 nM, reflectă alterarea în principal a
momentului de dipol al monostratului lipidic unde monomerii de melitină au fost
adsorbiţi, aşa cum a fost explicat anterior. Modificarea incrementală a componentei
U0 a diferenţei de potenţial aplicată, până la obţinerea unui semnal care reduce
amplitudinea armonicii a doua la ~ - 37 mV, (figura VII.4.2-b), arată o scădere a
23
24
momentului de dipol mult mai accentuată în cazul de faţă, când s-a folosit o tărie
ionică mai mare a mediului fiziologic. Este cunoscut faptul că în prezenţa sărurilor,
reziduurile cationice de la nivelul peptidei antimicrobiene melitină, concurează cu
cationii din soluţia fiziologică pentru aceleaşi situsuri de la nivelul membranei
lipidice. Faptul că în final, rezultă o alterare mai accentuată a potenţialului de dipol
membranar şi de suprafaţă, cuantificată la valoarea de ~ -37 mV, în condiţii de
tărie ionică mai mare, poate avea sens dacă se consideră că diminuarea
potenţialului de suprafaţă în condiţii de 0.5 M are un rol hotărâtor în alterarea
profilului electric membranar.
Păstrând tăria ionică a soluţiei fiziologice de 0.5 M şi aceeaşi concentraţie
a soluţiei peptidice folosite, 70 nM, datele experimentale au arătat faptul că
prezenţa colesterolului în membrana lipidică (30% w/w în L-α-
phosphatidylcholine) induce o alterare mai mică a potenţialului de dipol
membranar, cuantificată la valoarea de ~ -30 mV, faţă de experimentele realizate
cu membrane lipidice lipsite de colesterol.
Concluzii
Adsorbţia moleculelor de melitină pe suprafaţa membranei lipidice induce
atât creşterea potenţialului de suprafaţă cât şi diminuarea, mult mai
accentuată, a potenţialului de dipol al monostratului în care se adsorb.
În condiţii diferite de tărie ionică, în prezenţa sărurilor, reziduurile
cationice de la nivelul peptidei antimicrobiene melitina, concurează cu
cationii din soluţia fiziologică pentru aceleaşi situsuri de la nivelul
membranei lipidice.
Prezenţa colesterolului în membrana lipidică reduce efectul monomerilor
de melitină de a scădea potenţialul de dipol membranar şi diminuează
activitatea porilor transmembranari de melitină.
VII. 5. Mecanisme moleculare de destabilizare a biomembranelor de către
peptida antimicrobiană HPA3
Prin experimente de elecrofiziologie la nivel de ‚singură moleculă’ am reuşit
evidenţierea modului de acţiune al peptidei antimicrobiene HPA3, care este un
analog al peptidei HP(2-20) produsă de bacteria Gram-negativă Helicobacter
pylori (implicată esenţial în patologia bolilor gastrointestinale precum gastrite sau
ulcer), şi care, prin proprietăţile sale antimicrobiene oferă respectivei bacterii un
avantaj competitiv faţă de alte bacterii din fluidul gastrointestinal.
Figura VII.5.1. Date experimentale ce evidenţiază amplitudinea curenţilor electrici
mediaţi de canalele de HPA3 inserate în membrana artificială, la diferite valori ale
diferenţei de potenţial aplicate, împreună cu histogramele de amplitudini ale curenţilor
ionici, corespunzătoare activităţii canalelor de HPA3 în condiţii electrofiziologice de 0.5
M NaCl, 10 mM Bis Tris Propane, pH ~ 7. Diagrama curent tensiune ce caracterizează
proprietăţile de transport mediate de prima stare conductivă a canalelor de HPA3
inserate în membrana lipidică zwitterionică, indicata prin ‘o1’.
25
Valorile reproductive ale conductanţelor corespunzătoare destabilizării
membranei celulare induse de asocierea monomerilor de HPA3 în membrane
zwitterionice, la diferite valori ale potenţialelor aplicate membranei, au demonstrat
existenţa porilor transmembranari formaţi prin asocierea peptidelor la nivelul
membranelor lipidice. Scăderea în timp, după 30 minute, a raportului deviaţiilor
standard corespunzătoare fluctuaţiilor curentului ionic mediat de porii
transmembranari de HPA3 în condiţiile aplicării membranei a unor diferenţe de
potenţial electric negative (-100 mV) şi pozitive ( +100 mV), indica faptul că
monomerii de HPA3 translocă prin membrana lipidică.
Figura VII.5.2. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ care
evidenţiază evoluţia în timp a fluctuaţiilor de curent ionic mediate de porii de HPA3
(5 µM) inseraţi în membrana lipidică, în condiţiile în care s-au aplicat membranei
valori pozitive (panel A,C) şi negative (panel B, D) ale diferenţei de potenţial electric.
Concluzii:
Datele experimentale obţinute susţin ipoteza conform căreia mecanismul
molecular de acţiune al peptidei antimicrobiene HPA3, este dat de
formarea porilor transmembranari tranzienţi urmat de translocarea
monomerilor peptidici prin membrana biologică iar aceste procese sunt
facilitate electroforetic de către diferenţe de potenţial electric trans-
negative aplicate membranei.
26
27
VII. 6. Efectele induse de alterarea potenţialului de dipol membranar asupra
interacţiunilor manifestate între moleculele de HPA3 şi membrane lipidice
zwitterionice
Aşa cum aminteam în capitolul de materiale şi metode implementate în
acest studiu, un alt mod de a investiga mecanismele de interacţiune a peptidei
HPA3 cu membranele lipidice, poate fi realizat prin studierea influenţei exercitate
de modularea potenţialului de dipol membranar asupra activităţii canalelor de
HPA3 inserate în membrane lipidice zwitterionice. În acest sens am evaluat
calitativ influenţa exercitată de alterarea potenţialului de dipol transmembranar
asupra inserţiei peptidei antimicrobiene HPA3 în bistraturi lipidice zwitterionice,
formate din fosfatidilcolină.
Utilizând 200 µM phloretin, am observat că, spre deosebire de cazul
‘control’ (în absenţa phloretinului), în cazul interacţiunii dintre moleculele de
phloretin şi membrana lipidică artificială, este facilitată inserţia membranară a
moleculelor de HPA3, fapt reflectat de creşterea fluctuaţiilor curentului ionic
înregistrat prin canalele de HPA3, această accentuare a inserţiei membranare a
peptidei HPA3, fiind vizibilă atât în condiţiile aplicării membranei a unor diferenţe
de potenţial electric pozitive cât şi la valori negative ale diferenţei de potenţial
electric aplicate membranei lipidice. Explicaţia poate fi dată prin prisma faptului
că, în urma procesului de micşorare a potenţialului de dipol membranar de către
adsorbţia moleculelor de phloretin în zona hidrofilă a membranelor lipidice,
moleculele de HPA3 din soluţia apoasă vor resimţi un camp electric asociat
potenţialului de dipol membranar, avand o amplitudine mai mica şi astfel vor putea
penetra mai facil prin respectiva zona hidrofila. Aceasta ipoteza este sustinuta de
faptul ca, imediat după adaugarea phloretinului în partea cis a membranei,
abilitatea monomerilor de HPA3 de a forma pori devine mult mai accentuată şi la
tensiuni electrice pozitive aplicate membranei, induse de acumularea monomerilor
peptidici pe partea trans a membranei ca urmare a translocării acestora.
Figura VII.6.1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ ce
evidenţiază creşterea fluctuaţiilor de curent electric mediat de canalele de HPA3, în
urma interacţiunii membranei lipidice cu 200 µM phloretin, la pH = 7.2 şi la o valoare
a diferenţei de potenţial electric aplicate de + 80 mV ( panel A şi C) şi – 80 mV (panel B
şi D). Adăugarea a 200µM phloretin a fost realizată în partea cis a membranei lipidice,
la o valoare a diferenţei de potenţial electric aplicate de – 100 mV (panel E)
Concluzii
Diminuarea potenţialului de dipol al monostratului lipidic în partea cis a
membranei, unde este adăugată soluţia peptidică, facilitează în mod
semnificativ inserţia şi formarea porilor transmembranari de HPA3, ceea
ce inseamnă, în condiţii ‘in vivo’ o creştere a toxicităţii acestei peptide la
concentraţii mai mici a peptidei în mediul extracelular.
28
V II. 7. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de HPA3 în
membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează
gradul de împachetare a lanţurilor hidrocarbonate lipidice.
În continuarea acestui studiu am urmărit importanţa gradului de nesaturare
al lanţurilor hidrocarbonate ale lipidelor ce intră în componenţa biomembranei,
asupra interacţiunilor manifestate între peptida antimicrobiană HPA3 şi membrana
lipidică. Importanţa acestor studii este susţinută de informaţiile insuficiente până la
ora actuală legate de mecanismele clare prin care peptidele antimicrobiene, şi în
particular HPA3, îşi manifestă selectivitatea faţă de membranele celulare cu
compoziţie lipidică variabilă.
Figura VII.7.1.a) Reprezentarea structurală a moleculelor lipidice utilizate în
experimentele de electrofiziologie din acest studiu: POPC şi DOPC. b) Diagramele
curent-tensiune ce caracterizează din punct de vedere macroscopic proprietăţile de
transport ale porilor de HPA3 inseraţi în membrana artificială formată din lipide care
conţin un lanţ hidrocarbonat cu o singură nesaturare (POPC) şi membrana formată
din lipide ce conţin două lanţuri hidrocarbonate mononesaturate (DOPC).
Experimente de electrofiziologie realizate pe membrane artificiale
reconstituite din fosfatidilcolină cu unul (POPC) sau cu două (DOPC) lanţuri
hidrocarbonate mono - nesaturate, au demonstrat faptul că gradul mai mic de
împachetare al lanţurilor hidrocarbonate lipidice dat de prezenţa unui număr mai
29
mare de nesaturări (cum este molecula lipidică DOPC), facilitează activitatea
electrică a porilor de HPA3 inseraţi în membrana lipidică. Diagramele curent-
tensiune din figura VII.7.1 -b), înregistrate pe membrane realizate din lipide ce
conţin unul (POPC) sau două lanţuri hidrocarbonate mononesaturate (DOPC), pun
în evidenţă facilitarea mecanismelor de formare a porilor de către membranele
formate din DOPC. Aşa cum se poate observa în figura VII.7.2, în absenţa peptidei
în soluţia fiziologică (control), curentul electric înregistrat prin membrană, reflectă
doar contribuţia zgomotului termal, iar adiţia ulterioară a 1 µM HPA3 în soluţia
fiziologică, induce formarea unor agregate moleculare de tipul porilor în
membrana lipidică formată din POPC.
Figura VII.7.2. Înregistrări reprezentative care ilustreaza fluctuaţiile de curent ionic
mediate prin membrana lipidică reconstituită din POPC şi DOPC, în absenţa şi
prezenţa moleculelor peptidice în soluţia fiziologică.
În completarea studiilor electrofiziologice, am urmărit cinetica proceselor
de translocare a peptidei antimicrobiene HPA3 prin membrane lipidice cu
compoziţie lipidică diferită, utilizând tehnici de spectroscopie de fluorescenţă.
Astfel, măsurând intensitatea maximă a spectrelor de emisie în fluorescenţă a
triptofanului, conţinut în secvenţa primară a peptidei studiate, putem evalua
concentraţia peptidei care translocă prin porii formaţi în membrana lipidică.
30
Figura VII.7.3. Reprezentarea spectrelor normalizate de emisie în fluorescenţă a
reziduului aminoacidic triptofan din componenţa HPA3, înregistrate pe soluţia
fiziologică din cuva cis unde s-a adăugat soluţia peptidică în concentraţie de 1 µM, şi
pe soluţia din cuva trans, după promovarea inserţiei şi translocării peptidei prin
membrana formată din POPC.
31
Datele bazate pe spectroscopia de fluorescenţă, înregistrate din patru
experimente independente în care s-au utilizat membrane lipidice diferite, au
demonstrat că procentul relativ de peptidă HPA3 ce translocă prin membrană este
de 4.6 ± 1.7 în cazul membranelor lipidice reconstituite din DOPC şi 3.6 ± 1.9
pentru membrane reconstituite din POPC, demonstrând astfel procesul de facilitare
a interacţiunii dintre monomerii peptidici de HPA3 şi membrane reconstituite din
lipide cu un grad mai mare de nesaturare. Evaluarea concentraţiei relative de
peptidă HPA3, în cuvele cis şi trans după 5 minute, în care peptida a translocat prin
membrană, s-a realizat prin calcularea procentuală a maximului spectrului de
emisie în fluorescenţă a acestor probe, raportată la valoarea maximului de emisie în
fluorescenţă a spectrului înregistrat pe soluţia ‚buffer’ ce conţinea concentraţia
iniţială de peptidă adaugată la începutul fiecărui experiment, la aceeaşi lungime de
undă.
Figura VII.7.4. Reprezentarea spectrelor normalizate de emisie în fluorescenţă a
reziduului aminoacidic triptofan din componenţa HPA3, înregistrate pe soluţia
fiziologică din cuva cis unde s-a adăugat soluţia peptidică în concentraţie de 0.5 µM, şi
pe soluţia din cuva trans, după promovarea inserţiei şi translocării peptidei prin
membrana formata din DOPC.
Concluzii
Experimente de electrofiziologie realizate pe membrane artificiale
reconstituite din fosfatidilcolină cu unul sau cu două (lanţuri
hidrocarbonate mono-nesaturate, au demonstrat faptul că gradul mai mic
de împachetare al lanţurilor hidrocarbonate lipidice dat de prezenţa unui
număr mai mare de nesaturări (cum este cazul lipidei DOPC), facilitează
activitatea electrică a porilor de HPA3 inseraţi în membrana lipidică.
În plus, experimente de spectroscopie de fluorescenţă au permis analiza
cantitativă a proceselor de translocare a peptidei HPA3 prin membranele
lipidice reconstituite din lipide cu grade diferite de nesaturare,
demonstrând faptul că prin membranele formate din DOPC, cantitatea
netă de peptidă care translocă este cu ~ 22% mai mare decât în cazul
membranelor formate din POPC.
32
VII. 8. Determinarea coeficientului de difuzie al peptidei antimicrobiene
HPA3 prin membrana lipidică artificială
Pentru a determina coeficientul de difuzie a peptidei antimicrobene HPA3
prin membrana lipidica, D ( m2/s), am urmărit un raţionament simplu care are la
bază următoarele considerente: se presupune un bistrat lipidic având aria totală S
(m2) şi grosimea mieziului hidrofob δ (m), format între doua medii apoase
fiziologice fiecare de volum V (m3), cis sau trans, volume în care se va afla peptida
înainte (cis) şi după (trans) translocarea acesteia prin membrană. Presupunând dN -
numărul de molecule peptidice care translocă prin membrana lipidică în intervalul
de timp dt (s), se poate deduce, expresia fluxului de molecule peptidice prin
membrană ca fiind numărul de monomeri peptidici ce translocă prin suprafaţa dS
în unitatea de timp dt (parametrii dS şi dt fiind cunoscuţi); se consideră că fluxul de
monomeri ce tranlocă prin suprafaţa dS este omogen, iar procesul de difuzie
unidirecţional. În acelaşi timp însă, fluxul poate fi scris matematic şi prin
intermediul gradientului de concentraţie a moleculelor peptidice între partea cis şi
trans a membranei şi a coeficientului de difuzie D şi utilizând datele numerice din
experimentele de fluorescenţă şi valorile cunoscute pentru: δ, V, r, t, se poate
determina coeficientul de difuzie al peptidei prin membrana lipidică dată de
expresia (1):
1
12
transbulk
cisbulk
C
Ctr
dVD
şi (1) )/(105,12 2113 smDHPA
Concluzii
Evidenţierea proceselor de translocare membranară indică în mod indirect,
faptul că peptida antimicrobiană HPA3 îşi poate exercita rolul toxic, nu
doar prin alterarea transportului ionic intermembranar şi prin formarea
porilor transmembranari, dar şi prin mecanisme ne-litice ce afectează ţinte
non-membranare intracelulare.
33
34
VII. 9. Modularea proceselor chimice ce au loc în interiorul porilor inseraţi în
membrane artificiale, de către proprietăţile electrice ale membranei
În ceea ce priveşte studierea influenţei modificărilor proprietăţilor
electrice ale membranei asupra fenomenelor de transport prin porinele din clasa
OmpF, ce se găseşte în membrana externă a bacteriei Escherichia Coli, am abordat
inţial problematica interesantă a posibilei interacţiuni electrostatice între
biomembrana în care se găseşte inserată porina şi grupările ionizabile din zona sa
de constricţie, ce joacă un rol esenţial în procesele de transport a antibioticelor
beta-lactamice prin aceste porine [22]. Aşa după cum este ştiut din literatură, una
din cele mai importante regiuni de aminoacizi din structura porinei OmpF este cea
din zona domeniului L3, unde doi aminoaicizi acidici (Glu 117 şi Asp 113) sunt
situaţi faţă în faţă cu aminoaicizi bazici din structura porinei (Arg 42, Arg 82 şi
Arg 132) iar la un pH neutru al soluţiei fiziologice în care aceste proteine sunt
studiate este de remarcat prezenţa unui câmp electric transversal în raport cu axa
longitudinală a proteinei, cauzat de încărcările electrice net negative şi pozitive ale
acestor seturi de aminoacizi. Aşa după cum este de aşteptat, încărcarea electrică
netă a acestor aminoacizi este puternic dependentă de pH-ul soluţiei fiziologice, şi
aceasta se datorează faptului că reacţiile de protonare-deprotonare ale
aminoacizilor mai sus amintiţi depind puternic de concentraţia ionilor de hidrogen
din soluţie (valoarea pKa-ului aminoacizilor acidici este de ~3, iar a celor bazici de
~10).
Datele experimentale au evidenţiat faptul că, scăderea potenţialului de
dipol membranar în urma interacţiunii membranei artificiale cu 500 μM phlorizin,
conduce la o creştere vizibilă a zgomotului electric printr-un singur trimer de
OmpF inserat în biomembrană, aşa după cum este vizibil din figura VII.9.1. Astfel,
valoarea estimată a deviaţiei standard a fluctuaţiilor de curent electric măsurate
prin porină a fost de 26 pA înainte, şi respectiv 37 pA, după interacţiunea
biomembranei cu moleculele de phlorizin.
Figura VII.9.1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ ce
evidenţiază creşterea fluctuaţiilor de curent electric înregistrate într-un porin din clasa
OmpF, în urma interacţiunii membranei lipidice ce conţine porinul cu un compus
chimic ce scade valoarea potenţialului de dipol membranar (phlorizin). Aceste
înregistrari au fost făcute la pH = 3, soluţie fiziologică 1M NaCl şi o valoare a
diferenţei de potenţial aplicate membranei de +100 mV.
Asa după cum este ştiut, zgomotul de curent electric printr-un por de
OmpF are formă Lorentziană, este pH-dependent şi reflectă procesele reversibile
de protonare-deprotonare ale aminoacizilor acidici ce concură la generarea zonei
de constricţie a respectivului porin. Astfel, evenimentele tranziente (durata de
~ < 10 ms) ce marchează scăderea parţială a conducţantei porinului OmpF
corespund acelor stări moleculare în care proteina OmpF este deprotonată (ne
referim aici la aminoacizii Asp-113 şi Glu-117 din zona de constricţie).
Astfel, concluzia cu privire la aceste rezultate experimentale este că drept
urmare a scăderii valorii potenţialului de dipol membranar – fenomen indus de
interacţiunea biomembranei cu moleculele de florizin – valoarea concentraţiei
locale a protonilor în interiorul porinului, în zona apropiată de aminoacizii GLU
117 şi ASP 113 va creşte corespunzător. Drept urmare, având în vedere că reacţiile
35
de protonare a acestor aminoacizi sunt de ordinul II, cu rate de reacţie de protonare
depinzând de valoarea pH-ului, se va manifesta pregnant procesul de interacţiune
tranzitorie al ionilor de hidrogen cu respectivii aminoacizi; prin intermediul
interacţiunilor electrostatice de tip ‘long range’, faptul că zona de constricţie a
porinului este protonată (sarcina electrică a respectivului aminoacid egală cu 0) sau
deprotonată (sarcina electrică a respectivului aminoacid egala cu -1) va conduce la
alterări ale fluxurilor de cationi şi anioni prin proteină, iar aceasta se va manifesta
macroscopic prin alterarea fluctuaţiilor de curent electric mediate de porină .
Figura VII.9.2. Înregistrări la nivel de ‘singură moleculă’ la diferite valori ale
potenţialului electric aplicat membranei şi în condiţii de pH =2.8 al soluţiei fiziologice,
ale fluctuaţiilor de curent mediat de un canal deschis de OmpF, care reflectă procesele
de protonare reversibile ale aminoacizilor aspartat 113 şi glutamat 117 existenţi în
zona de constricţie a OmpF.
Din date experimentale, se constată faptul că procesele reversibile de
protonare ale aminoacizilor Glu 117 şi Asp 113 din regiunea de constricţie a
36
porinei OmpF sunt potenţate atât de valoarea absolută a diferenţei de potenţial
membranar aplicată membranei, dar şi de semnul acesteia. Astfel, în condiţii de
2M NaCl, este vizibil în figura VII.9.2, faptul că aceste procese de protonare-
deprotonare sunt mai pregnant vizibile atunci când valoarea diferenţei de potenţial
aplicată membranei este de -150 mV.
Într-un alt set de experimente, am utilizat ca metodă de investigare a
proprietăţilor porinei OmpF, analiza Fourier a fluctuaţiilor de curent electric
mediat de trimerul OmpF inserat în biomembrane, utilizând acelaşi protocol de
lucru ca şi cel folosit pentru experimentele anterioare.
Figura VII.9.3. Reprezentarea densităţilor de putere spectrală normalizată a
fluctuaţiilor curentului electric printr-un singur canal deschis OmpF în condiţii de 2 M
NaCl, la valori ale potenţialelor electrice aplicate de +100 mV; −100 mV în inset sunt
reprezentate, la o scară de timp mai mare, fluctuaţiile curentului ionic indus de
reacţiile de protonare a reziduurilor acidice din zona de constricţie a trimerului OmpF,
la +100 mV. Liniile solide reprezintă fitările spectrelor de putere cu o funcţie
Lorenziană.
Pentru evaluări cantitative, am utilizat un algoritm de fitare neliniară de
tip Lorenz a funcţiei de putere spectrală (‘power - spectrum’) a fluctuaţiilor
curentului macroscopic înregistrat, urmarind parametrul fc (‘corner frequency’)
37
care reprezintă un parametru important derivat din analiza numerică a funcţiei
spectrului de puteri care, prin definiţie, este frecvenţa la care valoarea puterii
spectrale a semnalului scade la jumătate şi care dă informaţii directe despre ratele
de protonare-deprotonare ale aminoacizilor din regiunea de constricţie.
Figura VII.9.4. Reprezentarea densităţilor de putere spectrală normalizată a
fluctuaţiilor curentului electric printr-un singur canal deschis OmpF în condiţii de 2 M
NaCl, la valori ale potenţialelor electrice aplicate de +150 mV; −150 mV. Liniile solide
reprezintă fitările spectrelor de putere cu o funcţie Lorenziană şi sunt evidenţiate
modificările parametrului fc- o măsură a timpului de relaxare caracteristic a
proceselor reversibile de protonare, la +150mv şi -150mV.
Pentru a obţine mai multe detalii despre posibila influenţă exercitată de
profilul de potenţial electric prin porină asupra proceselor reversibile de protonare
ale aminoacizilor din zona de constricţie, am realizat experimente în care am
modificat tăria ionică a soluţiei precum şi sensul şi amplitudinea diferenţei de
potenţial aplicate membranei. După cum poate fi observabil din figurile VII.9.3 şi
VII.9.4, valori mari ale parametrului fc la potenţiale mai negative reflectă creşterea
concentraţiei locale de ioni de hidrogen, ceea ce implică creşterea ratelor de
protonare a reziduurilor aminoacidice, ipoteză susţinută şi de datele anterioare.
38
Figura VII.9.5. Reprezentarea normalizată a densităţilor de putere spectrală a
fluctuaţiilor curentului ionic mediat de trimerul de OmpF la -100 mV, în condiţii
diferite de tărie ionică.
Este interesant de remarcat faptul că atât valori reduse ale tăriei ionice cât
şi valori mari şi negative ale diferenţei de potenţial aplicate conduc la creşterea
coeficientului ‘fc’, fapt ce întăreşte observaţiile anterioare privitoare la potenţarea
activitiăţii cinetice a porinei OmpF în asemenea condiţii. Din teoria Debye–Hückel
şi formalismul Poisson-Boltzmann, este cunoscut faptul că, în cazul în care tăria
ionică a soluţiei este redusă, datorită ecranării mai reduse a sarcinilor electrice din
interiorul porinei, fenomenele de interacţiune electrostatică sunt potenţate, fapt
demonstrat şi de datele experimentale prezentate în figura VII.9.5, din care se
observă că în condiţii fiziologice de 0.5 M NaCl, parametrul fc creşte cu ~ 33% faţă
de 2 M NaCl, ceea ce reflectă că tăria ionică mai mică induce creşterea
concentraţiei locale a ionilor de hidrogen în zona de constricţie a porinului unde se
găsesc reziduurile aminoacidice. Astfel, am emis ipoteza că, acelaşi efect de
modificare a concentraţiei locale de protoni la nivelul zonei de constricţie a porinei
OmpF, se poate obţine şi prin alterarea potenţialului de dipol în ambele
monostraturi lipidice, utilizând agentul chimic phloretin.
39
Figura VII.9.6. Reprezentarea dependenţei frecvenţei fc a densităţii de putere spectrale
a fluctuaţiilor curentului ionic mediat de canalul OmpF induse de reacţiile de
protonare reversibile, în funcţie de diferenţa de potenţial aplicată, în absenţa şi
prezenţa a 200 µM phloretin.
Astfel, scăderea potenţialului de dipol transmembranar prin adiţia
phloretinului are ca efect creşterea concentraţiei de [H+] la nivelul porului de
OmpF şi implicit a ratei de protonare a reziduurilor ionizabile ceea ce induce o
accentuare a fluctuaţiilor de curent ale canalului de OmpF.
Concluzii
Valori mari şi negative ale diferenţei de potenţial aplicate membranei,
tăria ionică mai mică a mediului fiziologic precum şi scăderea
potenţialului de dipol membranar prin adiţia phloretinului, conduc la
creşterea concentraţiei de [H+] la nivelul porului de OmpF şi implicit a
ratei de protonare a reziduurilor ionizabile ceea ce induce o accentuare a
fluctuaţiilor de curent ale canalului de OmpF.
40
41
CONCLUZII FINALE
*
Rezultatele obţinute au vizat analiza detaliată şi înţelegerea unora din
factorii chimci, biologici şi fizici, ce guvernează potenţialul litic precum şi
specificitatea unor peptide antimicrobiene şi predicţia de novo a unor noi
structuri moleculare polimerice cu potenţial litic antimicrobian ridicat, mai mare
decât al antimicrobienelor clasice.
*
Studierea cantitativă şi calitativă a efectului unor peptide antimicrobiene
asupra unor membrane microbiene şi eucariote, prin tehnici de electrofiziologie
şi biologie moleculară, precum şi analiza cantitativă a adsorbţiei membranare şi
a cineticii de inserţie a unor peptide antimicrobiene prin tehnici de fluorescenţă
şi tehnici ‘voltage-clamp’, au permis evaluarea calitativă a energiilor de
interacţiune dintre peptidele antimicrobiene utilizate şi membrane celulare, şi
evaluarea conductanţei electrice a porilor formaţi de peptidele selectate.
*
Datele experimentale obţinute, subliniază şi evidenţiază odată în plus
posibilitatea practică prin care, modificând controlabil profilul electric
membranar precum şi condiţiile fiziologice în care au loc procesele de inserţie
membranară, tăria ionică, compoziţia bistratului lipidic, se pot obţine detalii
precise privind mecanismele moleculare ce determină efectul litic al unor
peptide antimicrobiene selectate.
*
Rezultatele derivate din implementarea acestor studii ar putea permite
ulterior dezvoltarea unor aplicaţii în industria farmaceutică creând oportunităţi
pentru obţinerea unor terapii inovante în domeniul tratamentelor infecţiilor
microbiene.
42
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
[1] K.V.R. Reddy, R.D. Yedery, C. Antimicrobial peptides: premises and
promises, Aranha International J. of Antimicrobial Agents 24 (2004) 536–547
[2] H. G. Boman, Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts.
Journal of Internal Medicine 2003; 254: 197–215
[3] J.B. McPhee, R.E. Hancock, Function and therapeutic potenţial of host
defence peptides, J. Pept. Sci. 11 (2005) 677-687.
[4] Shahar Rotem, Amram Mor, Antimicrobial peptide mimics for improved
therapeutic properties, BBA – Biomembranes, Accepted date: 21 October 2008
[5] Hari Leontiadou, Alan E. Mark, Siewert J. Marrink,J., Antimicrobial Peptides
în Action, Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12156-12161
[6] Richard M. Epand, Hans J. Vogel, Review: Diversity of antimicrobial peptides
and their mechanisms of action, Biochimica et Biophysica Acta 1462 (1999) 11^28
[7] Erik Strandberg, Pierre Tremouilhac, Parvesh Wadhwani, Anne S. Ulrich,
Synergistic transmembrane inserţion of the heterodimeric PGLa/magainin 2
complex studied by solid-state NMR, BBA - Biomembranes (2009),
doi:10.1016/j.bbamem.
[8] Sarah R. Dennison, Leslie H.G. Morton, Frederick Harris, David A. Phoenix,
The impact of membrane lipid composition on antimicrobial function of an α-
helical peptide, Chemistry and Physics of Lipids xxx (2007) xxx–xxx
[9] Richard L. Gallo, MD, Masamoto Murakami, Takaaki Ohtake, Mohamed
Zaiou, Biology and clinical relevance of naturally occurring antimicrobial
peptides, J Allergy Clin Immunol, 2002, V.110, No. 6
[10] R. Jayaraman, Antibiotic resistance: an overview of mechanisms and a
paradigm shift, Current Science, VOL. 96, NO. 11, 10 JUNE 2009
[11] Senthil K. Kandasamy, Ronald G. Larson, Binding and inserţion of α-helical
anti-microbial peptides în POPC bilayers studied by molecular dynamics
simulations, Chemistry and Physics of Lipids 132 (2004) 113–132.
43
[12] Yechiel Shai, Review: Mechanism of the binding, inserţion and destabilization
of phospholipids bilayer membranes by α-helical antimicrobial and cell non-
selective membrane-lytic peptides, Biochimica et Biophysica Acta 1462 (1999)
[13] Marek Langner, Krystian Kubica, The electrostatics of lipid surfaces
Chemistry and Physics of Lipids 101 (1999) 3–35
[14] Sarah R. Dennison, Leslie H.G. Morton, Frederick Harris, David A. Phoenix,
The impact of membrane lipid composition on antimicrobial function of an α-
helical peptide, Chemistry and Physics of Lipids xxx (2007) xxx–xxx
[15] S. McLaughlin: “The electrostatic properties of membranes”, Annu. Rev.
Biophys. Biophys. Chem., Vol. 18, (1989), pp. 113–136.
[16] G. Cevc: “Membrane electrostatics”, Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1031,
(1990), pp. 311–382.
[17]D.L. Nelson and M.M. Cox: “Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth
Edition”, W. H. Freeman, (2004)
[18] P. O’Shea, Physical landscapes în biological membranes: physico-chemical
terrains for spatio-temporal control of biomolecular interactions and behaviour,
Phil. Trans. R. Soc. A. 363 (2005) 575–588.
[19] A. M. Nesbitt, K. Diraviyam, J. Wang, S. Singh, P.Murray, Z. Li, L. Rogers,
N. Mirkovic, D. Murray, The role of electrostatics în protein–membrane
interactions Biochimica et Biophysica Acta. 1761 (2006) 812–826.
[20] Daniel Allende, Adriana Vidal, Sidney A. Simon, Thomas J. McIntosh,
Bilayer interfacial properties modulate the binding of amphipathic peptides,
Chemistry and Physics of Lipids 122 (2003) 65_/76
[21] Olaf S. Andersen and Roger E. Koeppe, Bilayer Thickness and Membrane
Protein Function: An Energetic Perspective, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
2007.36:107–30
[22] E.M. Nestorovich, T.K. Rostovtseva, S.M. Bezrukov, Residue ionization and
ion transport through OmpF channels, Biophys. J. 85 (2003) 1–12.
44
LISTA DE PUBLICAŢII
Articole indexate ISI:
1. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, A virtual instrumentation based protocol
for the automated implementation of the inner field compensation method,
Central European Journal of Physics 4(3), 2006, 405-416
2. Tudor Luchian, Loredana Mereuţă, Phlorizin- and 6-ketocholestanol-
mediated antagonistic modulation of alamethicin activity în phospholipid
planar membranes, Langmuir 22(20), 2006, 8452-8457, citat în:
Olga S. Ostroumova, Valery V. Malev, Andrey N. Bessonov, Jon Y.
Takemoto, and Ludmila V. Schagina, Altering the Activity of Syringomycin
E via the Membrane Dipole Potenţial, Langmuir, 24 (7), 2008, 2987 -2991
Ostroumova, O.S., Kaulin, Y.A., Gurnev, P.A., Schagina, L.V, Effect of
agents modifying the membrane dipole potenţial on properties of
syringomycin e channels, Langmuir 23 (13), 2007, 6889-6892
Asandei A, Luchian T, Ion selectivity, transport properties and dynamics of
amphotericin B channels studied over a wide range of acidity changes
COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES Volume: 67 Issue: 1
Pages: 99-106 Published: NOV 15 2008
Luchian T, Dipole potenţial-induced modulation of the interactions between
reconstituted lipid membranes and certain pore forming peptides REVUE
ROUMAINE DE CHIMIE Volume: 54 Issue: 6(2009)455-463
3. Loredana Mereuţă, Roxana Chiriac, Tudor Luchian, Activity modulation of
certain ion-pore forming proteins by electric properties of artificial lipid
membranes, Journal of Optoelectronic and Advanced Materials 10 (7),
2008,1837 – 1842
45
4. Alina Asandei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, -‘Influence of membrane
potenţials upon reversible protonation of acidic residues from the OmpF
eyelet’, Biophysical Chemistry 135, 2008, 32–40, citat în:
Mobasheri, H., Shafiee, A., Foroumadi, A., Effects of novel antituberculosis
agents on OmpF channel activity, Mahdiuni, H., Biochemical and
Biophysical Research Communications 376 (1), 2008,174-179
Lopez ML, Aguilella-Arzo M, Aguilella VM, et al., Ion Selectivity of a
Biological Chanel at High Concentration Ratio: Insights on Small Ion
Diffusion and Binding, Journal of Physical Chemistry B113(25),2009,8745-
8751
5. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Yoonkyung Park and Kyung-Soo Hahm,
Single-molecule investigation of the interactions between reconstituted planar
lipid membranes and an analogue of the HP(2–20) antimicrobial peptide,
Biochemical and Biophysical Research Communications 373 (4), 2008,
467-472
6. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Yoonkynung Park and Kyung-Soo
Hahm, The role played by lipids unsaturation upon the membrane interaction
of the Helicobacter pylori HP(2–20) antimicrobial peptide analogue HPA3,
Journal of Bioenergetics and Biomembranes 41, 2009, 79–84 citat în:
The membrane inserţion of helical antimicrobial peptides from the N-
terminus of Helicobacter pylori ribosomal protein L1, Tzong-Hsien Lee,
Kristopher N. Hall, Marcus J. Swann, Jonathan F. Popplewell, Sharon Unabia,
Yoonkyung Park, Kyung-Soo Hahm, Marie-Isabel Aguilar, Biochimica et
Biophysica Acta MEM-80183;2010 No. of pages: 14; 4C:
7. Aurelia Apetrei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian The RH 421 styryl dye
induced, pore model-dependent modulation of antimicrobial peptides activity
în reconstituted planar membranes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
General Subjects 1790 (8), 2009, 809-816
46
Participări conferinţe naţionale şi internaţionale
1. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Dipole moment-indeced modulation of ion channels activity în phospholipid planar membranes, The 5th International Conference on Global Research and Education, 25-28 September 2006, Iasi, Inter-Academia 2006
2. Alina Asandei, Roxana Chiriac, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Ergosterol-induced modulation of transport and kinetic activity of alamethicin în artificial lipid membranes, A IX-a Conferinta Nationala de Biofizica (cu participare internationala)dedicata savantului George Emil PALADE, 11-13 Mai 2007, Bucuresti
3. Roxana Chiriac, Alina Asandei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, pH modulation of ion transport through alamethicin channels formed în phosphatidylcholine artificial membranes, A IX-a Conferinta Nationala de Biofizica (cu participare internationala) dedicata savantului George Emil PALADE, 11-13 Mai 2007, Bucuresti
4. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Membrane dipole potenţial-induced modulation of current fluctuaţions through the OmpF porin, International Conference on Fundamental and Applied Research în Physics 2007, 25-28 october 2007, Iasi
5. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, pH and electric-induced modulation of magainin 2 activity in reconstituted lipid membranes, The 8th International Conference on Physics of Advanced Materials (ICPAM-8) JUNE 04-07, 2008, IASI, ROMANIA
6. A. Asandei, L. Mereuţă, R. Chiriac, T. Luchian, The Influence of Superficial Charge and Ionic Strength Upon The Interaction Between Β-Lactam Antibiotics and Ompf Porins, The Annual InterNational Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, BUCHAREST, 29 – 31 May, 2008
7. R.Chiriac, A. Asandei, L. Mereuţă, T. Luchian, Rafts-Induced Modulation of Transport and Kinetic Properties of Certain Antimicrobial Peptides, The Annual InterNational Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, BUCHAREST, 29 – 31 May, 2008
8. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, pH and electric induced modulations of magainin 2 activity în reconstituted membranes, The 8th International Conference on Physics of Advanced Materials (ICPAM-8) June 04-07, 2008, Iasi, Romania
9. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, The influence of lipid unsaturation upon the interaction between HPA3 antimicrobial peptide and reconstituted lipid membranes, German Biophysical Society Meeting 2008 – GBSM 2008 Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biophysik Berlin, September 28 - October 1
47
10. A. Apetrei, L. Mereuţă, T. Luchian The study of the modulatory effect of melittin inserţion upon membrane surface and dipole potenţials, IEEE ROMSC, Iasi, 6-9 iunie, 2009
11. L. Mereuţă, T. Luchian, The modulatory role played by lipids packing upon the membrane - antimicrobial peptides interaction, International Workshop NanoRomania, Iasi, iunie 2009
12. Aurelia Apetrei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian Activity of antimicrobial peptides în reconstituted planar lipid membranes under the influence of membrane dipole moment modulatory agents, International Workshop NanoRomania, Iasi, 2-5 iunie 2009 (premiul I)
13. Loredana Mereuta, Aurelia Apetrei, Yoonkynung Park, Kyung-Soo Hahm, Tudor Luchian, Mechanisms of modulation of α-helical antimicrobial peptides activity în reconstituted planar membranes, Asia-Pacific Peptide Symposium în November Korea 2009
14. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Yoonkynung Park, Kyung-Soo Hahm,
Investigation of interactions between reconstituted planar lipid membranes and antimicrobial peptide HPA3, National Conference of Biophysics (CNB 2009) Cluj-1-3 October, (premiul I)
15. Mereuţă L, Asandei A, and Luchian T, "Influence of Membrane Electrostatics upon Reversible Protonation Reactions Taking Place on the Constriction Region of the Ompf Porin", The Annual InterNational Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, BUCHAREST, 29 – 31 May, 2008
16. Tudor Luchian, Aurelia Apetrei, Loredana Mereuţă, Roles of lipids and electric heterogeneity of lipid membranes în shaping antimicrobial peptides activity, NanoRomania, Iasi, 2-5 iunie 2009
*
Experimentele prezentate în cadrul acestei teze s-au realizat parţial
cu sprijinul financiar obţinut din Granturile de cercetare
CEEX 239/2006 şi PN-2 61-16 /2007 coordonate de prof. dr.
Tudor Luchian.
*