Facoltà di Ingegneria Laurea Specialistica in Ingegneria Spaziale.
Modificazione selettiva o casuale di una proteina allo...
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Modificazione selettiva o casuale di una proteina allo scopo di modificare la struttura o la funzione
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Ingegneria proteica
PROGETTARE
PRODURRE CARATTERIZZARE
MODULARE ATTIVITA’ O INTRODURRE NUOVE FUNZIONI
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APPLICAZIONI
INDUSTRIA
MOLECOLE STABILI ED ATTIVE IN CONDIZIONI PARTICOLARI DI PH, TEMPERATURA E CONDIZIONI DI REAZIONE
BIOMEDICINA
MOLECOLE STABILI ED ATTIVE IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE, IN PRESENZA DI ENZIMI ED INIBITORI, AD EMIVITA LUNGA E DA VEICOLARE EFFICACEMENTE AI BERSAGLI CELLULARI
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IN UN ESPERIMENTO DI INGEGNERIA PROTEICA SI POSSONO MODULARE MOLTE PROPRIETA’ DI UNA MOLECOLA
ALTRI PARAMETRI BIOLOGICI E CLINICI
Proprieta’ generali RESIDUI IDROFOBICI ESPOSTI SOLUBILITA’
SITI DI LEGAME AFFINITA’ SPECIFICITA’
TERMINALI FUSIONI CON PEPTIDI O PEG
LOOPS RESISTENZA PROTEOLISI
NUCLEO STABILITA’ CONTROLLO CONFORMAZIONALE
EPITOPI IMMUNOGENICITA’
DESIGN RAZIONALE EVOLUZIONE GUIDATA
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Bioinformatica Genomica strutturale Genomica funzionale
Biochimica strutturale
(NMR, X-ray, Massa)
IDENTIFICAZIONE MOLECOLA
RACCOLTA INFORMAZIONI
Ingegneria genetica Ingegneria proteica Ingegneria metabolica
BIOMOLECOLE ATTIVE
L’INGEGNERIA PROTEICA RICHIEDE UN APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE
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lamB
lamB
promotore terminatore
lamB RBS
Di cosa ho bisogno per esprimere una proteina?
UN GENE
UNA UNITA’ DI TRASCRIZIONE
UNA UNITA’ DI TRADUZIONE
STOP
DNA RICOMBINANTE ED INGEGNERIA PROTEICA
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Alcuni punti importanti da rispettare: Qualità del prodotto proteico e Resa del sistema di produzione. Rapporto qualità/costo vantaggioso. Assenza di agenti infettivi per l’uomo.
FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI
1: Identificazione, isolamento e clonaggio gene codificante per proteina bersaglio
2: espressione in sistema eterologo
3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type
4: progettazione, produzione e caratterizzazione versioni mutate
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FASE 1: isolamento gene codificante
- INFORMAZIONI SULLA PROTEINA DI INTERESSE -INFORMAZIONI SU PROTEINE OMOLOGHE
(STRUTTURA/FUNZIONE) -ANTICORPO SPECIFICO
⇓ - ISOLAMENTO (SINTESI) SEQUENZA CODIFICANTE
⇓ - ANALISI DI COLLEZIONI DI MOLECOLE (GENI O PRODOTTI) - REAZIONE A CATENA DI POLIMERASI TERMOSTABILI (PCR)
- SINTESI CHIMICA EX NOVO ⇓
-DETERMINAZIONE SEQUENZA NUCLEOTIDICA E CLONAGGIO
Alcuni casi difficili proteina e/o mRNA poco abbondante proteina oligomerica cofattori e/o gruppi prostetici
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Controllo trascrizionale Controllo traduzionale Controllo post-traduzionale
RNA polimerasi
Velocità di traduzione
Stabilità mRNA
Ribosoma mRNA
Proteina
Modificazioni
post-traduzionali
Compartimenti
(periplasma procarioti)
DNA
procarioti
eucarioti
L’espressione eterologa di una proteina segue le regole della cellula ospite
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-Scelta coppia sistema di espressione/ospite dipende dalle caratteristiche molecolari della proteina di interesse ( importanza di qualità e resa).
-Procarioti o eucarioti? Differenze (vantaggi e svantaggi):
- Compartimentalizzazione - Uso del codice genetico (tRNA) - Stabilità cloni ricombinanti - Modificazioni post-traduzionali - Resa in biomassa - Purificazione - Crescite terreni modificati (isotopi o metalli pesanti) - Costo - fattibilità su piccola scala e larga scala
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(a) Sistemi di espressione procariotici (Rese: µg-mg/litro coltura)
- Ospite più utilizzato: Escherichia coli -Plasmidi e virus batterici
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1. Caratteristiche vettore
2. Efficienza trascrizionale
2. Efficienza traduzionale
3. Stabilità della proteina
DNA RNA Proteina
Parametri principali nei procarioti
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NUMERO DI COPIE PER CELLULA: -Derivati di pBR322: 15-20 copie per cellula - Derivati di pUC: 150-200 copie per cellula
Il numero di copie influenza: - positivamente la stabilità del plasmide, cioè la sua presenza nelle generazioni successive. -negativamente la velocità di crescita del ceppo ospite: crescono meglio le cellule con meno copie.
I PLASMIDI AD ALTO NUMERO DI COPIE NON SEMBRANO CONFERIRE UN VANTAGGIO PER LA PRODUZIONE DELLA PROTEINA
VETTORE DI ESPRESSIONE PROCARIOTICO
SELEZIONE: Ampicillina, tetraciclina, kanamicina Sconsigliata ampicillina perché:
- perdita di resistenza - potenzialmente allergenica
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Densità cellulare
Tempo di crescita
Fase lag
Fase logaritmica
Fase stazionaria
Morte cellulare
PROMOTORE: COSTITUTIVO O INDUCIBILE??
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Promotore Induzione altrolac IPTG lattosiotac IPTG “trc IPTG “T7 IPTG “trp Trp
mancanzaAnalogo acidoindolacetico
araBAD L-ArabinosePL(l) termica Espr.basale/induzione
di hspPR(l) termica “lac(TS) termicaPSPA Costitutivo
PROMOTORE (costitutivo o inducibile): -costo dell’induttore -efficacia dell’induzione e della repressione in condizioni di non-induzione per bilanciare produzione di biomassa e resa in proteina -forza del promotore e resa in proteina (solubile)
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E.coli lambda lisogeno (λDE3)
Il sistema di espressione pET
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SEGNALI RELATIVI ALLA TRADUZIONE:
-SEQUENZA SHINE-DALGARNO OTTIMALE
5’-UAAGGAGG-3’
- POSIZIONE: 4-8 NUCLEOTIDI DA AUG (rimozione N-terminale?)
- SECONDO CODONE: di solito ricco in A nei geni molto espressi. AAA(lys) è frequente (13%).
- 5’ RICCO IN GC DIMINUISCE EFFICIENZA TRADUZIONE
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CODON USAGE USO DI CODONI RARI PUO’ PORTARE A PROBLEMI: STABILITA’ mRNA DIMINUITA TERMINAZIONE PREMATURA DI TRASCRIZIONE/TRADUZIONE FRAMESHIFT, DELEZIONI, INCORPORAZIONI ERRATE INIBIZIONE DELLA CRESCITA CELLULARE
CODONI USATI CON FREQUENZA BASSA NELLE VARIE SPECIE (tRNA meno abbondanti)
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FREQUENZA DI USO DEI CODONI RARI DI E.coli IN ALTRE SPECIE
ESPRIMERE IN E.COLI UN GENE RICCO IN CODONI RARI ABBASSA LA EFFICIENZA DI TRADUZIONE
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BL21 (DE3)CodonPlus-RIL
AGG/AGA(arginine),AUA(isoleucine)and CUA(leucine)
Stratagene
BL21 (DE3)CodonPlus-RP
AGG/AGA(arginine)and CCC(proline)
Stratagene
Rosetta orRosetta (DE3)
AGG/AGA(arginine),CGG(arginine),AUA(isoleucine)CUA(leucine),CCC(proline),and GGA(glycine)
Novagen
CEPPI DI E.COLI CHE ESPRIMONO tRNA RARI
QUALI SOLUZIONI?
-Geni mutati o costruiti (sintetici)
CEPPI CHE ESPRIMONO MENO PROTEASI
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MANCATA O BASSA ESPRESSIONE
LA PROTEINA VIENE ESPRESSA IN CONDIZIONI NON DI INDUZIONE
* ESPRESSIONE COSTITUIVA DI UN REPRESSORE lac repressor(the lacI or lacIq) PER PROMOTORE LAC * USARE UN PROMOTORE STRINGENTE, e.g. the arabinose promoter (PBAD). * USARE PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE * VETTORI PET: USARE CEPPI CON T7 Lisozima from a compatible pLysS or pLysE plasmid (Novagen). IL LISOZIMA SI LEGA ALLA POLIMERASI ED INATTIVA L’ENZIMA IN ASSENZA DI INDUTTORE • AGGIUNGERE 1% glucosio PER REPRIMERE IL PROMOTORE lac INDOTTO DA LATTOSIO PRESENTE NEI MEZZI DI COLTURA MASSIMI ( LB, 2xYT).
LA STABILITA’ DEL PLASMIDE E’ BASSA
*AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DELL’ANTIBIOTICO DI SELEZIONE
LA PROTEINA E’ TOSSICA
*ESPRESSIONE NEL PERIPLASMA O IN CORPI INCLUSI
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LA PROTEINA RICOMBINANTE DEVE ESSERE SOLUBILE
SPESSO SI HA LA FORMAZIONE DI CORPI INCLUSI
(aggregati proteici insolubili in acqua)
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STRATEGIE PER AUMENTARE LA SOLUBILITA’
RIDURRE LA VELOCITA’ DI TRADUZIONE
* ABBASSARE LA TEMPERATURA DI CRESCITA * USARE UN PROMOTORE PIU’ DEBOLE * USARE UN PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE * ABBASSARE LA CONCENTRAZIONE DI INDUTTORE
CAMBIARE LE CONDIZIONI DI CRESCITA * AGGIUNGERE COFATTORI NECESSARI PER FOLDING * CONTROLLARE LE VARIAZIONI DI PH * AGGIUNGERE GLUCOSIO 1% PER REPRIMERE LA ESPRESSIONE
DEL PROMOTORE LAC INDOTTO DA LATTOSIO PRESENTE NEI TERRENI MASSIMI ( LB, 2xYT).
* AGGIUNGERE ETANOLO, TIOLI A BASSO PESO MOLECOLARE, NaCl.
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CO- ESPRIMERE CON IL GENE DI INTERESSE CON:
ALTRE SUBUNITA’ DELL’OLIGOMERO
CHAPERONES MOLECOLARI
* GroES-GroEL * DnaK-DnaJ-GrpE * ClpB
FOLDASI
• PEPTIDIL -PROLIL CIS/TRANS ISOMERASI (PPI's) • DISULFURO-OSSIDOREDUTTASI (DsbA) • DISULFURO ISOMERASI (DsbC) • PROTEINA DISOLFURO ISOMERASI (PDI) – EUCARIOTICA- CATALIZZA SIA OSSIDAZIONE DELLE CISTEINE CHE DSI: HA ANCHE ATTIVITA’ CHAPERONE.
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ESPRIMERE LA PROTEINA NEL PERIPLASMA MEDIANTE AGGIUNTA DI UNA SEQUENZA SEGNALE (pelB/ompT)
• L’AMBIENTE E’ PIU’ OSSIDANTE CHE NEL CITOPLASMA • SONO PRESENTI DsbA E DsbC • ATTIVITA’ PROTEOLITICA RIDOTTA • PERMETTE ACCUMULO DI PROTEINE TOSSICHE NEL CITOPLASMA • N-TERMINALE VERO
Svantaggi: livelli di espressioni minori
USARE CELLULE OSPITI “SPECIALI” CON CITOPLASMA OSSIDANTE
CEPPI COMMERCIALI
* AD494, mutato nella tioredossina reduttasi (trxB). * Origami, mutato nella tioredossina reduttasi (trxB) e glutatione reduttasi (gor).
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PRODURRE UNA PROTEINA DI FUSIONE CON PROTEINA SOLUBILE
MALTOSE-BINDING PROTEIN UBIQUITIN DsbA TIOREDOSSINA IgG-BINDING DOMAIN
SVANTAGGI: RECUPERO DELLA PROTEINA MEDIANTE PROTEOLISI
ESPRIMERE FRAMMENTI SOLUBILI DELLA PROTEINA
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IN ALCUNI CASI LA ESPRESSIONE NEI CORPI INCLUSI PUO’ ESSERE UN VANTAGGIO:
• LA PROTEINA RICOMBINANTE E’ FINO AL 50% DELLE PROTEINE TOTALI
• E’ PROTETTA DALLA DEGRADAZIONE • NON PUO’ ESSERE TOSSICA PER LA CELLULA
LA PROTEINA NATIVA DEVE ESSERE RECUPERATA MEDIANTE DENATURAZIONE IN VITRO E REFOLDING
*ISOLAMENTO DEI CORPI INCLUSI. SHOCK OSMOTICO E CENTRIFUGAZIONE
*DENATURAZIONE IN PRESENZA DI AGENTI DENATURANTI COME GUANIDINA O UREA O CONDIZIONI RIDUCENTI (e.g. DTT).
*REFOLDING DELLA PROTEINA MEDIANTE LENTA RIMOZIONE DEL DENATURANTE CON DIALISI, DILUIZIONE O CROMATOGRAFIA (IN PRESENZA DI AGENTI RIDUCENTI )