Modern Orvostudományi Technológiák a Semmelweis Egyetemen

Terápiás modulMolekuláris medicina

Balla András, Erdélyi László, Hunyady LászlóÉlettani Intézet

2011. november 15.

G-protein kapcsolt receptorok aktivációs modelljeinek elemzése

A receptor aktiválódását követően a jelátviteli és a szabályozási mechanizmusok is aktiválódnak.

Agonista

G-fehérje

JELÁTVITEL INTERNALIZÁCIÓDESZENZITIZÁCIÓ

β-arresztin

Endoplazmás retikulum

A receptor mutációinak következményei.

G-fehérje

JELÁTVITELINTERNALIZÁCIÓ

Antagonista AntagonistaAntagonista AntagonistaAntagonista

Endoplazmás retikulum

Antagonista

Antagonista

G-fehérje

JELÁTVITELINTERNALIZÁCIÓ

Sel.Ag. Sel.Ag.Sel.Ag. Sel.Ag.Sel.Ag.

Endoplazmás retikulum

Sel.Ag.

Sel.Ag.

Elkülöníthető-e a G-fehérje és a β-arresztinaktiválását létrehozó konformáció?

Agonista

G-fehérje

JELÁTVITEL INTERNALIZÁCIÓDESZENZITIZÁCIÓ

β-arresztin

Az AT1-receptor aktiválódásának hatásai.

Arrestin

Stim

Time (sec)

AngII

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-0.02-0.010.000.010.020.030.040.050.060.070.080.090.10

DB

RE

T r

ati

o

Stim

Rab5

Time (sec)

DB

RE

T r

atio

AngII

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-0.010-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.050

G fehérje aktiválás ß-arrestin kötés

Internalizáció

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Time (sec)

B

RE

T R

atio

Stim

AngII

SII-AngII

G-fehérje

JELÁTVITEL INTERNALIZÁCIÓDESZENZITIZÁCIÓ

β-arresztin

Jelátvitel szelektív agonista: Sar1,Ile4,Ile8-Ang II (SII-AngII).

Stim

Rab5

Time (sec)

DB

RE

T r

ati

o

AngII SII-AngII

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-0.010-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.050

Arrestin

Stim

Time (sec)

AngII SII-AngII

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-0.02-0.010.000.010.020.030.040.050.060.070.080.090.10

DB

RE

T r

ati

o

G fehérje aktiválás ß-arrestin kötés

Internalizáció

Az AngII egyik peptid analógja (Sar1,Ile4,Ile8-Ang II) nem képes G-fehérjét aktiválni, de létrehozza a receptor internalizációját.

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Time (sec)

B

RE

T R

atio

Stim

AngIISII-AII

AngIISII-AII

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-0.02-0.010.000.010.020.030.040.050.060.070.080.090.10

AngIISII-AII

Stim

Time (sec)

ΔB

RE

T R

atio

Nefrogén diabetes insipidusXR öröklött forma

2-es típusú vazopresszin receptor és mutációi: Tünetek:polyuria polydypsiahyposthenuria

Vízfogyasztás: ~ 10 l/nap

Vazopresszin adásával NEM kezelhetőhttp://www.ndif.org/

frameshiftmissense mutációdeléció

Személyre szabott terápia: a betegséget okozó mutáció azonosítása és karakterizálása

M.G. beteg, a klinikai kép nefrogén diabetes inspidusra utalII. Sz. Belgyógyászati Klinika

Dr. Tóth Miklós, Dr. Patócs Attila, Prof. Dr. Rácz Károly

A mutációt azonosítottuk a genomból:Aszparigin-lizin csere a 2-es típusú vazopresszin receptor 321. aminosav pozíciójában (ritka,nem karakterizált mutáció)

www.medsearch.com

A funkcióvesztés mechanizmusa és terápiás lehetőségek

Célunk olyan farmakológiai chaperonok azonosítása, melyek segítik a recetor kihelyeződését a plazmamembránba, illetve szelektív agonistaként működve jelátvitelt indíthatnak el, de β-arresztint nem aktiválnak.

• ER retenció • Megváltozott β-arresztin kötés és internalizáció • Csökkent cAMP generálás

Az N321K mutáció vizsgálata

A mutáció vizsgálatára alkalmas módszerek beállítása:1. Receptor sejtfelszíni expresszió mérés fluoreszcens fehérjékkel2. β-arresztin kötés vizsgálata 3. cAMP jel detektálására alkalmas módszer beállítása

A cAMP szignál vizsgálata:Epac fehérje szenzort tartalmazó BRET szonda készítése és validálása

EPAC-BRET bioszenzor működése

REM

VLVLE

GEF

mV

Sluc

REM

VLVL

E

GEF

mV

Sluc cAMP

0 100 200 300 400 500

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

-0.00

0.05vehAVP

Time (s)

B

RE

T

Stim

Az N321K mutáció vizsgálata

A cAMP szignál vizsgálata:

-15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20WTN321K

log(AVP) (M)

B

RE

T (

stim

-nst

im)

Az N321K mutáció vizsgálata

A β-arresztin kötés vizsgálata: Fluoreszcensen jelölt β-arresztin detektálása konfokális mikroszkóppal a receptor stimulusa előtt és után

Vad típus N321K

AVP előtt

AVP után

• Nem a plazmamembránban elhelyezkedő mutáns receptor• Fiziológiás koncentrációban hatástalan AVP• Károsodott β-arresztin kötés

Következő lépés: olyan peptid- és nem-peptid vazopresszin receptor ligandok azonosítása, amelyek a károsodott receptor működését helyreállítják

Köszönöm megtisztelő figyelmüket!