Lambiente Usa e… rispetta lambiente R iduci icicla isparmia di Riccardo Molella.
Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in...
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Misure con biomarcatoriV. Markers enzimatici
Prof. Giorgio SartorCorso di Laurea Specialistica in Scienze per l’Ambiente e il Territorio
Copyright © 2001-2006 by Giorgio Sartor.
All rights reserved.
Versione 3.0 - gennaio 2006
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 2
Vie metaboliche e radicali dell’ossigeno
Rotturadel DNA
Inattivazioneenzimi Perossidazione
lipidica
Addottidel DNA
Addottidi proteine Prodotti
di coniugazione
METABOLITI REATTIVI
XENOBIOTICI
Ciclo redox
METABOLITIRADICALICI
COMPOSTIREDOX
O2
O-2
O2
GSH
GSSG GR
NADPH + H+
NADP+
GPX
H2O2
H2O
H2O + O2
HO· O2 Fe
NADPH + H+
NADP+
FADox
FADred Enzimi a flavina
FASE I
FASE I I
Addottidel DNA
Addottidi proteine Metabolismo
1
2
3
4
5
6
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9
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 3
Vie metaboliche e radicali dell’ossigeno
Rotturadel DNA
Inattivazioneenzimi Perossidazione
lipidica
Addottidel DNA
Addottidi proteine Prodotti
di coniugazione
METABOLITI REATTIVI
XENOBIOTICI
Ciclo redox
METABOLITIRADICALICI
COMPOSTIREDOX
O2
O-2
O2
GSH
GSSG GR
NADPH + H+
NADP+
GPX
H2O2
H2O
H2O + O2
HO· O2 Fe
NADPH + H+
NADP+
FADox
FADred Enzimi a flavina
FASE I
FASE I I
Addottidel DNA
Addottidi proteine Metabolismo
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1. Il metabolismo di fase I (incluso ossidazione da Citocromo P450) può formare metaboliti reattivi.
2. Il metabolismo di fase I può formare specie redox che possono subire un ciclo redox.
3. Ciclo redox che comprende flavoproteine.
4. Per completare il ciclo redox si forma anione superossido (O2
-·) e si rigenera il composto di partenza.
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 4
Vie metaboliche e radicali dell’ossigeno
Rotturadel DNA
Inattivazioneenzimi Perossidazione
lipidica
Addottidel DNA
Addottidi proteine Prodotti
di coniugazione
METABOLITI REATTIVI
XENOBIOTICI
Ciclo redox
METABOLITIRADICALICI
COMPOSTIREDOX
O2
O-2
O2
GSH
GSSG GR
NADPH + H+
NADP+
GPX
H2O2
H2O
H2O + O2
HO· O2 Fe
NADPH + H+
NADP+
FADox
FADred Enzimi a flavina
FASE I
FASE I I
Addottidel DNA
Addottidi proteine Metabolismo
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5. In presenza di ferro l’anione superossido forma il radicale idrossido (Haber-Weiss).
6. L’anione superossido può dismutare a H2O2 ad opera della superossidodismutasi (SOD).
7. In presenza di ferro l’ H2O2 forma il radicale idrossido e ossigeno (Fenton).
8. L’ H2O2 può essere degradata ad acqua ad opera della catalasi (CAT) o della glutatione perossidasi (GPX).
9. La glutatione reduttasi rigenera il glutatione ridotto (GSH) da quello ossidato (GSSG).
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 5
• Enzima microsomiale, il più versatile tra gli enzimi di fase I.
• Inducibile.• Anche conosciuto come ossidasi a funzioni miste
(MFO).• Proteina che contiene un gruppo eme
– Il complesso formato dal Fe2+ e CO ha uno spettro di assorbimento con massimo centrato a 450 nm (447-452) nm.
Citocromo P450 (CYP)
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 6
CYP
• Ossida gli xenobiotici usando il NADPH come cofattore e O2
• La reazione procede come ciclo catalitico:RH+O2+H++NADPH ROH+H2O+NADP+
• Non è attivo contro tutti i contaminanti (specialmente gli alogeni)
• In alcuni casi genera prodotti tossici (epossidi)• L’induzione delle MFO è un sistema di
biomarcatura
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Struttura del CYP (1PO5)
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Struttura del CYP (1PO5)
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Struttura del CYP (1PO5)
AA basici
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Struttura del CYP (1PO5)
AA basiciCys436
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Struttura del CYP (1PO5)
AA basiciCys436
Cavità
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Struttura del CYP (1PO5)
Cavità
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Struttura del CYP (1PO5)
Cavità
AA polariAA neutri
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Struttura del CYP
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Struttura del CYP
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 16
Struttura del CYP
Canfora
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Struttura del CYP
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Ciclo del CYP
Fe3+H2O
Fe3+RH
Fe2+RH
[Fe2+O2RH]-1
FeO3+RH
Fe3+ROH
[Fe2+O2RH]-2[Fe2+OOHRH]-1
ROHRH
H+ e-
e-
H+
H2O
H2O
H2O
(substrato)(prodotto)
O2NAD(P)H-citocromo
P450 reduttasi
citocromo b5
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Meccanismo ciclico del CYP
1. P450 acquo Fe(III)2. P450 canfora Fe (III)3. P450 canfora CO
Fe(III)4. P450 prodotto Fe(III)5. P450 canfora Fe(II)6. P450 canfora O2
- Fe(II)
7. P450 ossigeno attivato Fe(IV)
O
OH
O
HFe(I I I)
OHH
S
Fe(I I I)
S
Fe(I I)
OO
S
Fe(I I)
S
Fe(I I)
OO
S
Fe(I I I)
O
S
OH
Fe(IV)
O
S
Fe(I I I)
OHR
S
Fe(I I)O
O
S
Fe(I I)
O
S
ROHRH
RH
RH
RH
RH
RH
RH
H2O2
H2O
H+
H+ e-
e-
2-
--
RH
2-
(1)
(2)
(6)
(5)(7)
(4)
H+
RH -
(3)
O2
H2OH2O
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 20
Meccanismo
• L’ossigeno è legato non ad angolo retto.• Il legame dell’ossigeno allontana il ligando
(RH) solo dopo che I due atomi di ossigeno si sono ridotti il ligando si riavvicina. Ciò previene la formazione di ROS.
• Gli elettroni per la riduzione dell’ossigeno snoo forniti da una proteina Fe-S (P450 batterica o mitcondriale) o da una NADPH-citocromo P450 ossidoreduttasi FAD/FMN dipendente (microsomi).
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 21
Meccanismo generale del CYP
NADPH + H+
NADP+ CYTP450Reduttasi
FMNH2/FADH2
CYTP450Reduttasi FMN/FAD
CYP Fe2+
CYP Fe3+
RH
ROH
2H+ + O2
H2O
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 22
Meccanismo
• Nel complesso con la NADPH-citocromo P450 ossidoreduttasi l’elettrone si muove attraverso lo scheletro della proteina
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 23
Struttura del CYP
![Page 24: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/24.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 24
Colesterolo monoossigenasi(CYTP450scc - EC 1.14.15.6 - CYP11A)
NADPH + H+
NADP+
CYTP450Reduttasi
FMNH2
CYTP450Reduttasi
FMN
Colesterolomonoossigenasi
Fe2+
Colesterolomonoossigenasi
Fe3+
colesterolo
22-idrossicolesterolo
2H+ + O2
H2O
OH
H
H
H
H
OH
OH
H
HH
H
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 25
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Idrossilazione di aromatici• Epossidazione di aromatici • Idrossilazione di alifatici• Epossidazione di alcheni• N-dealchilazione• O-dealchilazione• S-sealchilazione• N-ossidazione• N-idrossilazione• S-ossidazione• Ossidazione di aldeidi• Aromatizzazione di
androgeni
• Ossidazione dell’alotano• Riduzione dell’alotano • Ossidazione dell’arginina• Taglio della catena laterale
del colesterolo• Deidrogenazione• Dealogenazione• Azoriduzione• Deaminazione• Desolforazione• Idrolisi di ammidi• Idrolisi di esteri• Perossidazione• Denitrazione
Più almeno altre 20
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 26
• Idrossilazione di atomi di carbonio alifatici o aromatici
– Da (S)-mefentoina a 4’-idrossi-(S)-mefentoina (CYP2C19)
– Da testosterone a 6-idrossitestosterone (CYP3A4)
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
NH
NO CH3CH3
O
H
HOH
O
H
H H
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 27
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Epossidazione di doppi legami– Da 5-colestene a 5,6-epossi-5-colestano
• Ossigenazione di eteroatomi, N-idrossilazione– Da amine a idrossilamine– Da omeprazolo to solfone (CYP3A4)
H
HH
OH
H
H
HO2
+
NADPHNADP+
+ + H+ H2O
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 28
• Dealchilazione di eteroatomi– O-dealchilazione (da destrometorfano a destrorfano) – N-demetilazione della caffeina
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
N
NN
N
OCH3
CH3
CH3
O
NN
N
CH3
N
OCH3
O
H
N
NN
N
OCH3
H
CH3
O
N
NN
N
O
CH3
CH3
O
H
H
NH
CH3
OCH3
H
NH
CH3
OH
teobromina
paraxantina
teofillina
CYP1A2
CYP2E1 CYP2E1
CYP2D6
caffeina
destrometorfano
destrorfano
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 29
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Trasferimento di gruppo per via ossidativa– N, S, X
rimpiazzato con O• Da parathion a
paroxon (da S a O)• Attivazione
dell’alotano a trifluoroacetilcloruro
POO
OS
CH3
CH3
N+O O
F
F
FCl
Br
POO
OO
CH3
CH3
N+O O
F
F
FCl
O
CH3
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 30
Reazioni catalizzate dal citocromo P450
• Scissione di esteri– Scissione del gruppo funzionale con O nel gruppo
uscente• Da loratadina a lorantadina desacetilata (CYP3A4, 2D6)
• Deidrogenazione– Astrazione di due H con formazione di C=C
• Attivazione di acetaminofene al metabolita epatotossico N-acetilbenzochinoneimina
OH
N
H
O
CH3
O
N
O
CH3
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 31
La famiglia del Citocromo P450
• Ha molti membri:– 450 nel riso, 57
nell’uomo, 84 nel topo, 10 nella Chlamodymonas
• Filogenesi
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 32
Induzione
• Meccanismo attraverso il quale uno stimolo esterno alla cellula provoca come risposta la produzione di una o più proteine o, comunque, una attivazione della sintesi proteica:– CYP– HSP– Stress
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Un gene
PROMOTORE
esone 1 esone 2
esone 3
introne 1 introne 2
GENE
5’
5’
3’
3’
+ (senso)
filamento
U (RNA)C T pirimidine||| ||G A purine
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Il DNA fa RNA che fa PROTEINA
PROMOTORE GENE
5’3’ RNApol
+ (senso)
filamento
esone 1 esone 2 esone 3
introne 1 introne 2
5’ 3’
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Trascrizione
5’3’
+ filamento
RNApol
5’
Pre-mRNA 3’
Il filamento complementare dà una COPIA del GENE.
esone 1 esone 2 esone 3
introne 1 introne 2
5’ 3’
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Splicing
5’3’ RNApol
5’
Pre-mRNA
3’
5’
splicing
3’
mRNA
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Traduzione
5’3’
mRNA
5’
3’
mRNA
TRADUZIONE
MS
G
proteina
NH2
RNA Ribosomiale
t RNA
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MAPK
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MAPK
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Il paradigma
Xenobiotico
Attivazione del gene per CYP
Espressione di CYP…Metabolismo
dello xenobiotico
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CYP1A1 e recettori per idrocarburi aromatici
• CYP1A1 non è espressa costitutivamente nel fegato di ratto.
• CYP1A1 è indotta da idrocarburi policiclici
– Benzo(α)pirene, TCDD (diossine).
– Farmaci (omeprazolo, inibitore delle pompe protoniche).
• Meccanismo – up-regulation trascrizionale.
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Induzione CYP1
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Induzione CYP2-4 (e 7)
A/B C D E F
Sito di legame del DNA
(Zn2+ fingers)
Regione cardine
Sito di legame del
ligando
Regolata da recettori nucleari
I recettori nucleari sono una superfamiglia di proteine
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Dominio zinc-fingers
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Dominio zinc-fingers
![Page 46: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/46.jpg)
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Dominio zinc-fingers
![Page 47: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/47.jpg)
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Recettori nucleari
NR1
Ligando
NR2
NR NR
Ligando
GENIElemento di rispostaDNA
espressione
+/-
I recettori nucleari sono fattori di trascrizioni attivati dai ligandi
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Recettori nucleari
• Recettori per gli steroidi
– GR: recettore per i glucocorticoidi
– MR: recettore per i mineralocorticoidi
– AR: recettore per glia androgeni
– ER: recettore per gli estrogeni
• Recettori per altri ligandi
– RXR: recettore per X retinoide
– RAR: recettore per acido retinoico
– TR: recettore per l’ormone tiroideo
– VDR: recettore per la vitamina D
• ?
• PXR: recettore per X pregnano
• CAR: recettore constitutivo attivato
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Recettori nucleari
• I recettori nucleari si legano ad uno specifico elemento di risposta
• Generalmente 2 mezzi siti di legame correlati con AGGTCA
• Sono i recettori per gli ormoni steroidei (GR, MR ecc...)
• Si lega come omodimero
• Sequenza palindromica imperfetta
• Separati da 3bp
AGGACANNNTGTACC
TCCTGTNNNACATGG
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Heat Shock Proteins
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Classificazione delle HSP
Famiglia Nome Altri nomiLocalizzazionesubcellulare
Livello di espressione
Normale Stress
hsp 100
hsp 110 Nucleo/nucleolo + ++
hsp 104 citosol + +++
grp 100 ER/Golgi + ++
hsp 90hsp 90 hsp 82, HtpG Citosol/nucleo ++ +++
grp 94 Erp90 ER + ++
hsp 70
hsp 70 hsp 72, DnaK Citosol/nucleo - +++
hsc 70 hsp 73 Citosol/nucleo ++ ?
grp 78 BIP, Kar2p ER ++ +++
mtp 70 Ssc1p, grp 75 Mitocondrio + ++
hsp 60hsp60 GroEL, cpn60 Citosol + +hsp 58 HuCHa 60 Mitocondrio + +
hsp 40 hsp 40 DnaJ, hdj-1 Citosol/nucleo + ++
hsp 30hsp 32 eme-ossigenasi Citosol + ++hsp 35 G3PDH Citosol + ++
Piccole hsp
hsp 27 -cristallino Citosol/nucleo + ?
hsp42p + ++
hsp 10 GroES, cpn-10 Mitocondrio + ++
Ubiquitina Ubiquitina Citosol + ++
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 52
Ruolo costitutivo delle HSP
• Le HSP presenti costitutivamente nelle cellule hanno un ruolo fondamentale nei processi fisiologici di ripiegamento trasferimento e degradazione delle proteine.
![Page 53: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/53.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 53
Ruolo citoprotettivo delle HSP
• Il ruolo delle HSP indotte in cellule sottoposte ad insulto è quello di minimizzare i danni arrecati ai processi di:
– sintesi,
– traslocazione
– ripiegamento
• di proteine cellulari.
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Risposta heat shock
• La risposta heat shock è un evento comune a tutti gli organismi, caratterizzato dall’aumentata sintesi di HSP in risposta ad un numero molto elevato di stimoli:
– aumento di temperatura,
– ipossia,
– shock osmotico,
– metalli pesanti, ischemia,
– invecchiamento
– …
![Page 55: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/55.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 55
Turn-over delle proteine
• Le proteine cellulari vengono regolarmente degradate e risintetizzate.
• Il tempo di semi-vita di un enzima nel fegato di ratto varia da 10 minuti a una settimana.
• In media il tempo di semi-vita di una proteina è correlato con il residue N-terminale:
– Proteine con N-terminale come Met, Ser, Ala, Thr, Val, o Gly hanno un tempo di semi-vita maggiore di 20 ore.
– Proteine con N-terminale Phe, Leu, Asp, Lys, o0 Arg hanno un tempo di semi-vita di 3 minuti o meno.
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Turn-over delle proteine
• È stato dimostrato che le proteine ricche in Pro (P), Glu (E), Ser (S) and Thr (T), chiamate proteine PEST, sono degradate più rapidamente che le altre proteine.
• La degradazione di specifiche proteine può essere regolata:
– Negli eucarioti il ciclo cellulare è controllato, alcuni enzimi regolatori del ciclo sono degradati in fasi particolari del ciclo cellulare in risposta a segnali intra o extra-cellulari.
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Proteolisi: meccanismo generale
O
N
HR'
H
NHR
R''
CR''
H
R
Nu:
H
O
N
HR'
H
NHR
R''
CR''
H
R
Nu+
H
O
R'
H
NHR
R
Nu N
H
R''
CR''
HH
O
R'
H
NHR OH N
H
R''
CR''
HH
R
Nu:H
H2O
n n+1 n n+1
n n+1n n+1
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 58
Enzimi proteolici
• Classi di enzimi proteolitici:
– Proteasi a serina: enzimi digestivi come tripsina, chimotripsina, elastasi...
– Differiscono nella specificità del substrato:
• Chimotripsina: privilegia il taglio del legame peptidico nel quale l’AA che impegna il C=O ha una catena laterale.
• Tripsina: preferisce un AA carico positivamente (Lys o Arg) nella stessa posizione.
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Enzimi proteolici: proteasi a serina
• Il sito attivo (tripsina bovina 3BTK) è fatto da un residuo di serina (Ser195), uno di istidina (His57) e uno di aspartato (Asp102).
• Durante la catalisi vi è un attacco nucleofilo del OH della serina sul carbonio del carbonile del legame peptidico che deve essere tagliato.
• Durante la reazione un H+ è trasferito dalla serina all’anello imidazolico dell’istidina, l’aspartato forma un legame H con l’istidina.
![Page 60: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/60.jpg)
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Enzimi proteolici: proteasi a aspartato
• Le proteasi ad aspartato comprendono:– La pepsina (enzima digestivo).– Alcune proteasi lisosomiali.– L’enzima renale renina.– Le proteasi dell’HIV.
• Due residui di aspartato sembra partecipino alla catalisi acido/base nel sito attivo.
• Un aspartato accetta H+ da una molecola di H2O nel sito attivo che attacca il carbonio carbonilico del legame peptidico.
• Simultaneamente l’atro aspartato cede l’H+ all’ossigeno del carbonile del legame peptidico.
![Page 61: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/61.jpg)
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Enzimi proteolici: metallo proteasi
• Appartengono alla classe delle proteasi a Zinco (metalloproteasi): – La carbossipeptidasi (enzima digestivo).– Le metalloproteasi della matrice (collagenasi),
coinvolte nella degradazione della matrice extra cellulare durante la crescita dei tessuti.
– Una proteasi lisosomiale.
• Nel sito attivo è presente uno zinc binding motif, con due residui di istidina il cui imidazolo complessa lo ione Zn++.
• Nella catalisi lo Zn++ interagisce con l’ossigeno del C=O promuovendo l’attacco nucleofilo dell’ossigeno di una molecola di acqua nel sito attivo al carbonio del C=O.
• Nella carbossipeptidasi un residuo di glutamato facilita la reazione estraendo un H+ dall’acqua.
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Enzimi proteolici: proteasi a cisteina
• Appartengono alla classe delle proteasi a Cisteine:– La papaina (della Carica Papaya).– Alcune protesi lisosomiali (catepsine). – Le caspasi che si occupano della degradazione delle
proteine dell’apoptosi (morte cellulare programmata).
• Le proteasi lisosomiali a cisteina sono omologhe alla papaina. Sono una famiglia molto grande con svariata specificità di substrato.
• Le caspasi tagliano il lato carbossilico di un aspartato. • Il meccanismo delle proteasi a cisteina si pensa che
coinvolga la deprotonazione del SH di una cisteina da parte di un residuo vicino di istidina seguito da un attacco nucleofilo dello zolfo al carbonio carbonilico.
![Page 63: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/63.jpg)
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Attivazione delle proteasi
• Attivazione delle proteasi:
• La maggior parte delle protesi sono sintetizzate come proenzimi di maggiori dimensioni.
• L’attivazione consiste nella rimozione di un segmento inibitorio nel proenzima.
• L’attivazione può avvenire dopo che la proteasi è stata secreta nell’apposito compartimento cellulare o nella matrice extracellulare.
• In alcuni casi (attivazione dell’apoptosi) l’attivazione può essere a cascata e portare all’attivazione di proteasi specifiche.
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Degradazione delle proteine
• Ci sono tre principali sistemi di degradazione delle proteine (nel muscolo):– Ubiquitina-proteosoma
• Le proteine sono marcate per la degradazione da unità di ubiquitina.
• I proteosoma 20S inattivo viene attivato da una proteina regolatrice diventando proteosoma 26S
• Il proteosoma 26S rompe la proteina in peptidi– I peptidi sono scissi in aminoacidi liberi da altri processi nella cellula
– Lisosomi• Le proteine entrano nei lisosomi via endocitosi
– La catepsina e le proteinasi degradano i legamo peptidici.
– Calpaina• Proteasi attivate da calcio nel citosol della cellula
– I differenti isomeri sono attivati da differenti concentrazioni di calcio.
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Ubiquitina:– Le proteine sono marcate per la proteolisi
selettiva dall’ubiquitina, una proteina ubiquitaria altamente conservata.
– Si forma un legame isopeptidico tra il carbossiterminale dell’ubiquitina e un gruppo NH2 di una lisina della proteina da degradare.
• Il processo è ATP dipendente.
• Sono coinvolti tre enzimi (E1, E2 e E3).
![Page 66: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/66.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 66
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Inizialmente il carbossiteminale dell’ubiquitina è legato con un legame tioestere al Ubiquitin-Activating Enzyme (E1) attraverso una reazione ATP dipendente
• L’ubiquitina vien quindi trasferita ad un gruppo sulfidrilico del Ubiquitin-Conjugating Enzyme (E2).
• Una Ubiquitin-Protein Ligase (E3) trasferisce l’ubiquitina attivata al gruppo -amino dui una lisina formando un legame isopeptidico.
• Ci sono diverse ligasi dell’ubiquitina che differiscono per la specificità.
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
H2N COOH
• Più ubiquitine sono legate per formare una catena.
• Il carbossiterminale forma un legame con il gruppo -amino della Lys48 di una catena adiacente di ubiquitina.
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 68
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Alcune proteine (per esempio le cicline, coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare) presentano una sequenza chiamata destruction box, riconosciuta da un dominio del corrispondente E3.
• L’interazione dell’ubiquitina ligasi con il suo bersaglio è regolata , in alcuni casi, dalla fosforilazione della proteina bersaglio e può coinvolgere altre proteine adattatrici.
H2N COOH
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• La degradazione selettiva di una proteina avviene nel proteosoma. Un complesso proteico presente nella cellula.
• Il core complex del proteosoma, ha un coefficiente di sedimentazione di 20S ed è costituito di 14 subunità di due tipi (77).– Le sette subunità formano un anello a struttura cilindrica.– Le sette subunità formano l’anello centrale.
77
77
{
{1JD2
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Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Il core complex del proteosoma racchiude una cavità fatta di tre compartimenti collegati da uno stretto passaggio.
• L’attività proteasica è associata a tre delle subunità ognuna con differente specificità per il substrato.
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 71
Sistema Ubiquitina-proteosoma
1. Una subunità ha una attività simile alla chimotripsina con preferenza per Tyr o Phe come AA al carbonile del legame peptidico.
2. Una subunità ha una attività simile alla tripsina con preferenza per Arg o Lys al carbonile del legame peptidico.
3. Una subunità ha una attività post-glutamil con preferenza per glutamato o altro residuo acido.
• Non sono coinvolti residui di cisteina o serina. • L’attività idrolasica del proteosoma costituisce una
famiglia di proteasi a treonina.
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 72
Sistema Ubiquitina-proteosoma
• Nella struttura del core complex del proteosoma non ci sono apparenti aperture verso l’esterno.
• Si è postulata l’interazione con un cap complex che apra il passaggio verso l’esterno.
• È stato cristallizzato il core complex 20S del proteosoma con il cap complex 11S.
• L’interazione del cap complex 11S altera la conformazione del dominio N-terminale delle subunità del core complex permettendo l’accesso dall’esterno.
1FNT
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Determinazione
• Western blotting:– anticorpo specifico – sviluppo di chemioluminescenza
Nitrocellulosa
Proteina
Ab1°
Lastra fotografica
LUCE
ECL
Ab2°
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Acetilcolinesterasi
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Aceticolina
ON
+
CH3
CH3
CH3
CH3
O
• È stato il primo neurotrasmettitore ad esser identificato
– da Otto Loewi nel 1921, attraverso la stimolazione del nervo vago nelle rane che, era noto, causa il rallentamento del battito cardiaco.
– Raccolse il fluido circostante il cuore stimolato e lo applicò ad un cuore non stimolato osservandone il rallentamento.
– Attribuì l’effetto ad un prodotto chimico che in seguito identificò come acetilcolina.
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Recettori per l’acetilcolina
• Due tipi:• Recettori Nicotinici
– Canali ionici, – Rispondono rapidamente ed hanno effetto
eccitatorio– Bloccati dal curaro
• Recettori Muscarinici– Accoppiati alla proteina G – Rispondono lentamente– Possono essere sia eccitatori che inibitori– Bloccati da atropina e scopolamina.
![Page 77: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/77.jpg)
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Il recettore nicotinico per l’acetilcolina
![Page 78: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/78.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 78
Recettori muscarinici
• Acetilcolina
• Muscarina
N+
CH3
CH3
CH3O CH3
O
N+CH3
CH3
CH3 O
OH
CH3
4.44 A
![Page 79: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/79.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 79
Recettori nicotinici
• Acetilcolina
• Nicotina
N+
CH3
CH3
CH3O CH3
O
N
CH3
N
5.59 A
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 80
Aceticolinesterasi (AChE) EC 3.1.1.7
• È l’enzima che si occupa di degradare l’acetilcolina per evitare una sovrastimolazione.
ON
+
CH3
CH3
CH3
CH3
O
OHN
+
CH3
CH3
CH3
OCH3
O
+
![Page 81: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/81.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 81
Sinapsi (anticolinesterasici)Corpo cellulare del neurone (organoclorurati, piretrine)
Cl- (GABA)ATPase Na+
K+
Ca++
Canali del Ca++, Calmodulina
Siti di azione degli insetticidi neurotossici
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 82
Colinesterasi
——
——
——
————
——
————
——
————
——
——
++
++++
++++++++
++++
++
++++
++++
—— ——
——
——
——
++++++
++
++++
——
——
++++
——
Na+
K+
Trasmissione del segnale nervoso
![Page 83: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/83.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 83
++——
——
——
——
——
——
————
——
————
——
——
——
++
++++
++++++++
++++
++
++++
++++
—— ——
——
——
——
++++++
++
++++
——
——++
——
Na+
Colinesterasi
K+
Trasmissione del segnale nervoso
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 84
++
——
——
—— ——
——
——
——
——
——
——
——
————
——
++
++++
++++++++
++++
++
++++
++
——
——
——
——
++++++
++++
——
——
++++
——
Na+
No Colinesterasi
++
K+
Trasmissione del segnale nervoso
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 85
Aceticolinesterasi
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 86
Acetilcolina e acetilcolinestrasi
CH3
N+
CH3
CH3
O
O
CH3
OH
His440 Ser200Glu327+-
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 87
Acetilcolina e acetilcolinesterasi
CH3
N+
CH3
CH3
O
O
CH3
OH
His440 Ser200Glu327+-
![Page 88: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/88.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 88
Colina e acetilcolinesterasi acetilata
CH3
N+
CH3
CH3
OH
O
O CH3
His440 Ser200Glu327+-
![Page 89: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/89.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 89
Colina e acetilcolinesterasi acetilata
CH3
N+
CH3
CH3
OHO
O CH3
OH
His440 Ser200Glu327+-
![Page 90: Misure con biomarcatori V. Markers enzimatici Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062312/5542eb4e497959361e8bc1c4/html5/thumbnails/90.jpg)
gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 90
Acetilcolinesterasi fosforilata
CH3
N+
CH3
CH3O
O
CH3
O
PORO
RO
His440 Ser200Glu327+-
Complesso stabile che può essere scisso da ossime
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 91
Acetilcolinesterasi fosforilata
O
PORO
RO
RN
OHPO RO
RO
RN
OH
His440 Ser200Glu327+-
Complesso stabile che può essere scisso da ossime
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 92
Acetilcolinesterasi fosforilata
O
PORO
HO
RN
OHOH R
His440 Ser200Glu327+-
La dealchilazione porta alla stabilizzazione del complesso
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Agenti anticolinesterasici
• Inizialmente sviluppati come arma chimica• Gas nervini
– Tabun, Sarin
• Insetticidi organofosfati– Malathion, parathion
P
O
OO CN
NCH3
CH3
CH3
P
O
CH3
O FCH3
CH3
H
S
P
O
O
O
O
S
O
O
CH3
CH3
CH3 CH3
POO
OS
CH3
CH3
N+O O
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 94
Acetilcolinesterasi e Sarin
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 95
Tossicità selettiva
S
P
O
O
O
O
S
O
O
CH3
CH3
CH3 CH3
S
P
O
O
O
O
O
O
O
CH3
CH3
CH3CH3
METABOLITIINATTIVI
VELOCE(insetti e mammiferi)
VELOCE (mammiferi)LENTO (insetti)
VELOCE (mammiferi)LENTO (insetti)
Malathion
Malaoxon
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 96
Inibitori dell’aceticolinesterasi
• Organofosfati– Poco costosi e poco tossici verso le specie non bersaglio.
– Più solubili in acqua del DDT, più degradabili e meno persistenti.
– Veleno del SN.
Struttura generale • R = catena idrocarburica• Z = gruppo organico• Y = S o O
CH3 OP
OCH3 S
O
NO2R
PR
Y
Yz
Parathion
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 97
Degradazione del parathion®
POO
OS
CH3
CH3
N+
O O
PO
O
OO
CH3
CH3
N+
O O
PO
O
OH
O
CH3
CH3
N+
O O
OH
OP
O
OS
CH3
CH3
NH2
PO
O
OH
S
CH3
CH3
NH2
OH
OH
OH
parathion
paraoxon
dietilfosfato
4-nitrofenolo
dietiltiofosfato
4-aminofenolo
aminoparathion
idrochinone
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 98
Determinazione
• L’enzima idrolizza l’acetilcolina in colina e acido acetico rimuovendola così dalle fessure sinaptiche
• Viene valutata l’idrolisi dell’acetiltiocolina (metodo di ELLMAN)
N+ S
CH3
CH3
CH3 O
CH3 N+ SH
CH3
CH3
CH3 O
CH3O+
N+ O
CH3
CH3
CH3 O
CH3 N+ OH
CH3
CH3
CH3 O
CH3O+
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gs © 2001-2006 ver 3.1 Misure con biomarcatori V 99
SS
NN
OO
OO
OO
S N
OO
ON
+ S
CH3
CH3
CH3
SHN
OO
O
N+ SH
CH3
CH3
CH3+ +
ditiobisnitrobenzoato, DTNB
Reazione di ELLMAN
Assorbimento a 412 nm
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• Il glutatione è un tripeptide formato da glicina, cisteina, acido glutamico.
GSH
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
GLU CYS GLY
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• Due tipi di reazione con il GSH– Spiazzamento di alogeni, solfati, solfonati, fosfati,
nitrogruppi– Il glutatione viene addizionato a doppi legami attivati
(epossidi) come nella sintesi delle prostaglandine.
• Substrati:– Idrofobici che contengono un elettrofilo– Possono reagire non enzimaticamente
Coniugazione con il GSH
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Coniugazione
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
NH
NH
O
SO
R
O
O
NH2
O
O
+
+
RX
HX
glutatione S-transferasiEC 2.5.1.18
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Glutatione S-transferasi – EC 2.5.1.18
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Glutatione S-transferasi EC 2.5.1.18 (1A0F)
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• Glutatione-S-transferasi microsomiale e citosolica
• Almeno quattro classi di glutatione-S-transferasi (), diversi isoenzimi inducibili.– Induttori (3-metilcolantrene, fenobarbital,
corticosteroidi, anti-ossidanti)– La sovraespressione porta a resistenza (insetti
DDT resistenti, piante resistenti all’atrazina, cellule tumorali resistenti alla chemioterapia)
Glutatione S-transferasi
CH3
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• Escrezione dei glutatione-coniugati:– Intatti nella bile– Convertiti in acido mercapturico nei reni ed escreti
nelle urine -glutamiltransferasi, aminopeptidasi M
Eliminazione dei composti coniugati con il GSH
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-glutamiltransferasi
NH
NH
O
SRO
O
O
NH2
O
O
NH
O
NH2
SR
O
O
NH2
O
O
O
O
+
+
H2O
-glutamiltransferasiEC 2.3.2.2
R-S-alanilglicina Glutamato
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Metallotioneine
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Metallotioneine
• Le metallotioneine (MT) sono peptidi e proteine ubiquitarie a basso peso molecolare ad alto contenuto in aminoacidi solforati e metalli.
• Si ipotizza che giochino un ruolo:– nella fissazione dei metalli in tracce (Zn++, Cu++),– nel controllare la concentrazione di questi ioni, – nella regolazione dei flussi degli ioni ai distretti
cellulari,– nella neutralizzazione dei metalli tossici (Cd++, Hg++)
e nella protezione dallo stress indotto dai metalli.
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Distribuzione
• Le metallotioneine sono presenti in tutti gli organismi: animali, vegetali e microrganismi.
• Negli animali queste proteine posseggono polimorfismo genetico e sono abbondanti nei tessuti parenchimali (fegato, rene, pancreas e intestino).
• La loro concentrazione dipende da specie, tessuto, età, sesso ed altri fattori non ancora completamente identificati
• Nonostante che le metallotioneine siano proteine citoplasmatiche si sono trovate accumulate nei lisosomi e nel nucleo.
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Trasporto di metallotioneine
• Schema ipotetico del trasporto di metalli pesanti attraverso l’epitelio branchiale di molluschi bivalvi.– M: metalli in traccia;– MT: metallotioneine.
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Turnover delle metallotioneine
• Schema del turnover di MT in cellule di molluschi bivalvi (Isani et al., 2000).
– M: Metalli; – MTF: Fattori di
Trascrizione; – MTI: Inibitori di
Trascrizione.
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Classificazione
• Il nome deriva dal fatto che hanno un alto contenuto di zolfo e metalli. Tale contenuto varia a secondo del metallo (fino ad oltre il 20% in peso)
• Nei mammiferi sono caratterizzate da un peso molecolare di 6000-7000 Da, contengono da 60 ad 68 amino acidi di cui 20 Cys che legano 7 equivalenti di ione metallico bivalente. Mancano di aminoacidi aromatici. Tutte le Cys sono in forma ridotta e sono coordinate con ioni metallici.
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Classificazione – Le metallotioneine
• La superfamiglia delle the metallotioneine è definita come quella che comprende i peptidi che assomigliano alla metallotioneina renale equina che ha le seguenti caratteristiche:– Basso peso molecolare– Composizione:
• Alto contenuto in Cys, basso contenuto in aromatici.• Sequenza caratteristica.
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Classificazione – Le famiglie
• Una famiglia di metallotioneine è caratterizzata da una particolare sequenza ed è legata ad una o più specie. – I membri di una determinata famiglia appartengono solo a
quella e si pensa siano correlati da un punto di vista evoluzionistico
– Ogni famiglia è identificata da un numero e dalla specie. – Per esempio: Famiglia 1: vertebrati.
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Classificazione
• Le sottofamiglie– Si definiscono sottofamiglie di metallotioneine quegli
insiemi di proteine che oltre i caratteri propri delle famiglie condividono un insieme di caratteri più stringenti.
– Per esempio: m1, m2…
• I sottogruppi– Un sottogruppo rappresenta un insieme di sequenza
correlate filogeneticamente. In un albero filogenetico rappresentano un ramo.
– Per esempio: m2U2 = MT-2 di ungulati, sottogruppo della sottofamiglia m2.
• Le isoforme– Sono i membri di sottogruppi, sottofamiglie e famiglie. – Per esempio MT-1E umana.
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Classificazione – I clan
• Un clan è un insieme di proteine che dividono delle caratteristiche non già definite:– Struttura,– Proprietà termodinamiche,– Affinità per i metalli– Proprietà funzionali– …
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Sequenza Famiglia Caratteristiche Sottofamiglie
K-x(1,2)-C-C-x-C-C-P-x(2)-C1
vertebrati
Da 60 a 68 AA; 20 Cys (21 in un caso), 19 totalmente conservate; due domini strutturali, contenenti 9 e 11 Cys che legano 3 e 4 ioni bivalenti rispettivamente. Il gene è composto di 3 esoni, 2 introni
m1, m2, m3, m4, m, a, a1, a2, b, ba, t
C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C-K
2molluschi
Da 64 a 75 AA; da 18 a 23 Cys, minimo 13 totalmente conservate; due domini
mo1, mo2, mog, mo
P-[GD]-P-C-C-x(3,4)-C-x-C3
crostacei
da 58 a 60 AA; esistono varianti con e senza Met N-terminale; 18 Cys totalmente conservate; due domini, ognuno con 9 Cys che legano 3 ioni bivalenti
c1, c2, c
P-D-x-K-C-[V,F]-C-C-x(5)-C-x-C-x(4)-C-C-x(4)-C-C-x(4,6)-C-C
4echinodermi Da 64 a 67 AA; 20 Cys ; due domini strutturali, contenenti
9 e 11 Cys che legano 3 e 4 ioni bivalenti rispettivamentee1, e2
C-G-x(2)-C-x-C-x(2)-Q-x(5)-C-x-C-x(2)D-C-x-C
5ditteri
Da 40 a 43 AA; 10 Cys conservate d1, d2
K-C-C-x(3)-C-C6
nematodi62 e 74 AAs; 18 Cys, contiene una Tyr n1, n2
una sequenza7
ciliati105 AA, 31 Cys, multiplo pattern CCC, una Tyr ci
C-G-C-S-x(4)-C-x-C-x(3,4)-C-x-C-S-x-C
8funghi I
Da 25 a 33 AA; 7 Cys f1
C-X-K-C-x-C-x(2)-C-K-C 11funghi IV
Da 55 a 56 AA; 9 Cys; un pattern CCC; contiene His e Phe f4
K-C-A-C-x(2)-C-L-C14
procariotiDa 53 a 56 AAs; 9 Cys; una Tyr, una His; contine residui non comuni
p
[YFH]-x(5,25)-C-[SKD]-C-[GA]-[SDPAT]-x(0,1)-C-x-[CYF]
15piante
Da 45 a 84 AAs; due regioni ric he di Cys (dominio 1 e dominio 3) separate da una regione con poche Cys (dominio 2)
p1, p2, p2v, p3, pec, p21
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Struttura
• Nonostante che le sequenze aminoacidiche siano diverse hanno caratteristiche strutturali simili:– Forma a manubrio,– Due domini,– Diverse unità tetraedriche Me(II)-Cys,– Tutte le Cys coinvolte nel legame con lo ione
metallico– Pressoché assente la struttura secondaria.
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Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae (1AQR)
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Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae (1AQR)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunità (1QJH)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunità (1QJH)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunità (1QJL)
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Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunità (1QJL)
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Cd-Metallotioneina umana (1MHU)
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Cd-Metallotioneina umana (1MHU)
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)
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Struttura genica
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Aspetti funzionali
• La più importante delle funzionalità delle metallotioneine è la loro inducibilità da una serie di agenti e condizioni:– Ioni metallici d10 (Cu++, Zn++, Cd++, Tl+, Pb++…)– Ormoni– Citochine– Fattori di crescita– Promotori tumorali– Stress
• È dimostrato il loro aumento fisiologico durante la proliferazione cellulare:
MT-Zn++ + Apo-Zinc-fingers MT + Zn++- Zinc-fingers
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Determinazione
• Le MT sono proteine ricche in cisteina con affinità elevata per i metalli pesanti
• La concentrazione di MT è quantificata valutando il contenuto in Cys
• Reazione di ELLMAN (standard GSH)
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• Il glutatione è un tripeptide formato da glicina, cisteina, acido glutamico.
GSH
NH
NH
O
SHO
O
O
NH2
O
O
GLU CYS GLY
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SS
NN
OO
OO
O
O
S N
OO
OSR
SHN
OO
O
+RS +
ditiobisnitrobenzoato, DTNB
Reazione di ELLMAN
Assorbimento a 412 nm
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Grazie a…
• … Bruna Gravina, Irene Tamburin, Christian Asirelli, Federico Caselli, Francesco Ferretti, Giuseppe Giammanco che, nell’ambito delle loro tesi di laurea in Scienze Ambientali, hanno prodotto testi, immagini, figure e diapositive, utilizzate in questa presentazione.
Giorgio Sartor
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Referenze sul WEB …
• Vie metaboliche – KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/
• Degradazione degli xenobiotici: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html
• Struttura delle proteine: – Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/– Hexpasy
• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/• Enzyme (Enzyme nomenclature database):
http://www.expasy.org/enzyme/– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/
• Enzimi: – Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry
http://www.atsdr.cdc.gov
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…e naturalmente
• Questo ed altro materiale può essere trovato visitando il sito: http://www1.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
• Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio SartorUniversità di Bologna a Ravenna Corso di Laurea in Scienze Ambientali