Mikropropagacija vrste Micromeria thymifolia (Scop.)
Transcript of Mikropropagacija vrste Micromeria thymifolia (Scop.)
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Manić V. Branislav
Mikropropagacija vrste Micromeria thymifolia (Scop.)
Fritsch
Master rad
Niš, 2014.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Mikropropagacija vrste Micromeria thymifolia (Scop.)
Fritsch
Master rad
Kandidat: Mentor:
Manić V. Branislav Dr Dragana D. Stojičić
Broj indeksa: 57 Vanredni profesor
Niš, 2014.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Micropropagation of Micromeria thymifolia (Scop.)
Fritsch
Master thesis
Candidat: Mentor:
Manić V. Branislav Dr Dragana D. Stojičić
No. of index: 57 Associate professor
Niš, 2014.
Zahvalnica
Zahvaljujem se mentoru, profesorki dr Dragani Stojičić na izboru
teme, ukazanom poverenju i pomoći pri samoj izradi ovog master rada.
Takođe se zahvaljujem i asistentkinji Svetlani Tošić na pruženoj pomoći
i strpljenju prilikom realizacije eksperimentalnog dela ovog rada. Ovaj
master rad je rađen u okviru doktorske disertacije asistentkinje Svetlane
Tošić i sadrži još uvek nepublikovane rezultate.
Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici i prijateljima na nesebičnoj
podršci i ljubavi, i ovaj rad posvećujem njima!
Skraćenice
IAA - indol - 3 sirćetna kiselina
BA (BAP) - benzil - 6 aminopurin
IBA - indol - 3 buterna kiselina
NAA - naftil sirćetna kiselina
2,4-D - 2,4 - dihlor fenoksi sirćetna kiselina
Sadržaj: 1. Uvod .......................................................................................................................................................... 1
1.1. Familija Lamiaceae ............................................................................................................................ 2
1.1.1. Rod Micromeria .......................................................................................................................... 3
1.1.2. Vrsta Micromeria thymifolia ....................................................................................................... 5
1.2. Kultura in vitro ................................................................................................................................... 7
1.2.1. Mikropropagacija ........................................................................................................................ 8
1.2.2. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro ................................................................ 12
2. Cilj istraživanja ........................................................................................................................................ 14
3. Materijali i metode ................................................................................................................................. 16
3.1. Biljni materijal ................................................................................................................................. 17
3.2. Metode sterilizacije .......................................................................................................................... 17
3.2.1. Sterilizacija eksplantata ............................................................................................................. 17
3.2.2. Sterilizacija hranljivih podloga ................................................................................................. 18
3.2.3. Sterilizacija laboratorije, radnih površina i pribora ................................................................... 18
3.3. Hranljiva podloga ............................................................................................................................. 19
3.3.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. thymifolia ......................................... 20
3.4. Statistička obrada podataka .............................................................................................................. 21
4. Rezultati .................................................................................................................................................. 22
4.1. Uvođenje Micromeria thymifolia u kulturu in vitro ......................................................................... 23
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria thymifolia ........................ 23
4.3. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria thymifolia .................................................. 30
5. Diskusija .................................................................................................................................................. 32
6. Zaključak .................................................................................................................................................. 35
7. Literatura ................................................................................................................................................. 37
Sažetak
Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch je višegodišnja biljka iz familije Lamiaceae,
poznata po svojim aromatičnim svojstvima i korišćenju u medicinske svrhe. U ovom radu ispitan
je uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka, kao i na produkciju
biomase ove biljke. Korišćena je MS podloga sa dodatkom različitih koncentracija citokinina -
BA i auksina - IAA. MS podloga sa dodatkom 30 μM BA i 0,57 μM IAA bila je najpogodnija za
indukciju aksilarnih pupoljaka, dok je njihova najveća prosečna dužina zabeležena na
eksplantatima gajenim na podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA. Najveća prosečna sveža masa
zabeležena je na eksplantatima gajenim na MS podlozi sa dodatkom 30 μM BA i 0,57 μM IAA,
dok je najveća prosečna vrednost suve mase bila na podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM
IAA.
Ključne reči: Micromeria thymifolia, aksilarni pupoljci, BA, IAA.
Abstract
Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch is a perennial herb in the family Lamiaceae,
known for its aromatic properties and use for medical purposes. According to the literature up to
now, this plant has not been introduced in vitro culture. In this work, the influence of growth
regulators, on the induction and axillary bud elongation were tested, as well as the biomass
production of the plant. We used MS medium supplemented with different concentrations of
cytokinins - BA and auxins - IAA. MS medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA
was the most suitable for the induction of axillary buds, while their longest average length
observed in the medium with 1 μM BA and 0,57 μM IAA. The highest average fresh weight was
observed on MS medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA, while the highest
value of dry weight was on the base with the addition of 1 μM BA and 0,57 μM IAA.
Keywords: Micromeria thymifolia, axillary buds, BA, IAA.
2
1.1. Familija Lamiaceae
Familija Lamiaceae (usnatice) je predstavljena sa 240 rodova i preko 7200 vrsta koje su
rasprostranjene širom Zemlje, izuzev Arktika (Braüchler et al., 2008). Najveće bogatstvo rodova
i vrsta ove familije je u oblasti Mediterana i Male Azije. Familija Lamiaceae je među
najbrojnijim u ovom delu Evrope i u flori Balkanskog poluostrva predstavljena je sa 371 vrstom,
a od toga su 84 vrste Balkanski endemiti. U Srbiji ima 147 vrsta ove familije koje su
predstavljene u okviru 30 rodova. Familija Lamiaceae je brojna familija, koju čine biljke sa
velikim značajem za čoveka.
Vrste familije Lamiaceae su kosmopolitskog rasprostranjenja i naseljavaju pretežno suva
i dobro osunčana staništa. Samo mali broj vrsta naseljava hladnije predele. Postoje vrste koje
rastu na skoro svim kontinentima, dok su neke ograničene na male oblasti, poput rtanjske metlice
(Nepeta rtanjensis) koja raste samo u Srbiji na planini Rtanj (Ljajević-Grbić, 2008).
Pripadnici familije Lamiaceae mogu biti zeljaste ili drvenaste biljke u obliku žbunova ili
polužbunova, retko drveće ili lijane. Stablo im je četvorougaono, listovi su po dva u pršljenu, bez
zalistaka, prosti ili na različite načine deljeni. Na nadzemnim vegetativnim organima nalaze se
žlezdane dlake, često u obliku glavice ili žlezdane ljuspice. Cvetovi kod ovih biljaka su
zigomorfni, retko aktinomorfni (Mentha), dvopolni, petočlani, ređe četvoročlani. Čašica se
sastoji od pet sraslih listića, cevasta je, kod nekih predstavnika čak dvousnata. Krunica je
sastavljena od pet listića, koji su u donjem delu srasli u cev, dok je gornji deo razdvojen na dva
dela: gornju usnu i donju usnu. Andreceum se sastoji od 4 prašnika, ili od 2 prašnika i 2
staminodije. Tučak je sinkarpan, sagrađen od dva oplodna listića. Plodnik je nadcvetan, dvook,
ili zbog sekundarno razvijene pregrade četvorook i u svakom okcu sadrži po jedan semeni
zametak. Cvetovi su grupisani u cimozne cvasti, vrlo retko su pojedinačni. Plod se najčešće
sastoji iz 4 oraščića (Tatić i Blečić, 2002).
Familiju Lamiaceae čine biljke sa važnom primenom u medicini, farmaciji i kozmetičkoj
industriji, jer sadrže veliki broj aktivnih sastojaka. Najvažnije je to što sadrže etarska ulja
(Slavkovska et al., 2005), a kao glavni sastojci se izdvajaju aromatični alkoholi, fenoli, terpeni,
3
ketoni, aldehidi itd. Najpoznatiji predstavnici familije su: majčina dušica, nana, bosiljak,
ruzmarin, žalfija, lavanda, origano, matičnjak, mrtva kopriva, rtanjski čaj, srdačica i mnogi drugi.
Osim kao lekovite, poznate su i kao korovske i rudimentarne vrste.
I vrste roda Micromeria su dobro poznate kao aromatične vrste, jer sadrži značajne
količine etarskog ulja.
1.1.1. Rod Micromeria
Prvi put rod Micromeria opisuje Bentham 1829. godine. Rod Micromeria sadrži vrste
koje se prostiru od Himalaja do Makaronezijskog arhipelaga (Madeira, Kape Verde i Kanarska
ostrva) i od Mediterana do Južne Afrike i Madagaskara (Morales, 1991; Brauchler et al., 2008).
Slika 1. Rasprostranjenost roda Micromeria u svetu (Brauchler, 2008)
4
Ovaj rod je predstavljen sa 54 vrste, 32 podvrste i 13 sorti. U flori Srbije i Crne Gore je
predstavljen sa 10 vrsta, od kojih su 7 endemične (Šilić, 1979).
Rod Micromeria smatra se delom nejasno definisanog “Satureja kompleksa”. Budući da
postoje jasne morfološke raznolikosti, mnogi taksonomisti su podelili ovaj kompleks u nekoliko
rodova: Satureja L., Clinopodium L., Calamintha Mill., Acinos Mill. i Micromeria Benth.
(Boissier, 1879). Sa druge strane, postoje taksonomisti koji spajaju ove grupe u jedan rod – rod
Satureja s.l.
Boissier je koristio termin “sekcija”, za klasifikaciju vrsta iz roda Micromeria. Na osnovu
morfoloških karakteristika i filogenetskih odnosa Boissier (1879) deli rod Micromeria u tri
sekcije:
Pseudomelissa (M. thymifolia, M. albanica, M. pulegium, M. dalmatica)
Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata, M. parviflora)
Cymularia
Na osnovu molekularnih analiza, pokazano je da je rod Micromeria polifilan, pa su vrste
iz sekcije Pseudomelissa prebačene u rod Clinopodium, gde zbog srodnosti i zbog morfoloških
karakteristika i pripadaju (Arabaci et al., 2010).
Postojanje velikog broja sinonima za pojedine vrste iz roda Micromeria potvrđuje da
postoje određene nejasnoće u pogledu taksonomije i nomenklature. Tako se kroz literature često
može naći da su neke vrste smeštene u rod Thymus, Satureja, Calamintha i dr.
Uglavnom aromatične, vrste roda Micromeria su često označene kao biljke sa
farmakološkim svojstvima. Koriste se kao lekovi protiv prehlade, poremećaja srca, bolova u
grudima, glavobolje, kožnih infekcija, očnih zapaljenja i zubobolje. Ističu se nihovo anestetičko,
antiseptičko, antireumatsko dejstvo, kao i stimulacija centralnog nervnog sistema (Gulluce et al.,
2004). Etarska ulja vrsta iz roda Micromeria imaju značajna antioksidantna, antibakterijska i
antifugalna dejstva (Duru et al., 2004).
5
1.1.2. Vrsta Micromeria thymifolia
Carstvo: Plantae
Razdeo: Magnoliophyta
Klasa: Magnoliopsida
Red: Lamiales
Familija: Lamiaceae
Rod: Micromeria
Vrsta: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch
*sinonim - Clinopodium thymifolium (Scop.) Kuntze
Slika 2. Rasprostranjenost vrste M. thymifolia (Scop.) Fritsch
6
M. thymifolia je višegodišnja biljka sa mirisom sličnim menti, vitka, tamno zelena sa
blago sjajnim lišćem i sa brojnim, uspravnim, sitnim cvetovima. Prosečna biljka je visoka 20-30
cm. Lišće je dugačko 5-20 mm, eliptičnog do ovalnog oblika. Cvetovi su dugački 5-9 mm, bele i
roze boje, grupisani tako da formiraju cvasti. Cveta u letnjem periodu. Na Balkanskom
poluostrvu se može naći na suvim, stenovitim i dobro osunčanim mestima, na nadmorskoj visini
od 30 do 2000 m. Ne podnosi previše vode.
Slika 3. Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch
Micromeria thymifolia se na području Mediterana koristi kao začin i kao medicinska
biljka (Hammer et al., 2005). Lišće se koristi za spremanje čaja. Istražen je sastav i diuretični
efekat etarskog ulja nadzemnih delova ove biljke. Ustanovljeno je da osnovu ulja čine ciklični
monoterpeni sa kiseonikom, a najzastupljeniji je pulegon (67,53%). Etarsko ulje deluje kao
diuretik, čemu posebno doprinosi pulegon (Vladimir-Knežević et al., 2005).
7
1.2. Kultura in vitro
Razmnožavanje biljaka može biti polno (generativno) i bespolno (vegetativno). Kod
polnog razmnožavanja, putem semena, dolazi do spajanja naslednog materijala roditelja. Kod
vegetativnog razmnožavanja, iz ćelija, tkiva ili vegetativnih organa, mogu se razviti nove
jedinke, genetski istovetne sa matičnom biljkom. Danas u biljnoj proizvodnji vegetativnim
razmnožavanjem, postoje metode, koje se dele na tehnike makropropagacije i mikropropagacije.
Kultura biljnog tkiva predstavlja poseban način proizvodnje novih individua u
laboratorijskim uslovima in vitro. Iz vegetativnih delova samo jedne biljke uzete iz prirode,
moguće je proizvesti veliki broj novih jedinki, gajenjem na hranljivoj podlozi, u sterilnim,
kontrolisanim laboratorijskim uslovima.
Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro diferenciraju, dele i regenerišu pojedine organe,
embrione ili celu biljku, zavisi od:
- totipotencije - sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele i da regenerišu
pojedine organe, embrione ili celu biljku
- plastičnosti - sposobnost biljke da menja svoj program rastenja, metabolizma i razvića u
zavisnosti od uslova sredine.
Vegetativna propagacija obuhvata nekoliko načina razmnožavanja, to su:
a) Mikropropagacija - permanentna kultura pupoljaka;
b) Organogeneza - formiranje pupoljaka de novo;
c) Somatska embriogeneza - razviće embriona iz somatskih ćelija;
d) Androgeneza i ginogeneza - razviće biljaka iz haploidne ćelije muškog i ženskog
gametofita bez oplođenja;
e) Somatska hibridizacija - somatske ćelije mogu da se ponašaju kao polne ćelije i da
fuzijom daju novi organizam.
8
Tehnike kulture biljaka in vitro se mogu podeliti i po tipu eksplantata koji se uvode u
kulturu: ćelije, tkiva ili organi.
Primena tehnike kulture in vitro može da ima poseban značaj kod očuvanja ugroženih i
retkih vrsta, tako što će se one u laboratorijskim uslovima umnožiti i zatim vratiti na prirodna
staništa. Takođe, veliki značaj ima i u farmaciji, šumarstvu i hortikulturi jer se bitno smanjuje
pritisak na prirodne populacije onih biljaka koje su bitne u navedenim privrednim granama. Vrlo
veliki značaj ima i u borbi za suzbijanje i eliminaciju biljnih virusa. Pošto se virusi, po pravilu,
ne nalaze u meristemskim ćelijama, razmnožavanjem zdravog materijala u kulturi dobija se
zdravo vegetativno potomstvo. Ako se iz obolele biljke izoluju meristemi, može se dobiti
potomstvo oslobođeno od virusa.
1.2.1. Mikropropagacija
U širem smislu termin mikropropagacija označava svaki način razmnožavanja biljaka u
kulturi in vitro.
U užem smislu označava razmnožavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih
pupoljaka, koji obuhvataju meristeme vrha stabla ili one koji su formirani u pazuhu lisnih
primordija (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996; Nešković et al., 2003).
Mikropropagacija se primenjuje kod brzog razmnožavanja novih genotipova, održavanja
interesantnih genotipova, ubrzanja, skraćivanja ili dovršavanja postupaka selekcije i
oplemenjivanja, regeneracije izdanaka i celih biljaka u genetičkom inženjerstvu (Vinterhalter i
Vinterhalter, 1996). U laboratorijskim uslovima u kojima je moguće obezbediti apsolutnu
kontrolu uslova rasta i zdravstvenog stanja kulture, mikropropagacija omogućava veliku brzinu
razmnožavanja. Na osnovu toga, mikropropagacija je dala rešenje za savremenu rasadničku
proizvodnju gde su neki od prvih radova bili na hrizantemi (Earl i Langhans, 1975).
Tokom razvoja kulture in vitro predložene su različite podele samog procesa. Prva je bila
definisana u tri koraka ili faze in vitro multiplikacije biljaka, ali je kasnije ova podela adaptirana.
9
Danas je najviše u upotrebi podela koju su dali Debergh i Maene (1981), koja podrazumeva faze
od 0-4.
Faza 0: Izbor majke biljke i njena priprema
Pre nego se počne sa mikropropagacijom treba pažljivo odabrati majku biljku, koja treba
da je tipičan predstavnik vrste i bez ikakvih vidljivih simptoma bolesti. Naziv ,,nulta” potiče od
toga što to nije faza samog razmnožavanja, već obuhvata postupke pravilnog prikupljanja,
prenošenja i čuvanja biljnog materijala. Kao početni materijal, u postupcima klonskog
razmnožavanja biljaka, preporučuje se vršni meristem.
Faza 1: Uspostavljanje aseptične kulture
Ova faza je, u stvari, prva faza klonskog razmnožavanja. Ona obuhvata:
- dobijanje aseptične kulture odabranog biljnog materijala;
- izolaciju dela biljke koji kloniramo (meristem, list, tučak, koren i dr.);
- celokupnu sterilizaciju posuđa, pribora, prostora;
- pripremanje i sterilizaciju hranljivih podloga.
Za uspešnost ove faze prvo je potrebno da eksplantat koji se uvodi u kulturu, bude bez
mikrobne kontaminacije, a zatim da ostvari neku vrstu rastenja, rast vršnog izdanka ili formiranje
kalusa. Obično se kultura započinje većom količinom početnog materijala (eksplantata). Nakon
kraćeg vremena inkubacije, svaka od posuda za kulturu za koju se utvrdi da je kontaminirana
(bilo da je u pitanju eksplantat ili podloga) mora biti odstranjena.
10
Faza 2: Produkcija (razmnožavanje) propagula
Osnovni cilj ove faze jeste produkcija tj. umnožavanje kloniranih biljka (ili novih
mladica, izdanaka ili propagula), koje su, kad se odvoje od kulture, sposobne da nastave rastenje
i da daju kompletnu biljku.
U ovoj fazi je najvažnije voditi računa da se postigne razmnožavanje bez gubitka
genetičke stabilnosti. Umnožavanje se može obavljati na različite načine, a koja metoda će se
primeniti to zavisi od rezultata koji se želi postići (broj biljaka, biljke sa određenim osobinama i
sl.), od vrste biljke koja se klonira i njenih bioloških ograničenja. Faza multiplikacije se ponavlja
sve dok se ne dobije željeni broj biljaka.
Faza 3: Priprema za rast u prirodnom okruženju
Izdanci ili biljke dobijene u fazi 2 su jako male i nesposobne za rast i samoodržavanje u
zemlji ili kompostu. Zato faza 3 podrazumeva sve korake neophodne za individualan rast biljaka,
sposobnih za fotosintezu i preživljavanje bez dodatka ugljenih hidrata. Neke biljke zahtevaju
poseban tretman tokom ove faze da ne bi ostale malog rasta ili dormantne kada se prebace iz
uslova kultiviranja. Kao što je Murashige predložio, ova faza podrazumeva ukorenjavanje
izdanaka in vitro pre prebacivanja u zemlju. Rizogeneza se obično indukuje u podlozi sa
auksinom. Tek kada adventivno korenje dostigne odgovarajuću dužinu, biljke se mogu
postepeno prenositi u ex vitro uslove.
Faza 4: Priprema i prenos biljaka u uslove spoljašnje sredine
Prenos biljaka iz in vitro u ex vitro uslove je veoma važan. Ako se ne obavi pažljivo,
transfer može da rezultira velikim gubitkom propagiranog materijala. Brojni su razlozi za to,
pošto se klonirane biljke razlikuju od biljka gajenih u ex vitro uslovima po brojnim anatomskim i
funkcionalnim karakteristikama.
11
Izdanci dobijeni kulturom razvijali su se u uslovima velike vlažnosti i niskog intenziteta
svetlosti, što za rezultat daje slabo razvijen epikutikularni voštani sloj lista. Stomaterni aparat
kod ovih biljaka je atipičan i nije u mogućnosti da se zatvara u uslovima niske relativne
vlažnosti. Ovo uslovljava da in vitro biljke gube vodu vrlo brzo čim se prebace u uslove
spoljašnje sredine.
In vitro tehnike poseduju sledeće prednosti u odnosu na tradicionalne metode razmnožavanja:
a) Razmnožavanje in vitro je mnogo brže od razmnožavanja in vivo;
b) Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti in vivo;
c) Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže nego biljke koje rastu in vivo, jer su
oslobođene patogena (virus free) i infekcija bakterijama i gljivama;
d) In vitro omogućava razmnožavanje samo zdravih biljaka;
e) Vegetativno razmnožavanje in vitro se može započeti sa vrlo malo biljnog materijala kao
početnog eksplantata;
f) Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski proizvodnju
određenih kultura;
g) Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti ugroženih i retkih vrsta;
h) Kultura in vitro je korisna za osnivanje banke gena.
Pored prednosti, in vitro tehnike imaju i nedostatke. Kao nedostaci kuture in vitro navode se:
a) U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska;
b) Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro;
c) Prenos biljaka iz in vitro u in vivo uslove je ponekad težak i mukotrpan posao;
d) Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva;
e) U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je teška.
12
1.2.2. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro
Gajenje kultura in vitro podrazumeva kontrolu svih činilaca, od izbora eksplantata i
uspostavljanja aseptičnih uslova, zatim manipulacije razvića u kulturi putem definisanja sastava
hranljive podloge, posebno balansa hormona, do kontrole spoljašnjih faktora sredine kao što su
svetlost, vlažnost i temperatura.
Uspešnost kulture ćelija, tkiva ili organa zavisi od sastava same podloge, koja bi trebalo da
zadovolji nutritivne i fiziološke potrebe ćelija u kulturi. No, bez obzira na različitost hranljivih
podloga, zajedničko za sve je da one moraju da sadrže sledeće:
- voda;
- agar;
- mineralne soli;
- ugljeni hidrati;
- vitamini;
- regulatori rastenja (biljni hormoni).
Biljni hormoni imaju ključnu ulogu u regulaciji rastenja biljnih kultura in vitro, jer
kontrolišu ne samo brzinu rastenja jednog organa ili tkiva, već svojim balansom mogu izazvati
diferenciranje organa, odnosno mogu da usmere i usklade rastenje kompleksnih struktura, kao
što su izdanci ili embrioni. U biljne hormone koji se koriste u kulturi in vitro spadaju:
1) Auksini - često se dodaju hranljivim podlogama. Prouzrokuju izduživanje ćelija i bubrenje
tkiva, ćelijsku deobu (obrazovanje kalusa), obrazovanje adventivnih korenova, inhibiciju
obrazovanja adventivnih i bočnih izdanaka, a često i embriogenezu u suspenzionim kulturama. U
auksine spadaju IAA, IBA, NAA ili 2.4-D.
13
2) Citokinini - često se koriste za stimulaciju rastenja i razvića. Najviše se koriste kinetin,
BA, 2iP i PBA. Oni obično pokreću deobu ćelija, naročito ako se dodaju zajedno sa auksinima.
U većim koncentracijama (1-10 mg/l) mogu indukovati obrazovanje adventivnih izdanaka, ali se
obrazovanje korenova u tom slučaju zaustavlja. Prirodni citokinin je i zeatin. Važno je
napomenuti da odnos koncentracija auksina i citokinina određuje razvoj biljne kulture. Veća
koncentracija auksina (manja koncentracija citokinina) indukuje razvoj korenova. Veća
koncentracija citokinina (manja koncentracija auksina) indukuje razvoj izdanaka. Jednaka
koncentracija ovih hormona indukuje razvoj kalusa.
3) Giberelini - grupa biljnih hormona koja se, generalno, slabo koristi u in vitro kulturi viših
biljaka. Ovi hormoni stimulišu izduživanje stabla izvesnih biljaka patuljaste forme.
4) Abscisinska kiselina (ABA) i etilen - hormoni koji se nekad označavaju inhibitorima, jer
vrše negativan uticaj na kulturu in vitro. U nekim slučajevima ABA izaziva pokretanje
obrazovanja kalusa (odnosno rasta kalusa), kao i sazrevanje embriona u procesu embriogeneze,
ali veoma retko.
Osmotski potencijal, pH podloge, svetlost i temperatura su još neki, od mnogih faktora,
koji bitno utiču na rast i razvuće biljaka gajenih u kulturi in vitro.
15
Cilj istraživanja:
Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. thymifolia i ispitivanje
uticaja kombinacije citokinina i auksina na rastenje i izduživanje aksilarnih pupoljaka
Ispitivanje uticaja kombinacije citokinina i auksina na produkciju biomase eksplantata M.
thymifolia
Statistička obrada dobijenih rezultata
Izvođenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa literaturnim podacima
17
3.1. Biljni materijal
Biljni materijal je uzorkovan sa lokaliteta u zapadnoj Srbiji, u klisuri Belog Rzava kod
Kotromana. Biljke vrste Micromeria thymifolia uzorkovane su u vegetativnoj fazi. Tokom
eksperimentalnog rada, kao eksplantati su korišćeni nodalni segmenti približno iste veličine
(Stojičić i Tošić, 2014, nepublikovan rezultat). Vršni pupoljci nisu korišćeni. Eksplantati su
postavljeni na hranljivu podlogu MS (Murashige i Skoog, 1962) sa različitim koncentracijama
regulatora rastenja, citokinina (BA) i auksina (IAA). Na svaku podlogu postavljano je 30
nodalnih eksplantata i to po 10 eksplantata u tri tegle.
3.2. Metode sterilizacije
Sterilizacija je postupak kojim se kompletno odstranjuju ili uništavaju svi oblici
mikroorganizama. U kulturi in vitro postoje 4 glavna izvora infekcija: biljka, hranljiva podloga,
vazduh i istraživač (neprecizan rad) (Marić, 1995).
3.2.1. Sterilizacija eksplantata
Ako se eksplantat izoluje iz biljke koja je rasla u prirodi neophodno je izvršiti površinsku
sterilizaciju, sa ciljem da se sa spoljašnosti primarnog eksplantata biljke uklone mikroorganizmi
koji bi mogli prilikom uvodjenja eksplantata u kulturu in vitro da kontaminiraju hranljivu
podlogu (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996). Površinska sterilizacija se izvodi tako što se nodalni
segmenti isecaju, smeštaju u odgovarajuće sterilne posude i tretitaju sredstvom za površinsku
sterilizaciju.
Jedinjenja koja se najčešće koriste u tu svrhu su: alkohol (uglavnom se koristi 70% alkohol);
varikina; K-hipohlorit, Ca-hipohlorit; sublimat ili živin hlorid (HgCl2) rastvoren u česmenskoj
vodi.
18
Biljke Micromeria thymifolia su sterilisane korišćenjem 30%-tnog rastvora varikine u
trajanju od 25 minuta i potom ispirane tri puta sterilnom destilovanom vodom. Radi eliminacije
gljivične infekcije eksplantati su izlagani delovanju 0,05%-tnog rastvora nistatina u trajanju od
24 časa, nakon čega su isprani tri puta sterilnom destilovanom vodom, a zatim preneti na
hranljivu podlogu (Stojičić i Tošić, 2014, nepublikovan rezultat).
3.2.2. Sterilizacija hranljivih podloga
Sterilizacija hranljive podloge se može obaviti na više načina:
- Fizičkim uništavanjem mikroorganizama pomoću suvog toplog vazduha, pare ili
zračenja;
- Fizičkim odstranjivanjem mikroorganizama pomoću filtracije ili pranjem;
- Hemijskim uništavanjem mikroorganizama (etilen-hlorid, Na-hipohlorit, K-hipohlorit,
Ca-hipohlorit, antibiotici);
- Autoklaviranjem (sterilizacija vrućom parom pod povišenim pritiskom).
Sterilizacije hranljive podloge u našem eksperimentu je vršena u autoklavu, na temperaturi
od 120°C u trajanju od 30 minuta.
3.2.3. Sterilizacija laboratorije, radnih površina i pribora
Radna prostorija i površine su sterilisane pomoću UV lampe, najmanje dva sata pre
početka rada. Radne površine su sterilisane 96%-tnim alkoholom i pre početka eksperimenta, kao
i više puta tokom rada.
Instrumenti, petri kutije i ostalo posuđe i pribor, sterilisani su suvom sterilizacijom u
trajanju od 1-2 sata na temperaturi od 160-180 °C. Pre sterilizacije u suvom sterilizatoru, objekti
se stavljaju u metalne kutije ili uvijaju u foliju, kako nakon sterilizacije ne bi došlo do
19
kontaminacije. Pincete i skalpeli su sterilisani iskuvavanjem u destilovanoj vodi do 30 min,
nakon čega su uranjeni u 96%-tni etil-alkohol. Pre upotrebe, metalni pribor se zagreva do
usijanja nad plamenom špiritusne lampe. Tokom rada, pribor treba više puta menjati, vraćati u
alkohol i sterilisati na plamenu.
3.3. Hranljiva podloga
Osnovna hranljiva podloga na kojoj su gajeni eksplantati vrste M. thymifolia bila je MS
podloga (Murashige i Skoog, 1962). Vrednost pH podloge se pre autoklaviranja uglavnom
podešava na 5,8, ali treba uzeti u obzir da ta vrednost može da se promeni nakon autoklaviranja,
kao i da sama biljka može da utiče na promenu (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996). Sastav za
pripremu prikazan je u tabeli 1:
Tabela 1. Sastav MS hranljive podloge
Makro mineralne soli MS (mg/l)
NH4 NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2× 2H2O 440
MgSO4× 7H2O 370
KH2PO4 170
Mikro mineralne soli MS (mg/l)
Mn SO4 × 4H2O 22,3
Zn SO4× 7H2O 8,6
H3BO3 6,2
KJ 0,83
NaMoO4 × 2H2O 0,25
CuSO4 × 5 H2O 0,025
CoCl2 × 6 H2O 0,025
FeSO4 × 7H2O 27,8
Na2EDTA 37,3
20
Organski dodaci MS (mg/l)
vitamin B1 0.4
vitamin B6 0.5
nikotinska kiselina 0.5
glicin 2.0
mioinozitol 100
saharoza 30 000
agar 700
3.3.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. thymifolia
U ovom eksperimentu, da bi se ispitao uticaj regulatora rastenja na indukciju aksilarnih
pupoljaka, u osnovnu hranljivu MS podlogu dodati su citokinin (BA) - u rasponu koncentracija
od 0,1 μM do 30 μM, i auksin (IAA) u koncentraciji 0,57 μM. Korišćene kombinacije regulatora
rastenja su prikazane u tabeli 2:
Tabela 2. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka M. thymifolia
Hranljiva
podloga 1 2 3 4 5 6 7 8
BA (μM) 0 0 0,1 0,3 1 3 10 30
IAA (μM) 0 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57
Eksplantati su gajeni u kulturi 28 dana, na temperaturi od 21 ± 2 °C i fotoperiodu od 16
sati svetlosti i 8 sati mraka. Nakon 28 dana eksplantati su vađeni sa podloge i određivan je broj
pupoljaka koji se razvio i merena je njihova dužina. Takođe, za svaki eksplantat je izmerena
njegova sveža masa, a nakon nekoliko dana sušenja i suva masa. Sva merenja mase, obavljena su
na automatskoj analitičkoj vagi, sa preciznošću od 0,1 mg. Dobijeni podaci su obrađeni
statistički, a dobijene prosečne vrednosti predstavljene su u narednom poglavlju.
21
3.4. Statistička obrada podataka
Obrada podataka je urađena statističko-grafičkim paketom Statgraphics, procedura
ANOVA i test LCD na nivou značajnosti p<0,05. Statistička analiza je urađena za svaki
parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su
različitim slovima, ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.
23
4.1. Uvođenje Micromeria thymifolia u kulturu in vitro
Vrsta M. thymifolia u kulturu in vitro uvedena je od strane Stojičić i Tošić (2014,
nepublikovani rezultati). Sa biljaka iz sterilne kulture uzeti su nodalni eksplantati (deo dve
internodije sa listovima u čijem pazuhu su se nalazili začeci aksilarnih pupoljaka). Nodalni
eksplantati su postavljeni na hranljive podloge sa različitim koncentracijama regulatora rastenja
gde su proveli 4 nedelje. U tom periodu odstranjeni su eksplantati koji su bili zaraženi nekom
infekcijom ili eksplantati koji su bili nekrotični. Zdrav biljni materijal iskorišćen je za indukciju
aksilarnih pupoljaka na nodalnim segmentima M. thymifolia i praćenje produkcije biomase.
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima
Micromeria thymifolia
Nodalni eksplantati M. thymifolia postavljeni su na MS hranljivu podlogu: bez regulatora
rastenja (kontrola), sa auksinom IAA (0,57 µM) i sa kombinacijom auksina IAA (0,57 µM) i
različitih koncentracija citokinina BA (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 i 30 µM ). Ubrzo nakon postavljanja
eksplantata na MS hranljivu podlogu, bez ili sa citokininom BA i auksinom IAA, moglo se
primetiti razviće aksilarnih pupoljaka i njihovo izduživanje na svim postavljenim eksplantatima.
Od ukupno 240 eksplantata smestenih u 24 tegle, po 10 eksplantata u svakoj, samo u jednoj tegli
došlo je do kontaminacije i pojave plesni, pa je ta tegla izuzeta iz dalje obrade podataka. U roku
od dve nedelje došlo je od uočavanja aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M.
thymifolia.
U tabeli 3 je prikazan prosečan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu kao i prosečna
dužina aksilarnih pupoljaka. Najveći broj pupoljaka formiran je na eksplantatima gajenim na
podlozi sa 0,57 μM IAA i 30 μM BA, dok je prosečna dužina pupoljaka bila najveća kada su oni
gajeni na podlozi sa 0,57 μM IAA i 1 μM BA.
24
Tabela 3. Uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka M. thymifolia
Tretman Prosečan broj pupoljaka
po eksplantatu
Prosečna dužina pupoljaka
(mm)
1 Bez hormona 8,84 ± 0,86ab
4,32 ± 0,34a
2 0,57 μM IAA 6,87 ± 0,56a 5,99 ± 0,43
b
3 0,57 μM IAA + 0,1 μM BA 6,72 ± 1,04a 5,40 ± 0,45
ab
4 0,57 μM IAA + 0,3 μM BA 8,00 ± 1,07ab
6,20 ± 0,52bc
5 0,57 μM IAA + 1 μM BA 7,67 ± 1,14ab
7,69 ± 0,69d
6 0,57 μM IAA + 3 μM BA 7,96 ± 0,77ab
5,87 ± 0,40b
7 0,57 μM IAA + 10 μM BA 8,96 ± 0,80ab
5,79 ± 0,37b
8 0,57 μM IAA + 30 μM BA 9,00 ± 0,61b 7,30 ± 0,41
cd
Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p≤0.05
MS podloga bez hormona bila je jedna od najpogodnijih za razvoj u pogledu indukcije
aksilarnih pupoljaka, budući da je u proseku formirano 8,84 pupoljaka po eksplantatu. Sa druge
strane, izduživanje tih aksilarnih pupoljaka bilo je najslabije na ovoj podlozi, pa je prosečna
dužina pupoljaka iznosila 4,32 mm (Tab. 3). Eksplantati formirani na ovoj podlozi bili su
normalno razvijeni, uglavnom nešto niži ali prilično razgranati. Listovi koji su bili u dodiru sa
podlogom su nekrozirali (Sl. 4).
Slika 4. M. thymifolia na MS podlozi bez hormona, a) grupa biljaka u tegli, b) pojedinačni eksplantat
a b
MS
M. thymifolia
MS
M. thymifolia
25
Na podlozi MS sa 0,57 μM IAA, bez dodatka citokinina, razvijen je manji prosečan broj
aksilarnih pupoljaka nego na kontrolnoj podlozi i on je iznosio 6,87 po eksplantatu. U odnosu na
podlogu bez hormona, uočava se povećanje prosečne dužine pupoljaka, pa je ona za ovu podlogu
iznosila 5,99 mm (Tab. 3). Eksplantati su svetliji, sa mestimičnim tamnim mrljama i sa nešto
slabije razvijenim listovima (Sl. 5).
Slika 5. M. thymifolia na MS podlozi sa 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli, b) pojedinačni eksplantat
Najmanji prosečan broj pupoljaka po eksplantatu zabeležen je na MS podlozi sa 0,1 μM
BA i 0,57 μM IAA (Tab. 3). Prosečan broj formiranih aksilarnih pupoljaka po eksplantatu
iznosio je 6,72, a njihova prosečna dužina bila je 5,40 mm, što je takođe među najnižim
vrednostima, upoređujući prosečnu dužinu pupoljaka na svim podlogama. Među eksplantatima
uglavnom dominira žbunasta, zbijena forma, sa nešto krupnijim listovima (Sl. 6).
MS + 0,57 μM IAA
M. thymifolia
MS + 0,57 μM IAA
M. thymifolia a b
26
Slika 6. M. thymifolia na MS podlozi sa 0,1 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,
b) pojedinačni eksplantat
Na hranljivoj podlozi MS sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA zabeleženo je povećanje
prosečanog broja aksilarnih pupoljaka, ali je taj broj ipak manji od onog u kontolnoj grupi, kod
eksplantata na podlozi bez hormona. Ovde se razvilo prosečno 8,00 aksilarnih pupoljaka po
eksplantatu, a njihova prosečna dužina je iznosila 6,20 mm (Tab. 3). Eksplantati su bili izduženi,
svetliji i sa manjim brojem listova. Uočena je nekroza na obodu najstarijih listova (Sl. 7).
Slika 7. M. thymifolia na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,
b) pojedinačni eksplantat
MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia
MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia a b
MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia
MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia a b
27
Eksplantati gajeni na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA formirali su prosečno 7,67
aksilarnih pupoljaka. Ovo je podloga na kojoj je zabeležena najveća prosečna dužina aksilarnih
pupoljaka i ona je iznosila je 7,69 mm (Tab. 3). Eksplantati su bili malo niži nego na drugim
podlogama, ali sa bogatim grananjem i krupnim listovima (Sl. 8).
Slika 8. M. thymifolia na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,
b) pojedinačni eksplantat
Na MS podlozi sa 3 μM BA i 0,57 IAA prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je
7,96, a njihova prosečna dužina 5,87 mm (Tab. 3). Na ovoj podlozi su najizraženiji eksplantati
sa žbunastom formom, niski i sa velikim brojem jako razvijenih, zbijenih listova (Sl. 9).
MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia
MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia a b
28
Slika 9. M. thymifolia na MS podlozi sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,
b) pojedinačni eksplantat
Na podlogama sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA prosečan broj aksilarnih pupoljaka iznosio je
8,96, što je među najvećim zabeleženim vrednostima u ovom istraživanju, veći i od onog u
kontrolnoj grupi tj. podlozi bez hormona. Prosečna dužina pupoljaka na eksplantatima na ovoj
podlozi iznosila je 5,79 mm (Tab. 3). Eksplantati su bili vitalni, razvijeni, sa bogatim grananjem.
Na nekima od njih primećena je pojava tamnijih mrlja na listovima (Sl. 10).
Slika 10. M. thymifolia na MS podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,
b) pojedinačni eksplantat
MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia
MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia a b
MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia
MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia a b
29
Najveći prosečan broj aksilarnih pupoljaka razvijen je na eksplantatima na MS podlozi sa
30 μM BA i 0,57 IAA i iznosio je 9,00 po eksplantatu. Ovo je podloga koja je najviše odgovarala
razvoju biljaka vrste Micromeria thymifolia, pa je i prosečna dužina pupoljaka bila velika i
iznosila je 7,30 mm (Tab. 3). Samo je na podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA zabeležena veća
prosečna dužina. Na osnovu samog izgleda eksplantata moglo se zaključiti da je ovo podloga
koja je najpogodnija za njihov razvoj. Svi postavljeni eksplantati su uspešno razvijeni, sa
najvećom prosečnom visinom biljaka u odnosu na ostale podloge. Listovi su se razvili u velikom
broju (Sl. 11).
Slika 11. M. thymifolia na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA, a) grupa biljaka u tegli,
b) pojedinačni eksplantat
Na histogramu 1. može se videti uporedni prikaz svih prethodno navedenih podataka o
prosečnom broju pupoljaka po eksplantatu, kao i o prosečnoj dužini tih aksilarih pupoljaka,
predstavljenih po podlogama. Jasno se uočava da su, izuzimajući podlogu bez hormona, za
formiranje aksilarnih pupoljaka, najpogodnije bile podloge sa najvišom koncentracijom BA. Sa
druge strane, za izduživanje tih pupoljaka ne može se izvesti takav zaključak. Na MS podlozi bez
hormona zabeležena je najmanja prosečna dužina pupoljaka, posle koje se beleži rast na ostalim
podlogama, ali ne baš proporcionalno sa povećanem koncentracije BA. Tako je za izduživanje
MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia
MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA
M. thymifolia a b
30
bočnih pupoljaka najpogodnija bila MS podloga sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA, a ne ona sa 30 μM
BA kako je možda očekivano.
Histogram 1. Delovanje regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka Micromeria
thymifolia
4.3. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria thymifolia
U sklopu ispitivanja uticaja različitih regulatora rastenja iz podloge na indukciju i
izduživanje aksilarnih pupoljaka, ispitani su i uticaji istih tretmana na produkciju biomase
biljaka. Prvo je merena sveža masa za svaki eksplantat posebno, na svim koncentacijama, a kroz
2-3 nedelje, nakon što bi se ti eksplantati sušili na sobnoj temperaturi, merena je i njihova suva
masa. Dobijeni rezultati predstavljeni su u tabeli 4.
31
Tabela 4. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria thymifolia
Tretman Prosečna sveža masa
(mg)
Prosečna suva masa
(mg)
1 Bez hormona 0,075 ± 0,0072ab
0,0095 ± 0,0008ab
2 0,57 μM IAA 0,064 ± 0,0048a 0,0071 ± 0,0006
a
3 0,57 μM IAA + 0,1 μM BA 0,081 ± 0,0097abc
0,0094 ± 0,0009ab
4 0,57 μM IAA + 0,3 μM BA 0,088 ± 0,0107abcd
0,0095 ± 0,0012ab
5 0,57 μM IAA + 1 μM BA 0,116 ± 0,0150de
0,0108 ± 0,0015b
6 0,57 μM IAA + 3 μM BA 0,094 ± 0,0096bcd
0,0094 ± 0,0008ab
7 0,57 μM IAA + 10 μM BA 0,105 ± 0,0069cde
0,0107 ± 0,0008b
8 0,57 μM IAA + 30 μM BA 0,126 ± 0,0106e 0,0108 ± 0,0008
b
Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p0.05
Sasvim očekivano, budući da su eksplantati bili najrazvijeniji, sa krupnim listovima,
najveća prosečna sveža masa po eksplantatu zabeležena je na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57
IAA i iznosila je 0,126 mg. Visoke vrednosti su zabeležene i na podlogama sa dodatkom 1 μM
BA i 10 μM BA.
To su tri podloge na kojima je i prosečna suva masa po eksplantatu bila najveća, ali
posebno treba istaći MS podlogu sa 1 μM BA i 0,57 IAA, gde je ta masa iznosila 0,0128 mg. To
je ista podloga na kojoj je zabeležena najveća prosečna dužina aksilarnih pupoljaka, što je
svakako uticalo na povećanje sveže i posebno suve mase.
33
Biljke iz roda Micromeria su u naučnim radovima najčešće opisivane sa stanovišta
etarskih ulja koja sadrže. Utvrđivanje sastava etarskih ulja bitno je da bi se na pravi način vršilo
njihovo dalje iskorišćavanje u farmaceutske svrhe, obzirom na mnoga pozitivna, medicinska
svojstva ovih ulja.
Slavkovska et al. (2005) utvrdili su da je grupa Pseudomelissa, gde između ostalih spada i
vrsta Micromeria thymifolia, jako bogata etarskim uljima (>0,5%) gde dominiraju oksigenisani
monoterpeni. Nešto ranije, Marinković et al. (2003) su potvrdili antibakterijsku aktivnost
esencijalnih ulja biljke M. thymifolia, a kao glavne sastojke ističu pulegon (32,81%), piperiton i
izomenton. Šavikin et al. (2008) potvrđuju da su to pulegon, zastupljen sa čak 50,4%, piperiton
sa 10,3% i piperiton oksid. Marin et al (2013) su izvršili detaljno ispitivanje trihoma vrste
Micromeria thymifolia, kao glavnih sekretornih organa, i tom prilikom je urađena histohemijska,
mikromorfološka i ultrastrukturalna analiza. Ristić et al (1997) su uradili analizu hloroformskih
ekstrakata ove biljke i došli do rezultata da preovlađuju nezasićene masne kiseline, a
najzastupljenije su palmitinska, linolna i linolenska.
U ovom radu opisan je postupak mikropropagacije vrste Micromeria thymifolia u
uslovima in vitro, sa ciljem određivanja najbolje kombinacije hormona u MS podlozi, radi što
uspešnije indukcije aksilarnih pupoljaka, njihovog izduživanja i produkcije biomase. Biljni
hormoni koji su korišćeni bili su BA iz grupe citokinina i IAA iz grupe auksina. MS podloga sa
dodatkom 30 μM BA i 0,57 IAA bila je najpogodnija za indukciju aksilarnih pupoljaka, a
podloga sa 1 μM BA i 0,57 IAA najpogodnija za njihovo izduživanje.
Kombinaciju ovih hormona u podlozi uspešno su koristili mnogi autori u svojim
istraživanjima, kod biljaka iz familije Lamiaceae ali i drugih familija. Tako Elhag (1991)
utvrđuje da je podloga sa 0,3 mg/L BA i 0,3 mg/L IAA najbolja za rast i izduživanje pupoljaka
vrste Catha edulis iz familije Celastaceae. Duhoky i Rasheed (2010) nalaze da je za vrstu
Gardenia jasminoides (familija Rubiaceae) to podloga sa 1,5 mg/L BA i 0,6 mg/L IAA. Što se
tiče familije Lamiaceae, Mišić et al (2006) nalaze da niske koncentracije auksina u kombinaciji
sa citokininom pozitivno utiču na indukciju izdanaka i stimulišu njihov rast, kod vrste Salvia
brachyodon (familija Lamiaceae). Za indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka biljke Mentha
viridis najbolja je MS podloga sa 2,0 mg/L BA and 0,5 mg/L IAA, prema Rahman et al (2013).
34
Zielinska et al (2011) su do sličnih rezultata došli ispitujući vrstu Agastache rugosa. Kod nekih
biljaka, adekvatnija je bila kombinacija nekih drugih hormona ili prisustvo samo jednog od njih.
Tako je kod vrste Mentha arvensis, kombinacija BA i kinetina dala dobre uslove za indukciju i
multiplikaciju izdanaka (Akram et al, 2013), dok je kod vrsta Prunella vulgaris (Rasol, 2009),
Origanum sipyleum (Oluk i Çakır, 2009) i Ocimum kilimandscharicum (Saha et al, 2010) to bio
samo BA.
Izduživanje aksilarnih pupoljaka vrste Micromeria thymifolia u našem istraživanju bilo je
najbolje na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA. Ovo je kombinacija hormona koja je u
drugim radovima retko upotrebljavana za izduživanje pupoljaka. Pattnaik i Chand (1996) su za
izduživanje aksilarnih pupoljaka vrsta Ocimum americanum i Ocimum sancum, koristili podlogu
sa BA i giberelinom, a kod vrste Mentha piperita povoljna je bila visoka koncentracija zeatina
(Laslo et al, 2011). Postoje i podaci da kod nekih biljaka iz familije Lamiaceae citokinin BA
deluje inhibitorno (Mišić et al. 2006) i da je uspešnije izduživanje na podlogama bez hormona,
ali to u našem eksperimentu nije bio slučaj.
Kao novina u ovom istraživanju, rađena je analiza uticaja hormona BA i IAA iz podloge
na produkciju mase biljaka Micromeria thymifolia. Najveća vrednost prosečne sveže mase
zabeležena je na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA i iznosila je 0,126 mg, dok je najveća
prosečna suva masa bila na podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM IAA i iznosila je 0,0108
mg. Podloga bez dodatka citokinina, samo sa auksinom 0,57 μM IAA, bila je najmanje pogodna
za razvoj biomase. Na njoj su zabeležena i najniža prosečna sveža i najniža prosečna suva masa.
36
U ovom radu detaljno je opisano uspostavljanje i uspešno gajenje vrste Micromeria
thymifolia (Scop.) Fritsch u kulturi in vitro. Ispitan je uticaj regulatora rastenja (auksina i
citokinina) na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka, kao i na produkciju biomase ove
biljke.
Najveći prosečan broj aksilarnih pupoljaka zabeležen je na eksplantatima koji su gajeni
na MS podlozi sa dodatkom 30 μM BA i 0,57 μM IAA. Ovo je bila podloga koja je odgovarala i
izduživanju pupoljaka, ali je ipak najveća prosečna dužina aksilarnih pupoljaka zabeležena na
eksplantatima na MS podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM IAA. Pojave adventivnih
korenova nije bilo.
Najveću prosečnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na MS podlozi sa dodatkom 30
μM BA i 0,57 μM IAA, dok je najveća prosečna vrednost suve mase zabeležena na
eksplantatima na MS podlozi sa dodatkom 1 μM BA i 0,57 μM IAA.
Na osnovu rezultata koji su dobijeni može se zaključiti da je vrstu Micromeria thymifolia
moguće uspešno gajiti i razmnožavati u kulturi in vitro, što može biti jako značajno u pogledu
očuvanja i zaštite ove vrste.
38
1) Akram, M., Afrasiab, H., Mahmood, S., Aftab, F., 2007: Monoterpene contents in in vitro
cultures and field-grown plants of Japanese mint Mentha arvensis L. Pak. j. biochem.
mol. biol., 40 (2): 74 79.
2) Arabaci, T., Dimenci, T., Celep, F., 2010: Morphological character analysis in Turkish
Micromeria Benth. (Lamiaceae) species with a numerical taxonomic study. Turkish
Journal of Botany, 34: 379 – 389.
3) Boissier, E., 1879: Flora Orientalis. Basel & Geneve.
4) Brauchler, C., Ryding, O., Heubl, G., 2008: The genus Micromeria (Lamiaceae), a
synoptical update. Willdenowia, 38: 363 – 410.
5) Debergh, P., Maene, L., 1981: A scheme for commercial propagation of ornamental
plants by tissue culture, Sci. Hort., 14: 335 – 345.
6) Duhoky, M., Rasheed, K., 2010: Effect of different concentration of BA and IAA on
micropropagation of Gardenia jasminoides. Mesopotamia J.of Agric., 38 (2): 1 14.
7) Duru, M., Öztürk, M., Uğur, A., Ceylan, Ö., 2004: The constituents of essential oil and
in vitro antimicrobial activity of Micromeria cilicica from Turkey. Journal of
Ethnopharmacology, 94 (1): 43 48.
8) Earle, E.D., Langhans, R.W., 1975: Carnation propagation from shoot tips cultured in
liquid medium. HortScience, 10: 608 – 610.
9) Elhag, H., 1991: In Vitro Propagation of Catha edulis. HortScience, 26 (2): 212.
10) Güllüce, M., Sökmen, M., Şahin, F., Sökmen, A., Adigüzel, A., Özer, H., 2004:
Biological activities of the essential oil and methanolic extract of Micromeria
fruticosa (L) Druce ssp serpyllifolia (Bieb) PH Davis plants from the eastern Anatolia
region of Turkey. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84 (7): 735 741.
11) Hammer, K., Laghetti, K., Pistrick, K., 2005: Calamintha nepeta (L.) Savi and
Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch cultivated in Italy. Genetic Resourses and Crop
Evolution, 52 (2): 215 219.
12) Laslo, V., Zăpârţan, M., Vicaş, S., Agud, E., 2011: Use of nodal explants in "in vitro"
micropropagation of Mentha piperita L.. Analele Universităţii din Oradea, 14: 247
251.
13) Ljajević-Grbić, M., Stupar, M., Vukojević, J., Soković, M., Mišić, D., Grubišić, D.,
Ristić, M., 2008: Antifungal activity of Nepeta rtanjensis essential oil. J. Serb. Chem.
Soc., 73 (10): 961 – 965.
39
14) Marin, M., Jasnić, N., Ascensão, L., 2013: Histochemical, micromorphology and
ultrastructural investigation in glandular trichomes of Micromeria thymifolia. Botanica
Serbica, 37 (1): 49 53.
15) Marinković, B., Vuković-Gašić, B., Knezević-Vukčević, J., Marin, P. D., Soković, M.,
Duletić-Lausević, S., 2003: Antibacterial activity of the essential oil of Micromeria
thymifolia and M.albanica (Lamiaceae). Bocconea, 16 (2): 1131 1134.
16) Marić, M., 1995: Kultura biljnih tkiva. Draganić, Beograd.
17) Mišić, D., Grubišić, D., Konjević, R., 2006: Micropropagation of Salvia brachyodon
through nodal explants. Biologia planetarium, 50 (3): 473 476.
18) Morales, V., 1991: El genero Micromeria Bentham (Labiateae) en la Peninsula Iberica e
Islas Baleares. Anales Jard. Bot. Madrid, 48: 131 – 156.
19) Murashige, T., Skoog, F., 1962: A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays
with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473 – 497.
20) Nešković, M., Konjević, R., Ćulafić, LJ., 2003: Fiziologija biljaka. NNK - International,
Beograd.
21) Oluk, E.A., Çakır, A., 2009: Micropropagation of Origanum sipyleum L., an endemic
medicinal herb of Turkey. African Journal of Biotechnology, 8 (21): 5769 5772.
22) Pattnaik, S., Chand, P.K., 1996: In vitro propagation of the medicinal herbs Ocimum
americanum L. syn. O. canum Sims. (hoary basil) and Ocimum sanctum L. (holy basil).
Plant Cell Rep, 15 (11): 846 850.
23) Rahman, M. M., Ankhi, U. R., Biswas, A., 2013: Micropropagation of Mentha viridis L.:
An aromatic medicinal plant. International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 4: 2926
– 2930.
24) Rasool, R., Kamili, A., Ganai, B., Akbar, S., 2009: Effect of BAP and NAA on Shoot
Regeneration in Prunella Vulgaris. Journal of Natural Sciences and Mathematics,
Qassim University, 3 (1): 21 26.
25) Ristić, N., Palić, R., Kitić, D., Stojanović, G., 1997: The fatty acids from some plants of
Micromeria genus. Facta universitatis, 1 (4): 53 56.
26) Saha, S., Dey, T., Ghosh, P., 2010: Micropropagation of Ocimum kilimandscharicum
Guerke (Labiatae). Acta biologica Cracoviensia, 52 (2): 50 – 58.
40
27) Slavkovska, V., Couladis, M., Bojović, S., Tzakou, O., Pavlović, M., Lakušić, B., Jancić,
R., 2005: Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria Bentham
from Serbia and Montenegro. Plant Systematics and Evolition, 255: 1 – 15.
28) Tatić, B., Blečić, V., 2002: Sistematika i filogenija viših biljaka. Zavod za udžbenike i
nastavna sredstva, Beograd.
29) Vinterhalter, D., Vinterhalter, B., 1996: Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka.
Axial, Beograd.
30) Vladimir-Knežević, S., Jurišić-Grubešić, R., Kalođera, Z., Blažević, N., 2005: Diuretični
učinak eteričnog ulja vrste Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch. Knjiga sažetaka, Treći
hrvatski kongres farmacije, Zagreb.
31) Zielinska, S., Piatczak, E., Kalemba, D., Matkowski, A., 2011: Influence of plant growth
regulators on volatiles produced by in vitro grown shoots of Agastache rugosa (Fischer &
C.A.Meyer) O. Kuntze. Plant Cell Tiss Organ Cult, 107: 161 – 167.
32) Šavikin, K., Menković, N., Zdunić, G., Tasić, S., Ristić, M., Stević, T., Dajić-Stevanović,
Z., 2010: Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oils
of Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch., M. dalmatica Benth., and Satureja
cuneifolia Ten. and Its Secretory Elements. Journal of essential oil research, 22 (1): 91-
96.
33) Šilić, Č., 1979: Monografija radova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria
Bentham, Acinos Miller i Clinopodium L. u flori Jugoslavije. Zemaljski muzej Bosne i
Hercegovine, Sarajevo.
41
Biografija kandidata
Manić Branislav je rođen 17.02.1989. godine u Pirotu. Osnovnu školu ,,8. septembar“ u
Pirotu završio je 2004. godine sa Vukovom diplomom. Iste godine upisao je Gimnaziju u Pirotu,
prirodno-matematički smer. Nakon završetka srednje škole, 2008. godine upisao je osnovne
akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu Univerziteta u Nišu, Departman za
biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završio je 2011. godine sa zvanjem ,,biolog“.
Iste godine upisao je master akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-
matematičkog fakulteta u Nišu, smer - Biologija. Master akademske studije završio je 2014.
godine sa zvanjem ,,master biolog“.
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Бранислав Манић
Ментор, МН: Драгана Стојичић
Наслов рада, НР: Микропропагација биљке Micromeria thymifolia (Scop.)
Fritsch
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2014.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
49 стр., 11 слика, 4 табеле, 1 хистограм
Научна област, НО: биологијa
Научна дисциплина, НД: биологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria thymifolia, аксиларни пупољци, BA, IAA
УДК 581.165.7:582.929.4
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch је вишегодишња биљка из фамилије Lamiaceae,
позната по својим ароматичним својствима и коришћењу у медицинске сврхе. У
овом раду испитан је утицај регулатора растења на индукцију и издуживање
аксиларних пупољака, као и на продукцију биомасе ове биљке. Коришћена је МS
подлога са додатком различитих концентрација цитокинина - BА и ауксина - IАА.
МS подлога са додатком 30 μМ BA и 0,57 μМ IАА била је најпогоднија за индукцију
аксиларних пупољака, док је њихова највећа просечна дужина забележена на
експлантатима гајеним на подлози са 1 μМ BА и 0,57 μМ IАА. Највећа просечна
свежа маса забележена је на експлантатима гајеним на МS подлози са додатком
30 μМ BА и 0,57 μМ IАА, док је највећа просечна вредност суве масе била на
експлантатима гајеним на подлози са додатком 1 μМ BА и 0,57 μМ IАА.
Датум прихватања теме, ДП:
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник:
Члан:
Члан,
ментор:
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: master thesis
Author, AU: Branislav Manić
Mentor, MN: Dragana Stojičić
Title, TI: Micropropagation of Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2014.
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
49 pages, 11 figures, 4 tables, 1 histogram
Scientific field, SF: biology
Scientific discipline, SD: biology
Subject/Key words, S/KW: Micromeria thymifolia, axillary buds, BA, IAA
UC 581.165.7:582.929.4
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB: Micromeria thymifolia (Scop.) Fritsch is a perennial herb in the family Lamiaceae,
known for its aromatic properties and use for medical purposes. In this work, the
influence of growth regulators, on the induction and axillary bud elongation were
tested, as well as the biomass production of the plant. We used MS medium
supplemented with different concentrations of cytokinins - BA and auxins - IAA. MS
medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA was the most suitable for the
induction of axillary buds, while their longest average length observed in the medium
with 1 μM BA and 0,57 μM IAA. The highest average fresh weight was observed on
MS medium supplemented with 30 μM BA and 0,57 μM IAA, while the highest value of
dry weight was on the base with the addition of 1 μM BA and 0,57 μM IAA.
Accepted by the Scientific Board on, ASB:
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President:
Member:
Member, Mentor:
Образац Q4.09.13 - Издање 1