MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME - klimud.org Sınıflandırma 7 DiversiLab Genetik Farklılıklar:...
Transcript of MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME - klimud.org Sınıflandırma 7 DiversiLab Genetik Farklılıklar:...
1
MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRME
Can AYDOĞANKlinik Pazarlama Müdürü
Kasım 2011, Antalya
Mikrobiyal Genotiplendirme
Diversilab çalışma adımları
Sonuç değerlendirmesi
Kütle Spektrometresi – VITEK MS
Sistem tanıtımı (demo)
İÇERİK
2
Mikrobiyal Genotiplendirme
Diversilab çalışma adımları
Sonuç değerlendirmesi
Kütle Spektrometresi – VITEK MS
Sistem tanıtımı (demo)
Moleküler Tiplendirme
Bir çok farklı yöntem mevcut
Tüm yöntemlerin avantaj ve dezavantajları var
Yöntem seçimi
Ayırım gücü ve tekrarlanabilirlik
Yöntemin kullanılabilirliği ve sonuçların değerlendirilmesi
Kurulum ve çalışma maliyetleri
İhtiyaç ve gerekli olan beceri seviyesi
Klinik laboratuarında kullanım için uygunluk ve otomasyon
Yöntem seçimi
3
Bir çok farklı yöntem mevcut
Tüm yöntemlerin avantaj ve dezavantajları var
Yöntem seçimi
Ayırım gücü ve tekrarlanabilirlik
Yöntemin kullanılabilirliği ve sonuçların değerlendirilmesi
Kurulum ve çalışma maliyetleri
İhtiyaç ve gerekli olan beceri seviyesi
Klinik laboratuarında kullanım için uygunluk ve otomasyon
Bacterial Barcodes
Bacterial Barcodes - Athens, Georgia / ABD
Ekim 2006’da bioMérieux tarafından satın alındı
Nisan 2007 ECCMID / Munih’te Diversilab lansmanı yapıldı
Komple Enfeksiyon Kontrol Çözümü
4
Bacterial Barcodes - Athens, Georgia / ABD
Ekim 2006’da bioMérieux tarafından satın alındı
Nisan 2007 ECCMID / Munih’te Diversilab lansmanı yapıldı
Komple Enfeksiyon Kontrol Çözümü
Diversilab
Ne işe yarar? Bakteri, küf ve mayaların genotiplendirmesini yapar
- Köken tayini
- Parmakizi tayini
Neden suş genotiplendirmesi yapılır? Organizmaların gelişim ve yayılımlarının takibi amacı ile organizmaların genetik
benzerliklerini ve değişimlerini ortaya koymak için
55
Ne işe yarar? Bakteri, küf ve mayaların genotiplendirmesini yapar
- Köken tayini
- Parmakizi tayini
Neden suş genotiplendirmesi yapılır? Organizmaların gelişim ve yayılımlarının takibi amacı ile organizmaların genetik
benzerliklerini ve değişimlerini ortaya koymak için
KKromoromozzomal DNAomal DNA AAnalnaliziizi
REA REA-Prob Dizi Analizi
• PFGE
• RAPD• AP-PCR• DAF• ERIC-PCR• BOX-PCR• REPREP--PCRPCR• (GTG)5
• MLVA & VNTR• ARDRA• ITS (tRNA-PCR)• SSCP• TGGE & DGGE
• RFLP• Ribotyping• AFLP
•MLST• SLST
PCR
Moleküler Tiplendirme Yöntemleri
66
• PFGE
• RAPD• AP-PCR• DAF• ERIC-PCR• BOX-PCR• REPREP--PCRPCR• (GTG)5
• MLVA & VNTR• ARDRA• ITS (tRNA-PCR)• SSCP• TGGE & DGGE
• RFLP• Ribotyping• AFLP
•MLST• SLST
•DiversiLab
Vitek, API
Riboprinting
MicroSeq
Riboprinter
Filogenetik Sınıflandırma
7
DiversiLab
Genetik Farklılıklar: FAZLA AZ
Teknik Ayırım: DÜŞÜK YÜKSEK
AFLP
PFGE
Önlem
Sürveyans
Bilgi Yönetimi
Müdahale
Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar
88
HAIÖnlem
Tarama
Çevre Kontrolü
Yapı,Organizasyon,
süreç
İletişim Eğitimi
Müdahale
HAI Tanı
Salgın Yönetimi
DüzenleyiciEylem Planı
Önlem
Sürveyans
Bilgi Yönetimi Myla
DiversiLab
Müdahale
Sağlık Bakımı İlişkili Enfeksiyonlar
99
HKEÖnlem
Hasta Tarama
Çevre Kontrolü
Yapı,Organizasyon,
süreç
İletişim Eğitim
chromID MRSA, ESBL,VRE
Hava: air IDEAL+ media
Yüzey: Count-tact
Su: GVPC, BCYE, SlidexLegionella
DiversiLab
Müdahale
HKE Tanı
Salgın Yönetimi
Eylem Planları
VITEK MS, VT2 (ID/AST),API, Media, Slidex, E-
test
Nuclisens MRSA, KPC,RSV, bioNexia, RSV
Direct IF identification
Vikia Rota Adeno
Vidas CDAB, Rota
DiversiLab
BacT-Alert
1010
DiversiLab bu adımları otomatize eder
Bean, P., et al J Clin Micro 1999 Vol 37
Tekrarlayan diziler : Organizmaların DNA’sında fonksiyonlarıbilinmeyen kısa DNA dizileri (35-40 bp) belirli bir düzende tekrarlanır.
1. rep-PCR primerleri genom boyunca aralara yayılmış olan spesifiktekrarlayan dizilere bağlanırlar. Çeşitli uzunluklarda bir çok parça amplifiyeedilir.
2. Parçalar boyut ve yük olarak ayrılabilerler. Çeşitli boyutlarda bir çokbanttan oluşan rep-PCR parmakizi profili oluşturulur.
3. Mikrobiyal klonların profilleri suşlara spesifiktir. Bu parmakizleri dahasonra mikroorganizmalar arasındaki ilişkileri göstermede kullanılabilir.
Çalışma Prensibi
1111
Tekrarlayan diziler : Organizmaların DNA’sında fonksiyonlarıbilinmeyen kısa DNA dizileri (35-40 bp) belirli bir düzende tekrarlanır.
1. rep-PCR primerleri genom boyunca aralara yayılmış olan spesifiktekrarlayan dizilere bağlanırlar. Çeşitli uzunluklarda bir çok parça amplifiyeedilir.
2. Parçalar boyut ve yük olarak ayrılabilerler. Çeşitli boyutlarda bir çokbanttan oluşan rep-PCR parmakizi profili oluşturulur.
3. Mikrobiyal klonların profilleri suşlara spesifiktir. Bu parmakizleri dahasonra mikroorganizmalar arasındaki ilişkileri göstermede kullanılabilir.
İzole kültürden manuelDNA ekstraksiyonu
yapılır.
Thermalcycler’daDiversiLab Parmakizikitleri kullanılarakrep-PCR yapılır.
I. II.
Çalışma Adımları
1212
Biyoanalizör kullanılarakotomatik microfluidicelektroforez yapılır.
İnternet tabanlı yorumlamayazılım programı ile kolay vehızlı değerlendirme yapılır.
Sonuç süresi = izole organizmadan ~4 saat
III. IV.
DiversiLab LabChip
microfluidic elektroforez
LabChip
1313
Elektroferogram Jel
Standardize Parmakizi Kitleri
Valide test protokolleri
Kitlerde + / - kontrol
24 testlik ambalaj
Uzun son kullanım tarihi
Dondurma/çözme imkanı
Teknik destek
Standardizasyon…
1414
Standardize Parmakizi Kitleri
Valide test protokolleri
Kitlerde + / - kontrol
24 testlik ambalaj
Uzun son kullanım tarihi
Dondurma/çözme imkanı
Teknik destek
410946 DiversiLab Acinetobacter Kit 24 test 410983 DiversiLab Listeria Kit 24 test
410948 DiversiLab Archaebacteria Kit 24 test 410984 DiversiLab Mycobacterium Kit 24 test
410949 DiversiLab Aspergillus Kit 24 test 410985 DiversiLab Mycoplasma Kit 24 test
410962 DiversiLab Bacillus Kit 24 test 410986 DiversiLab M. tuberculosis Kit 24 test
410963 DiversiLab Bifidobacterium Kit 24 test 410987 DiversiLab Propionibacterium Kit 24 test
410964 DiversiLab Campylobacter Kit 24 test 410988 DiversiLab Pseudomonas Kit 24 test
410965 DiversiLab Candida Kit 24 test 410989 DiversiLab Salmonella Kit 24 test
Test Menüsü
1515
410966 DiversiLab Clostridium Kit 24 test 410991 DiversiLab Staphylococcus Kit 24 test
410967 DiversiLab C. perfringens Kit 24 test 410992 DiversiLab Streptococcus Kit 24 test
410968 DiversiLab Enterobacter Kit 24 test 411007 DiversiLab Bacterial KitDiversiLab Bacterial Kit 24 test
410969 DiversiLab Enterococcus Kit 24 test 411008 DiversiLab Fungal Kit 24 test
410980 DiversiLab Escherichia Kit 24 test 410990 DiversiLab Serratia Kit 24 test
410981 DiversiLab Klebsiella Kit 24 test 410993 DiversiLab Francisella Kit 24 test
410982 DiversiLab Lactobacillus Kit 24 test 410994 DiversiLab Saccharomyces Kit 24 test
Web tabanlı kullanıcı yazılımı
Otomatik değerlendirme
Kullanıcılara özel şifre
Her an verilere erişim imkanı
Veri kaybetme riski yok
İstendiğinde farklı üniteler ile veri paylaşma imkanı
Standart bMx kütüphaneleri ile hızlı identifikasyon imkanı
Her zaman en güncel sürüm kullanımı
Ücretsiz yazılım güncellemeleri
Yazılım…
1616
Web tabanlı kullanıcı yazılımı
Otomatik değerlendirme
Kullanıcılara özel şifre
Her an verilere erişim imkanı
Veri kaybetme riski yok
İstendiğinde farklı üniteler ile veri paylaşma imkanı
Standart bMx kütüphaneleri ile hızlı identifikasyon imkanı
Her zaman en güncel sürüm kullanımı
Ücretsiz yazılım güncellemeleri
1717
Sonuçlar…
1818
Sonuçlar…
1919
Liste Dağılım
Sonuçlar…
2020
Mevcut kütüphaneler
MRSA C. difficileMycobacterium KüfMaya Candida Francisella E.coli SalmonellaGram +Gram -
Geliştirilen kütüphaneler
Acinetobacter VRE Non-Fermenter Coag-Neg Staph
Standardize Kütüphaneler…
2121
Mevcut kütüphaneler
MRSA C. difficileMycobacterium KüfMaya Candida Francisella E.coli SalmonellaGram +Gram - M. chelonae – M. abscessus, M. avium – M. intercellulare, M.
tuberculosis – M. Bovis, M. peregrinum – M. septicum Candida glabrata – Candida albicans Salmonella typhimurium – Salmonella enterditis E. coli O157 – O155
Mycobacterium Mycobacterium
2222
MayaMaya
2323
Escherichia coli
2424
• 30 günde 10 defa 2 E.coli O157H7suşunun subkültürü yapıldı
• –70°C’de 5 defa donduruldu
• Petriler 4°C’de 7 ve 14 günbekletildi
• Toplam 100 DNA ekstraksiyonu
Yüksek tekrarlanabilirlik…
2525
200bp 4Kb
• Altı farklı Biyoanalizör
• Üç farklı teknisyen
• Üç gün
• %1’den az varyasyon%99
Healy, et al. JCM Jan 2005
• 30 günde 10 defa 2 E.coli O157H7suşunun subkültürü yapıldı
• –70°C’de 5 defa donduruldu
• Petriler 4°C’de 7 ve 14 günbekletildi
• Toplam 100 DNA ekstraksiyonu
Yüksek tekrarlanabilirlik…
2626
• Üç farklı mikroorganizma
• Üç farklı teknisyen tarafından
• Üçer farklı DiversiLab Parmakizi kiti lotu ile çalışıldı ve < %2 varyasyon bulundu
%98
Healy, et al. JCM Jan 2005
Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitesi…
2727
MRSAkronikotitli
sağlıkçalışanı
Erciyes Üniversitesi…
2828
Moleküler Kongresi, 2010
Erciyes Üniversitesi…
2929
XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 2010
GATA…
3030
GATA…
3131
Erciyes Üniversitesi…
3232
XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 2010
DiversiLab PFGE
3333
24 Numune:6 saat
İzole kültürden ~4 saatte hızlı sonuç
Web tabanlı arayüzü ile kolay kullanım
Standardizasyon & Yüksek Tekrarlanabilirlik
Otomatik Değerlendirme & Yorumlama
Teknik Destek
Diversilab
3434
İzole kültürden ~4 saatte hızlı sonuç
Web tabanlı arayüzü ile kolay kullanım
Standardizasyon & Yüksek Tekrarlanabilirlik
Otomatik Değerlendirme & Yorumlama
Teknik Destek
Klinik Laboratuarı’nda Genotiplendirme
Erciyes Üniversitesi
Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi
Marmara Üni. Pendik Eği. Ve Araş. Hastanesi
Çukurova Ü. Veterinerlik Fakültesi
Mersin Üniversitesi
Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi
Gaziantep Üniversitesi
Koç Üniversitesi / Amerikan Hastanesi
Hacettepe Ü., Süleyman Demirel Ü. (proje bazında)
Türkiye’de Diversilab…
3535
Erciyes Üniversitesi
Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi
Marmara Üni. Pendik Eği. Ve Araş. Hastanesi
Çukurova Ü. Veterinerlik Fakültesi
Mersin Üniversitesi
Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi
Gaziantep Üniversitesi
Koç Üniversitesi / Amerikan Hastanesi
Hacettepe Ü., Süleyman Demirel Ü. (proje bazında)
FMLA ( Full Microbiology Lab Automation)
HastaneHastaneKaynaklıKaynaklı
EnfeksiyonlarınEnfeksiyonlarınYönetimiYönetimi ––
DiversilabDiversilab
3636
NumuneninEkimi
GramBoyama
İdentifikasyonAntibiyogram
Kültür
37
KÜTLE SPEKTROMETRE
“Kütle Spektrometresi” numunenin temel içeriğinin belirlenmesinde
kullanılan analitik bir tekniktir.
MS prensibi yüklü moleküller oluşturup onların kütle – yük oranını
ölçerek kimyasal bileşiğin iyonizasyonu esasına dayanır.
Doğrudan koloniden MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix
Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) ile
bakteri/maya/mantarların hızlı tanımlanması.
MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight)
Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi
Kütle Spektrometresi Nedir?
38
“Kütle Spektrometresi” numunenin temel içeriğinin belirlenmesinde
kullanılan analitik bir tekniktir.
MS prensibi yüklü moleküller oluşturup onların kütle – yük oranını
ölçerek kimyasal bileşiğin iyonizasyonu esasına dayanır.
Doğrudan koloniden MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix
Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight) ile
bakteri/maya/mantarların hızlı tanımlanması.
MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation - Time of Flight)
Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi
protein bacterial cell
DNA
genome
Modern Mikrobiyal Taksonomi:Proteomikler & Genomikler
39
speciesdefinition & determination
genomeproteome
DNAfingerprint
3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)
2117.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117]
44
24
.2
94
76
.2
48
61
.0
88
23
.5
58
97
.8
62
71
.2
80
54
.3
66
29
.0
74
24
.9
12
27
1.4
47
38
.6
69
84
.6
83
83
.8
67
86
.7
65
33
.3
90
75
.2
31
32
.3
61
37
.3
72
09
.8
89
03
.3
86
10
.6
10
11
0.8
47
65
.4
10
97
5.2
40
26
.9
45
35
.6
33
11
.8
10
49
3.9
34
91
.4
96
11
.5
massfingerprint
ManuelÖn-seçim
ManuelÖn-seçim yok
24 saatlik kültür
Günümüzde Kullanım…
40
VITEK 2 -Sistemi
API - Sistemi
GörselMetodlar
Direnç Testleri Serolojik Testler
Mikroorganizma tanımlaması
MALDI-TOF MSSARAMIS
Sadece 2 dakika4 – 72 saat
PCR
Mayıs 2010: bioMérieux tarafından satın alındı* SARAMIS: Mikrobiyal ID veritabanı (patentli SuperSpectra™) ve algoritmaları
Haziran 2010: ile anlaşma yapıldı Mikrobiyoloji laboratuvarları için ortak kütle spektrometre geliştirilmesi MALDI-TOF teknolojisi Shimadzu tarafından bulunmuştur
bioMérieux Kütle Spektrometre Tarihçesi…
41
Mayıs 2010: bioMérieux tarafından satın alındı* SARAMIS: Mikrobiyal ID veritabanı (patentli SuperSpectra™) ve algoritmaları
Haziran 2010: ile anlaşma yapıldı Mikrobiyoloji laboratuvarları için ortak kütle spektrometre geliştirilmesi MALDI-TOF teknolojisi Shimadzu tarafından bulunmuştur
*SARAMIS = Spectral ARchive And Microbial Identification System
İyon dedektörü
+ +
++
Hareket alanıayırım
tespit
MALDI-TOF MS: Temel Prensip
42
+
+
++
kuyucuk
matriks / analitkristallerii
Hızlanma alanı
elektrot
desorpsiyon
iyonizasyon
hızlanma
48 pozisyonlu plak
Tek koloni veyasüspansiyondan seçimve transfer
0.3 µl Matriks solüsyonu eklenmesi
İş akışı: Numune Hazırlığı (Adım 1)
43
Tek koloni veyasüspansiyondan seçimve transfer
Otomatik spektrum eldesi ~60 sn.
Sağlam protein iyonizasyonu vemoleküler ağırlık ölçümü
Pow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum Negative
İş akışı: Ölçüm (Adım 2)
44
3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)
1648.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3
37
75
70
75
80
74
87
44
10
93
9
94
53
99
94
79
80
10
34
7
50
15
78
63
11
57
2
70
92
59
31
96
54
35
81
68
37
93
30
73
67
10
22
6
84
50
10
60
8
11
90
6
Pow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum Negative
Mikroorganizmatanımlaması
İş akışı: Analiz (Adım 3)
45
Veritabanı ilekarşılaştırma
Algoritmahesaplaması
Tam bakteri hücresindeki kütle spektrometresine göre farklı peak paternlerinin oluşması
4000 m/z 8000
Burkholderia cepacia
Raoultella ornithinolytica
Staphylococcus aureus
Pantoea agglomerans
Acinetobacter lwoffi
Escherichia coli
464000 m/z 8000
Burkholderia cepacia
Raoultella ornithinolytica
Staphylococcus aureus
Pantoea agglomerans
Acinetobacter lwoffi
Escherichia coli
İş akışı adımları Süre (dakika)n = 5izolat
n = 24izolat
n = 96izolat
Plak 1 5 16Matriks 1 3 10Kurutma 2 2 7Okuma 5 12 43Sonuç süresiToplam 9 22 76
Sonuç Süresi…
47
İş akışı adımları Süre (dakika)n = 5izolat
n = 24izolat
n = 96izolat
Plak 1 5 16Matriks 1 3 10Kurutma 2 2 7Okuma 5 12 43Sonuç süresiToplam 9 22 76
Myla : Kullanım arayüzüMS-ID sonuç görüntülenmesi
48
VITEK MS sonuçları
Çok hızlı tanımlama
Kolay kullanım
Maliyet etkin
Kullanıcı dostu
Sürekli genişleyen veritabanı ve geliştirmeler ile
mükemmel performans
LIS ve diğer laboratuvar sistemleri ile entegrasyon
49
Çok hızlı tanımlama
Kolay kullanım
Maliyet etkin
Kullanıcı dostu
Sürekli genişleyen veritabanı ve geliştirmeler ile
mükemmel performans
LIS ve diğer laboratuvar sistemleri ile entegrasyonPow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum NegativePow er Ionising Vacuum Negative
Türkiye’de VITEK MS…
50Marmara Ü. Pendik Eğit. ve Araş. Hastanesi
Sorularınız ?
51
52