Leksionet Master ne Shendetin Publik. Phd, Med Vet. Dardan Shehdula Mikrobet dhe Ushqimet Te ushqyerit ka qene gjithnje nje nga problemet fondamentale te mbijeteses dhe te zhvillimit te njerezimit. Ushqimet jane burimi i energjise dhe i mikroelementeve te domosdoshem per rritjen dhe zhvillimin e organizmit, i cili ka nevoje per nje shumellojshmeri nutrientesh energjitik (karoboidrate, yndyrna, proteina) dhe jo energjitik (vitamina, kripera minerale). Zgjedhja e ushqimeve nga konsumatoret eshte rezultati i nderveprimit te nje sere faktoresh ekonomik, demografik dhe social. Ne vecanti ne shperndarjen e niveleve te konsumit nderhyjne, niveli i te ardhurave, struktura e shoqerise, dhe bashkesia e traditave kulturale, zakoneve, dhe besimeve fetare te popullsive te ndryshme. Ne vendet e zhvilluara aktualisht niveli i kalorive me prejardhje nga ushqimet me origjine shtazore eshte mbi 20% e kalorive totale te djetes, kurse ne vendet ne zhvillim ky nivel nuk i kalon te 7%. Panvaresisht ketyre diferencave ne diete eshte e sigurte se kushti paraparak i domosdoshem per cdo produkt ushqimor perfaqesohet nga siguria e ketij produkti ushqimor. Me produkt ushqimor te sigurte nenkuptojme qe ky ushqim eshte totalisht i lire nga rreziqet per shendetin e konsumatorit. Pasi eshte permbushur para kushti i sigurise, cilesia e ushqimeve eshte nje koncept teper relativ, dhe teper i variueshem ne vartesi te perdorimeve te ndryshme te ushqimeve nga popuj te ndryshem me kulture dhe tradita ushqimore specifike. Sigurisht kerkimi i cilesive organoleptike te ushqimeve eshte nje nga kerkesat kryesore te konsumatorit pasi ato sugjerohen nga shqisat dhe perbejne qendren e gjykimit per cilesine e nje produkti ushqimor. Nisur nga kendveshtrimi i inspektorit te ushqimit, nje nga cilesite kryesore te ushqimeve eshte cilesia mikrobiologjike e produkteve ushqimore. Cilesia mikrobiologjike eshte nje pjese e pritshmerive ndaj ushqimeve dhe ajo perqendrohet ne dy aspekte esenciale: -mungesa e rrezikut per shendetin publik i shkaktuar nga prezenca ne produktin ushqimor i mikrorganizmave patogjen dhe/ose te toksinave te tyre; -mungesa e rrezikut per te gjithe personelin e perfshire ne prodhimin, shperndarjen dhe konsumin e produkteve ushqimore, si pasoje e shumimit te mikrorganizmave saprofit te pergjegjshem per alterime dhe perkeqesim te produkteve ushqimore, me konseguence humbje te substancave ushqyese. Sic ka shkruar Mossel ne 1972, asnje aktivitet njerezor nuk eshte pa rrezik, perfshire dhe te ushqyerit. Sipas ketij autori, me mungese te rrezikut ne te ushqyer duhet te nenkuptojme “ nivelin me te ulet te rrezikut racionalisht te realizueshem qe mund te arrihet dhe te ruhet me nje nderhyrje te pershtateshme”. Nga kjo pikepamje, rreziku mikrobiologjik eshte vecanerisht i fshehur dhe, ashtu sic ka afirmuar Juove ne 1990, nuk mund te mbahet ne nivelin me te ulet te mundshem pa ndihmen e nje lufte te pandalshme rezultatet e se ciles nuk mund te jene kurre definitive. Nuk eshte per tu habitur qe rreziku mikrobiologjik klasifikohet si me shqetesuesi nga ekspertet shkencor. Megjithate eshte teper kurioz fakti qe ky rrezik nuk perceptohet si nga me shqetesuesit nga publiku i gjere. Disa kerkime kane treguar qe opinioni publik percepton si shqetesim me te madh per ushqimin rreziqet kimike (pesticide, ndotje ambjentit), rreziqet nutricionale (kolesterol, obezitet) dhe problemin e mashtrimeve. Rreziku mikrobiologjik katallogohet ne vendin e fundit, ndoshta per karakterin e tij me pak spektakolar. Origjina e Rreziqeve Ushqimore Nje ushqim konsiderohet i rrezikshem kur permban agjente fizik, kimik apo biologjik te cilet mund ti shkaktojne dem atij qe e konsumon. Ne shumicen e rasteve, semundjet e trasmetuara nga konsumi i ushqimeve jane te klasifikueshme si intoksikime (helmime) spo si infeksione. Intoksikimet verifikohen si pasoje e konsumit te ushqimeve qe permbajne substanca toksike te para-formuara te cilat mund te jene; -prezente ne menyre natyrale ne indet e disa specie kafshesh apo bimesh, prej te cilave derivon ushqimi. -te prodhuara dhe te eskretuara nga mikroorganizma kontaminues (toksina bakteriale, mykore apo algale); -prezente ne ambjentet e prodhimit, perpunimit, konservimit, transportit te ushqimeve dhe qe kane rene aksidentalisht ne kontakt me produktin ushqimor (intoksikimet nga elemente dhe perbereje kimike). Infeksionet me origjine ushqimin shkaktohen nga konsumi i ushqimeve te kontaminuara me organizma patogjen. Shumica e ushqimeve mbart nje popullsi mikrobike natyrale e cila mund te rritet gjate proceseve te trasformimit dhe ruajtjes, per shkak te kontaminimit atmosferik, apo per shkak te kontaktit te ushqimeve me paisjet, njerezit dhe kafshet. Prezenca e ketyre mikroorganizmave mund te beje qe te variojne karakteristikat organoleptike te produkteve ose mund percaktoje shumimin e agjenteve patogjene, duke e bere keshtu produktin te rrezikshem per konsumatorin.

Agjentet patogjen mund te veprojne nepermjet prodhimit te toksinave in vivo (enterotoksinat qe prodhohen ne zorre), apo nepermjet aftesise se disa prej tyre te invadojne mukozen intestinale dhe eventualisht te invadojne inde dhe organe te tjera (infkesionet invazive sistemike). Rreziku mikrobiologjik eshte ai qe ze pjesen me te madhe te rreziqeve biologjike, pasi aty permblidhen rreziqet bakteriale, virale, myqet, prazitet njeqelizor, dhe nje numer i madh substancash toksike te prodhuara nga agjentet mikrobik.

Mikrobiologjia dhe Studimi i Semundjeve te Lidhura me Ushqimin Mikrobiologjia e aplikuar ne sektorin ushqimor ka njohur zhvillime te rendesishme dy shekujt e fundit. Fusha e hetimit kryesore e saj ka te beje me studimin e specieve mikrobike prezente ne llojet e ndryshme te produkteve ushqimore, me qellim qe te percaktoje origjinen dhe te analizoje sjelljen e tyre gjate proceseve te perpunimit dhe ruajtejs se ushqimeve. Pjese e ketij konteksti jane edhe kerkimet shkencore me objektiv zhvillimin dhe kolaudimin e teknikave me te pershtateshme per te kontrolluar apo reduktuar numrin e mikroorganizmave prezent ne ushqim, me qellim zgjatjen sa me shume te kohes se ruajtjes se produkteve ushqimore. Mikrobiologjia ushqimore i ushtron vemendje te vecante kryesisht studimit te grupeve te vecanta mikrobike, prezenca e te cilave mund te shkaktoje sindroma patologjike tek konsumatoret (toks-infeksionet). Eshte e rendesishme qe te njihen, jo vetem karkateristikat e mbijeteses dhe te shumimit te ketyre mikroorganizmave ne ushqime te llojeve te ndryshme por edhe epidemiologjia e semudjeve qe keto organizma shkaktojne, ne menyre qe te identifikohen me saktesi lidhjet e eventeve dhe situatave te ndryshme me rrezikun e transmetimit te semundjeve nepermjet ushqimeve. Mikrorganizmat Normalisht Prezent ne Ushqime Higjenisti dhe mikrobiologu duhet te njohin vendndodhjen normale te mikrorganizmave mbi apo brenda ushqimeve te llojve te ndryshme. Cdo vleresim i metejshem i kontaminimit nuk mund te ekzistoje pa konceptin kualitativ dhe mbi te gjitha sasior te mikrorganizmave qe kolonizojne normalisht ate qe hame. Deri me sot ka qene e pamundur te perpilohet nje harte sistematike e mikrorganizmave prezent ne ushqime. Megjithate ekzistojne tentativa per ti dhene konsistence ketij argumenti. Ne keto traktate popullsia e mikroroganizmave qe gjendet ne ushqime klasifikohet si saprofite (flora natyrale), deteriorantet (perkeqesuesit e karkateristikave organoleptike), mikroroganizma potencialisht patogjen , si dhe mikrorganizmat e dobishem qe ndihmojne ne ruajtjen e ushqimeve. Skema e meposhteme eshte nje tentative per te permbledhur popullsite mikrobike te disa lloje ushqimesh.

3

CAP. 1 - Introduzione

ORIGINE DEI RISCHI ALIMENTARI

Un alimento è considerato pericoloso per la salute quando contiene agenti fisici, chimici o biologici che possono arrecare danno a chi lo consuma. Nella assoluta maggioranza dei casi, le malattie trasmesse con il consumo di alimenti sono classificabili come intossicazioni (avvelenamenti) o come infezioni. Le prime si verificano per ingestione di prodotti alimentari che contengono preformate sostanze tossiche, le quali possono essere:

- presenti naturalmente nei tessuti di alcune specie animali o vegetali dalle quali origina-no gli alimenti (animali o piante velenosi);

- prodotte e rilasciate da microrganismi che abbiano avuto modo di contaminare l’ali mento e di moltiplicarvisi (tossine batteriche, fungine, algali);

- presenti negli ambienti di produzione, trasformazione, preparazione, conservazione e tra-sporto degli alimenti ed entrate accidentalmente in contatto con gli alimenti stessi (intos-sicazioni da elementi e composti chimici).

Le infezioni di origine alimentare sono causate dal consumo di alimenti contaminati con organismi patogeni. La maggior parte degli alimenti ospita una popolazione microbica na-turale che può accrescersi durante i processi di trasformazione e conservazione cui vengono sottoposti gli alimenti stessi, oppure può aumentare per effetto della contaminazione atmo-sferica o di quella derivante dal contatto con utensili, animali e uomini. La presenza di questi microrganismi può far variare semplicemente le caratteristiche organolettiche dell’alimento, oppure può determinare lo sviluppo di agenti patogeni, rendendo quindi l’alimento pericoloso per il consumatore.

Gli agenti patogeni possono esplicare la loro azione attraverso la produzione in vivo di tossine (si tratta, per lo più, di enterotossine che vengono prodotte nell’intestino), oppure in virtù della loro capacità di invadere la mucosa intestinale e, eventualmente, di superarla e di raggiungere altri tessuti e organi (infezioni invasive).

Nello schema seguente si vuole far notare come il rischio microbiologico occupi gran parte dello spazio riservato ai pericoli di natura biologica, perché interessa batteri, miceti, virus, parassiti unicellulari e un gran numero di sostanze tossiche prodotte dai medesimi agenti, peraltro spesso non ancora ben conosciute.

Mishi i Fresket dhe i Ngrire Dihet qe in vivo pH i muskulit eshte pothuajse neutral (rreth 7,2) dhe pas therjes, ai zbret deri ne vlera 5.3-5.8 per shak te veprimit enzimatik mbi glikogjenin i cili trasfomohet ne ac laktik. Maturimi i mishit ne frigorifer ne temp -1/+2° kompletohet ne 10-14 dite per mishin e gjedhit dhe ne 2-4 dite per ate te derrit. Gjate kesaj periudhe zvegelohet sasia e baktereve Gram negative, te cilet zevendesohen nga mikroaerofilet Gram pozitiv, vecanerisht laktobacile dhe Brochothrix thermosphacta. Kontaminimi siperfaqesor i nje karkase gjedhi mund te arrije vlera te ngarkesave bakteriale deri ne 103-105 baktere aerobe mezofile per cm2 nga te cilet rreth njeqind perfaqesohen nga koliforme dhe nga psokrofile. Shpejtesia e shumfishimit te baktereve mbi siperfaqen e mishit eshte mjaft e larte. Per shembull ne 8°C, E.coli katerfishohet ne 48 ore. I njejti evolucion i flores bakteriale manifestohet, edhe pse me e vouar, ne mishin e vene nen vakum ne te cilin prevalojne Carnobacterium dhe Brochothrix thermospacta, apo ne mishin nen atmosfere te modifikuar. Brendesia e muskulti te nje kafshe te sapo therur eshte normalisht sterile dhe, me se shumti mund te permbaje nga 10 deri ne 100 baketere per 100 gm mish (enterobaktere, Cl perfrinegens). Me zgajtjen e kohes se ruajtjes, ngarkesa mikrobike totale e mishit mund te mberrije deri ne 106 baktere/gram pa paraqitur alterime organoleptike te dallueshme. Kur ngarkesa bakteriale totale i tejkalon 107 baktere/gram shfaqet aroma e pakenaqeshme dhe kur i tejkalon 108 baktere/gram verehete formimi i mukusit mbi siperfaqe. Mishi i grire, i prere ne copa, i ndare nga kockat eshte me i ndjeshem ndaj shumfishimit bakterial, pasi ka nje siperfaqe te ekspozuar me te madhe dhe kalojne neper nje ser procesesh manipulative. N vecanti mishi i grire paraqet nje rritje te shpejte te ngarkeses mikrobike, aq sa jetegjatesia e tij konsiderohet e limituar na nje dite ne frigorifern ne temp 0-2°C. Alterimet organoleptike te lidhura me shufishimin bakterial shfaqen se pari ne siperfaqe per shkak baktereve gram negative si Pseudomonas fluorescence, Acinetobacter, Alcaligenes, Moraxella, Serratia, Citrobacter, Proteus, dhe Gram-pozitivi, si Staphylococcus dhe Bacillus. Me tej veprimi i baktereve spostohet ne thellesi per invazion te baktereve Gram- pozitive, si Clostridium perfringens, Clostridium hystolyticum, Clostridium sporogenes, Enterococcus, Bacillus, dhe ne nje mase me te vogel e baktereve, Gram-negative, midis te cileve ata te gjinise Proteus. Mishi i deleve shfaq nje perqindje me te madhe Cl perfringensi ne thellesi te indit.

6

Microbi e alimenti

MICRORGANISMI NORMALMENTE PRESENTI NEGLI ALIMENTI

L’igienista e il microbiologo, in particolare, devono conoscere la localizzazione normale dei germi presenti sopra o dentro le diverse tipologie di alimenti. Ogni valutazione successiva di contaminazione, infatti, non può esistere senza la nozione qualitativa e, soprattutto, quanti-tativa dei microrganismi che normalmente colonizzano ciò che mangiamo.

Batteri Gram-negativi

aerobiAcetobacter, Acinetobacter, Brucella, Flavobacterium, Moraxella, Pseudomonas, Xantomonas

microaerofili Campylobacter

anaerobi facoltativiE.coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella, Serratia, Yersinia, Vibrio, Plesiomonas, Aeromonas

Batteri Gram-positiviaerobi facoltativi Brochothrix, Listeria

anaerobi aerotolleranti Lactobacillus

Cocchi Gram-positivi

aerobi Micrococcusmicroaerofili aerobi Aerococcusanaerobi facoltativi Staphylococcus

anaerobi aerotollerantiStreptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus

anaerobi Sarcina

Batteri corineformiaerobi Corynebacterium, Brevibacterium,

Mycobacteriumanaerobi facoltativi Propionibacterium

anaerobi BifidobacteriumBatteri Gram-positivi

sporigeni aerobi/anaerobi facoltativi Bacillus cereus

Batteri appartenenti a gruppi particolari

anaerobi Clostridium (perfringens, botulinum)aerobi Halococcus, Halobacterium

ospiti cellulari obbligati Rickettsie (Coxiella burnetii)

Non si può tracciare, a tutt’oggi, una mappa sistematica dei microrganismi presenti nei vari alimenti. Dalle informazioni frammentarie pubblicate nei vari lavori scientifici emerge tuttavia un blando tentativo di dare organicità alla materia.

Almeno per dimostrare l’esistenza di un principio d’interesse sul problema, vengono ripor-tati alcuni esempi. In essi, si fa menzione di germi ospiti abituali degli alimenti, i saprofiti, e di altri germi che compaiono sulla scena in un secondo tempo, accompagnati dalla comparsa di alterazioni organolettiche, chiamati “deterioranti”. Oltre a questi, si nominano i micror-ganismi potenzialmente patogeni, pericolosi per la salute. Si accenna, infine, a batteri che svolgono un’azione benefica, aiutando a salvare dal degrado alcuni alimenti deperibili.

Questa rapida trattazione non pretende assolutamente di essere una disamina esaustiva della materia. È da accettare piuttosto nella veste di un riassunto.

Mishi i kafsheve tejet te lodhura dhe te stresuara para therjes (DFD) jane subjekt i alterimeve me te shpejta per shkak te shumfisihimit te baktereve laktike, Serratia, Brochothrix thermosphacta. Jane gjithashtu subjekt i degradimit te hershem mishi i derrit PSE. Mbi mishin e ngrire te pa paketuar mund te shfaqen njolla te bardha per shkak te zhvillimit te myqeve te gjinive Penicillium, Cladosporium, Sporotrichum. Majate mund te perfaqesohen nga gjinite Trichosporon, Candida e Rhodotorula. Mishi i kuq nuk shkakton problematika nese konsumohet i gatuar mire. Vetem ne rastet e nje trajtimi termik ta pamjaftueshem mund te shfaqet problematika nga mbijetesa salmonelave, stfilokokeve, klostrideve dhe E. coli enterotoksik. Ne shpendet e gjalle kontaminimi mikrobik origjinon nga shtrati, nga uji dhe nga ushqimi dhe eshte i perqendruar ne siperfaqe. Ne kafshen e therur ajo eshte konseguence direkte e igjenes se therjes dhe mund te arrije mbi lekure perqendrime 105 baktere cm2 siperfaqe. Mikrorganizmat kryesore perfaqesohen nga Pseudomonas, Acineto- bacter, Flavobacterium, Corynebacterium dhe enterobakteriacet. Ne fazat e putrifikimit bakterial, verehet formimi i mukusit mbi karkase e ndjekur nga shfaqja e aromes se rende, dhe se fundmi verehet nje pamje mucilaginoze e mishit. Bakteret me shpesh te perfshira ne fenomenin e putrifikimit te karkasave jane Pseudomonas, Shewanella putrefaciens, Acinetobacter dhe Moraxella. Mikrorganizmat patogjen qe kontaminojne me shpesh mishin e pules (shpendeve ne pergjithesi) jane Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Cam- pylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica. Mishi i Perpunuar Pergatitja e sallameve fillon me grirjen e msihit pa dhjam dhe e dhjamit. Ne kete faze flora mikrobike eshte e perbere nga enterobakter, micrococche, laktobacille, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Brochothrix thermosphacta dhe myqe (Penicillium, Aspergillus). Konservimi i sallameve arrihet me ane te kriposjes. Praktikisht shtohet NaCl 2.4-3% (ul Aw ne 0.96-0.95) dhe nitrati apo nitriti (deri ne 150 mg/kg) qe sherbejne per te ruajtur ngjyren e mishit, per te frenuar oksidimin e yndyrnave dhe per te favorizuar seleksionimin e laktobacileve dhe te mikrokokeve te dobishem per maturimin e produktit final. Shtimi i nitrateve ka edhe funksinonin e rendesishem e pengimit te shumfishimit te Clostridium botulinum. Shtimi i erezave, stazhonimi (ulje e metejshme e Aw), modifikimi i flores bakteriale gjate maturimit (ulje e pH), trajtimi termik apo tymosj,a kompletojne serine e nderhyrjeve te cilat parandalojne zhvillimin e specieve mikrobike te padeshirueshme. Ne pergatitjen industriale te sallameve te stazhonuara perdoren normalisht starter mikrobik (Micrococcus, Staphylococcus carnosus dhe xylosus, Pediococcus, Lactobacillus e specieve plantarum, pentosus, sakei, curvatus), pervec majave per krijimin e aromave te vecanta dhe myqeve (Penicillium chrysogenum e nalgiovense) per formimin e nje shtrese siperfaqesore te bardhe. Mikrobet e shtuara kane aftesine te favorizojne ruajtjen e sallameve per antagonizem e floren origjinale te mishit, te krijojne aromen tipike te produktit dhe te permiresojne ngyren. Ne fund te periudhes se stazhonimit sallamet mund te kene vlera te Aw di 0,90-0,80 dhe te pH di 5,7-5,9. Bakteret patogjene qe mund te jene prezente ne mishin e perpunuar jane teorikisht shume, por ne baze te frequences se izolimit mund te permblidhen ne salmonella (ne salsicet e fresketa), stafilococchi, salmonelle, listerie (ne sallamet e stazhonuara). Statistikisht eshte vertetuar tashme se toksinfeksionet nga salmonelat te transmetuara nga salsicet e fresketa kane nje rendesi te vecante pasi ato kosumohen pa u gatuar mire ne thellesi te produktit. Produktet Itike Peshku eshte subjekt ndaj moltiplikimit te shpejte bakterial per arsye te pH gati neutral te mishit te tij, nje perqindje e larte e ujit te lire (Aw 0,98-0,99) dhe te shume substancave nutritive te treteshme. Flora bakteriale normale perbehet kryesisht nga bakteret Gram-negative dhe Pseudomonas, prezenca e te cilave, pervec proceseve te alterimit organoleptik te produktit dhe te degradimit te tij mund te shkaktoje prodhimin e substancave toksike si istamina, vecanerisht ne peshqit e pasur me istidine (toni , skumbri). Alterimet e peshkut i detyrohen kryesisht Shewanella putrefaciens dhe Pseudomo- nas fluorescens. Baktere te tjere te demshem per ruajtjen jane, Moraxella, Acinetobacter, Bacillus, Halococcus, Halobacterium e Halomonas. Bakteret metabolizojne proteinat duke formuar amoniak, acid sulfidrik,indol, dhe amina te eres se rende(trimetilamina) duke filluar qe nga perqendrimi 106 baktere per gram. Ne disa vende si Japonia konsumi i peshkut te pa gatuar perben rrezik per toksinfeksionet nga Vibrio parahaemolyticus dhe vibrioni alofile te ngjashem me (alginolyticus, fluvialis, hollisae, mimicus, metschnikovii). Patogjene te tjere te trasmetueshem nga peshku jane Clostridium perfrin- gens, Clostridium botulinum tipi E, Erysipelothrix insidiosa, Edwardsiella tarda, Shigella, Vibrio cholerae. Tek krustacet (karkaleca, gaforre, aragosta) dhe tek mollusqet mund te jene prezent salmonelle, shigelle, Vibrio cholerae e Vibrio parahaemolyticus.

PRODUKTET E GASTRONOMISE Produktet gastronomike perbejne nje grup teper heterogjen produktesh ushqimore, te bashkuara nga fakti qe keto produkte pesojne nje sere procesesh trasformuese perpara se te jene te gateshme per tu konsumuar. Shpesh here keto produkte jane rezultat i nje permbledhje apo perzjerje lendesh te para te natyrave te ndryshme. Produktet gastronomike jane shpesh te pasur me mikrorganizma te cilet origjinojne nga lendet e para dhe nga perpunimi i tyre ne ambjente te papershtateshme higjenikisht. Sallata ruse, sallata me salce me baze vezet,etj, permbajne nje liste mikrorganizmash teper te gjate per ta permendur te teren. Ja vlejne per tu permendur ato me kryesoret, si stafilococch, Klostridet, Salmonella, Listeria e Campylobacter vi . Qumeshti Ne qumeshtin e paperpunuar mund te gjenden mikrorganizma me origjine ambjentale apo fekale nga te cilet mund te permendim, micrococchi, stafilococchi, corine- batteri, bacilet Gram-negativ (Pseudomonas, Enterobacteriaceae), laktobacilet, Bacillaceae, bacilet Gram-positivi, clostridi, majate e myqet. Qumeshti mund te kontaminohet gjithashtu edhe me baktere patogjen si Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Brucella abortus, Bru- cella melitensis, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Salmonella, Campylobacter jejuni etj. Ftmiresisht trajtimi termik i qumeshti (oasterizimi, UHT) i reduktojne ne menyre drastike keto rreziqe Qumeshti i fermentuar Produkti me i njohur komercialisht eshte kosi (yogurt) i cili pergatitet me ane te fermentimit te qumeshtit ne temperature 42- 45 °C per nje kohe rreth 2.3 ore. Kosi karakterizohet nga vlera pH 4,2-4,3 edhe nga nje permbajtje e larte bakteresh (me e larte se108/gm). Alterimi i kosit eshte jo i zakonshem dhe mund ti atribuohet kontaminimit me koliforme apo nga maja acido-tolerante, apo myqeve. Edhe episodet e intoksikimit nga patogjenet jane te rralle edhe pse ka raste te dokumentuara nga Listeria. Djathrat Per shkak te baktereve saprofite prezente ne qumeshtin e paperpunuar apo ne rast te gabimeve gjate perpunimit te djathit mund te manofestohen alteracione, te karakterizuara nga formimi i nje shije te hidhur dhe te prishur(Pseudomonas), ose nga manifestimi i fryrjeve per shkak te acidifikimit te pa-mjaftueshem dhe te zhvillimit te Klebsiella aerogenes apo e koliformeve. Fryrjet e djathit me te rrezikshme jane ato te voneshmet, te provokuara nga klostridet termodurike (Clostridium tyrobutyricum). Sporet e klostrideve ne qumesht me origjine silazhin arrijne ti mbijetojne pasterizimit dhe pasi jane kthyer ne formen vegjetatitive prodhojne gaz dhe acid butirrik. Alteracionet e siperfaqes se djathit shkaktohen shpesh nga zhvillimi i myqeve te tipve Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Al- ternaria. Mikroroganizmat patogjen qe mund te gjenden ne djath sidomos tek djathrat e bute perfaqesohen nga Staphylococcus aureus, disa shtame enterohemorragjike te Escherichia coli si ato te grupit O157:H7, nga Salmonella, dhe nga Listeria monocytogenes. Gjalpi Ne gjalp mund te gjenden enterobaktere, myqe, maja. Akulloret Permbajne zakonisht flore laktike te qumeshtit te pasterizuar. Akullorja e papaketuar mund te permbaje koliforme, Salmonele, St. aureus, dhe Listeria monocytogenes per kontaminim sekondar (personeli). Qumesht Pluhur Per foshnjet Nese eshte pergatitur me qumesht gjedhi te cilesise se larte duhet te permbaje nje numer teper te ulet kontaminuesish. Vezet dhe Produktet e Tyre

Vezet mund te jene te kontaminuara sidomos mbi levozhge ku ngarkesa bakteriale perfaqesohet kryesisht nga baktere Gram pozitive (Staphylococcus spp. e Bacillus spp.) dhe nga Gram-negative me origjine enterike, dhe mund te arrije ngarkese deri ne 102 -107 per cm2. Nga bakteret Gram negative mund te gjenden salmonelat. Ne brendesi te vezeve, ne rast te trasmetimit vertikal nga vezoret mund te gjenden Pseudomonas dhe Enterobacteriaceae, nga te cilat Salmonella gallinarum, Salmonella enteritidis dhe pak sierotipe te tjera. Ne rastin e Salmonelave shume statistika kane treguar se si kjo rruge trasmetimi eshte teper e limiuar dhe nje perqendrim te salmonelave ne brendesi te vezeve teper te vogel. Ne fermat e infektuara nga Salmonella numri i vezeve te infektuara nga Salmonella duket te jete 1 veze ne 15 000. Problemi i toksinfeksioneve nga salmonelat te trasmetuara nga vezet ka te beje me shume me zakonin e keq e ruajtjes se vezeve jashte frigoriferit. Me te shumten e rasteve toksinfeksionet ushqimore nga salmonelat jane te perfshire produktet me prejardhje nga vezet (kremra, salsa, maioneze, torta etj) te cilet mund te permbajne nje numer te larte salmonelash per shkak te mos praktikimit te praktikave te mira te perpunimit dhe ruajtjes se ushqimeve. Prishja e vezeve mund te varet nga kalimi i mikroroganizmave nga siperfaqja e levozhges ne brendesi te saj, per shkak te ndryshimit te temperaturave ne prezence te niveleve te larta te lageshtise, apo per shkak te krisjve te levozhges. Hollimi i membranes proteinike te jashteme per arsye te ndryshme (gjenetike, nutricionale) eshte nje nga shkaqet kryesore e fenomenit te mesiperm. Mund te penetrojne ne kete menyre mikrorganizmi qe ja dalin ti mbijetojne edhe faktoreve mbrojtes te brendshem te vezes (lizozima) si psh Pseudomonas putida (qe e ben fluorescente albuminen), Pseudomonas fluorescens (qe i jep nje ngjyre roze komponenteve te brendshem te vezes), Proteus vulgaris e Aeromonas (qe bejne te verdhen te zeze). Produktet e vezes mund te kene nje rrezik me te larte kontaminimi nese nuk i ushtrohen pasterizimit. Ekzistojne shume produkte te tjera ushqimore me interes per Mikrobiologjine ushqimore si produktet e pasticerise, mjalti, uji i pijshem, uji mineral dhe i gazuar, perimet, frutat, konservat, gjysem-konservat etj. Disa Nga Teknikat Analitike Mikrobiologjike te Ushqimeve Kohet e fundit jane prezantuar shume te reja ne fushen e analizimit te produkteve ushqimore, megjithate analiza mikrobiologjike e ushqimeve vazhdon te behet me metoda tradicionale tashme te standartizuara per shkak te zyrtarizimit te ketyre teknikave. Ngarkesa bakteriale aerobe mezofile totale (NBT) percaktohet duke mbjelle hollime dhjetore te kampioneve ushqimore te omogjenizuara ne diluent izotonik mbi piata standart Agar. Kjo analize vlen psh per analizimin e mishit ne pergjithesi, te ujit te pijshem, qumeshtit e tj. Procedura te ngjashme perdoren per numerimin e bakterve te vecanta. Per numerimin e baktereve apo familjesh bakteriale te vecanta mjafton te perdoren terrene selektive apo diferenciale te pershtateshme. Me pak ndryshime te thjeshta ekzekutohen disa numerime bakteriale ne piata petri. Per shembull percaktimi i anaerobeve solfito-reduktues qe behet duke perdorur piatat TSC. Percaktimi i numrit te koliformeve behet duke perdorur terrenin VRBA. Per Stafiloccocus aureus perdoret terreni Baird-parker. Numerimi i enterobaktereve behet me terrenin VRBG. Per numerimin e baktereve laktike perdoren terrenet MRS dhe M17 agar. Ekzistojne edhe kerkime sasiore te cilat parashikojne mbjelljen e hollimeve te kampionit ne terrene te lengeshme si per shembull per kerkimin e Koliformeve fekal apo E,coli, te ciat kryhen me metoden e “Numrit me te mundshem” (Most probable Number, MPN). Teknika e filtrimit te kampionit ne mebrana te pershtateshme (te cilat kultivohen pastaj ne terrene te pershtateshme selektive) perdoret per numerimin e kliformeve dhe streptokokeve me origjine fekale. Shume metoda analitike te tjera, te cilta nuk jane sasiore por cilesore edhe pse nisin me nje peshim te kampionit perdoren per te identifikuar prezencen apo mungesen e baktereve specifike. Salmonelat, Vibrionet, Campilobakter, Yersinia enterocolitica kane te perbashket ne teknikat e izolimit dhe identifikimit te tyre fazat e para-pasurimit-pasurimit.mbjelljen ne terrene selektive. Te gjitha keto teknika analitike fshehin dizavantazhe disa prej te cileve jane te listuara me poshte. Ne macerimin e kampionit gjate omogjenizimit te tij, qelizat mikrobike bien ne nje ambient kimik shume te ndryshem nga ambienti nga ku ato origjinojne. Kjo situate e re ambjentale mund te kete nje efekt frenues apo edhe toksik mbi disa specie mikrorganizmash, sidomos myqe, maja, duke patur si pasoje nje nenvleresim te permbajtjes mikrobike te kampionit. Pergjegjesite me te medha bien mbi pH dhe temperaturen e diluentit te perdorur, mbi demin mekanik nga

omogjenizimi dhe mbi demtimin bakterial nga mbjella e vonuar ne terrenin perkates. Hollimi i omegjenatit duhet te promovoje shperndarjen e qelizave bakteriale ne kampion pa goditur vitalitetin e tyre. Pervec perberjes se diluentit dhe kohes qe kalon nga hollimi ne mbjellje ekzistojne edhe faktore te tjere qe ndikojne ne mbijetesen e mikrorganizmave qe duam te analizojme. Nga keta, faza e ciklit riprodhues, prezenca e joneve metalike dhe e alkaloidve te liruara nga specie te ndryshme, stresi nga pH dhe nga temperatura. Kerkimet per anaerobet e obliguar, perberes sinjifikativ i mikroflores ushqimore, nuk japin rezultate te besueshme nese nuk ndiqet nje metode rogorozisht anaerobe. Shume ekosisteme natyrale permbajne popullata mikrobike qe tejkalojne popullatat mikrobike te matura. Vleresohet se me terrenet bakteriologjie te perdorura izolohet vetem nje pjese e flores mikrobike preznete realisht, sidomos nga produktet e fresketa (mish, perime) apo ato me komplekse te fermentuara (sallame, djathra te stazhonuar). Sipas disa autoreve ne raste ekstreme kuota e mikroroganizmave te izoluar mund te reduktohet deri ne 10% te asaj realisht prezente. Kjo anomali mund te shpjegohet nga dy evente; prezenca e specieve te reja te panjohura te cilat nuk rriten me metodat aktuale, dhe se dyti prezenca e specieve te njohura, vitale por ne nje gjendje te pakultivueshme. Keto te fundit nuk rriten as ne terrene pa agjente selektiv, ndryshe nga bakteret e stresuara te cilat pasi kane kaluar deme subletale, jane te rekuperueshme me metoda te vecanta rivitalizimi. Fenomeni i baktereve vitale por jo te kultivueshme eshte eksperimentuar dhe riprodhuar in vitro, per disa patogjene (Salmonella, Campylobacter, Vibrio), me ane te trajtimit ne temperatura te uleta apo duke limituar substancat nutritve ne dispozicion te baktereve. Keto kushte te pafavorshme per vitalitetin e mikrorganizmave mund te ndodhin edhe ne natyre, ne ujrat apo mbi siperfaqen e bimeve. Nje shembull eshte Helicobakter Pylori. Ky i fyndit eshte nje patogjen oportunist qe shkakton patologji te rendesishme gastroenterike (ulcera, linfoma e MALT) serbatori i te cilit eshte uji. Ky mikroorganizem eshte i afte edhe te ndryshoje morfologjine duke kaluar nga nje aspekt bastoncellar ne ate kokoide. Per me teper ai eshte totalisht i pakultivueshem in vitro. Keto lloje bakteresh jane zbuluar fale teknologjise se biologjise molekualere (PCR) dhe substancave te markuara me substanca fluorescente. Analizat Mikrobiologjike Me te Indikuara per Kategorite e Ndryshme te Ushqimeve Analizat mikrobiologjike te parashikuara ne regulloren e komuniteti europian n° 2073/2005 jane te kufizuara brenda disa parametrave te cilat kane si objektiv kryerjen e detyres se dyfishte te verifikimit te produktit perfundimtar (permes kritereve te sigurise ushqimore) dhe te procesit produktiv (Permes kritereve te vleresimit te higjenes se procesit). Ligjvenesi europian ka parashikuar qe analiza te metejshme te mund te kryehen si nga Autoritetet e kontrollit ashtu edhe nga prodhuesi per te kompletuar gjykimin mbi shendetshmerine e produktit dhe mbi higjenen e prodhimit. I perket eksperiences se laborantit, per te zgjedhur cilat analiza te aplikoje mbi bazen e informacioneve te marra dhe mbi te gjtha mbi qellimin e analizimit te kampionit.

65

CAP. 3 - Analisi batteriologiche su alimenti

RICERCHE BATTERIOLOGICHE PIÙ INDICATE PER LE VARIE CATEGORIE DI ALIMENTI

Le ricerche batteriologiche previste dal Regolamento n° 2073/2005 della Comunità Euro-pea sono ristrette attorno ad alcuni parametri che, come si può desumere dal testo riprodotto integralmente nel Capitolo 8, dovrebbero assolvere al duplice compito di verificare, rispetti-vamente, l’alimento finito (attraverso i criteri di sicurezza alimentare) e il processo produttivo del medesimo (attraverso i criteri di valutazione dell’igiene di processo).

Il legislatore europeo ha però previsto che sia l’Autorità Sanitaria sia il fabbricante pos-sano compiere altri accertamenti per completare i giudizi, rispettivamente, di salubrità del-l’alimento e di igiene della produzione. Pertanto, sulla scorta delle informazioni esposte nel capitolo 1 circa gli effetti che i microrganismi provocano negli alimenti all’origine e durante il loro ciclo di vita, è possibile redigere un prospetto abbastanza completo delle ricerche di laboratorio che hanno una certa utilità ai fini dell’emissione dei giudizi predetti.

Compete all’esperienza del laboratorista, sulla base delle informazioni ricevute e, soprat-tutto, delle finalità del lavoro da compiere, scegliere quali analisi effettuare fra quelle sottoe-lencate.

MATERIALE RICERCHE CONSIGLIATE RIF.1. CARNI FRESCHE (refrigerate o congelate)Muscolo (da mezzene, quarti, tagli anatomici) CBT, Salmonella, sostanze inibenti (1)2. CARNI MACINATE

Carni macinate CBT, stafilococchi coagulasi +, E. coli, Salmonella (2)

Prodotti a base di carne (hamburger, svizzere, ecc)

E. coli, stafilococchi coagulasi +, Salmo-nella

3. POLLAME(4)

Pollame (intero o in parti) CBT, Salmonella, sostanze inibenti (3)4. SELVAGGINA

Soggetti interi sotto pelle o parti staccate CBT, Salmonella, Listeria monocytoge-nes, S. aureus, clostridi solfito-riduttori

5. CARNI PREPARATE (salumi o insaccati)

Freschi (salsiccia, cotechino, zampone, ecc)Stafilococchi coagulasi +, E. coli, clostri-di solfito-riduttori, Salmonella, Listeria monocytogenes

Stagionati (prosciutto crudo, coppa, salame, speck, ecc)

Stafilococchi coagulasi +, E. coli, latto-bacilli, micrococchi, Salmonella, Listeria monocytogenes

Cotti (mortadella, cotechino precotto, zampone precotto, wurstel , ecc)

CBT, stafilococchi coagulasi +, E. coli, clostridi solfito-riduttori, lattobacilli, Salmonella, Listeria monocytogenes

6. PESCE FRESCO (refrigerato o congelato) (3)Pesce intero sotto pelle CBTTranci, filetti, porzioni commerciali (compresi affumicati)

CBT, stafilococchi coagulasi+, E. coli, Salmonella, Listeria monocytogenes

         METODA PËR VLERËSIMIN E KONTAMINIMIT MIKROBIK Sikurse jemi shprehur më sipër, për të realizuar produkte ushqimore higjienikisht të pastra dhe me një kontaminim mikrobik minimal, është shumë e rëndësishme të stabilizohen veçanërisht kriteret e vlerësimit. Me fjalë të tjera, duhen përcaktuar standardet e vlerësimit me metoda relative të analizave, përmes të cilave mund të verifikohet nëse janë respektuar ose jo normat higjienike për të garantuar një produkt përfundimtar optimal.

66

Microbi e alimenti

MATERIALE RICERCHE CONSIGLIATE RIF.7. MOLLUSCHI E CROSTACEI (3)

Freschi E. coli, Salmonella, Vibrio cholerae O1, Vibrio parahaemolyticus

Cotti CBT, stafilococchi coagulasi +, E. coli, Salmonella

8. LATTE E DERIVATI (5)

Latte pasteurizzato e panna pasteurizzata CBT, coliformi, Salmonella, Listeria monocyto genes

Latte sterilizzato e UHT CBT

Burro Coliformi, Salmonella, Listeria mo-nocytogenes (9)

Gelati Coliformi, S. aureus, Salmonella, Liste-ria monocytogenes

Formaggi E. coli, S. aureus, coliformi, Salmonella, Listeria monocytogenes

Latte in polvere Coliformi, Salmonella (9)Yogurt Lattobacilli

9. PASTE ALIMENTARICBT, coliformi, E. coli, Salmonella, S. aureus,

Cl. perfringens(6)

10. UOVA E DERIVATI (7)Uova da consumo Salmonella

Prodotti d’uovo CBT, stafilococchi coagulasi +, Entero-bacteriaceae, Salmonella

11. PREPARAZIONI GASTRONOMICHE (1)Crude (spiedini, arrotolati) vedi carni macinate (prodotti a base di carne)Pasteurizzate, cotte, precotte (piatti pronti, da riscaldare prima del consumo o da consumare tal quali)

CBT, stafilococchi coagulasi +, E. coli, B. cereus, Salmonella, Listeria mo-nocytogenes, clostridi solfito-riduttori

12. VEGETALI E FRUTTA CBT, miceti, Listeria monocytogenes

13. PRODOTTI DELLA IV GAMMA Listeria monocytogenes, Yersinia entero-colitica, Aeromonas hydrophila

14. PRODOTTI STERILIZZATI E CONSERVE CBT aerobia, CBT anaerobia, spore aerobie, spore anaerobie (8)

15. MIELE Cl. botulinum, anaerobi sporulati

16. ACQUA POTABILE CBT, coliformi, enterococchi, spore di anaerobi solfito-riduttori

17. ACQUE MINERALIPseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, enterococchi, spore di anae-robi solfito-riduttori, Salmonella

18. BEVANDE PASTEURIZZATE Saccharomyces

19. SEMICONSERVE S. aureus, Cl. perfringens, Cl. botulinum, Sal monella, miceti

20. PRODOTTI DI PASTICCERIACBT, enterobatteri, S. aureus, Salmonel-la, Cl. perfringens, B. cereus. Listeria monocytogenes, miceti

Këto standarde mund të stabilizohen përmes analizave të ndryshme gjatë përpunimit të produktit dhe duke zbatuar praktikat e mira të punës. VLERËSIMI I KONTAMINIMIT NË PIKAT KRITIKE Vlerësimi i kontaminimit në pikat kritike të kontrollit mund të kryhet sipas procedurave të mëposhtme: a) Kontrolli viziv i kushteve higjienike. Është një metodikë që bazohet në konceptin që sa më

shumë papastërti të ketë aparatura dhe mjedisi, aq më i madh është numri i mikroorganizmave në ushqim. Vlerësimi përmes inspektimit pamor ose viziv mund të përfaqësojë një parametër të mirë për të kontrolluar veprimtarinë e punonjësve gjatë fazave të punës dhe respektimin e higjienës personale të tyre. Kontrolli viziv mund të evidentojë defekte në momentin që ai kryhet. Ky kontroll duhet t’u besohet njerëzve të specializuar.

b) Kontrolli i laboratorit. Padyshim që është një metodikë e saktë dhe e vlefshme për të vërtetuar limitet e kontaminimit.

Këto metodika të labortatorit mund të ndryshojnë në varësi të parametrave të stabilizuar. Për çdo pikë kritike ka analiza ku, sigurisht, ato mikrobiologjiket konsiderohen më të domosdoshmet. Analizat bakterologjike mund të ndahen në:

1. Kualitative, të cilat përdoren ekskluzivisht për të stabilizuar nëse një mikroorganizëm është i pranishëm në mostrën që do të analizohet. Në përgjithësi, përdoren për kërkimin e shtameve patogjene, me përjashtim të L.monocytogenes, për të cilat është pranuar një numër maksimal i pranueshëm në disa produkte;

2. Sasiore. Përdoren për të pasur një vlerësim real të nivelit të kontaminimit. Në këtë rast është shumë e domosdoshme të njohësh numrin minimal të shtameve të kërkuar, si dhe të evidentosh metodën e përdorur.

Midis metodikave të përdorura për vlerësimin e kontaminimit mikrobik mund të kujtojmë: • ngarkesën mikrobike totale; • shtamet indikatore të kontaminimit; • shtamet indikatore të procesit.

Ngarkesa Bakteriale Totale Perkufizimi Ngarkesa baketriale totale eshte nje vleresim teorik i numrit total te mikroorganizmave prezent ne nje kampion. Bazohet mbi hipotezen qe nje qelize bakteriale e vendosur mbi nje terren te fortte, formon vetem nje koloni te dallueshme. Numri i baktereve perkufizohet edhe numri i njesive qe formojne koloni (CFU). Mbi bazen e temperaturave optimale te rritjes mikrorganizmat ndahen ne mezofile (25-40 °C), psicrofile (15-20 °C), termofile (45-60 °C). Ne klasifikimi duhet te futen edhe bakteret termodurike te cilat jane te rendesishme ne sektorin e perpunimit te qumeshtit. Metoda Pergatitja e omogjenatit Pergatitja e hollimeve dhjetore Mbjellja ne Plate count agar (PCA) Inkubim Numerim i Kolonive Numerimi i Baktereve totale Mezofile

Metoda e numerimit standart ne Pjate (Pour plate method) Materialet e duhura Qese sterile me filter per Stomacher Proveza sterile Solucion dilunet sterile ringer i hooluar ¼, ose solucion fisiologjik i peptonuar (NaCl 0.85%+peptone 0.1%) Pipeta sterile te graduara nje perdorimshe Piata petri sterile diameter 9 cm Terren Plate Count Agar steril dhe i mbajtur i shkrire ne temp 44-46°C Ekzekutimi Operacionet e peshimit te kampionit dhe te shtimit te diluentit mund te behen direkt mbi peshoren teknike, duke lunur ne menyre sterile. Pergatitet nje suspension i kampionit ne qesen e Stomakerit, duke shtuar ne raportin P/V nga 1:1 deri ne 1:10 (ne vartesi te natyres dhe te saise se materialit ne dispozicion). Nese eshte e mundur mund te merren 50gm kampion dhe ti shtohen 100 ml diluent. Ne kete menyre realizohet nje suspension 1:3 e produktit qe po analizohet. Behet omogjenizimi ne stomaker per 1-2 minuta. Ne rastin e produkteve te lengeshme dhe te supozuara me ngarekese te ulet bakterilae mund te evitohet hollimi fillestar. Perndryshe duhet te procedohet si me produktet e ngurta. Nga omogjenati fillestar behen hollime dhjetore (1+9 ml diluent) sipas nevojes, duke perdorur si diluent ringer ¼ apo solucioni fiziologjik te peptonuar steril. Transferohen, ne paralel ne 2 pjata petri per cdo hollim, 1 ml omogjenat per cdo pjate petri. Brenda 20 minutave nga pergatitja e hollimeve duhet te derdhet ne pjatat e petrit 15 ml terren Plate Count Agar te mbajtur te lenet ne 44-46°C. Perpara se terreni te ngurtesohet duhet te rrotullohet dhe te levizet pjata e petrit ne menyre qe inokuli te perzjehet ne menyre sa me homogjene me terrenin. Pas ngurtesimit te terrenit pjatat inkubohen ne 37°C per 48 ore ose ne 30°C per 72 ore. Ne analizen e kampioneve shume te kontaminuar mund te jete e dobishme mbulimi i terrenit te mbjelle me nje shtrese terreni (overlay). Praktikisht pas solidifikimit te terrenit te inokuluar hidhet nje shtrese e dyte (5-6ml) per piate nga i njejti terren, i cili mbahet vecante ne banjomari ne 44-46°C. Teknika e mbjelljes ne thellesi perdoret gjithashtu per percaktimin e ngarkeses bakteriale totale te ujit te paketuar me modifikimet e duhura. Per percaktimin e ngarkese bakteriale mezofile totale te qumeshtit (te pasterizuar, UHT apo te sterilizuar) arrihen rezultate me te mira duke mbjelle kampionin ne nje terren qe permban qumesht sic eshte Milk palte count agar (Donato e kol, 1994). Interpretimi Per interpretimin e rezultatit duhet te merren ne konsiderate hollimi i mbjelle ne piata petri qe ka dhene rritjen e nje numri kolonish nga 30-300. Llogaritja e numrit te kolonive behet me formulen si me poshte; CBT/g (ml, cm2) = C/ D1xD2xV Ku: C = mesatarja e numrit te kolonive te numeruara ne te dy pjatat e inokuluara paralelisht D1 = hollimi i bere gjate pergatitjes se homogjenatit D2 = hollimi dhjetor i homogjenatit V = vellimi i inokulit ne piata (1 ml) Shembull 1 Numri i kolonive te numeruara ne te dy piatat ne hollimin 10-3: 54 dhe 48. Homogjenati u pergatit me 50 g (apo 50 ml) kampion dhe 100 g (apo 100 ml) diluent. Vellimi i inokuluar: 1 ml. Atehere : C = (54+48)/2=102/2=51 D1 = 50/(50+100)=50/150=1/3 D2 = 10-3 V =1 ml

114

Microbi e alimenti

Sostituendoli nell’espressione, si ottiene il seguente risultato:

51CBT/g (ml) = ––––––––––– = 51 x 3 x 103 x 1 =153 x 103 = 1,53 x 105

1/3 x 10-3 x 1

Esempio 2

Numero colonie contate sulle due piastre alla diluizione 10-5: 87 e 93.Sospensione iniziale allestita con 20 g (o 20 ml) di campione e 100 g (o 100 ml) di di-luente.Volume di inoculo: 1 ml.I dati da considerare sono:C =(87+93)/2=180/2=90D1 =20/(20+100)=20/120=1/6D2 =10-5

V =1 mlSostituendoli nell’espressione, si ottiene il seguente risultato:

90CBT/g (ml) = ––––––––––– = 90 x 6 x 105 = 5,4 x 107

1/6 x 10-5 x 1

Esempio 3

Numero colonie contate sulle due piastre alla diluizione 10-1: 167 e 175Sospensione iniziale allestita con 40 cm2 di cute di pollame e 100 ml di diluente.Volume di inoculo = 1 ml.I dati da considerare sono: C =(167+175)/2=342/2=171D1 =40/100=2/5D2 =10-1

V =1 mlSostituendoli nell’espressione, si ottiene il seguente risultato:

171CBT/cm2 = ––––––––––– = 171 x 5/2 x 10 = 171 x 2,5 x 10 = 4275 2/5 x 10-1 x 1

Esempio 4

Campione liquido omogeneo, a bassa contaminazione, che, seminato tal quale senza dilu-izione iniziale, ha prodotto sulle piastre, rispettivamente, 54 e 60 colonie.Sospensione iniziale: non eseguita.Volume di inoculo: 1 ml.I dati da considerare sono:C =(54+60)/2=114/2=57D1 =1D2 =1V = 1 mlSostituendoli nell’espressione, si ottiene il seguente risultato:

Metoda e Mbjelljes ne Siperfaqe (Surface spread plate) Materialet e duhura Qese sterile me filter per Stomacher Proveza sterile Solucion dilunet sterile ringer i hooluar ¼, ose solucion fisiologjik i peptonuar (NaCl 0.85%+peptone 0.1%) Pipeta sterile te graduara nje perdorimshe Piata petri me terren Plate Count Agar Spatula ne form L sterile Ekzekutimi Pergatitet suspensioni fillestar i kampionit dhe hollimet dhjetore si ne tekniken e me siperme. Nga homogjenati fillestar dhe nga hollimet dhjetore trasferohen ne paralel 0.1 ml ne piatat PCA. Behet shperdnarja e inokulit ne te gjithe siperfaqen e terrenit me nje spatul sterile njeperdorimshe te vecante per cdo hollim. Per ushqimet me ngarkese bakteriale te ulet (ushqimet e trajtuara termikisht), keshillohet te behet mbjellja ne paralel e 1 ml homogjenat te ndare ne dy piata (0.5+0.5 ml). Hollimet e mepasshme ne keto raste mund te mos behen, duke bere ne vend te tyre nje mbjellje ne 2 piata paralele te nje vellimi 0.1 ml te hmogjenatit. Pas inokulimit piatat duhet te lihen te thahen per rreth 30 minuta dhe te vendosen me pas ne inkubator te kthyera permbys ne 37°C per 48-72 ore. Interpretimi Merren ne konsiderate piatat ku eshte mbjellur hollimi i kampionit qe ka dhene formimin e 30-300 kolonive. Per piatat e mbjellura respektivisht me 1 dhe 0.1 ml lejohet numerimi edhe i atyre piatave qe kane me pak se 30 koloni. Llogaritja behet me formulen e mesiperme. Metoda Drop Plate (Micrometodo) Materialet e duhura Qese sterile me filter per Stomacher Piata sterile microtiter monouso me 96 gropeza Mikropipeta me vellim te variueshem (0-20 dhe 20-200) Maja per mikropipete Solucion dilunet sterile ringer i hooluar ¼, ose solucion fisiologjik i peptonuar (NaCl 0.85%+peptone 0.1%) Piata petri me terren Plate Count Agar Ekzekutimi Pergatitet nje suspension i kampionit si ne teknikat e msiperme. Nga homogjenati behen hollimet sipas teknikes mikro-hollimit ne piastren mikrotiter. Hollimi i pare behet duke shtuar 180 μl Ringer te perqendruar 1/4 dhe 20 μl homogjenat; hollimet e tjera behen duke trasferuar ne sekuence 20 μl te hollimit parardhes ne 180 μl Ringer te perqendruar ¼. Hollimet behen duke filluar me shtimin e diluentit (ringer) duke perdorur mikropipeten 200 μl. Pasazhet nga hollimi i pare ne ate qe vijon behen me mikropipeten 20 μl duke nderruar cdo here majen e pipetes. Perzjerja e permbajtjes se gropezave behet me pipeten 200 μl duke aspiruar dhe shakrkuar 4-5 here per cdo gropez dhe duke nderruar gjithnje majat. Ndahen piatat ne 4 sektor te barabarte ne menyre qe te mundet te kemi nje sektor te piates per homogjenatin dhe per hollimet e njepasnjeshme. Trasferohet ne paralel (dopio) 20 μl homogjenat dhe nga secili hollim ne sektorin respektiv te piatave. Lihen piatat te thahen per 30 minuta. Vendosen piatat jo permbys ne termostat ne 37°C per 24-48 ore ose me 30°c per 72 ore (duke i lexuar per dite). Ne rast te kampioneve me ngarkese bakteriale te ulet (supozuar, ushqimet e trajtuara termikisht) keshillohet te integrohet

teknika Drop plate me metoden Surface spread plate, duke mbjelle ne 2 piata paralele 1 dhe 0.1 ml homogjenat. Interpretimi Merren ne konsiderate hollimet qe pasi jane mbjelle kane dhene formimin e jo me shume se 20 kolonive. Llogritja e ngarkese bakteriale totale behet me formulen e mesiperme.

Ngarkesa Bakteriale Psikrofile Totale Mikrorganizmat psikrofil kane temeprature optimale te rritjes 15-20°C, por keto mikrorganizma jane ne gjendje te rriten edhe ne temperatura me te uleta se 5°C. Keto baktere jane te rendesishme gjate degradimit te ushqimeve te ruajtura ne frigorifer. Ngarkesa Bakteriale psikrofile totale eshte kresjtesiht analoge me ate mezofile, me perjashtim te temperatures dhe kohes se inkubimit qe per psikrofilet behet ne 5°C per 10 dite, ne nje kontenitor te mbyllur per te evituar didratimin e terrenit. Ngarkesa Bakteriale Termofile Totale Analoge me ngarkesen bakteriale totale mezofile, por piatat inkubohen ne 55°c per 48 ore, ne nje kontenitor te mbyllur me nje burim lageshtie (pambuk i njomur me uje te distiluar steril) per te evituar dehidratimin e terrenit. Ngarkesa Bakteriale e Baktereve Termodurike Ne sektorin e perpunimit te qumeshtit perkufizimi baktere termodurike perdoret per mikrorganizmat (kryesisht bacile dhe Klostride) te cilet jane te afte ti mbijetojne pasterizimit, por qe nuk jane ne gjendje te rriten ne temperaturat e pasterizimit. Analiza eshte krejtesisht analoge me ngarkesen bakteriale totale mezofile por perpara se te behen hollimet dhjetore, homogjenati pasterizohet ne laborator (ne banjomari ne tem 62.8°C per 30 min). Numerimi i Baktereve Alofile Mund te numerohen ne vecanti koket tolerant ndaj kripes, te cilet predominojne ne sallamet e stazhonuar, dhe bakteret alofil te detyruar qe mbizoterojne tek peshqit dhe tek perimet apo tek ushqimet e kriposura. Perdoren teknikat pour plate apo spread plate por me terren specifik per keto lloj bakteresh (caseinate agar) dhe inkubohen per 3 dite ne 32°C. Numerimi i baktereve alofile te dtyruara behet pastaj me metoden MPN duke mbjelle tre hollime te kampionit ne tre grupe epruvetash (me nga tre epruveta secili). Inkubimi i epruvetave behet ne 32°C per 7 dite. Numerimi i Baktereve Lipolitike Bakteret lipolitike perbejne nje grup heterogjen i cili perfshin micrococchi, stafilococchi, clostridi, flavobatteri dhe Pseudomonadacee. Kane te perbashket aftesine per te shkaterruar acidet yndyrore. Numerohen ne terrenin Tributyrin Agar, i sili inkubohet 72 ore ne +37 °C. Shenim-Kerkime te metejshme: ckomponimi i ngarkese bakteriale

117

CAP. 5 - Prove tipicamente quantitative

Esempio 1

Numero di colonie contate nelle due semine del settore di piastra corrispondente alla diluizione 10-1: 10 e 14.Sospensione iniziale allestita con 50 g (o 50 ml) di campione e 100 g (o 100 ml) di di-luente.Volume di inoculo: 20 µl.I dati da considerare sono:C = (10+14)/2=24/2=12D1 = 50/(50+100)=50/150=1/3D2 = 10-1

V =20 µlSostituendoli nell’espressione, si ottiene il seguente risultato:

12CBT/g (ml) = ––––––––––––– = 12 x 3 x 101 x 50 =18.000 1/3 x 10-1 x 1/50

Nota applicativa

La tecnica del “micrometodo” descritta (ideata da Fung e Coll. nel 1969 e poi modificata da Kramer nel 1977) è stata rielaborata più volte da differenti Autori.

La versione più recente proviene da Kim e Fung (2005), che propongono ancora una micro-diluizione in piastre, ma a 24 pozzetti, entro i quali si fanno passaggi di 30 µl contro 270 µl di diluente. Si usa un’unica pipetta multicanale per fare le diluizioni e anche per la miscelazione entro i pozzetti, che avviene aspirando e scaricando 2-3 volte, senza cambiare i puntali.

Le diluizioni vengono poi seminate, in blocco, su un’unica piastra di terreno agarizzato di 15 cm di diametro, prelevando contemporaneamente il liquido dai pozzetti con un supporto sterile fornito di “tulipani”.

Le gocce da 25 µl deposte sulla piastra consentono, dopo incubazione, la crescita di micro-colonie entro un diametro di 0,5 cm, che vengono considerate contabili se presenti in numero compreso tra 5 e 50.

2. CONTA BATTERICA TOTALE PSICROFILA

I microrganismi psicrofili, pur avendo una temperatura ottimale di sviluppo compresa tra +15 e +20 °C, sono ancora in grado di crescere a temperature inferiori a +5 °C. Essi hanno importanza per la degradazione degli alimenti conservati in frigorifero.

Per approfondire l’argomento dei germi psicrofili e del loro effetto sugli alimenti, si con-siglia di prendere visione della rassegna pubblicata in un numero speciale (1972, n° 23) della rivista Archiv für Lebensmittelhygiene, del lavoro di Ottaviani e Coll. (1994) per il settore del latte e del lavoro di Berry e Coll. (1997) per le carni. Da questi lavori, e da altri, emergono anche indicazioni sui terreni specifici per conteggiare separatamente i batteri psicrofili. Per esempio, Flint (1994) riporta di aver sviluppato un terreno selettivo per Acinetobacter.

Va tuttavia ricordato che alcune specie batteriche, considerate potenzialmente patogene e annoverate comunemente fra i microrganismi mesofili, sono in grado di sopravvivere e di moltiplicarsi anche a basse temperature, assumendo, pertanto, il ruolo di psicrofili.

Erickson e Coll. (1992) descrivono il comportamento, nelle uova pasteurizzate in com-mercio, dei seguenti “patogeni psicrotrofi”: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica,

Ne rastet e kampioneve te mishit me ngarkese bakteriale mezofile totale mbi 10 milion baktere/g, keshillohet te behen nje seri mbjelljesh duke u nisur nga kolonite ne PCA me morfologji te ndryshme, duke marre ne konsiderate deri ne maksimum 5 koloni. Pasi behet ngjyrosja me Gram dhe ekzaminohen ne mikroskop zgjidhet me pas terreni i pershtatshem duke u bazuar ne tabelen e meposhteme. Rezultatet mund te na japin informacion te dobishem mbi ngarkesen bakteriale totale teper te larte.

         Teknika e ngarkeses bakteriale totale mund te aplikohet pa ndonje ndryshim te vecante por duke perdorur terrene specifike edhe per kerkimin sasior te shume specieve bakteriale.      Metodat Indirekte Njekohesisht me shfaqjen e mjeteve plastike njeperdorimshe ne laborator u prodhuan edhe kite diagnostike te bazuara mbi metoda te ashtuquajtura inovative apo jo-tradicionale. Keto kite diagnostike karakterizohen nga kohe e shkurter e rezultatit, thjeshtesi ne ekzekutim, ndjeshmeri te mire dhe specificitet i larte. Ne pergjithesi keto kite kane nevoje per nje perqendrim te larte te baktereve ne kerkim (103/ml ), prandaj aplikimi i tyre fillon ne fazen e pasurimit te mikrorganizmave ne sensin tradicional. Ketu do te permednim tre grupe kitesh respektivisht testet e natyres fiziko-kimike, imunologjike dhe gjenetike. Ketu nuk po permendim testet qe perdoren mbi kultura bakteriale te izoluara. Testet Fiziko-kimke Filtrimi me Membrane Prinicipi i kesaj metode eshte i thjeshte . Behet nje filtrim i kampioneve te lengeshme (lavazhe apo tessute te homogjenizuara) nga karkasat e gjedhit apo te derrit. Pas filtrimit behet mbjellja e membranes ne terren selektiv te ngurte m-Coli blue. Nje variant tjeter i kesaj teknike konsiston ne vendosjen e kampionit mbi membrane e cila gjendet e vendosur mbi siperfaqen e nje terreni te ngurte specifik, pa nevojen e nje filtrimi te vertete. Bakteret mbi membrane do te perdorin principet nutritive te terrenit me ane te ozmozes. Reklamohet se nje qelize bakteriale do te formoje nje koloni mbi mebrane duke bere te mundur leximin. Nje metode tjeter e ketij lloji testi ofrohet nga Duffy dhe kol 2000. Kjo metode parashikon pasurimin e kampionit per 18 ore ne uje te peptonuar, ne te cilin zhytet per 15 minuta nje membrane polokarbonati, e ngjitur ne nje lamele. Qelizat e salmoneles qe ngjiten tek membrana evidentohen nga nje antitrup mmonoklonal i kniuguar me nje kolorant fluoreshent (i kuq Texas) dhe me pas behet nje ngjyrosje me (jeshile Sytox). Salmonelat shfaqen me nje bord te kuq fluoreshent; ato te ngordhurat tregojne edhe nje qender jeshile. E gjithe procedura zgjat rreth 1 ore. Metoda Impedimetrike

119

CAP. 5 - Prove tipicamente quantitative

6. CONTA DEI BATTERI LIPOLITICI

I germi lipolitici formano un gruppo eterogeneo, composto da micrococchi, stafilococchi, clostridi, flavobatteri e Pseudomonadacee. Sono accumunati dalla proprietà di demolire gli acidi grassi. Sono conteggiabili su terreno Tributyrin Agar, dove le colonie, dopo incubazione per 72 ore a +37 °C, appaiono circondate da un alone trasparente, che contrasta con l’aspetto torbido del terreno.

Nota - Ulteriori ricerche: scomposizione della CBT

Nel caso di campioni di carni con carica batterica totale mesofila superiore a 10 milioni di germi/grammo, si consiglia di eseguire una serie di strisci, partendo da colonie su PCA morfologicamente diverse e prendendo in considerazione fino a un massimo di 5 colonie. Colorare con Gram ed esaminare al microscopio.

Scegliere quali terreni seminare tra MRS Agar, M 17 Agar, STAA, MSA, Sabouraud Dex-trose Agar, VRBG Agar, GSPA (vedi tabella seguente). Le diluizioni e le semine possono essere fatte in micrometodo. I risultati ottenuti possono dare utili indicazioni circa le cause della carica batterica elevata.

Tabella indicativa per la scomposizione della CBT nelle carniesamemicroscopico

ricercada effettuare

terrenoda seminare

diluizioniconsigliate

condizionidi incubazione

bastoncini Gram + lattobacilli MRS Agar

M 17 Agar

ND/10-4

ND/10-4

37°C x 72 ore (10% CO2)

37°C x 48 ore

bastoncini Gram + Brochothrixthermosphacta

STAA ND/10-4 20°C x 48 ore

cocchi Gram + micrococchi MSA ND/10-4 37°C x 48 ore

cocchi Gram + lieviti SabouraudDextrose Agar

ND/10-4 20°C x 5 gg

bastoncini Gram - Enterobacteriaceae VRBG Agar ND/10-4 37°C x 24 ore

bastoncini Gram - PseudomonasAeromonas

GSPA ND/10-4 20°C x 72 ore

LegendaMRS = Mann, Rogosa, Shape Agar VRBG = Violet Red Bile Glucose AgarSTAA = Streptomycin Thallium Acetate Agar MSA = Mannitol Salt AgarGSPA = Glucose Starch Penicillin Agar ND = non diluito

Nota importante

La tecnica della conta batterica totale, cambiando terreno, può essere applicata, senza particolari variazioni, alla ricerca quantitativa di molte specie di microrganismi. Pertanto, nei successivi capitoli, le fasi iniziali relative all’omogeneizzazione e alla preparazione delle diluizioni, non vengono più descritte in dettaglio.

Si fa presente, inoltre, che, nell’esposizione delle tecniche di valutazione della carica batte-rica, non è stata presa in considerazione la metodica del numero più probabile (Most Probable Number o MPN). Le modalità di esecuzione di questa tecnica, ritenuta troppo indaginosa, sono riportate in quasi tutti i testi di microbiologia degli alimenti e in numerosi lavori con-sultabili.

Ndryshimet e konduksionit mund te bejne qe te dyshohet prezenca e nje bakteri ne nje terren specifik pasurimi ne te cilin jane zhytur kampioni dhe dy elktroda. Matja ne milivolt e impedences (rezistenca e fluksit të një korrenti alternativ në një konduktor) e bere ne intervale kohe te caktuar krahasohet men je kurbe standarte te paracaktuar. Ne kerkimin e salmonelave me sistemin Malthus psh, kampionet negative mund te njihen brenda 30 oreve dhe analizat mund te vazhdojne ne ato pozitive me metodat klasike. Duke nderruar terrenin e perdorur behet e mundur te analizohet ngarkesa bakteriale totale apo patogjene specifike te tjere. Vlefshmeria e ketyre sistemeve qendron ne aftesine e terrenit selektiv qe nuk duhet te ndrhyje me matjen e impedences. Bioluminescenza Si te gjithe qelizat e gjalla bakteret permbajne ATP, e cila eshe e perfshire ne disa reaksione metabolike te rendesishme. Trasformimi i ATP ne substanca te tjera mund te vizualizohet po ti ofrojme qelizave bakteriale nje substrat (luciferinen), nje enzime (luciferazen) dhe ione magnezi. Luciferina shnderrohet ne oksiluciferine ne sasi proporcionale me ATP duke leshuar drite e cila matet me nje instrument (luminometer). Kjo metode e perfeksionuar nga disa kompani ka gjetur aplikim (lumetron) ne percaktimin e ngarkeses bakteriale, ne vecanti ne vleresimin e gjendjes higjenike te siperfaqeve te perpunimit ne industrine ushqimore. Testet Imunologjike (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Teknika ne kete rast orientohet nga demostrimi i nje antigjeni bakterial specifik ne kampion. Ky test mund te aplikohet ne pistra me gropeza duke kryer disa faza: Kapja e nje antigjeni bakterial me nje antitrup specifik i lidhur ne fund te gropzes ne piaster. Larje per te larguar materilain e pa lidhur Shtimi i nje antitrupi i drejtuar kunder antitrupit te pare i koniuguar me nje enzime Larje per te larguar antitrupat e koniuguar te pa lidhur Shtimi i nje substarti, i cili per veprimin e enzimes ngyroset ose behet fluoreshent -Kjo teknike ka gjetur aplikime te vlefshme si per kerkimin e patogjeneve ne kultura pasurimi ashtu edhe per identifikimin e toksinave direkt nga produktet ushqimore. Testet me Natyre Gjenetike Keto jane metoda qe bazohen ne kerkimin specifik te acideve nukleike nepermjet ibridizimit. Perdoren sonda me ADN apo ARN te cilat njohin sekuenca specifike te gjeneve te mikrorganizmit qe na intereson. Me keto metoda eshte e mundur te kerkohen patogjenet e pakultivueshem me menyrat tradizionale. Gjitashtu eshte e mundur te percaktohet nese mikrorganizmi qe po analizohet eshte apo nuk eshte patogjen duke kerkuar per gjenet qe prodhojne faktore virulence apo toksina. Sondat perftohen zakonisht me ane te enzimave (endonukleazat) ose me sinteze. .