MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM). Coltura batterica al TEM.
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MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)
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Coltura battericaal TEM
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Schermo fluorescente
Binoculare
Lente proiettore
Campione
Apertura Lente obiettivo
condensatore
Fonte di elettroni
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Fascio di elettroni primari
Elettroni secondari
SEM
TEM
Scattering anelastico Scattering elastico
Elettroni trasmessi
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TEM
e- conscattering anelastico
e- conscattering elastico
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TEM convenzionale
Scattering elastico Scatteringanelastico
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Elettroni incidenti
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Preparazione dei campioni per TEM
FISSAZIONE
a) FISSAZIONE CHIMICA con impiego di fissativi come GLUTARALDEIDE ePARAFORMALDEIDE (per stabilizzare le proteine) e post-fissativi come OSMIO (1%) per lafissazione di lipidi. I fissativi sono usati a concentrazioni 3-5% e sciolti in tamponi
b) CRIOFISSAZIONE, congelamento rapido per immersione del campione in azoto liquido(-190°C), in genere si usano anche composti crioprotettivi per evitare danni del campione
N.B: osmio e glutaraldeide vanno maneggiati condispositivi di sicurezza secondo il D.L. 626
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DISIDRATAZIONE
Procedimento che porta alla totale rimozione dell’acqua nel campione e alla sostituzione con un solvente (etanolo)
Passaggi in etanolo 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%
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INCLUSIONE IN RESINA
Le resine sono sostanze che polimerizzano in opportune condizionie una volta che sono entrate nel campione induriscono il campione e lo rendono sezionabile.Le resine usate per la microscopia convenzionale sono EPOSSIDICHE(costituite da miscele di aldeidi) e polimerizzano a 60°
Il campione viene immerso in un solvente intermedio che si miscela sia conL’etanolo sia con la resina (OSSIDO DI PROPILENE)
Passaggi: ossido di propilene-etanolo, ossido di propilene assoluto,
Ossido di propilene:resine (3:1) per 1h, 1:1per 1h, 1:3 per 2hResina assoluta per 2hPolimerizzazione in stufa a 60° per 3 giorni
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SEZIONAMENTO
I campioni induriti vengono tagliati mediante ULTRAMICROTOMO insezioni ultrasottili (40-80 nm) e depositati su retini (anelli con griglie diOro, nichel, rame
retino
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CONTRASTAMENTO
Con metalli pesanti come uranio e piombo si aumentalo scattering elastico di membrane e inclusi nellecellule
I retini su cui sono state deposte le sezioni vengonoimmerse prima in acetato di uranile, lavati e successivamente in citrato di piombo
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COLORAZIONE NEGATIVA