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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de
Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
Diana Filipa Lopes Penim
Dissertaccedilatildeo para a obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em
Engenharia Alimentar
Orientador Doutor Vitor Manuel Delgado Alves
Coorientadora Doutora Maria Luiacutesa Beiratildeo da Costa
Juacuteri
Presidente Doutora Margarida Moldatildeo Martins Professora Auxiliar com agregaccedilatildeo do
Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa
Vogais Doutor Vitor Manuel Delgado Alves Professor Auxiliar do Instituto Superior de
Agronomia da Universidade de Lisboa
Doutora Maria Margarida Canas Mendes de Almeida Cardoso Professora
Auxiliar Convidada da Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia da Universidade
Nova de Lisboa
2015
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
I
Agradecimentos
Eacute com grande consideraccedilatildeo que agradeccedilo a todos os que directa ou indirectamente contribuiacuteram e
ajudaram na realizaccedilatildeo deste trabalho
Ao professor Vitor Alves por toda a ajuda apoio e esclarecimentos prestados durante a realizaccedilatildeo da
tese de mestrado e pela disponibilidade e paciecircncia que demostrou ter
Aacute professora Maria Luiacutesa Beiratildeo da Costa que introduziu o tema da tese e que forneceu material de
apoio introdutoacuterio agrave teacutecnica de Spray-Drying
Agrave professora Margarida Moldatildeo que deu sempre uma palavra de apoio e incentivo no decorrer da
parte experimental do trabalho
Agrave minha famiacutelia e amigos que me apoiaram durante a realizaccedilatildeo do trabalho sem eles este trabalho
natildeo seria possiacutevel A eles agradeccedilo tudo que fizeram por mim
Um agradecimento especial aos meus pais agrave Laura Joana Liane e Margarida por nunca desistirem
de mim por natildeo me deixarem desistir da tese e por me apoiarem nos momentos mais difiacuteceis mas
tambeacutem por estarem presentes durante os bons momentos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
II
Resumo
O proacutepolis eacute uma resina elaborada pelas abelhas que apresenta diversas propriedades bioactivas
sendo uma das mais importantes a sua actividade antioxidante No presente trabalho procedeu-se agrave
microencapsulaccedilatildeo por spray drying de um extracto etanoacutelico de proacutepolis utilizando goma-araacutebica
quitosano e inulina como materiais de revestimento O extracto etanoacutelico de proacutepolis analisado
apresentou uma quantidade de compostos fenoacutelicos totais de cerca 443 mg EAG g Relativamente agrave
actividade antioxidante esta foi 0191 M Trolox g de proacutepolis e 0251 M Trolox g de proacutepolis atraveacutes
do meacutetodo DPPH e FRAP respectivamente Os compostos encapsulados nas micropartiacuteculas
continuaram a apresentar actividade antioxidante As micropartiacuteculas obtidas satildeo caacutepsulas e
apresentaram uma forma esfeacuterica com uma superfiacutecie lisa e o seu tamanho variou entre 5 e 25 μm
Em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada dos compostos fenoacutelicos destaca-se a libertaccedilatildeo por parte das
micropartiacuteculas de goma-araacutebica ser menor em relaccedilatildeo agraves outras matrizes em meio aacutecido e ser
maior em meio neutro A velocidade de libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute elevada no entanto em
meio neutro haacute uma maior libertaccedilatildeo do que em meio aacutecido
Palavras-chave Proacutepolis actividade antioxidante spray-drying goma-araacutebica inulina quitosano
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
III
Abstract
Proacutepolis is a resin produced by bees which has several bioactive properties the most important being
its antioxidant activity In the present work we proceeded to the microencapsulation by spray drying
of a proacutepolis ethanolic extract by using gum arabic inulin and chitosan as a coating material The
ethanol extract analyzed proacutepolis presented a quantity of phenolic compounds of about 443 mg GAE
g In relation to the antioxidant activity that was 0191 M Trolox g of propolis and 0251 M Trolox g
of propolis by DPPH method and FRAP respectively Compounds encapsulated in microparticles
have continued to antioxidant activity Microencapsulation of proacutepolis in different matrices produced
spherical microparticles having a smooth surface their size varied between 5 and 25 micrometers
Regarding the controlled release of phenolic compounds the release by gum arabic microparticles be
smaller than the other matrices in acid media and be higher in the neutral media It was observed that
the phenolic compounds release from the microparticles was low in both media however in neutral
medium there it was a greater than in acidic medium
Keywords proacutepolis antioxidant activity spray-drying gum arabic inulin chitosan
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IV
Extended Abstract
Proacutepolis is a natural resin produced by bees composed of several resinous and balsamic substance
sap flowers bee saliva pollen and wax Because of these mixing elements proacutepolis has a complex
chemical composition and various bioactive properties one of them are the antioxidant activity
Since a few years the food with antioxidant properties have become important due to its health benefit
so proacutepolis also became an attractive product due to their bioactive properties However proacutepolis is
also negatively characterized by its intense flavor and odor hence the need to hide andor cancel
these two proprieties
The present study aimed at encapsulate an ethanolic proacutepolis extract of in different matrices of
polysaccharides such as chitosan gum arabic and inulin and understand whether it was feasible to
carry out this procedure based on the physicochemical properties of the product concerned Another
additional objective was to study the behavior of active compound when microparticles were released
in acidic and neutral media analogously to what may occur in the stomach and intestine
It was quantified the antioxidant activity of the proacutepolis ethanolic extract by DPPH and FRAP
methods and total phenolics by Folin-Ciacalteu method The antioxidant activity was 0191 M Trolox
g of propolis and 0251 M Trolox g of propolis from DPPH and FRAP methods respectively To total
phenolics content was 443 mg GAE g of proacutepolis
After the encapsulation process by drying process different microparticles were obtained Gum
arabica with proacutepolis (GA) Chitosan with proacutepolis (Q1) Chitosan with citric acid and proacutepolis (Q2)
Inulin with proacutepolis (I)
Microparticles were characterized in terms of shape and size In general microparticles containing
proacutepolis had a spherical shape and a smooth surface Regarding the mean diameter it ranged
between this 5 and 25 μmIt was observed that the average size of the microparticles increased when
proacutepolis was encapsulated regarding to empty particles
This study also showed that the microparticles with proacutepolis still presented antioxidant activity
depending the value on the encapsulating matrix The degree of encapsulation of various
microparticles containing proacutepolis were GA=656 and 895 Q1=1228 and 1752 Q2=409 and 682
I=1866 and 3555 mg GAE g of particles by Folin ndash Ciacalteu method and direct method
respectively The antioxidant activity values obtained by DPPH method were 0169 0232 0092 and
0572 M Trolox g of particles for the FRAP method the values were 0036 07 0187 and 0896 M
Trolox g of particles for GA Q1 Q2 and I respectively
Release studies were performed in acidic medium (pH = 12) and neutral medium (pH = 70) It was
found that the release of bioactive compounds was low in both media however there was a greater
release in the neutral medium The release by gum arabic microparticles be smaller than the other
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
V
matrices in acid media and be higher in the neutral media The different chemical composition of Gum
arabica for other matrices should be the main factor for this behavior
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VI
Iacutendice
Agradecimentos I
ResumoII
Abstract III
Extended Abstract IV
Lista de Figuras IX
Lista de Tabelas X
Lista de Abreviaturas XI
I Introduccedilatildeo e Objectivos 1
II Enquadramento Teoacuterico 2
1 Proacutepolis 2
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica 2
12 Propriedades Farmacoloacutegicas 3
13 Produtos com Proacutepolis 3
2 Actividade Antioxidante 4
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 4
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu 5
212 Meacutetodo Directo 5
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 5
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH 5
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP 6
3 Microencapsulaccedilatildeo 7
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo 7
311 Etapas do Processo 8
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo 9
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo 11
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes 11
321 Goma-Araacutebica 12
322 Inulina 12
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
Aliyazıcıoglu R Sahin H Erturk O Ulusoy E Kolayli S (2013) Properties of Phenolic
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
I
Agradecimentos
Eacute com grande consideraccedilatildeo que agradeccedilo a todos os que directa ou indirectamente contribuiacuteram e
ajudaram na realizaccedilatildeo deste trabalho
Ao professor Vitor Alves por toda a ajuda apoio e esclarecimentos prestados durante a realizaccedilatildeo da
tese de mestrado e pela disponibilidade e paciecircncia que demostrou ter
Aacute professora Maria Luiacutesa Beiratildeo da Costa que introduziu o tema da tese e que forneceu material de
apoio introdutoacuterio agrave teacutecnica de Spray-Drying
Agrave professora Margarida Moldatildeo que deu sempre uma palavra de apoio e incentivo no decorrer da
parte experimental do trabalho
Agrave minha famiacutelia e amigos que me apoiaram durante a realizaccedilatildeo do trabalho sem eles este trabalho
natildeo seria possiacutevel A eles agradeccedilo tudo que fizeram por mim
Um agradecimento especial aos meus pais agrave Laura Joana Liane e Margarida por nunca desistirem
de mim por natildeo me deixarem desistir da tese e por me apoiarem nos momentos mais difiacuteceis mas
tambeacutem por estarem presentes durante os bons momentos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
II
Resumo
O proacutepolis eacute uma resina elaborada pelas abelhas que apresenta diversas propriedades bioactivas
sendo uma das mais importantes a sua actividade antioxidante No presente trabalho procedeu-se agrave
microencapsulaccedilatildeo por spray drying de um extracto etanoacutelico de proacutepolis utilizando goma-araacutebica
quitosano e inulina como materiais de revestimento O extracto etanoacutelico de proacutepolis analisado
apresentou uma quantidade de compostos fenoacutelicos totais de cerca 443 mg EAG g Relativamente agrave
actividade antioxidante esta foi 0191 M Trolox g de proacutepolis e 0251 M Trolox g de proacutepolis atraveacutes
do meacutetodo DPPH e FRAP respectivamente Os compostos encapsulados nas micropartiacuteculas
continuaram a apresentar actividade antioxidante As micropartiacuteculas obtidas satildeo caacutepsulas e
apresentaram uma forma esfeacuterica com uma superfiacutecie lisa e o seu tamanho variou entre 5 e 25 μm
Em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada dos compostos fenoacutelicos destaca-se a libertaccedilatildeo por parte das
micropartiacuteculas de goma-araacutebica ser menor em relaccedilatildeo agraves outras matrizes em meio aacutecido e ser
maior em meio neutro A velocidade de libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute elevada no entanto em
meio neutro haacute uma maior libertaccedilatildeo do que em meio aacutecido
Palavras-chave Proacutepolis actividade antioxidante spray-drying goma-araacutebica inulina quitosano
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
III
Abstract
Proacutepolis is a resin produced by bees which has several bioactive properties the most important being
its antioxidant activity In the present work we proceeded to the microencapsulation by spray drying
of a proacutepolis ethanolic extract by using gum arabic inulin and chitosan as a coating material The
ethanol extract analyzed proacutepolis presented a quantity of phenolic compounds of about 443 mg GAE
g In relation to the antioxidant activity that was 0191 M Trolox g of propolis and 0251 M Trolox g
of propolis by DPPH method and FRAP respectively Compounds encapsulated in microparticles
have continued to antioxidant activity Microencapsulation of proacutepolis in different matrices produced
spherical microparticles having a smooth surface their size varied between 5 and 25 micrometers
Regarding the controlled release of phenolic compounds the release by gum arabic microparticles be
smaller than the other matrices in acid media and be higher in the neutral media It was observed that
the phenolic compounds release from the microparticles was low in both media however in neutral
medium there it was a greater than in acidic medium
Keywords proacutepolis antioxidant activity spray-drying gum arabic inulin chitosan
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IV
Extended Abstract
Proacutepolis is a natural resin produced by bees composed of several resinous and balsamic substance
sap flowers bee saliva pollen and wax Because of these mixing elements proacutepolis has a complex
chemical composition and various bioactive properties one of them are the antioxidant activity
Since a few years the food with antioxidant properties have become important due to its health benefit
so proacutepolis also became an attractive product due to their bioactive properties However proacutepolis is
also negatively characterized by its intense flavor and odor hence the need to hide andor cancel
these two proprieties
The present study aimed at encapsulate an ethanolic proacutepolis extract of in different matrices of
polysaccharides such as chitosan gum arabic and inulin and understand whether it was feasible to
carry out this procedure based on the physicochemical properties of the product concerned Another
additional objective was to study the behavior of active compound when microparticles were released
in acidic and neutral media analogously to what may occur in the stomach and intestine
It was quantified the antioxidant activity of the proacutepolis ethanolic extract by DPPH and FRAP
methods and total phenolics by Folin-Ciacalteu method The antioxidant activity was 0191 M Trolox
g of propolis and 0251 M Trolox g of propolis from DPPH and FRAP methods respectively To total
phenolics content was 443 mg GAE g of proacutepolis
After the encapsulation process by drying process different microparticles were obtained Gum
arabica with proacutepolis (GA) Chitosan with proacutepolis (Q1) Chitosan with citric acid and proacutepolis (Q2)
Inulin with proacutepolis (I)
Microparticles were characterized in terms of shape and size In general microparticles containing
proacutepolis had a spherical shape and a smooth surface Regarding the mean diameter it ranged
between this 5 and 25 μmIt was observed that the average size of the microparticles increased when
proacutepolis was encapsulated regarding to empty particles
This study also showed that the microparticles with proacutepolis still presented antioxidant activity
depending the value on the encapsulating matrix The degree of encapsulation of various
microparticles containing proacutepolis were GA=656 and 895 Q1=1228 and 1752 Q2=409 and 682
I=1866 and 3555 mg GAE g of particles by Folin ndash Ciacalteu method and direct method
respectively The antioxidant activity values obtained by DPPH method were 0169 0232 0092 and
0572 M Trolox g of particles for the FRAP method the values were 0036 07 0187 and 0896 M
Trolox g of particles for GA Q1 Q2 and I respectively
Release studies were performed in acidic medium (pH = 12) and neutral medium (pH = 70) It was
found that the release of bioactive compounds was low in both media however there was a greater
release in the neutral medium The release by gum arabic microparticles be smaller than the other
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
V
matrices in acid media and be higher in the neutral media The different chemical composition of Gum
arabica for other matrices should be the main factor for this behavior
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VI
Iacutendice
Agradecimentos I
ResumoII
Abstract III
Extended Abstract IV
Lista de Figuras IX
Lista de Tabelas X
Lista de Abreviaturas XI
I Introduccedilatildeo e Objectivos 1
II Enquadramento Teoacuterico 2
1 Proacutepolis 2
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica 2
12 Propriedades Farmacoloacutegicas 3
13 Produtos com Proacutepolis 3
2 Actividade Antioxidante 4
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 4
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu 5
212 Meacutetodo Directo 5
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 5
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH 5
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP 6
3 Microencapsulaccedilatildeo 7
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo 7
311 Etapas do Processo 8
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo 9
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo 11
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes 11
321 Goma-Araacutebica 12
322 Inulina 12
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
II
Resumo
O proacutepolis eacute uma resina elaborada pelas abelhas que apresenta diversas propriedades bioactivas
sendo uma das mais importantes a sua actividade antioxidante No presente trabalho procedeu-se agrave
microencapsulaccedilatildeo por spray drying de um extracto etanoacutelico de proacutepolis utilizando goma-araacutebica
quitosano e inulina como materiais de revestimento O extracto etanoacutelico de proacutepolis analisado
apresentou uma quantidade de compostos fenoacutelicos totais de cerca 443 mg EAG g Relativamente agrave
actividade antioxidante esta foi 0191 M Trolox g de proacutepolis e 0251 M Trolox g de proacutepolis atraveacutes
do meacutetodo DPPH e FRAP respectivamente Os compostos encapsulados nas micropartiacuteculas
continuaram a apresentar actividade antioxidante As micropartiacuteculas obtidas satildeo caacutepsulas e
apresentaram uma forma esfeacuterica com uma superfiacutecie lisa e o seu tamanho variou entre 5 e 25 μm
Em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada dos compostos fenoacutelicos destaca-se a libertaccedilatildeo por parte das
micropartiacuteculas de goma-araacutebica ser menor em relaccedilatildeo agraves outras matrizes em meio aacutecido e ser
maior em meio neutro A velocidade de libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute elevada no entanto em
meio neutro haacute uma maior libertaccedilatildeo do que em meio aacutecido
Palavras-chave Proacutepolis actividade antioxidante spray-drying goma-araacutebica inulina quitosano
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
III
Abstract
Proacutepolis is a resin produced by bees which has several bioactive properties the most important being
its antioxidant activity In the present work we proceeded to the microencapsulation by spray drying
of a proacutepolis ethanolic extract by using gum arabic inulin and chitosan as a coating material The
ethanol extract analyzed proacutepolis presented a quantity of phenolic compounds of about 443 mg GAE
g In relation to the antioxidant activity that was 0191 M Trolox g of propolis and 0251 M Trolox g
of propolis by DPPH method and FRAP respectively Compounds encapsulated in microparticles
have continued to antioxidant activity Microencapsulation of proacutepolis in different matrices produced
spherical microparticles having a smooth surface their size varied between 5 and 25 micrometers
Regarding the controlled release of phenolic compounds the release by gum arabic microparticles be
smaller than the other matrices in acid media and be higher in the neutral media It was observed that
the phenolic compounds release from the microparticles was low in both media however in neutral
medium there it was a greater than in acidic medium
Keywords proacutepolis antioxidant activity spray-drying gum arabic inulin chitosan
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IV
Extended Abstract
Proacutepolis is a natural resin produced by bees composed of several resinous and balsamic substance
sap flowers bee saliva pollen and wax Because of these mixing elements proacutepolis has a complex
chemical composition and various bioactive properties one of them are the antioxidant activity
Since a few years the food with antioxidant properties have become important due to its health benefit
so proacutepolis also became an attractive product due to their bioactive properties However proacutepolis is
also negatively characterized by its intense flavor and odor hence the need to hide andor cancel
these two proprieties
The present study aimed at encapsulate an ethanolic proacutepolis extract of in different matrices of
polysaccharides such as chitosan gum arabic and inulin and understand whether it was feasible to
carry out this procedure based on the physicochemical properties of the product concerned Another
additional objective was to study the behavior of active compound when microparticles were released
in acidic and neutral media analogously to what may occur in the stomach and intestine
It was quantified the antioxidant activity of the proacutepolis ethanolic extract by DPPH and FRAP
methods and total phenolics by Folin-Ciacalteu method The antioxidant activity was 0191 M Trolox
g of propolis and 0251 M Trolox g of propolis from DPPH and FRAP methods respectively To total
phenolics content was 443 mg GAE g of proacutepolis
After the encapsulation process by drying process different microparticles were obtained Gum
arabica with proacutepolis (GA) Chitosan with proacutepolis (Q1) Chitosan with citric acid and proacutepolis (Q2)
Inulin with proacutepolis (I)
Microparticles were characterized in terms of shape and size In general microparticles containing
proacutepolis had a spherical shape and a smooth surface Regarding the mean diameter it ranged
between this 5 and 25 μmIt was observed that the average size of the microparticles increased when
proacutepolis was encapsulated regarding to empty particles
This study also showed that the microparticles with proacutepolis still presented antioxidant activity
depending the value on the encapsulating matrix The degree of encapsulation of various
microparticles containing proacutepolis were GA=656 and 895 Q1=1228 and 1752 Q2=409 and 682
I=1866 and 3555 mg GAE g of particles by Folin ndash Ciacalteu method and direct method
respectively The antioxidant activity values obtained by DPPH method were 0169 0232 0092 and
0572 M Trolox g of particles for the FRAP method the values were 0036 07 0187 and 0896 M
Trolox g of particles for GA Q1 Q2 and I respectively
Release studies were performed in acidic medium (pH = 12) and neutral medium (pH = 70) It was
found that the release of bioactive compounds was low in both media however there was a greater
release in the neutral medium The release by gum arabic microparticles be smaller than the other
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
V
matrices in acid media and be higher in the neutral media The different chemical composition of Gum
arabica for other matrices should be the main factor for this behavior
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VI
Iacutendice
Agradecimentos I
ResumoII
Abstract III
Extended Abstract IV
Lista de Figuras IX
Lista de Tabelas X
Lista de Abreviaturas XI
I Introduccedilatildeo e Objectivos 1
II Enquadramento Teoacuterico 2
1 Proacutepolis 2
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica 2
12 Propriedades Farmacoloacutegicas 3
13 Produtos com Proacutepolis 3
2 Actividade Antioxidante 4
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 4
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu 5
212 Meacutetodo Directo 5
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 5
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH 5
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP 6
3 Microencapsulaccedilatildeo 7
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo 7
311 Etapas do Processo 8
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo 9
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo 11
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes 11
321 Goma-Araacutebica 12
322 Inulina 12
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
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X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
III
Abstract
Proacutepolis is a resin produced by bees which has several bioactive properties the most important being
its antioxidant activity In the present work we proceeded to the microencapsulation by spray drying
of a proacutepolis ethanolic extract by using gum arabic inulin and chitosan as a coating material The
ethanol extract analyzed proacutepolis presented a quantity of phenolic compounds of about 443 mg GAE
g In relation to the antioxidant activity that was 0191 M Trolox g of propolis and 0251 M Trolox g
of propolis by DPPH method and FRAP respectively Compounds encapsulated in microparticles
have continued to antioxidant activity Microencapsulation of proacutepolis in different matrices produced
spherical microparticles having a smooth surface their size varied between 5 and 25 micrometers
Regarding the controlled release of phenolic compounds the release by gum arabic microparticles be
smaller than the other matrices in acid media and be higher in the neutral media It was observed that
the phenolic compounds release from the microparticles was low in both media however in neutral
medium there it was a greater than in acidic medium
Keywords proacutepolis antioxidant activity spray-drying gum arabic inulin chitosan
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IV
Extended Abstract
Proacutepolis is a natural resin produced by bees composed of several resinous and balsamic substance
sap flowers bee saliva pollen and wax Because of these mixing elements proacutepolis has a complex
chemical composition and various bioactive properties one of them are the antioxidant activity
Since a few years the food with antioxidant properties have become important due to its health benefit
so proacutepolis also became an attractive product due to their bioactive properties However proacutepolis is
also negatively characterized by its intense flavor and odor hence the need to hide andor cancel
these two proprieties
The present study aimed at encapsulate an ethanolic proacutepolis extract of in different matrices of
polysaccharides such as chitosan gum arabic and inulin and understand whether it was feasible to
carry out this procedure based on the physicochemical properties of the product concerned Another
additional objective was to study the behavior of active compound when microparticles were released
in acidic and neutral media analogously to what may occur in the stomach and intestine
It was quantified the antioxidant activity of the proacutepolis ethanolic extract by DPPH and FRAP
methods and total phenolics by Folin-Ciacalteu method The antioxidant activity was 0191 M Trolox
g of propolis and 0251 M Trolox g of propolis from DPPH and FRAP methods respectively To total
phenolics content was 443 mg GAE g of proacutepolis
After the encapsulation process by drying process different microparticles were obtained Gum
arabica with proacutepolis (GA) Chitosan with proacutepolis (Q1) Chitosan with citric acid and proacutepolis (Q2)
Inulin with proacutepolis (I)
Microparticles were characterized in terms of shape and size In general microparticles containing
proacutepolis had a spherical shape and a smooth surface Regarding the mean diameter it ranged
between this 5 and 25 μmIt was observed that the average size of the microparticles increased when
proacutepolis was encapsulated regarding to empty particles
This study also showed that the microparticles with proacutepolis still presented antioxidant activity
depending the value on the encapsulating matrix The degree of encapsulation of various
microparticles containing proacutepolis were GA=656 and 895 Q1=1228 and 1752 Q2=409 and 682
I=1866 and 3555 mg GAE g of particles by Folin ndash Ciacalteu method and direct method
respectively The antioxidant activity values obtained by DPPH method were 0169 0232 0092 and
0572 M Trolox g of particles for the FRAP method the values were 0036 07 0187 and 0896 M
Trolox g of particles for GA Q1 Q2 and I respectively
Release studies were performed in acidic medium (pH = 12) and neutral medium (pH = 70) It was
found that the release of bioactive compounds was low in both media however there was a greater
release in the neutral medium The release by gum arabic microparticles be smaller than the other
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
V
matrices in acid media and be higher in the neutral media The different chemical composition of Gum
arabica for other matrices should be the main factor for this behavior
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VI
Iacutendice
Agradecimentos I
ResumoII
Abstract III
Extended Abstract IV
Lista de Figuras IX
Lista de Tabelas X
Lista de Abreviaturas XI
I Introduccedilatildeo e Objectivos 1
II Enquadramento Teoacuterico 2
1 Proacutepolis 2
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica 2
12 Propriedades Farmacoloacutegicas 3
13 Produtos com Proacutepolis 3
2 Actividade Antioxidante 4
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 4
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu 5
212 Meacutetodo Directo 5
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 5
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH 5
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP 6
3 Microencapsulaccedilatildeo 7
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo 7
311 Etapas do Processo 8
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo 9
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo 11
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes 11
321 Goma-Araacutebica 12
322 Inulina 12
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IV
Extended Abstract
Proacutepolis is a natural resin produced by bees composed of several resinous and balsamic substance
sap flowers bee saliva pollen and wax Because of these mixing elements proacutepolis has a complex
chemical composition and various bioactive properties one of them are the antioxidant activity
Since a few years the food with antioxidant properties have become important due to its health benefit
so proacutepolis also became an attractive product due to their bioactive properties However proacutepolis is
also negatively characterized by its intense flavor and odor hence the need to hide andor cancel
these two proprieties
The present study aimed at encapsulate an ethanolic proacutepolis extract of in different matrices of
polysaccharides such as chitosan gum arabic and inulin and understand whether it was feasible to
carry out this procedure based on the physicochemical properties of the product concerned Another
additional objective was to study the behavior of active compound when microparticles were released
in acidic and neutral media analogously to what may occur in the stomach and intestine
It was quantified the antioxidant activity of the proacutepolis ethanolic extract by DPPH and FRAP
methods and total phenolics by Folin-Ciacalteu method The antioxidant activity was 0191 M Trolox
g of propolis and 0251 M Trolox g of propolis from DPPH and FRAP methods respectively To total
phenolics content was 443 mg GAE g of proacutepolis
After the encapsulation process by drying process different microparticles were obtained Gum
arabica with proacutepolis (GA) Chitosan with proacutepolis (Q1) Chitosan with citric acid and proacutepolis (Q2)
Inulin with proacutepolis (I)
Microparticles were characterized in terms of shape and size In general microparticles containing
proacutepolis had a spherical shape and a smooth surface Regarding the mean diameter it ranged
between this 5 and 25 μmIt was observed that the average size of the microparticles increased when
proacutepolis was encapsulated regarding to empty particles
This study also showed that the microparticles with proacutepolis still presented antioxidant activity
depending the value on the encapsulating matrix The degree of encapsulation of various
microparticles containing proacutepolis were GA=656 and 895 Q1=1228 and 1752 Q2=409 and 682
I=1866 and 3555 mg GAE g of particles by Folin ndash Ciacalteu method and direct method
respectively The antioxidant activity values obtained by DPPH method were 0169 0232 0092 and
0572 M Trolox g of particles for the FRAP method the values were 0036 07 0187 and 0896 M
Trolox g of particles for GA Q1 Q2 and I respectively
Release studies were performed in acidic medium (pH = 12) and neutral medium (pH = 70) It was
found that the release of bioactive compounds was low in both media however there was a greater
release in the neutral medium The release by gum arabic microparticles be smaller than the other
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
V
matrices in acid media and be higher in the neutral media The different chemical composition of Gum
arabica for other matrices should be the main factor for this behavior
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VI
Iacutendice
Agradecimentos I
ResumoII
Abstract III
Extended Abstract IV
Lista de Figuras IX
Lista de Tabelas X
Lista de Abreviaturas XI
I Introduccedilatildeo e Objectivos 1
II Enquadramento Teoacuterico 2
1 Proacutepolis 2
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica 2
12 Propriedades Farmacoloacutegicas 3
13 Produtos com Proacutepolis 3
2 Actividade Antioxidante 4
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 4
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu 5
212 Meacutetodo Directo 5
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 5
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH 5
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP 6
3 Microencapsulaccedilatildeo 7
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo 7
311 Etapas do Processo 8
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo 9
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo 11
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes 11
321 Goma-Araacutebica 12
322 Inulina 12
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
V
matrices in acid media and be higher in the neutral media The different chemical composition of Gum
arabica for other matrices should be the main factor for this behavior
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VI
Iacutendice
Agradecimentos I
ResumoII
Abstract III
Extended Abstract IV
Lista de Figuras IX
Lista de Tabelas X
Lista de Abreviaturas XI
I Introduccedilatildeo e Objectivos 1
II Enquadramento Teoacuterico 2
1 Proacutepolis 2
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica 2
12 Propriedades Farmacoloacutegicas 3
13 Produtos com Proacutepolis 3
2 Actividade Antioxidante 4
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 4
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu 5
212 Meacutetodo Directo 5
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 5
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH 5
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP 6
3 Microencapsulaccedilatildeo 7
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo 7
311 Etapas do Processo 8
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo 9
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo 11
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes 11
321 Goma-Araacutebica 12
322 Inulina 12
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
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313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
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322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
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diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VI
Iacutendice
Agradecimentos I
ResumoII
Abstract III
Extended Abstract IV
Lista de Figuras IX
Lista de Tabelas X
Lista de Abreviaturas XI
I Introduccedilatildeo e Objectivos 1
II Enquadramento Teoacuterico 2
1 Proacutepolis 2
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica 2
12 Propriedades Farmacoloacutegicas 3
13 Produtos com Proacutepolis 3
2 Actividade Antioxidante 4
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 4
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu 5
212 Meacutetodo Directo 5
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 5
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH 5
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP 6
3 Microencapsulaccedilatildeo 7
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo 7
311 Etapas do Processo 8
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo 9
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo 11
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes 11
321 Goma-Araacutebica 12
322 Inulina 12
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
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27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
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28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
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29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
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30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
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32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
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36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VII
323 Quitosano 13
33 Estrutura das Micropartiacuteculas 14
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados 16
III Desenvolvimentos Experimental 19
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 19
11 Preparaccedilatildeo das Amostras 19
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos 19
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante 20
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis 21
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees 21
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica 21
212 Soluccedilatildeo de Inulina 22
213 Soluccedilatildeo de Quitosano 22
22 Condiccedilotildees do Processo de Secagem 23
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 24
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 24
32 Extracccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis 24
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 25
IV Resultados e Discussatildeo 27
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos atraveacutes do Meacutetodo Folin-Ciacalteu 27
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis 27
21 Meacutetodo DPPH 27
22 Meacutetodo FRAP 28
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas 30
31 Morfologia das Micropartiacuteculas 30
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 30
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 31
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 32
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 33
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
VIII
32 Tamanho das Micropartiacuteculas 34
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica 34
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano 35
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico 35
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina 36
33 Grau de Encapsulamento 37
34 Actividade Antioxidante das Micropartiacuteculas 38
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados 39
61 Libertaccedilatildeo em meio Aacutecido 39
62 Libertaccedilatildeo em meio Neutro 41
V Conclusotildees 43
VI Trabalho Futuro 44
VII Referecircncias Bibliograacuteficas 45
VIII Anexos 51
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
IX
Lista de Figuras
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis
c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccediladoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
Figura 2 Spray Dryer LabPlant SD-05helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 3 Spray Dryerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
Figura 5 Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200
x d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 200 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo a) 500 x b) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x
d) 1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip32
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d)
1000 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
Figura 9 Microcaacutepsula de Inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 xhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a)Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas Ihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA -
Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido
ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio
neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 -
Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfatohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
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3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
X
Lista de Tabelas
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Spray-Drying1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-dryinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
Tabela 7 Actividade Antioxidante das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAPhelliphelliphellip38
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos de e velocidade inicial das diferentes
micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
XI
Lista de Abreviaturas
Abs Absorvacircncia
Ag Aacutecido Gaacutelico
DPPH 22-diphenyl-1-picrylhydrazyl
EAG Equivalentes em Aacutecido Gaacutelico
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica
GA Micropartiacuteculas de goma-araacutebica com proacutepolis
I Micropartiacuteculas de inulina
I Micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano
Q1 Micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico
Q2 Micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato
Q3 Micropartiacuteculas de quitosano com tripolifosfato e proacutepolis
RSA Radical Scavenging Activity
SEM Scanning Electron Microscopy
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TPTZ 246-tryridyl-s-triazina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
1
I Introduccedilatildeo e Objectivos
De forma a melhorar a qualidade de vida e ajudar na longevidade de vida das pessoas a comunidade
cientiacutefica tem vindo a estudar novas tecnologias e produtos capazes de responder a esses
propoacutesitos
Dos vaacuterios compostos existentes nos frutos e vegetais os antioxidantes satildeo os que mais tecircm captado
a atenccedilatildeo dos investigadores devido agraves suas propriedades fiacutesico-quiacutemicas aleacutem dos seus benefiacutecios
para a sauacutede Estudos realizados comprovam que a ingestatildeo de antioxidantes contribui para a
diminuiccedilatildeo do risco de doenccedilas cardiovasculares e cancro sendo tambeacutem anti-inflamatoacuterio e tendo
ainda outras indicaccedilotildees terapecircuticas
Existem antioxidantes naturais tais como as vitaminas os compostos fenoacutelicos e os carotenoacuteides no
entanto tambeacutem existem antioxidantes sinteacuteticos tanto uns como outros satildeo utilizados na induacutestria
alimentar para retardar o processo de oxidaccedilatildeo dos alimentos
De entre os diversos alimentos e ou produtos que apresentam propriedades antioxidantes o proacutepolis
eacute um dos produtos que tem vindo a ser foco de estudo O proacutepolis eacute uma resina natural produzida
pelas abelhas apresenta uma complexa composiccedilatildeo quiacutemica o que lhe confere propriedades
bioactivas entre outras Duas das caracteriacutesticas que tornam este produto sensorialmente
desagradaacutevel satildeo o seu aroma e odor intensos havendo a necessidade de diminuir eou atenuar
estes atributos
A evoluccedilatildeo da tecnologia permitiu com o tempo desenvolver teacutecnicas capazes de aprisionar
substacircncias eou compostos dentro de materiais de forma a obter-se microcaacutepsulas A teacutecnica de
microencapsulaccedilatildeo permite a obtenccedilatildeo de microcaacutepsulas que protegem o composto com
propriedades bioactivas do meio ambiente envolvente
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo sendo a teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo uma
das mais utilizadas devido ao seu custo e agraves vaacuterias vantagens do equipamento e da sua utilizaccedilatildeo
O presente trabalho teve como objectivos encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis em matrizes de
polissacaacuteridos como o quitosano a goma-araacutebica e a inulina compreender a viabilidade de realizar
este procedimento tendo por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas do produto em causa analisar as
microcaacutepsulas quanto agrave sua forma e tamanho avaliar a actividade antioxidante e a quantidade de
compostos fenoacutelicos apoacutes a microencapsulaccedilatildeo do proacutepolis nas diferentes matrizes e por fim o
estudo do perfil de libertaccedilatildeo dos compostos encapsulados quando as diferentes matrizes contendo
proacutepolis eram colocadas em meio aacutecido e meio neutro de forma anaacuteloga ao que pode ocorrer no
estocircmago e no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
2
II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
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3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
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4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
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5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
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3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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II Enquadramento Teoacuterico
1 Proacutepolis
A palavra Proacutepolis tem origem etimoloacutegica greco-latina onde proacute tem o sentido de em defesa de e
polis significa cidade sendo uma substacircncia utilizada pelas abelhas para cobrir consolidar e calafetar
as fendas e paredes irregulares da colmeia (Matsuno 1997)
O proacutepolis eacute uma substacircncia resinosa recolhida pelas abelhas de brotos e exsudados resinosos de
algumas plantas (pinheiros asbestos aacutelamos beacutetalas carvalhos laranjais castanheiros faias
ulmeiros chorotildees eucaliptos e outras espeacutecies) (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) A sua cor eacute
predominantemente castanho-escuro mas pode variar ateacute amarelo claro (Burdock 1998) As suas
propriedades mecacircnicas dependem da temperatura apresentando um comportamento viscoelaacutestico a
temperaturas elevadas (acima de 30 ˚C) sendo riacutegido e quebradiccedilo a baixas temperaturas (abaixo de
15 ˚C) (Matsuno 1997)
Existem duas teorias que tentam explicar a origem do proacutepolis Uma tem por base de que o produto eacute
elaborado por abelhas com mais de 15 dias de vida e que resulta da recolha de substacircncias
balsacircmicas e resinosas existentes nos ramos e troncos de aacutervores A outra teoria defende que o
proacutepolis eacute um produto que resulta da digestatildeo dos gratildeos de poacutelen que as abelhas recolhem das flores
(Matsuno 1997)
11 Composiccedilatildeo Quiacutemica
O proacutepolis eacute constituiacutedo por diversos componentes designadamente substacircncias resinosas e
balsacircmicas outros provenientes da seiva das flores da saliva da abelha do poacutelen e da cera
(Matsuno 1997)
A sua composiccedilatildeo quiacutemica eacute complexa e variaacutevel dependendo da origem das espeacutecies botacircnicas e
da sua colheita da quantidade de poacutelen e ceras presentes e da quantidade de secreccedilotildees da abelha
utilizada no seu processo de transformaccedilatildeo (Matsuno 1997 Barbarić et al 2011) No entanto eacute
referido que o proacutepolis eacute constituiacutedo por 50 de substacircncias resinosas e balsacircmicas 25 a 35 de
ceras 10 de oacuteleos essenciais 5 de gratildeos de poacutelen e 5 de outras substacircncias orgacircnicas e
minerais (Matsuno 1997)
Dos estudos realizados ao proacutepolis foram identificados mais de 180 compostos principalmente
polifenoacuteis destes a maior parte satildeo flavonoacuteides (pinostrobina quercetina pinobanquesina) aos quais
estatildeo associados aacutecidos fenoacutelicos (aacutecidos benzoacuteico gaacutelico feruacutelico e cafeico) vitaminas (vitamina C
e E proacute-vitamina A e vitaminas do grupo B) aacutecidos gordos natildeo saturados compostos terpeacutenicos e
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
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DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
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27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
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28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
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30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
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32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
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35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
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36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
3
minerais (caacutelcio potaacutessio soacutedio manganecircs ferro alumiacutenio foacutesforo siliacutecio vanaacutedio e estrocircncio)
(Matsuno 1997 Barbarić et al 2011)
O proacutepolis eacute ainda constituiacutedo por 29 tipos de substacircncias volaacuteteis o que confere odores
caracteriacutesticos e um grande complexo de fragracircncias ao seu perfil de aroma (Branco 2001)
12 Propriedades Farmacoloacutegicas
Historicamente o proacutepolis era utilizado na medicina para tratar diversas doenccedilas Devido aos diversos
compostos presentes no proacutepolis este era utilizado como faacutermaco para ajudar no tratamento de
doenccedilas como a tuberculose renal profilaxia de lesotildees no colo do uacutetero colite subaguda e na colite
croacutenica hipertensatildeo inflamaccedilotildees vaginais e do colo do uacutetero otorrinolaringologia bronquite natildeo
especiacutefica pneumonia e tuberculose laringite e rinofaringite croacutenica rinite croacutenica tiroacuteide (boacutecio) a
doenccedila de Leiner-Moussous doenccedilas dermatoloacutegicas (tricofitia e sicose hiperqueratose e
epidermofitose queimaduras e queda do cabelo) (Matsuno 1997 Branco 2001)
Com os avanccedilos tecnoloacutegicos e estudos realizados ao proacutepolis foi possiacutevel constatar que este
apresenta uma elevada concentraccedilatildeo de flavonoacuteides o que lhe atribuiacute poder antioxidante anti-
inflamatoacuterio antibacteriano e anticanceriacutegeno (Mohammadzadeh et al 2007 Barbarić et al 2011)
13 Produtos com Proacutepolis
O proacutepolis pode apresentar-se em bruto em extracto ou em soluccedilatildeo aquosa ou etanolica No entanto
existem muitos outros produtos que apresentam proacutepolis na sua composiccedilatildeo por exemplo sprays
pomadas cremes rebuccedilados pastilhas elaacutesticas shampoos gel de banho e sabonetes Na figura 1
estatildeo representados alguns exemplos de produtos onde o proacutepolis se encontra presente (Matsuno
1997 Branco 2001)
Figura 1 Exemplos de produtos formados por proacutepolis a) Proacutepolis em bruto b) Extracto de proacutepolis c) Gel para o rosto d) Pasta dentiacutefrica e) Rebuccedilados
a) b) c) d) e)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
4
2 Actividade Antioxidante
Halliwell e Guterridge (1995) definiram um antioxidante como qualquer substacircncia que quando
presente em baixas concentraccedilotildees em comparaccedilatildeo com as de um substrato oxidaacutevel diminui
significativamente ou evita a oxidaccedilatildeo do referido substrato (Benzie e Strain 1999)
Durante o processo metaboacutelico satildeo produzidas espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) tais como o
radical superoacutexido (O2-) o radical hidroxilo (OH) e o radical peroacutexilo (ROO) Os mesmos satildeo
responsaacuteveis pela oxidaccedilatildeo de liacutepidos proteiacutenas e aacutecidos nucleicos podendo levar ao aparecimento
de doenccedilas croacutenicas doenccedilas coronaacuterias arteriosclerose cancro entre outras (Wong et al 2006) A
forma de evitaratenuar o efeito destes radicais eacute consumindo alimentos ricos em antioxidantes De
um modo geral os antioxidantes tecircm a capacidade de doar um aacutetomo de hidrogeacutenio ou um electratildeo e
de desemparelhar electrotildees devido agrave sua estrutura aromaacutetica Assim os antioxidantes satildeo capazes
de proteger as moleacuteculas bioloacutegicas das oxidaccedilotildees sendo importante estudar e avaliar a sua
actividade (Fernandez-Panchos et al 2008)
Existem diversas teacutecnicas para avaliar o potencial antioxidante de uma substacircncia A partir da
definiccedilatildeo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) eacute possiacutevel determinar a actividade
antioxidante de uma substacircncia utilizando o reagente Trolox como padratildeo
Existem diversos meacutetodos que utilizam o trolox como padratildeo No presente trabalho abordou-se a
quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu e do meacutetodo directo e a
avaliaccedilatildeo da actividade antioxidante atraveacutes do meacutetodo baseado na captaccedilatildeo de radicais (DPPH) e
do meacutetodo de oxidaccedilatildeo do ferro (FRAP)
21 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos Totais
211 Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
Os compostos fenoacutelicos satildeo um grupo de antioxidantes muito importantes e especiacutefico satildeo formados
por um grupo hidroxilo ligado a um grupo hidrocarboneto aromaacutetico Com base no nuacutemero de
unidades de fenol existente os compostos fenoacutelicos podem ser classificados como fenoacuteis simples ou
polifenoacuteis
Um dos meacutetodos mais utilizados para quantificar os compostos fenoacutelicos eacute o meacutetodo de Folin-
Ciacalteu Este meacutetodo resulta da adaptaccedilatildeo do meacutetodo de Folin-Denis no qual se adicionou sulfato
de liacutetio para evitar precipitaccedilotildees tornando este meacutetodo mais sensiacutevel a compostos fenoacutelicos
(Hemingway et al 1992 Zhang et al 2006)
No meacutetodo de Folin-Ciacalteu o reagente de Folin formado por heteropoliaacutecidos e por aacutecidos
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) quando em meio de reacccedilatildeo alcalino os aacutecidos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
5
fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
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7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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fosfomolibdiacuteco (MoO42-
) e fosfotungtico (WO42-
) reduzem formando-se o azul molibdeacutenio e o azul
tungsteacutenio por outro lado ocorre a oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos (Hemingway et al 1992 Ikawa
et al 2003)
Apoacutes a reacccedilatildeo obteacutem-se uma soluccedilatildeo de cor azul que pode ser monitorizada atraveacutes de
espectrofotometria A concentraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos eacute proporcional agrave intensidade de luz
absorvida a um comprimento de onda de 760 nm onde outras espeacutecies bioloacutegicas natildeo o satildeo Os
valores de absorvacircncia normalmente satildeo comparados com uma curva padratildeo formada por aacutecido
gaacutelico O teor de fenoacutelicos totais eacute expresso geralmente em equivalentes de aacutecido gaacutelico por grama
ou por litro (Schwannecke 2009) Contudo os compostos presentes neste meacutetodo natildeo reagem
apenas com compostos fenoacutelicos podendo a presenccedila de agentes redutores interferir na anaacutelise dos
compostos e no resultado obtido (Hemingway et al 1992)
212 Meacutetodo Directo
O meacutetodo directo baseia-se na mediccedilatildeo directa da absorvacircncia atraveacutes de espectrofotometria Natildeo
havendo necessidade de fazer reagir a amostra com outros reagentes
Este meacutetodo tambeacutem conhecido de espectrofotometria UVVisiacutevel permite quantificarmedir o
processo de biodegradaccedilatildeo atraveacutes do raacutecio da absorvacircncia (Santos etal 2014)
Por norma eacute um meacutetodo bastante utilizado para a detecccedilatildeo de nitritos e nitratos utilizando um
comprimento de onda entre 200-230 nm no entanto eacute possiacutevel utilizar outros comprimentos de onda
para a detecccedilatildeo de outros compostos (Nollet 2000)
Este eacute um meacutetodo raacutepido e de baixo custo no entanto eacute um meacutetodo sensiacutevel e que pode induzir
erros Estes erros podem dever-se agrave existecircncia de interferentes presentes em soluccedilatildeo e devido agrave
presenccedila de compostos que absorvam radiaccedilatildeo num mesmo comprimento de onda que o composto a
ser analisado (Bart 2006)
22 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
221 Meacutetodo baseado na reacccedilatildeo com o radical de DPPH
Este meacutetodo consiste em fazer reagir o radical DPPH (22- Difenil-1-picrilhidrazilo) com uma soluccedilatildeo
que contenha um antioxidante ou um radical livre No caso de o DPPH reagir com um antioxidante
ocorre a cedecircncia do aacutetomo de hidrogeacutenio por parte do antioxidante para o DPPH por outro lado se
o DPPH reagir com um radical livre haveraacute a cedecircncia do electratildeo do radical para o DPPH Nas
equaccedilotildees 1 e 2 eacute possiacutevel observar a reduccedilatildeo do DPPH com um antioxidante e com um radical livre
respectivamente (Brand-Williams et al 1995 Milardović et al 2006 Lee et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
6
DPPH + AH rarr DPPH-H + A Equaccedilatildeo 1
DPPH + R rarr DPPH-R Equaccedilatildeo 2
Durante a reacccedilatildeo o radical DPPH reduz-se aumentando assim a quantidade de DPPH natildeo
disponiacutevel este aumento eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo da absorvacircncia a um comprimento de onda
entre os 515-517 nm A diminuiccedilatildeo da absorvacircncia eacute facilmente visiacutevel devido agrave mudanccedila de cor da
substacircncia Inicialmente quando haacute muito DPPH livre a soluccedilatildeo apresenta uma cor violeta escura e agrave
medida que a reacccedilatildeo vai ocorrendo o violeta vai tornando-se cada vez menos intenso Quando todo
o DPPH reage a soluccedilatildeo passa a ter uma cor amarelo paacutelida (Brand-Williams et al 1995 Milardović
et al 2006)
222 Meacutetodo baseado na oxidaccedilatildeo do ferro - FRAP
Existem antioxidantes natildeo-enzimaacuteticos que satildeo espeacutecies redutoras e tecircm a capacidade de inactivar
oxidantes atraveacutes de reacccedilotildees redox onde a espeacutecie reactiva eacute reduzida devido agrave oxidaccedilatildeo do
antioxidante Neste caso o poder redutor eacute o mesmo que o poder antioxidante Uma forma de avaliar
o poder redutor eacute atraveacutes de um meacutetodo colorimeacutetrico utilizando um oxidante em excesso
estequiomeacutetrico que seja facilmente reduziacutevel No entanto o meacutetodo mais utilizado eacute o poder
oxidanteredutor do ferro (FRAP)onde os antioxidantes satildeo utilizados como redutores no meacutetodo
colorimeacutetrico (Benzie e Strain 1996)
Quando o complexo tripyridyltriazine feacuterrico (FeIII-TPTZ) eacute colocado num meio reaccional de pH baixo
o complexo reduz-se para a sua forma ferrosa (FeII) Assim um meio reaccional cujo potencial redox
seja mais baixo do que o meio de reacccedilatildeo feacuterricoferroso ocorreraacute a conversatildeo do complexo feacuterrico
(FeIII) em ferroso (Fe
II)
A soluccedilatildeo formada apresenta uma tonalidade azul escura e a leitura da sua absorvacircncia pode ser
realizada atraveacutes de espectrofotometria a um comprimento de onda de 593 nm A variaccedilatildeo da
absorvacircncia estaacute directamente relacionada com o potencial de reduccedilatildeo no qual os electrotildees satildeo
doados aos antioxidantes presentes na reacccedilatildeo (Benzie e Strain 1996 1999)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
7
3 Microencapsulaccedilatildeo
A microencapsulaccedilatildeo eacute um processo no qual um composto com caracteriacutesticas especiacuteficas
designado por core eacute revestido por um material de revestimento que forma uma barreira wall sob a
forma de pequenas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007)
Este processo promove uma barreira fiacutesico-quiacutemica entre o core e o ambiente externo protegendo
assim o material core Por outro lado torna-se possiacutevel promover uma libertaccedilatildeo controlada do
composto encapsulado mascarar o sabor eou flavour do material encapsulado e ainda diluir
pequeniacutessimas quantidades de material encapsulado Por estas razotildees a induacutestria alimentar e
farmacecircutica recorrem cada vez mais ao processo de microencapsulaccedilatildeo (Shahidi et al 1993
Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversas teacutecnicas de microencapsulaccedilatildeo tais como spray-drying spray-cooling spray-
chilling extrusatildeo liofilizaccedilatildeo coacervaccedilatildeo co-cristalizaccedilatildeo aprisionamento em lipossomas
polimerizaccedilatildeo interfacial inclusatildeo molecular entre outros (Gharsallaoui et al 2007 Jyothi et al
2010)
Neste trabalho a teacutecnica utilizada para encapsular o proacutepolis foi o processo de secagem por
atomizaccedilatildeo
31 Processo de Secagem por Atomizaccedilatildeo
A teacutecnica de secagem por atomizaccedilatildeo tambeacutem conhecida por spray-drying surgiu em 1930 sendo
utilizada para encapsular flavours utilizando a goma-araacutebica como material de revestimento Esta eacute
uma das teacutecnicas mais comuns utilizadas para encapsular produtos para alimentos devido ao seu
baixo custo e disponibilidade do equipamento (Shahidi et al 1993)
De um modo geral o processo de spray-drying consiste numa operaccedilatildeo unitaacuteria na qual um produto
liacutequido eacute atomizado numa corrente de gaacutes quente obtendo-se seguidamente as micropartiacuteculas por
secagem das gotas A alimentaccedilatildeo liacutequida inicial eacute por norma uma soluccedilatildeo emulsatildeo ou suspensatildeo
Os gases mais utilizados satildeo o ar ou um gaacutes inerte (azoto)
Esta teacutecnica permite obter um produto com propriedades fiacutesico-quiacutemicas especiacuteficas diminuir o teor
de aacutegua e a sua actividade assegurando assim a estabilidade microbioloacutegica do produto diminuindo o
risco de degradaccedilatildeo quiacutemica e bioloacutegica e por fim diminuir os custos de armazenamento e de
transporte (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
8
311 Etapas do Processo
O processo de spray-drying eacute constituiacutedo por quatro etapas a atomizaccedilatildeo o contacto das partiacuteculas
com o ar quente a evaporaccedilatildeo da aacutegua das partiacuteculas e por fim a separaccedilatildeo do produto seco e do ar
huacutemido
A atomizaccedilatildeo do liacutequido eacute realizada atraveacutes de pressatildeo ou de energia centriacutefuga para isso eacute
necessaacuterio um atomizador um dispositivo capaz de produzir uma fina pulverizaccedilatildeo de um liacutequido
Existem diversos tipos de atomizadores sendo a escolha deste influenciada pela composiccedilatildeo e a
viscosidade do liacutequido de alimentaccedilatildeo e as caracteriacutesticas desejadas no produto final (Masters
1997)
A etapa seguinte consiste no contacto das partiacuteculas com o ar quente e inicia-se durante a
atomizaccedilatildeo Este contacto pode ser realizado em co-corrente ou contracorrente No processo em co-
corrente o liacutequido eacute atomizado na mesma direcccedilatildeo em que o ar quente passa normalmente a uma
temperatura que varia entre os 150 a 200 ˚C A evaporaccedilatildeo da aacutegua eacute instantacircnea e as partiacuteculas
obtidas satildeo de seguida expostas a temperaturas de 50 a 80 ˚C natildeo havendo assim degradaccedilotildees
teacutermicas substanciais No processo em contra corrente o liacutequido de alimentaccedilatildeo eacute atomizado na
direcccedilatildeo oposta agrave direcccedilatildeo do ar quente o que leva a que o produto seco esteja mais tempo exposto
a altas temperaturas obtendo-se um produto final mais termo sensiacutevel a vantagem deste processo eacute
o facto de ser mais econoacutemico em termos de consumo de energia (Fleming 1921)
Durante a evaporaccedilatildeo da aacutegua produz-se um gradiente de temperatura e de pressatildeo parcial de aacutegua
entre a fase liacutequida e a fase gasosa A transferecircncia de calor ocorre no sentido do ar quente para o
produto por outro lado a diferenccedila de temperatura e de pressatildeo de vapor leva a que a aacutegua seja
transferida no sentido contraacuterio (Gharsallaoui et al 2007)
O ar quente ao contactar com as partiacuteculas liacutequidas promove o aumento da temperatura ateacute um valor
constante no interior dessas mesmas partiacuteculas De seguida ocorre a evaporaccedilatildeo das gotiacuteculas de
aacutegua a uma temperatura e a uma pressatildeo parcial de vapor de aacutegua constantes A taxa de difusatildeo da
aacutegua desde o nuacutecleo ateacute agrave superfiacutecie eacute normalmente constante e igual agrave taxa de evaporaccedilatildeo
superficial Por fim forma-se um revestimento na superfiacutecie da partiacutecula pois o teor de aacutegua na
partiacutecula atinge o valor critico a velocidade de secagem diminui agrave medida que se vai formando o
revestimento e a difusatildeo da aacutegua tambeacutem diminui Termina o processo de secagem e a temperatura
das partiacuteculas torna-se igual agrave temperatura do ar
As vaacuterias etapas deste do processo de secagem podem apresentar diferentes tempos de duraccedilatildeo
conforme as caracteriacutesticas iniciais do produto e a temperatura do ar de entrada Assim se a
temperatura do ar de entrada for elevada forma-se mais rapidamente a massa seca (revestimento)
devido agrave elevada taxa de evaporaccedilatildeo de aacutegua pois a superfiacutecie da partiacutecula liacutequida eacute superior ao
volume (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
9
A uacuteltima etapa do processo de spray-drying eacute designada de separaccedilatildeo do ar huacutemido do produto seco
e tem lugar no interior de um ciclone O spray-drying pode ser equipado ainda com dois filtros com o
objectivo de remover as micropartiacuteculas natildeo recolhidas no ciclone antes de libertar o ar de secagem
para a atmosfera A forma final das partiacuteculas depende da composiccedilatildeo inicial do liacutequido de
aliementaccedilatildeo do teor de aacutegua e do gaacutes presente nas partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007 Fang et al
2012)
312 Processo de Microencapsulaccedilatildeo
O processo de microencapsulaccedilatildeo eacute formado pelas etapas de preparaccedilatildeo da soluccedilatildeo dispersatildeo ou
emulsatildeo contendo os componentes a encapsular e o material de revestimentos a atomizaccedilatildeo do
liacutequido de alimentaccedilatildeo dentro da cacircmara de secagem e a desidrataccedilatildeo das gotas (Shahidi et al
1993)
No que diz respeito agrave etapa de preparaccedilatildeo da amostra a encapsular se o material a encapsular for
de natureza hidrofoacutebica este eacute disperso numa soluccedilatildeo que conteacutem o material de revestimento
formando-se uma emulsatildeo Pode ser necessaacuterio adicionar um emulsionante conforme as
propriedades do material de revestimento pois este pode ter actividade interfacial Eacute de referir que as
propriedades fiacutesicas e quiacutemicas da emulsatildeo formada vatildeo interferir no processo de
microencapsulaccedilatildeo A emulsatildeo formada deve ser estaacutevel durante um determinado periacuteodo de tempo
as gotas de oacuteleo devem ser pequenas e a viscosidade baixa de forma a natildeo haver inclusatildeo de ar nas
partiacuteculas formadas por outro lado a viscosidade natildeo deve ser elevada para natildeo ocorrer o
alongamento e aumento do tamanho das partiacuteculas (Gharsallaoui et al 2007) Por outro lado o
material do revestimento ou do core pode apresentar-se em suspensatildeo na soluccedilatildeo aquosa Quando
ambos os materiais satildeo soluacuteveis no meio aquoso temos uma soluccedilatildeo
As etapas de atomizaccedilatildeo e de desidrataccedilatildeo das partiacuteculas ocorrem simultaneamente A fonte de
alimentaccedilatildeo eacute atomizada atraveacutes de um fluxo de ar quente fornecido agrave cacircmara de secagem
ocorrendo de seguida a evaporaccedilatildeo da aacutegua formando-se assim as micropartiacuteculas (Gharsallaoui et
al 2007) O tempo de exposiccedilatildeo das partiacuteculas ao ar quente eacute curto havendo uma evaporaccedilatildeo
raacutepida da aacutegua mantendo assim a temperatura do nuacutecleo abaixo de 40˚C (Fang e Bhandari 2012)
As condiccedilotildees de funcionamento satildeo importantes para uma boa eficiecircncia de microencapsulaccedilatildeo para
isso eacute necessaacuterio optimizar e controlar a temperatura de alimentaccedilatildeo temperatura do ar de entrada
a concentraccedilatildeo de soacutelidos da alimentaccedilatildeo e a razatildeo entre a concentraccedilatildeo do core e do material de
revestimento (Liu et al 2004)
A temperatura de alimentaccedilatildeo diminui a viscosidade da soluccedilatildeo dispersatildeo ou emulsatildeo o que altera a
capacidade de aspersatildeo do atomizador podendo esta natildeo ser de forma homogeacutenea A elevada
temperatura de alimentaccedilatildeo promove a diminuiccedilatildeo da sua viscosidade e do tamanho das partiacuteculas
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
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32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
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35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
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36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
Aliyazıcıoglu R Sahin H Erturk O Ulusoy E Kolayli S (2013) Properties of Phenolic
Composition and Biological Activity of Propolis from Turkey International Journal of Food Properties
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
10
Figura 3 Spray-dryer (adaptado de Wikipedia)
A ndash Liacutequido de alimentaccedilatildeo B ndash Gaacutes de atomizaccedilatildeo 1 ndash
Entrada do gaacutes de secagem 2 ndash Aquecimento do gaacutes
de secagem 3 ndash Pulverizaccedilatildeo do liacutequido de
alimentaccedilatildeo 4 ndash Cacircmara de secagem 5 ndash Parte entre a
cacircmara de secagem e ciclone 6 - Ciclone 7 ndash Saiacuteda do
gaacutes de secagem 8 ndash Colector do produto seco
Figura 2 Spray-dryer Lab Plant SD-05
Spray-Dryer
no entanto pode levar agrave volatilizaccedilatildeo e agrave degradaccedilatildeo de compostos termo sensiacuteveis (Gharsallaoui et
al 2007)
Em relaccedilatildeo agrave temperatura do ar agrave entrada quanto esta eacute baixa a taxa de evaporaccedilatildeo eacute lenta
havendo a formaccedilatildeo de micropartiacuteculas com uma membrana superficial com elevada densidade um
elevado teor de aacutegua e com facilidade em aglomerar Por outro lado se a temperatura de entrada for
elevada a evaporaccedilatildeo pode ser excessiva o que pode levar agrave formaccedilatildeo de uma membrana
quebradiccedila e a uma libertaccedilatildeo ou exposiccedilatildeo prematura do composto encapsulado
A temperatura do ar de saiacuteda depende das caracteriacutesticas do material de secagem sendo difiacutecil
prever qual o valor com antecedecircncia Esta temperatura natildeo pode ser controlada directamente pois
depende da temperatura do ar de entrada no entanto a temperatura ideal do ar de saiacuteda deve ser na
ordem dos 50 a 80 ˚C (Liu et al 2004 Gharsallaoui et al 2007)
Assim para obter as melhores condiccedilotildees de secagem eacute necessaacuterio conciliar uma elevada
temperatura do ar com uma elevada concentraccedilatildeo de soacutelidos na alimentaccedilatildeo a uma aspersatildeo e
secagem faacuteceis para obter um produto final cujas micropartiacuteculas natildeo estejam expandidas nem com
rupturas (Fang e Bhandari 2012)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
11
313 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo
Como qualquer processo o spray-drying tem tambeacutem vantagens e desvantagens Na tabela 1
encontram-se descritas algumas vantagens e desvantagens descritas na literatura
Tabela 1 Vantagens e Desvantagens do Processo de Atomizaccedilatildeo1
Vantagens Desvantagens
Processo contiacutenuo e raacutepido
Possibilidade de controlar as
propriedades fiacutesicas do produto final
Controlo automaacutetico
Qualidade do produto constante mesmo
em larga escala
Processo versaacutetil
Partiacuteculas obtidas podem ter uma
determinada distribuiccedilatildeo de tamanho
Processo com um baixo custo mas de
elevada qualidade e estabilidade
Produccedilatildeo de microcaacutepsulas soluacuteveis e
de pequeno tamanho
As microcaacutepsulas podem natildeo ser
uniformes
Limitaccedilatildeo do material de revestimento
(baixa viscosidade mas com elevada
concentraccedilatildeo de soacutelidos)
Produto final muito fino que possa
necessitar de processamento posterior
Natildeo eacute o melhor meacutetodo para material
sensiacutevel ao calor2
1 Autores (Parikh 1997 Heldman et al 1997 Madene et al 2006 Chen et al 2008)
2 Eacute de referir que para alguns autores este meacutetodo pode ser utilizado em material sensiacutevel ao calor
pois o tempo que estatildeo sujeito a altas temperaturas eacute relativamente curto
32 Tipos de Matrizes Encapsulantes
O revestimento das partiacuteculas tem como objectivo proteger o material encapsulado do meio exterior
Dependendo das caracteriacutesticas finais que se pretende no produto final eacute necessaacuterio escolher o
material de revestimento Esta escolha tem por base as propriedades fiacutesico-quiacutemicas desse material
tais como a solubilidade o peso molecular a temperatura de transiccedilatildeo viacutetrea a capacidade de
formaccedilatildeo de peliacutecula as propriedades emulsionantes entre outras Deste modo a escolha do
material de revestimento eacute importante para a eficiecircncia da encapsulaccedilatildeo e para as propriedades e
estabilidade das micropartiacuteculas (Shahidi et al 1993 Gharsallaoui et al 2007)
Existem diversos materiais de revestimento jaacute utilizados no processo de microencapsulaccedilatildeo Por
norma polissacaacuteridos e proteiacutenas satildeo os compostos mais utilizados (Rosenberg e Sheu 1996
Dalgleish 2006) No presente trabalho apenas utilizou-se a goma-araacutebica o quitosano e a inulina
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
12
321 Goma-araacutebica
A goma-araacutebica eacute um polissacaacuterido natural produzido e extraiacutedo de duas espeacutecies de Acaacutecia a
Acacia senegal e a Acacia seyal A sua cor varia do branco-paacutelido ao laranja-acastanhado eacute um
produto comercializado sob a forma de poacute (micropartiacuteculas) flocos gracircnulos e em spray Eacute uma
substacircncia soluacutevel em aacutegua mas insoluacutevel em etanol Em termos praacuteticos eacute utilizada como
emulsionante e espessante (Phillips et al 2008)
Quimicamente a goma-araacutebica eacute constituiacuteda por uma mistura complexa de polissacaacuteridos e
glicoproteiacutenas Eacute formada por uma cadeia principal de ligaccedilotildees β-(13) galactose da qual derivam
cadeias laterais nas ligaccedilotildees (16) constituiacutedas por arabinose ramnose e aacutecido glucuroacutenico Esta
goma conteacutem ainda uma pequena porccedilatildeo de material proteico (cerca de 2) (Randall et al 1988
Osman et al 1993)
Devido agrave propriedade de produzir filmes e de ser um bom emulsionante a goma-araacutebica eacute utilizada
nos processos de encapsulaccedilatildeo tanto de aromas e flavours como de compostos volaacuteteis A pequena
fracccedilatildeo proteica presente na goma-araacutebica permite originar uma melhor emulsatildeo num sistema oacuteleo
em aacutegua (OW) se neste caso estiver presente o composto a encapsular quando esta mistura eacute
aspergida atraveacutes do spray-dryer a aacutegua eacute removida rapidamente e o composto a encapsular natildeo
permanece exposto a elevadas temperaturas durante um periacuteodo de tempo elevado (Stephen et al
2006)
Segundo a literatura alguns aromas alimentares jaacute foram encapsulados atraveacutes de spray-drying
como por exemplo oacuteleo de oreacutegatildeos oacuteleo de menta oacuteleo de laranja e de outros compostos bioactivos
capazes de enriquecer os produtos onde satildeo aplicados (Ribeiro 2007 Jun-xia et al 2011 Sarkar et
al 2013)
322 Inulina
A inulina eacute um polissacaacuterido de reserva de muitas plantas Este composto encontra-se em diversos
vegetais frutos e cereais fazendo parte da alimentaccedilatildeo diaacuteria Na europa e em outros paiacuteses a
inulina eacute classificada como uma fibra dieteacutetica
Existem diversas fontes de produccedilatildeo de inulina aleacutem das plantas a inulina pode ser encontrada em
bacteacuterias de diferentes espeacutecies Industrialmente a chicoacuteria eacute a planta mais utilizada para a produccedilatildeo
de inulina (Stephen et al 2006)
Em termos quiacutemicos a inulina eacute um polissacaacuterido formado por poliacutemeros de frutose ligados por
ligaccedilotildees β-(12) frutosil-frutose havendo alguns casos onde possa existir porccedilotildees de glucose Esta eacute
caracterizada como um poacute branco inodoro o seu sabor eacute ligeiramente adocicado (10 de doccedilura
em comparaccedilatildeo com a sacarose) A inulina eacute soluacutevel em aacutegua quente e a soluccedilatildeo obtida eacute de baixa
viscosidade
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
13
A inulina eacute uma fibra dieteacutetica soluacutevel natildeo digeriacutevel e com baixo valor caloacuterico (5 KJg) sendo
adequada para diabeacuteticos Promove o crescimento de bacteacuterias beneacuteficas da flora intestinal tendo
assim um efeito prebioacutetico eacute capaz tambeacutem de aumentar a bio-disponibilidade de minerais como o
caacutelcio e o magneacutesio Aleacutem destas vantagens o consumo de inulina permite a reduccedilatildeo de trigliceacuteridos
a reduccedilatildeo do risco de cancro no coacutelon e a protecccedilatildeo contra alteraccedilotildees intestinais e infecccedilotildees
(Stephen et al 2006)
Na induacutestria alimentar a inulina eacute utilizada para substituir a gordura para dar corpo e paladar aos
alimentos e melhorar a textura eacute utilizada tambeacutem para a estabilizaccedilatildeo de espumas e de emulsotildees e
trabalha em sinergia com agentes de gelificaccedilatildeo (Stephen et al 2006) Beiratildeo-da-Costa et al (2013)
tambeacutem utilizou a inulina para microencapsular oacuteleo essencial de oreacutegatildeos Existem ainda outros
estudos num dos quais eacute microencapsulado oacuteleo essencial de alecrim e noutro estudo realizou-se a
microencapsulaccedilatildeo de bifidobacteacuterias (Fritzen-Freire et al 2012 Fernandes et al 2014)
323 Quitosano
O quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico obtido atraveacutes de desacetilaccedilatildeo alcalina do poliacutemero
quitina A quitina eacute tambeacutem um polissacaacuterido estrutural que estaacute presente em animais (crustaacuteceos
insectos) e em paredes celulares de determinados fungos e algas (Stephen et al 2006 Estevinho et
al 2013)
A moleacutecula de quitosano eacute um co-poliacutemero de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina no entanto
esta moleacutecula pode deferir quanto ao seu grau de N-acetilaccedilatildeo (40-98) e na sua massa molecular
(50-2000 kDa) (Ravi Kumar 2000 Estevinho et al 2013)
O processo de transformaccedilatildeo da quitina em quitosano eacute simples Para isso eacute aplicado um tratamento
alcalino (NaOH) agrave quitina que remove simultaneamente a proteiacutena e o grupo acetil ficando o
quitosano apenas com um grupo amina No entanto a remoccedilatildeo dos grupos acetil natildeo eacute completa
logo as moleacuteculas podem diferir em termos de grau de N-acetilaccedilatildeo (Ravi Kumar 2000 Estevinho et
al 2013) Assim o grau de acetilaccedilatildeo da quitina eacute cerca 90 isto porque prevalecem todos os grupos
acetil por outro lado como o quitosano sofre desacetilaccedilatildeo tem um grau de acetilaccedilatildeo menor que
pode ser cerca de 35 ou menos (Ravi Kumar 2000)
O quitosano eacute utilizado na induacutestria alimentar e farmacecircutica principalmente para a produccedilatildeo de
micropartiacuteculas devido a varias propriedades tais como a sua biocompatibilidade biodegrabilidade o
facto de ser natildeo toacutexico e agraves suas propriedades de adsorccedilatildeo entre outras (Ravi Kumar 2000
Estevinho et al 2013) O quitosano eacute tambeacutem considerado uma fibra dieteacutetica sendo beneacutefico na
diminuiccedilatildeo de peso na reduccedilatildeo dos niacuteveis de colesterol e reduz a absorccedilatildeo de liacutepidos Egrave um agente
antimicrobiano e o facto de formar filmes permite controlar a transferecircncia de agentes do meio
externo para os alimentos controlar a libertaccedilatildeo de antioxidantes nutrientes flavours e drogas
controlar a taxa de respiraccedilatildeo e a temperatura (Stephen et al 2006)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
14
Este polissacaacuterido eacute muitas vezes utilizado para a produccedilatildeo de filmes micropartiacuteculas e
nanopartiacuteculas devido agrave possibilidade de estabelecer ligaccedilotildees covalentes eou ioacutenicas com agentes
reticulantes
As micropartiacuteculas formadas a partir de ligaccedilotildees covalentes estabelecidas entre o agente reticulante
e o poliacutemero utilizado possuem uma matriz permanente pois as ligaccedilotildees formadas satildeo irreversiacuteveis
No entanto se as ligaccedilotildees formadas forem do tipo ioacutenicas a rede de ligaccedilotildees formadas eacute natildeo
permanente pois pode haver reversibilidade das ligaccedilotildees formadas
Existem diversos agentes reticulantes tais como aacutecido ciacutetrico e tripolifosfato sendo o tripolifosfato o
agente que estabelece ligaccedilotildees mais fortes com o quitosano
O quitosano eacute um dos materiais de revestimento que tem sido utilizado para encapsular diversos
compostos tais como β-galactosidase aacutecido gaacutelico oacuteleo essencial de pimento entre outros (Rosa et
al 2013 Dima et al 2014 Estevinho et al 2014)
33 Estrutura das Micropartiacuteculas
De um modo geral as micropartiacuteculas produzidas por spray-drying satildeo pequenas esferas uniformes
onde o material interno eacute designado por core e o material que envolve o material interno eacute designado
por revestimento ou membrana
O tamanho e a forma das micropartiacuteculas variam conforme o material de revestimento o material
encapsulado e a teacutecnica de encapsulaccedilatildeo utilizados Assim existem diferentes tipos de
micropartiacuteculas como se pode observar na figura 4 esferas rodeadas por um revestimento fino e
uniforme micropartiacuteculas irregulares devido agrave forma irregular do core vaacuterias partiacuteculas de core
agregadas e envolvidas numa matriz continua de material de revestimento um core definido mas com
vaacuterias camadas de revestimento concecircntricas (Gharsallaoui et al 2007)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
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amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
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212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
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Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
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Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
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4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
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Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
15
Figura 4 Exemplo de diferentes estruturas de micropartiacuteculas Adaptado de Gharsallaoui et al 2007
Simples Irregular
Muacuteltiplas Paredes
Matrix
Muacuteltiplos Cores
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
16
Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 3
4 Mecanismos de Libertaccedilatildeo de Encapsulados
Como foi referido anteriormente o processo de microencapsulaccedilatildeo tem como objectivo principal
encapsular compostos bioactivos em matrizes de forma a proteger o composto do ambiente externo
No entanto tambeacutem eacute necessaacuterio avaliar a forma de como o composto bioactivo se iraacute libertar apoacutes a
sua encapsulaccedilatildeo (Rahman 2007)
Inicialmente os mecanismos de libertaccedilatildeo de encapsulados surgiram com o objectivo de melhorar o
controlo da administraccedilatildeo de produtos farmacecircuticos de forma a potencializar a sua acccedilatildeo
terapecircutica (Moura 2012) Posteriormente foi possiacutevel aplicar diversos mecanismos agrave induacutestria
alimentar tendo em conta vaacuterios factores como por exemplo os materiais de revestimento e os
proacuteprios mecanismos de libertaccedilatildeo
Estes mecanismos de libertaccedilatildeo tecircm como vantagens a libertaccedilatildeo do composto activo em
determinadas zonas especiacuteficas do organismo o controlo da concentraccedilatildeo de composto activo
libertado o controlo da libertaccedilatildeo do bioactivo em determinados periacuteodos de tempo e tambeacutem eacute
possiacutevel diminuir as perdas de vitaminas e minerais durante o processamento e a cozedura (Duarte
2011 e Raimundo 2011)
Existem diversos mecanismos de libertaccedilatildeo sendo eles por difusatildeo dissoluccedilatildeo biodegradaccedilatildeo
modificaccedilatildeo do pH mecanismos teacutermicos mecacircnicos osmoacuteticos e bioquiacutemicos (Gaonkar et al
2014)
A avaliaccedilatildeo dos mecanismos de libertaccedilatildeo eacute realizada atraveacutes de taxascineacuteticas de libertaccedilatildeo
Existem diversas cineacuteticas de libertaccedilatildeo a de difusatildeo de ordem zero a difusatildeo de primeira ordem
modelo de Fickian e o modelo de Higuchi‟s (Gaonkar et al 2014)
Cineacutetica de ordem zero
De um modo geral a taxa de libertaccedilatildeo natildeo depende da concentraccedilatildeo do composto activo Assim o
aumento ou a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo natildeo aumenta ou diminui a velocidade de libertaccedilatildeo
Assim para uma taxa de libertaccedilatildeo de ordem zero a quantidade de composto bioactivo libertado eacute
proporcional ao tempo como se pode observar matematicamente pela equaccedilatildeo 3
Onde Ct eacute a quantidade de composto libertado num determinado tempo t eacute o tempo e k0 eacute a
constante de ordem zero
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
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Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
17
Equaccedilatildeo 6
Equaccedilatildeo 5
Equaccedilatildeo 4
Cineacutetica de primeira ordem
Neste caso a difusatildeo do composto activo depende da concentraccedilatildeo do composto activo A cineacutetica de
primeira ordem pode ser traduzida matematicamente atraveacutes da equaccedilatildeo 4
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo e k1 eacute a constante de primeira ordem
Modelo de Fick
Este modelo tem por base fluxos de difusatildeo onde ocorre a difusatildeo do composto bioactivo de uma
regiatildeo com elevada concentraccedilatildeo para uma de menor concentraccedilatildeo Na equaccedilatildeo 5 encontra-se
representada a lei deste modelo
Onde C eacute a quantidade de composto libertado t eacute o tempo D eacute o coeficiente de difusatildeo A eacute a aacuterea
superficial da micropartiacutecula e R eacute o raio da micropartiacutecula ΔC=CoM-C1M onde CoM eacute a concentraccedilatildeo
de composto activo no espaccedilo externo agrave micropartiacutecula e C1M eacute a concentraccedilatildeo de composto activo
no interior da micropartiacutecula
Modelo de Higuchi
De um modo geral este modelo baseia-se num estado pseudo-estacionaacuterio onde a quantidade
cumulativa libertada eacute proporcional agrave raiz quadrada do tempo Este modelo baseia-se em vaacuterias
permissas tais como
A concentraccedilatildeo inicial do composto bioactivo na matriz eacute superior agrave solubilidade na matriz
A difusatildeo ocorre a uma dimensatildeo
Nenhuma superfiacutecie encontra-se contaminada com o composto bioactivo
As partiacuteculas de composto bioactivo satildeo inferiores ao sistema microcaacutepsula
Natildeo haacute dissoluccedilatildeo nem swelling da matriz
A difusividade do composto activo eacute constante
O ambiente de libertaccedilatildeo tem de conceber condiccedilotildees perfeitas para a libertaccedilatildeo das
micropartiacuteculas
Assim pode utilizar-se a equaccedilatildeo 6 para representar o modelo de Higuchi‟s
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
18
Eacute importante referir que os mecanismos de libertaccedilatildeo e as suas respectivas taxas satildeo influenciados
por diversos factores tais como o material de revestimento a forma e geometria das micropartiacuteculas
a concentraccedilatildeo de composto encapsulado solubilidade peso molecular difusividade tempo
temperatura entre outros (Rahman 2007)
No que diz respeito a este trabalho estudou-se os mecanismos de libertaccedilatildeo controlada do composto
activo em dois meios diferentes um meio aacutecido e um meio neutro de forma a reproduzir as condiccedilotildees
no estocircmago e no intestino respectivamente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
19
III Desenvolvimento Experimental
1 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos e Determinaccedilatildeo da Actividade
Antioxidante
11 Preparaccedilatildeo da Amostra de Proacutepolis
A preparaccedilatildeo da amostra foi semelhante para todos os tipos de anaacutelise para isso dilui-se 1 μL de
extracto de proacutepolis (propex gotas ndash ortis) em 10 mL de metanol (Sigma Aldrich)
12 Quantificaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos
Meacutetodo de Folin-Ciacalteu
De iniacutecio preparou-se dois reagentes Folin-Ciacalteu (Panreac) a 025 M e o Carbonato de soacutedio
Na2CO3 (Panreac) a 1 M Em frascos acircmbar colocou-se 2400 μL de aacutegua destilada 150 μL de
amostra de proacutepolis e 150 μL de Folin (025 M) agitou-se no vortex para homogeneizar e aguardou-
se durante 3 minutos de seguida adicionou-se 300 μL de Na2CO3 (1 M) agitou-se novamente no
vortex (Velp Scientifica Itaacutelia) e deixou-se repousar no escuro durante 2 horas agrave temperatura
ambiente Ao fim desse tempo fez-se a leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 725 nm
no espectrofotoacutemetro (Swain e Hillis 1959)
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo1) utilizou-se o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com uma gama
de concentraccedilotildees que variou entre 50 e 700 mgL Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-se
de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido gaacutelico e
a absorvacircncia a 725 nm apoacutes reacccedilatildeo
Meacutetodo Directo
Este meacutetodo foi apenas utilizado para analisar as amostras do extracto metanoacutelico onde foram
dissolvidas as micropartiacuteculas e para a anaacutelise das amostras nos ensaios de libertaccedilatildeo
(procedimentos que seratildeo descritos mais adiante)
Apoacutes a obtenccedilatildeo das amostras colocou-se 35 mL de amostra numa cuvette de quartzo De seguida
fez-se a leitura atraveacutes de espectrofotometria utilizando um comprimento de onda de 280 nm
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
20
Para a curva de calibraccedilatildeo (anexo 2) foi utilizado o aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo A partir
de uma soluccedilatildeo matildee de 1000 mgL de aacutecido gaacutelico preparou-se diferentes soluccedilotildees com as
concentraccedilotildees a variar entre 25 e 25 mgL (anexo 5) Apoacutes a preparaccedilatildeo destas soluccedilotildees procedeu-
se de forma semelhante agrave acima descrita para obter uma relaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo de aacutecido
gaacutelico e a absorvacircncia a 280 nm apoacutes reacccedilatildeo
13 Determinaccedilatildeo da Actividade Antioxidante
Meacutetodo DPPH
Inicialmente preparou-se uma soluccedilatildeo stock obtida atraveacutes da dissoluccedilatildeo de 24 mg de DPPH (22-
difenil-1-picril-hidrazil) (Sigma Aldrich) em 100 mL de metanol e armazenou-se a (-19-20˚C)
Apoacutes duas horas preparou-se a soluccedilatildeo de trabalho por diluiccedilatildeo de 10 mL de soluccedilatildeo stock em 45 mL
de metanol Seguidamente procedeu-se agrave leitura da absorvacircncia a um comprimento de onda de 517
nm no espectrofotoacutemetro (Unicam UVVis Spectrometer ndash UV4 Alemanha) A diluiccedilatildeo foi ajustada de
modo a que o valor da absorvacircncia fosse inferior a 11
Apoacutes o procedimento descrito transferiu-se 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho para frascos acircmbar aos
quais se adicionou 150 μL de amostra de proacutepolis previamente preparada agitou-se ligeiramente e
deixou-se reagir no escuro durante 40 minutos Apoacutes esse tempo mediu-se a absorvacircncia das
amostras a um comprimento de onda de 517 nm As anaacutelises foram feitas em triplicado
O caacutelculo do RSA (Radical Scavenging Activity) foi realizado utilizando a equaccedilatildeo 3
Equaccedilatildeo 7
onde o ADPPH eacute a absorvacircncia de uma soluccedilatildeo formada por 4 mL de soluccedilatildeo de trabalho e 150 μL de
metanol e AAmostra eacute a absorvacircncia da amostra que se quer analisar
Para a preparaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (anexo3) utilizou-se o reagente Trolox (Sigma Aldrich)
como padratildeo e procedeu-se da mesma forma descrita acima mas neste caso a amostra foram as
diferentes concentraccedilotildees de Trolox A gama de concentraccedilotildees utilizadas variou entre 50 e 800 μM
(Thaipong et al 2006)
Meacutetodo FRAP
Primeiramente preparou-se uma soluccedilatildeo de reagente FRAP resultante da mistura de 25 mL de
tampatildeo acetato 03 M 25 mL de uma soluccedilatildeo de TPTZ (Sigma Aldrich) 10 mM e 25 mL de uma
soluccedilatildeo aquosa de cloreto feacuterrico (Panreac) 20 mM Em frascos acircmbar adicionou-se 90 μL de
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
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27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
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28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
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32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
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36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
21
amostra 270 μL de aacutegua e 27 mL de soluccedilatildeo reagente FRAP homogeneizou-se no vortex e de
seguida colocou-se os frascos num banho de aacutegua durante 30 minutos a 37 ˚C Apoacutes esse tempo
realizou-se a leitura da absorvacircncia a 595 nm no espectrofotoacutemetro As leituras fizeram-se em
triplicado (Rufino et al 2006)
Elaborou-se duas curvas padratildeo (anexo 4 e 5) Numa utilizou-se o reagente sulfato ferroso (Panreac)
como padratildeo em concentraccedilatildeo de 500 1000 1500 e 2000 μM Na outra forma foi utilizado o
reagente Trolox como padratildeo em concentraccedilotildees que variaram entre 50 a 800 μM Apoacutes a preparaccedilatildeo
das diferentes soluccedilotildees padratildeo com as diferentes concentraccedilotildees procedeu-se da mesma forma que
anteriormente onde a amostra passou a ser cada uma das soluccedilotildees com uma determinada
concentraccedilatildeo
2 Microencapsulaccedilatildeo do Extracto de Proacutepolis
21 Preparaccedilatildeo das Soluccedilotildees
211 Soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Adicionou-se 15 g de goma-araacutebica (Panreac) a 50 g de aacutegua de forma a natildeo se formar
gracircnulos Colocou-se a agitar durante 24 horas a uma velocidade de 360 rpm
Posteriormente adicionou-se 30 g de etanol a 60 (Fisher Chemical) de forma a natildeo ocorrer
precipitaccedilatildeo e deixou-se sob agitaccedilatildeo durante 30 minutos
No final obteve-se uma soluccedilatildeo homogeacutenea cuja concentraccedilatildeo de goma-araacutebica era de 15 As
partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Soluccedilatildeo com proacutepolis
A soluccedilatildeo de Goma-Araacutebica com extracto de proacutepolis foi realizada de forma semelhante agrave
descrita acima no entanto em vez de 30 g de etanol a 60 adicionou-se 30 g de extracto
etanoacutelico de proacutepolis com 10 de proacutepolis
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por GA
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
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Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
22
212 Soluccedilatildeo de Inulina
Soluccedilatildeo sem proacutepolis
Dissolveu-se 12 g de inulina (Roftiline ST ndash Oraftireg GR) em 60 g de aacutegua preacute-aquecida (70-80 ˚C)
e sob agitaccedilatildeo
Simultaneamente preparou-se uma soluccedilatildeo com 20 g de aacutegua e 24 g de etanol a 60 que foi
aquecida (70-80 ˚C) e homogeneizada sob agitaccedilatildeo
Posteriormente adicionou-se a soluccedilatildeo aacuteguaetanol agrave soluccedilatildeo de inulina e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 10 minutos
Por fim deixou-se a soluccedilatildeo arrefecer ateacute agrave temperatura ambiente e procedeu-se agrave secagem por
spray-dryer As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de I
Soluccedilatildeo com proacutepolis
Para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis elaborou-se uma soluccedilatildeo
semelhante agrave descrita anteriormente no entanto em vez de se adicionar 24 g de etanol a 60
adicionou-se 24 g de extracto de proacutepolis a (10 massa de proacutepolis massa de extracto)
As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas por I
213 Soluccedilatildeo de Quitosano
Soluccedilotildees sem proacutepolis
Inicialmente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico (Fisher Chemical) a 1 ao qual foi adicionado 20 g
de quitosano
Deixou-se a agitar durante 24 horas agrave temperatura ambiente e a uma velocidade de agitaccedilatildeo de
350 rpm
Pesou-se 500 g da soluccedilatildeo obtida e procedeu-se agrave secagem As partiacuteculas obtidas apoacutes
secagem foram designadas por Q1
Aos restantes 500 g de quitosano adicionou-se 10 g de aacutecido ciacutetrico (Panreac) e deixou-se sob
agitaccedilatildeo durante 30 minutos a 350 rpm As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas
por Q2
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
23
Soluccedilotildees com proacutepolis
Primeiramente preparou-se 1 L de aacutecido aceacutetico a 1
De seguida pesou-se 700 g de aacutecido aceacutetico a 1 e adicionou-se 20 g de quitosano Deixou-se
sob agitaccedilatildeo durante 24 horas agrave temperatura ambiente e agrave velocidade de 350 rpm
Aos restantes 300 g de aacutecido aceacutetico a 1 adicionou-se 40 g de extracto de proacutepolis a
10Colocou-se a soluccedilatildeo a agitar durante 30 minutos de forma a homogeneizar
Posteriormente adicionou-se os 700 g de soluccedilatildeo de quitosano e deixouse a agitar durante 30
minutos
Da soluccedilatildeo final pesou-se 500 g que foram secas atraveacutes da teacutecnica de spray-drying obtendo-se
partiacuteculas designadas de Q1
Aos restantes 500 g de soluccedilatildeo foi adicionado 5 g de aacutecido ciacutetrico e colocou-se sob agitaccedilatildeo
durante 30 min As partiacuteculas obtidas apoacutes secagem foram designadas de Q2
Eacute de referir que foi elaborada uma matriz Q3 obtida a partir das partiacuteculas de quitosano com
proacutepolis (Q1) reticuladas com tripolifosfato o qual foi adicionado ao meio de libertaccedilatildeo (1 mm)
No decorrer do trabalho soacute haacute referecircncia desta matriz nos ensaios de libertaccedilatildeo controlada dos
encapsulados
214 Condiccedilotildees do Processo de Secagem
Na tabela 2 encontram-se representadas as condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem
com o spray-dryer (Lab Plant modelo SD-05 Alemanha) para a produccedilatildeo de micropartiacuteculas sem
proacutepolis e com proacutepolis encapsulado
Existem diversos autores que descreveram e testaram diversas condiccedilotildees de funcionamento do
spray-dryer Foi atraveacutes da literatura que se optou por estas condiccedilotildees de funcionamento Para a
goma-araacutebica utilizou-se as condiccedilotildees descritas por Ribeiro (2007) no caso do quitosano com e sem
aacutecido ciacutetrico as condiccedilotildees utilizadas foram as mesmas que Beijoca (2014) e por fim as condiccedilotildees
utilizadas para a secagem das micropartiacuteculas de inulina foram obtidas por ensaios realizados por
Beiratildeo-da-Costa (2013)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
24
Tabela 2 Condiccedilotildees utilizadas durante o processo de secagem por spray-drying
Amostra Massa (g) Velocidade da
Bomba (mLmin)
Temperatura de Entrada (˚C)
GA e GA 95
80 170 Q1 e Q1 500
Q2 e Q2 500
I e I 115 58 190
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
A caracterizaccedilatildeo da morfologia das micropartiacuteculas (Hitachi modelo 52400 Alemanha) foi obtida
atraveacutes de microscopia electroacutenica de varrimento (SEM) Para isso as micropartiacuteculas foram
colocadas num suporte de amostra de alumiacutenio revestidas com ouro e palaacutedio e analisadas
32 Extracccedilatildeo dos Composto Fenoacutelicos das Micropartiacuteculas com Proacutepolis
Para a extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos pesou-se 50 mg de micropartiacuteculas e dilui-se em 10 mL de
metanol
Levou-se a soluccedilatildeo ao Ultraturrax (IKA LabortechNK T25 Basic Alemanha) para imprimir uma forccedila
capaz de destruir as partiacuteculas e armazenou-se durante 24 horas a uma temperatura de 4 ˚C para
que se desse a extracccedilatildeo
Posteriormente centrifugou-se a soluccedilatildeo e retirou-se o sobrenadante o qual foi submetido a anaacutelises
atraveacutes do meacutetodo directo DPPH e FRAP
Ao pelet que sobrou adicionou-se novamente 10 mL de metanol e fez-se novamente uma extracccedilatildeo
voltando a repetir-se o mesmo processo anteriormente descrito
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
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27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
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28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
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32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
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36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
25
4 Libertaccedilatildeo Controlada dos Encapsulados
Na realizaccedilatildeo dos ensaios de libertaccedilatildeo controlada foram utilizados dois meios um aacutecido (pH=12) e
um neutro (pH=70) que foram previamente preparados
Preparaccedilatildeo dos Meios
Meio Aacutecido
Dissolveu-se 20 g de cloreto de soacutedio (Panreac) em 70 mL de aacutecido cloriacutedrico (HCl) (Fisher
Chemical) e perfez-se o volume de 1000 mL com aacutegua
Meio Neutro
Dissolveu-se 68 g de fosfato de potaacutessio nanobaacutesico (KH2PO4) (Panreac) em 250 mL de
aacutegua
Seguidamente adicionou-se 77 mL de hidroacutexido de soacutedio (NaOH) (Fisher Chemical) a 02 M e
prefez-se o restante volume ateacute 1000 mL com aacutegua destilada
Ambas as soluccedilotildees tampatildeo apoacutes serem elaboradas tiveram de ser acertadas em relaccedilatildeo ao pH e
para isso utilizou-se HCl e NaOH a 02 M
Meacutetodo de Libertaccedilatildeo
Para cada tipo de amostra pesou-se uma determinada quantidade de massa de micropartiacuteculas a
qual foi adicionada a um determinado volume de meio Essas quantidades encontram-se descritas na
tabela 3
Primeiramente pesou-se a amostra e simultaneamente o meio a utilizar
De seguida colocou-se o meio num vaso de libertaccedilatildeo ateacute que este atingisse os 37 ˚C
(temperatura que se utilizou durante todos os ensaios de libertaccedilatildeo)
Sob agitaccedilatildeo adicionou-se as micropartiacuteculas de forma a natildeo se formarem gracircnulos
Em intervalos regulares de tempo retirou-se 1 mL de amostra para um eppandorf e colocou-
se a centrifugar numa microcentrifuga (Thermo Scientific Espresso Alemanha)
Retirou-se o sobrenadante o qual foi utilizado para ler a absorvacircncia a 280 nm
Ao pelet adicionou-se meio fresco e agitou-se ligeiramente seguidamente colocou-se no
vaso de libertaccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
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26
Tabela 3 Massa de micropartiacuteculas libertadas e volume de meio de libertaccedilatildeo
Meio Aacutecido Meio Neutro
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
Massa de Amostra (g)
Volume de meio (mL)
GA 002 20 0035 35
Q1 01 100 005 50
Q2 01 100 005 50
Q3 005 50 005 50
I 01 100 005 50
Para o estudo de libertaccedilatildeo controlada foi necessaacuterio produzir quatro diferentes rectas de calibraccedilatildeo
Duas rectas de Calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro (anexo 6 e 7) e outras duas
rectas de calibraccedilatildeo com aacutecido gaacutelico para o meio aacutecido e neutro contendo tripolifosfato (anexo 8 e
9) Para a produccedilatildeo das rectas de calibraccedilatildeo utilizou-se aacutecido gaacutelico (Sigma Aldrich) como padratildeo
com diferentes gamas de concentraccedilotildees O meacutetodo utilizado para a elaboraccedilatildeo das quatro rectas de
calibraccedilatildeo foi o directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
27
IV Resultados e Discussatildeo
1 Determinaccedilatildeo dos Compostos Fenoacutelicos a partir do meacutetodo Folin-Ciacalteu
Para a determinaccedilatildeo da quantidade de compostos fenoacutelicos presentes no extracto de proacutepolis foi
necessaacuterio elaborar previamente uma recta de calibraccedilatildeo (anexo 4) determinando-se assim a
quantidade em estudo
Atraveacutes do meacutetodo de Folin-Ciacalteu foi possiacutevel concluir que a quantidade de compostos fenoacutelicos
totais presentes no extracto de proacutepolis analisado era de 4431 mg Eq Aacutec Gaacutelico g de proacutepolis
Estudos realizados por Aliyazıcıoglu (2013) mostram que a quantidade de compostos fenoacutelicos varia
entre 11549 plusmn 204 e 21033 plusmn 204 mg GAE g proacutepolis Comparando o valor obtido eacute possiacutevel
verificar que este natildeo se enquadra dentro dos valores da literatura sendo um valor menor do que os
apresentados
Segundo a literatura o proacutepolis e os seus extractos contecircm diferentes quantidades de compostos
fenoacutelicos formando assim um perfil distinto para cada tipo de amostra A variaccedilatildeo dos perfis deve-se
agrave origem da flora do proacutepolis e da eacutepoca do ano em que eacute colhido
2 Actividade Antioxidante do Extracto de Proacutepolis
21 Meacutetodo DPPH
O meacutetodo do DPPH eacute muitas vezes utilizado para a determinaccedilatildeo de radicais livres em amostras e a
partir do qual eacute possiacutevel obter valores de RSA (Radical Scavenging Activity) e de TEAC (Trolox
Equivalent Antioxidante Capacity)
Para a determinaccedilatildeo do valor de TEAC foi necessaacuterio elaborar uma curva de calibraccedilatildeo com o
reagente padratildeo Trolox No anexo 1 estaacute representada a recta de calibraccedilatildeo cuja gama de
concentraccedilotildees utilizada foi entre 50 e 800 μM Na tabela 4 eacute possiacutevel observar os valores de RSA e
de TEAC
Tabela 4 Valores de RSA e de TEAC obtidos atraveacutes do meacutetodo DPPH
Meacutetodo DPPH
RSA () TEAC
M Trolox g de proacutepolis
62 019
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
28
Atraveacutes da tabela 4 eacute possiacutevel observar que o valor de RSA eacute de 62 para uma concentraccedilatildeo de
extracto de proacutepolis de 868 gL
Segundo estudos executados por Moreira (2008) a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis
variam conforme a regiatildeo de onde provem esses extractos Um estudo realizado por este autor
mostrou que extractos de proacutepolis provenientes da regiatildeo de Bornes tinham um RSA de 33 para
uma concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0001 gL e 94 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Por outro lado os extractos de proacutepolis provenientes do Fundatildeo tinham um RSA de 1 para uma
concentraccedilatildeo de extracto de proacutepolis de 0007 gL e 18 para uma concentraccedilatildeo de 002 gL
Eacute possiacutevel observar que com menores concentraccedilotildees de extracto de proacutepolis Moreira et al (2008)
obteve valores de RSA maiores e menores do que o obtido atraveacutes da nossa anaacutelise Assim se para
uma concentraccedilatildeo de 868 gL obteve-se um RSA de 62 significa que o extracto de proacutepolis
utilizado apresenta uma actividade de captaccedilatildeo de radicais livres menor
Por outro lado estudos realizados por Mihai (2011) mostraram que diferentes extractos de proacutepolis de
diferentes regiotildees da Transilvacircnia tinham valores de TEAC que variavam entre 029 plusmn 010 e
124plusmn001 mmol Trolox g proacutepolis
Ao converter-se os M de trolox g de proacutepolis do extracto deste trabalho obteacutem-se um valor de 0045
mmol Trolox g de proacutepolis Eacute possiacutevel verificar que eacute um valor menor do que o da literatura
anteriormente referida dando a ideia que este extracto tecircm uma actividade antioxidante menor
Segundo a literatura a composiccedilatildeo quiacutemica da flora de cada regiatildeo de onde eacute recolhido o poacutelen e as
resinas influencia a actividade antioxidante dos extractos de proacutepolis e a sua composiccedilatildeo quiacutemica
(Moreno 2000 Mihai 2011)
22 Meacutetodo FRAP
Para a determinaccedilatildeo da actividade antioxidante do proacutepolis atraveacutes do meacutetodo FRAP foi necessaacuterio
elaborar duas rectas de calibraccedilatildeo uma cujo reagente padratildeo utilizado foi o sulfato ferroso e na outra
o reagente foi o trolox As rectas de calibraccedilatildeo estatildeo representadas no anexo 2 e 3 bem como as
equaccedilotildees de cada recta e os seus coeficientes de determinaccedilatildeo
A partir das equaccedilotildees das rectas foi possiacutevel determinar a actividade antioxidante dos extractos de
proacutepolis analisados atraveacutes do meacutetodo FRAP Na tabela 5 encontram-se os valores de actividade
antioxidante tendo por base o padratildeo sulfato ferroso e o padratildeo trolox
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
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313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
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314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
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Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
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322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
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diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
29
Tabela 5 Valores de Actividade Antioxidante obtidos pelo meacutetodo FRAP
Meacutetodo FRAP
ATT
M Sulfato Ferroso g de proacutepolis
TEAC
M Trolox g de proacutepolis
065 025
Os valores apresentados na tabela 5 indicam que o extracto de proacutepolis analisado por este meacutetodo
tambeacutem demonstra actividade antioxidante
Mihai (2011) ao analisar diferentes extractos de proacutepolis recorrendo ao meacutetodo FRAP obteve valores
de actividade antioxidante que variavam entre 074 plusmn 005 e 254 plusmn 010 mmol FeIISO4 g proacutepolis
O extracto analisado neste trabalho apresenta um valor de ATT de 021 mmol FeIISO4 g proacutepolis
Comparando com os valores apresentados na literatura eacute possiacutevel observar que eacute um valor menor
Mas ainda assim o extracto analisado apresenta capacidade de oxidar o ferro presente na soluccedilatildeo
de reacccedilatildeo
Por outro lado Aliyazıcıoglu (2013) estudou extractos de proacutepolis provenientes de diferentes zonas
da Turquia e a actividade antioxidante desses extractos em TEAC utilizando o meacutetodo FRAP
variavam entre 18212 plusmn 225 e 32547 plusmn 312 μM Trolox g proacutepolis
Analisando o valor obtido do extracto de proacutepolis em estudo eacute possiacutevel verificar que eacute muito superior
aos valores da literatura
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
30
3 Caracterizaccedilatildeo das Micropartiacuteculas
31 Morfologia das Micropartiacuteculas
311 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 5 encontra-se representada imagens obtidas por microscopia electroacutenica de varrimento
das micropartiacuteculas de goma-araacutebica (GA) e de goma-araacutebica com proacutepolis (GA)
De um modo geral eacute possiacutevel observar que em ambos os casos haacute formaccedilatildeo de aglomerados de
micropartiacuteculas Eacute tambeacutem possiacutevel visualizar que satildeo poucas as micropartiacuteculas que possuem uma
superfiacutecie lisa na maior parte dos casos a superfiacutecie tem zonas cocircncavas Estas zonas cocircncavas
podem ter resultado da contracccedilatildeo raacutepida das partiacuteculas liacutequidas durante a fase inicial do processo de
secagem (Kim1996)
Figura 5 Micropartiacutecula GA ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000 x Micropartiacuteculas GA ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
31
312 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
Na figura 6 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de quitosano (Q1) e de quitosano com
proacutepolis (Q1)
Atraveacutes da figura 6 a) e b) eacute possiacutevel observar que as esferas de quitosano apresentam uma forma
esfeacutericas e uma superfiacutecie enrugadaondulada estudos realizados por Weerakody (2008) as
micropartiacuteculas de quitosano mostraram resultados semelhantes aos aqui apresentados
corroborando assim os nossos resultados
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis eacute possiacutevel observar que estas
apresentam tambeacutem uma forma esfeacuterica no entanto a sua superfiacutecie eacute mais lisa do que as
microcaacutepsulas de quitosano Esta superfiacutecie lisa poderaacute dever-se natildeo soacute haacute presenccedila do proacutepolis e
das ceras que o constituem mas tambeacutem ao facto da viscosidade da soluccedilatildeo preparada ser mais
elevada pois estudos realizados por P He (1999) mostraram que micropartiacuteculas de quitosano
preparadas a partir de uma soluccedilatildeo com elevada viscosidade apresentavam uma superfiacutecie lisa
Figura 6 Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q1 ampliaccedilatildeo
c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
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52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
32
313 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano e Aacutecido Ciacutetrico
Eacute possiacutevel observar na figura 7 imagens de micropartiacuteculas de quitosano com aacutecido ciacutetrico (Q2) e de
quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis (Q2)
Atraveacutes das figuras 7 a) e b) eacute possiacutevel visualizar que a maior parte as micropartiacuteculas de quitosano
com aacutecido criacutetico natildeo apresentam uma forma esfeacuterica mas sim irregular e cuja superfiacutecie aleacutem de
enrugada tem tambeacutem zonas cocircncavas Por outro lado as micropartiacuteculas agrave base de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e proacutepolis exibem uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa no entanto existem
excepccedilotildees as quais apresentam a superfiacutecie um pouco enrugada
Figura 7 Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x Micropartiacuteculas Q2 ampliaccedilatildeo c) 500 x d) 1000 x
a)
d) c)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
33
314 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 8 estaacute representada imagens de micropartiacuteculas de inulina (I) e de inulina com proacutepolis (I)
Em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas de inulina com e sem proacutepolis eacute possiacutevel observar que em ambos os
casos as micropartiacuteculas apresentam uma forma esfeacuterica e uma superfiacutecie lisa Eacute tambeacutem possiacutevel
observar que em ambos os casos as micropartiacuteculas apresentam rupturas sendo de maior incidecircncia
no caso das micropartiacuteculas de inulina com proacutepolis
Estudos realizados por Beiratildeo-da-Costa (2013) mostram o contraacuterio do que ocorreu no trabalho aqui
apresentado obtiveram micropartiacuteculas com uma estrutura resistente sem rupturas eou cavidades
nem microcaacutepsulas colapsadas
Na figura 9 estaacute representada parte de uma micropartiacutecula de inulina com proacutepolis onde eacute possiacutevel
observar que a parede da mesma tem uma espessura de 39 μm
Figura 8 Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo a) 200 x b) 1000x Micropartiacuteculas I ampliaccedilatildeo c) 200 x d) 1000 x
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
34
Figura 9 Micropartiacutecula de inulina com proacutepolis ampliaccedilatildeo 2500 x
32 Tamanho das Micropartiacuteculas
321 Micropartiacuteculas agrave base de Goma-Araacutebica
Na figura 10 encontram-se representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de goma-
araacutebica e de goma-araacutebica com proacutepolis respectivamente
Eacute possiacutevel observar que no geral o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre 1 e 30 μm sendo
o diacircmetro meacutedio cerca de 10 μm Por outro lado o diacircmetro das micropartiacuteculas de GA varia entre
1 e 40 μm sendo o diacircmetro meacutedio cerca de 12 μm No entanto eacute possiacutevel observar que em ambos
os casos maior parte das partiacuteculas tecircm um tamanho que varia entre 5 e 15 μm
Figura 10 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas GA b) Micropartiacuteculas GA
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
35
322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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322 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano
A distribuiccedilatildeo de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano e de quitosano com proacutepolis encontra-se
representada na figura 11 respectivamente
No caso das micropartiacuteculas de Q1 o seu tamanho varia entre 1 e 20 μm e o diacircmetro meacutedio eacute cerca
de 63 μm Tambeacutem neste caso o tamanho das micropartiacuteculas Q1 varia entre 1 μm e 40 μm e o
tamanho meacutedio das micropartiacuteculas cerca de 12 μm Em ambos os casos maior parte das
micropartiacuteculas apresenta um tamanho meacutedio entre 5 e 15 μm
323 Micropartiacuteculas agrave base de Quitosano com Aacutecido Ciacutetrico
Na figura 12 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de quitosano com
aacutecido ciacutetrico e de quitosano com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis respectivamente
Analisando a figura 12 eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas de Q2 apresentam um diacircmetro
que varia entre 1 e 15 μm e o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute de 78 μm Por outro lado o
a)
b)
Figura 11 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q1 b) Micropartiacuteculas Q1
Figura 12 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas Q2 b) Micropartiacuteculas Q2
a)
b)
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
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Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
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4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
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A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
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42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
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nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
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V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
36
diacircmetro das esferas de Q2 varia entre 1 e 50 μm sendo esta variaccedilatildeo um pouco maior que as
anteriores (figura 10 e 11) tambeacutem o diacircmetro meacutedio das micropartiacuteculas eacute um pouco superior sendo
de 17 μm
No caso das micropartiacuteculas Q2 maior parte apresenta um tamanho meacutedio que varia entre 5 e10 μm
jaacute as micropartiacuteculas Q2 maior parte tem um tamanho meacutedio entre 5 e 25 μm
324 Micropartiacuteculas agrave base de Inulina
Na figura 13 estatildeo representadas as distribuiccedilotildees de tamanho das micropartiacuteculas de inulina e de
inulina com proacutepolis
Analisando ambos os histogramas eacute possiacutevel observas que as o tamanho das partiacuteculas de I varia
entre 1 e 30 μm e o diacircmetro meacutedio eacute de 91 μm Jaacute as partiacuteculas de I apresentam uma distribuiccedilatildeo
de tamanhos que varia entre 1 e 40 μm e o diacircmetro meacutedio destas partiacuteculas eacute de 11 μm
Eacute tambeacutem possiacutevel observar que no caso das micropartiacuteculas I maior parte possui um tamanho que
varia 5 e 15 μm por outro lado maior parte das micropartiacuteculas I apresentam um tamanho que varia
entre 5 e 20 μm
De um modo em geral eacute possiacutevel observar que as micropartiacuteculas apenas formadas pelos
polissacaacuteridos apresentam uma distribuiccedilatildeo de tamanho e um diacircmetro meacutedio inferior agraves
micropartiacuteculas que contecircm o proacutepolis encapsulado Por outro lado verifica-se que as micropartiacuteculas
contendo proacutepolis promovem um aumento da distribuiccedilatildeo do tamanho havendo uma maior variaccedilatildeo
de tamanhos das micropartiacuteculas Ainda eacute possiacutevel observar que das micropartiacuteculas contendo
extracto de proacutepolis as de goma-arabica e quitosano satildeo as de menor tamanho seguidas das de
inulina sendo as de quitosano e aacutecido ciacutetrico as de maior tamanho
a)
b)
Figura 13 Distribuiccedilatildeo de tamanhos a) Micropartiacuteculas I b) Micropartiacuteculas I
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
37
Tambeacutem Beiratildeo-da-Costa (2013) observou o mesmo facto quando analisou partiacuteculas de inulina
contendo oacuteleo essencial O aumento do tamanho pode dever-se ao encapsulamento do composto
bioactivo que leva agrave expansatildeo das micropartiacuteculas
33 Grau de Encapsulamento
O grau de encapsulamento foi obtido atraveacutes da quantificaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos dando uma
ideia da quantidade de proacutepolis que foi encapsulado
Na tabela 6 encontram-se representados os valores de fenoacutelicos encapsulados obtidos pelo meacutetodo
de Folin-Ciacalteu e pelo meacutetodo directo sendo esta quantificaccedilatildeo expressa em mg EAG g de
partiacutecula
Tabela 6 Grau de encapsulamento das diversas micropartiacuteculas
Compostos Fenoacutelicos
Micropartiacuteculas Meacutetodo Folin-Ciacalteu
(mg EAG g de partiacuteculas)
Meacutetodo Directo
(mg EAG g de partiacuteculas)
GA 656 895
Q1 1228 1752
Q2 409 682
I 1866 3555
Analisando os valores apresentados na tabela 6 eacute possiacutevel verificar que atraveacutes do meacutetodo de folin-
ciacalteu a quantidade de compostos fenoacutelicos eacute menor do que os obtidos pelo meacutetodo directo Isto
pode deve-se ao facto de o primeiro meacutetodo ser mais especiacutefico porque envolve uma reacccedilatildeo com os
fenoacutelicos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
38
34 Actividade Antioxidante do Extracto Metanoacutelico das Micropartiacuteculas
A determinaccedilatildeo da actividade antioxidantes do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas contendo
proacutepolis encontra-se representada tabela 7
Tabela 7 Actividade Antioxidante do extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas atraveacutes dos meacutetodos DPPH e FRAP
Actividade Antioxidante
Micropartiacuteculas DPPH
(M Trolox g de partiacuteculas)
FRAP
(M Trolox g de partiacuteculas)
GA 0169 0336
Q1 0232 0700
Q2 0092 0187
I 0572 0896
De um modo geral eacute possiacutevel observar que o extracto metanoacutelico onde as micropartiacuteculas foram
dissolvidas apresenta actividade antioxidante
No entanto natildeo eacute possiacutevel comparar directamente estes valores com os valores obtidos da anaacutelise
do extracto de proacutepolis Pois no extracto etanoacutelico de proacutepolis haacute uma quantificaccedilatildeo da actividade de
todos os compostos antioxidantes jaacute no extracto metanoacutelico das micropartiacuteculas a quantificaccedilatildeo da
actividade antioxidante eacute relativa soacute aos compostos antioxidantes encapsulados
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
39
4 Libertaccedilatildeo Controlada de Encapsulados
41 Libertaccedilatildeo em Meio Aacutecido
Na figura 14 estatildeo representados os perfis de libertaccedilatildeo das micropartiacuteculas de GA I Q1 Q2 e
Q3 Na tabela 8 estatildeo representados os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e de velocidade
inicial de libertaccedilatildeo
Figura 14 Libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio aacutecido GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 8 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio aacutecido
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
34 35 83 205 76
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00005 00021 00019 00026 00009
Eacute possiacutevel observar atraveacutes da figura 14 que existe uma pequena distinccedilatildeo entre a fase inicial
designada de ldquoburst efectrdquo e a fase em que a libertaccedilatildeo se torna constante ldquotime lagrdquo atingindo-se
logo de seguida um patamar
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
40
A velocidade de libertaccedilatildeo elevada no iniacutecio pode estar relacionada com a libertaccedilatildeo de fenoacutelicos que
estatildeo agrave superfiacutecie das partiacuteculas A seguir a libertaccedilatildeo mais lenta pode ser resultado da expansatildeo do
volume das partiacuteculas devido agrave absorccedilatildeo de aacutegua quando estas satildeo imersas no meio ou entatildeo
devido ao relaxamento das cadeias polimeacutericas quando os poliacutemeros hidrofilicos hidratam
Tambeacutem eacute possiacutevel verificar tanto atraveacutes da figura 14 como da tabela 8 que as micropartiacuteculas de
goma-araacutebica com proacutepolis satildeo as que apresentam uma menor libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos
quer por massa de micropartiacuteculas em soluccedilatildeo quer em relaccedilatildeo agrave quantidade maacutexima que poderia
ser libertada tendo em conta o grau de encapsulamento Esta situaccedilatildeo pode ocorrer devido agrave
estrutura quiacutemica desta matriz A goma-araacutebica eacute composta por uma fracccedilatildeo de polissacaacuteridos e uma
fracccedilatildeo glico-proteica sendo bastante diferente de todos as outras matrizes estudadas que natildeo
apresentam fracccedilotildees proteicas Este facto pode estar na origem de interacccedilotildees mais fortes com os
compostos fenoacutelicos em meio aacutecido inibindo a sua libertaccedilatildeo
De entre as outras as micropartiacuteculas de quitosano com proacutepolis apresentam maior libertaccedilatildeo
Relativamente agraves micropartiacuteculas de quitosano verifica-se que a velocidade de libertaccedilatildeo eacute
ligeiramente superior para Q2 seguindo-se Q1 e Q3 No entanto a quantidade maacutexima libertada por
massa de micropartiacuteculas eacute muito semelhante (Figura 14) Neste caso esperar-se-ia uma libertaccedilatildeo
maior com as partiacuteculas Q1 dado que natildeo foram preparadas com agentes de reticulaccedilatildeo O facto de
a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas Q2 ser mais raacutepida pode ser devido ao efeito plastificante do aacutecido
ciacutetrico em excesso (que natildeo reagiu com o quitosano) originando uma matriz mais facilmente
hidrataacutevel promovendo a difusatildeo dos bioactivos No caso das partiacuteculas Q3 o tripolifosfato teraacute
actuado formando ligaccedilotildees fortes com o quitosano originando uma matriz mais riacutegida capaz de reter o
composto bioactivo de forma a natildeo ser libertado tatildeo facilmente e tatildeo rapidamente (Estevinho et al
2013) No entanto o grau de reticulaccedilatildeo natildeo teraacute sido suficiente para promover uma maior retenccedilatildeo
dos bioactivos comparando comas outras partiacuteculas As partiacuteculas com aacutecido ciacutetrico e proacutepolis
apresentam uma libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos superior a 100 isto poderaacute dever-se ao facto de
natildeo existir uma quantificaccedilatildeo exacta dos compostos fenoacutelicos aquando da extracccedilatildeo dos mesmos em
meio metanoacutelico
O aacutecido ciacutetrico tambeacutem eacute um reticulante no entanto e segundo Estevinho et al (2013) as ligaccedilotildees
formadas pelo quitosano com tripolifosfato satildeo dez vezes mais fortes do que as ligaccedilotildees formadas
entre o quitosano e outros agentes reticulantes o que permite supor que a libertaccedilatildeo do composto
bioactivo seria superior na matriz quitosano-aacutecido ciacutetrico em relaccedilatildeo agrave matriz quitosano tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
41
42 Libertaccedilatildeo em Meio Neutro
Na figura 15 estatildeo representados os diversos perfis de libertaccedilatildeo das diversas microcaacutepsulas em
meio neutro Os valores de libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos bem como a velocidade inicial de
libertaccedilatildeo encontram-se representados na tabela 9
Figura 15 Libertaccedilatildeo controlada de compostos fenoacutelicos das diversas micropartiacuteculas em meio neutro GA - Goma-araacutebica + proacutepolis I - Inulina + proacutepolis Q1 - Quitosano + proacutepolis Q2 - Quitosano + Aacutecido ciacutetrico + proacutepolis Q3 - Quitosano + proacutepolis + tripolifosfato
Tabela 9 Determinaccedilatildeo da libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos e velocidade inicial das diferentes micropartiacuteculas contendo proacutepolis em meio neutro
Micropartiacuteculas
GA I Q1 Q2 Q3
Libertaccedilatildeo maacutexima de fenoacutelicos ()
72 112 167 464 208
Velocidade Inicial
(g EAG min) 00052 00073 00028 00014 00069
Atraveacutes da tabela 9 verifica-se que a massa maacutexima de compostos fenoacutelicos libertada em relaccedilatildeo agrave
que poderia ter sido libertada tendo em conta o grau de encapsulamento eacute superior a 100 em
todas as matrizes agrave excepccedilatildeo da goma-araacutebica com proacutepolis
Como foi referido anteriormente a extracccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio metanoacutelico pode natildeo
ocorrer de forma semelhante agrave que ocorre durante a libertaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos em meio
neutro levando a uma quantificaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos inferior agrave que realmente estaacute presente
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
42
nas micropartiacuteculas Estima-se que o meacutetodo para a quantificaccedilatildeo do grau de encapsulamento natildeo
tenha sido eficiente muito provavelmente devido agrave complexidade do proacutepolis
No entanto comparando os perfis das Figuras 14 e 15 eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Por outro lado em meio
neutro verifica-se o oposto ao observado em meio aacutecido a libertaccedilatildeo a partir das partiacuteculas de GA eacute
superior agrave das outras partiacuteculas A composiccedilatildeo quiacutemica bastante diferente da goma-araacutebica em
relaccedilatildeo agraves outras matrizes deveraacute ser o factor principal para este comportamento
Relativamente agraves diferentes matrizes de quitosano neste meio verifica-se o oposto do que acontece
em meio aacutecido neste meio a matriz de quitosano contendo tripolifosfato (Q3) eacute a que liberta mais
composto bioactivo e a matriz apenas de quitosano eacute a que liberta menos O que daacute a entender que
em meio neutro a presenccedila de agentes reticulantes natildeo vai influenciar no aprisionamento dos
compostos bioactivos
Ainda em relaccedilatildeo agraves diferentes matrizes de quitosano eacute possiacutevel observar que haacute uma maior
libertaccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em meio neutro do que em meio aacutecido Como foi referido
anteriormente o quitosano eacute um polissacaacuterido catioacutenico em meio aacutecido Este facto pode ter originado
o estabelecimento de interacccedilotildees electroestaacuteticas entre os grupos amina protonados do quitosano
com os grupos hidroxilo dos compostos fenoacutelicos promovendo uma menor libertaccedilatildeo destes para o
meio aacutecido Por outro lado em meio neutro os grupos amina do quitosano natildeo se encontram
protonados pelo que as referidas interacccedilotildees electroestaacuteticas natildeo devem ocorrer estando os
compostos fenoacutelicos mais livres para se difundirem
Relativamente agraves micropartiacuteculas de inulina estas comportam-se como as de quitosano tanto em
meio aacutecido como em meio neutro Isto pode dever-se agrave sua composiccedilatildeo ser semelhante agrave do
quitosano embora natildeo tenha os grupos amina No entanto a inulina eacute considerada uma fibra
alimentar natildeo eacute digeriacutevel e a sua solubilidade depende da temperatura do meio onde a mesma eacute
libertada neste caso ambos os meios estavam a 37ordmC eacute uma temperatura intermeacutedia que pode natildeo
ser suficiente para que haja uma total solubilizaccedilatildeo da inulina
As libertaccedilotildees controladas realizadas neste trabalho tiveram como objectivo mimetizar o que sucede
no estocircmago e no intestino mas tendo em conta apenas o pH desses dois locais excluindo outros
factores como enzimas e processos que possam ocorrer durante a digestatildeo e absorccedilatildeo dos
alimentos O que se verificou foi que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo do composto bioactivo era menor do
que no meio neutro assim e fazendo uma analogia ao que ocorre no organismo pode-se inferir que
no estocircmago a libertaccedilatildeo dos compostos bioactivos do proacutepolis poderaacute ser menor do que no intestino
Este facto vai de encontro a um dos objectivos do processo de microencapsulaccedilatildeo o de haver uma
libertaccedilatildeo controlada de faacutermacos eou de compostos bioactivos em locais propiacutecios agrave sua maior
absorccedilatildeo que neste caso eacute no intestino
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
43
V Conclusotildees
Apoacutes a realizaccedilatildeo deste trabalho conclui-se que eacute possiacutevel encapsular extracto etanoacutelico de proacutepolis
em diversas matrizes como a goma-araacutebica o quitosano e a inulina atraveacutes do processo de spray-
drying
As micropartiacuteculas produzidas apresentam actividade antioxidante inferior ao extracto etanoacutelico de
proacutepolis utilizado para a microencapsulaccedilatildeo o que pode ser devido ao baixo carregamento das
mesmas e ao encapsulamento de soacute parte das classes de compostos presentes o extracto inicial
Ainda em relaccedilatildeo agraves micropartiacuteculas a anaacutelise realizada por microscopia de varrimento (SEM)
mostrou que as micropartiacuteculas satildeo caacutepsulas e que no geral apresentavam uma forma esfeacuterica no
entanto as micropartiacuteculas que continham proacutepolis apresentavam uma superfiacutecie lisa ao contraacuterio das
micropartiacuteculas sem proacutepolis
No que diz respeito ao tamanho as micropartiacuteculas contendo proacutepolis apresentavam um tamanho
meacutedio maio do que as micropartiacuteculas sem proacutepolis encapsulado
Relativamente agrave libertaccedilatildeo controlada das micropartiacuteculas destaca-se a matriz de goma-araacutebica pois
em meio aacutecido libertou uma menor quantidade de compostos bioactivos e em meio neutro libertou
uma maior quantidade relativamente agraves outras matrizes Este comportamento deveraacute estar
relacionado com a composiccedilatildeo quiacutemica da goma-arabica e por esta ser tatildeo diferente dos outros
polissacaacuteridos
Ainda em relaccedilatildeo agrave libertaccedilatildeo controlada esta mostrou que em meio aacutecido a libertaccedilatildeo dos
compostos bioactivo era menor do que em meio neutro permitindo fazer uma analogia do que
poderia acontecer in vivo havendo uma maior libertaccedilatildeo do composto bioactivo no intestino que eacute a
zona de maior absorccedilatildeo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
44
VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
polissacaacuteridos
Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
capaz de atenuar o aroma e odor caracteriacutesticos
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
VII Referecircncias Bibliograacuteficas
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VIII Anexos
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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VI Trabalho Futuro
Com a realizaccedilatildeo do presente trabalho surgiram outras ideias e propostas de trabalho futuro
Continuar com o estudo de microencapsulaccedilatildeo de proacutepolis noutras matrizes de
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Optimizar os paracircmetros de secagem no spray-drying de forma a obter um maior rendimento
em termos de produto final e de forma a obter micropartiacuteculas esfeacutericas e sem enrugamento
Relativamente aos polissacaacuteridos estudados aumentar a concentraccedilatildeo destes nas soluccedilotildees
de base e compara-los com estudos de menor concentraccedilatildeo para verificar se esta vai alterar
o rendimento da microencapsulaccedilatildeo e a quantidade de compostos bioactivos
Aumentar a concentraccedilatildeo de proacutepolis na soluccedilatildeo a encapsular e estudar e caracterizar as
micropartiacuteculas tanto a niacutevel de actividade antioxidante como a niacutevel de estrutura
Analisar e avaliar outros meacutetodos de extracccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos de modo a
quantificar os mesmos com mais exactidatildeo e precisatildeo
Realizar provas sensoriais de forma a compreender se o encapsulamento de proacutepolis eacute
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51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
45
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
50
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51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
47
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
50
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Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
53
Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
54
Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
55
Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
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VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
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Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
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Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
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Anexo 7 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro
Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
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Anexo 9 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Neutro com Tripolifosfato
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51
VIII Anexos
Anexo 1 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo Folin-Ciacalteu
Anexo 2 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o meacutetodo directo
Microencapsulaccedilatildeo de Proacutepolis em Matrizes de Polissacaacuteridos e Estudos de Libertaccedilatildeo Controlada
52
Anexo 3 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo DPPH
Anexo 4 Curva de Calibraccedilatildeo com Sulfato Ferroso para o meacutetodo FRAP
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Anexo 5 Curva de Calibraccedilatildeo com Trolox para o meacutetodo FRAP
Anexo 6 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido
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Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
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Anexo 8 Curva de Calibraccedilatildeo com Aacutecido Gaacutelico para o Meio Aacutecido com Tripolifosfato
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