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mGMOP: UN NUEVO PÉPTIDO PARA EL DESARROLLO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES CON PROPIEDADES TERAPÉUTICAS MEJORADAS
Iturraspe, Francisco; Gugliotta A.; Etcheverrigaray, M.; Kratje, R.; Oggero, M.; Ceaglio, N.
UNL, CONICET, FBCB (Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas), CBL (Centro Biotecnológico del Litoral), Ciudad Universitaria, Ruta Nacional 168 - Km 472,4 - C.C. 242 - (S3000ZAA) Santa Fe, Pcia. de Santa Fe, Argentina. E-mail: [email protected]
Actualmente, la administración clínica de proteínas recombinantes para el tratamiento de enfermedades presenta ciertas limitaciones, como baja estabilidad o corta vida media en plasma.
Por otro lado, distintas técnicas de glicosilación han sido utilizadas para mejorar las propiedades de estas proteínas. La estrategia implementada en este trabajo fue la fusión de un péptido
denominado mGMOP, derivado del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF). La secuencia de este péptido consiste en los primeros 7 aminoácidos
de la región N-terminal del hGM-CSF junto con 8 residuos adicionales que han sido agregados con el objetivo de generar 6 sitios potenciales de O-glicosilación. El objetivo de este trabajo
fue estudiar la capacidad de mGMOP de conferir propiedades biológicas mejoradas a un bioterapéutico humano ampliamente utilizado tal como interferón α-2b humano (hIFN-α2b).
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
1. DISEÑO, PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS VARIANTES mGMOP/hIFN-α2b
Se construyeron cinco quimeras mediante fusión del péptido mGMOP al extremo N y/o C del
hIFN-α2b en diferentes proporciones: mGMOP-IFN, mGMOP2-IFN, mGMOP3-IFN,
mGMOP2-IFN-mGMOP y mGMOP3-IFN-mGMOP.
La nueva etiqueta peptídica denominada mGMOP, derivada del factor estimulante de
colonias de granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF), consta de los primeros 7
aminoácidos de la región N-terminal de esta citoquina, junto con 8 residuos adicionales
que confieren 6 sitios potenciales de O-glicosilación.
Figura 1. Diseño y secuencia del péptido mGMOP y la variante mGMOP-IFN.
PSGM: Péptido señal del hGM-CSF.
Figura 2. Variantes de hIFN-α2b construidas con diferentes proporciones de mGMOP.
Las quimeras fueron producidas en condiciones de adherencia y purificadas por
cromatografía de inmunoafinidad utilizando un anticuerpo monoclonal anti-hIFN-α2b.
2. ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE MASA MOLECULAR
Al aumentar el número de etiquetas peptídicas GMOPm, la masa molecular se incrementó
y lo hizo en una proporción superior a lo esperable sólo por la contribución de la porción
peptídica.
Figura 3. SDS-PAGE de las variantes de hIFN-α2b. Calle 1, IFN no glicosilado; calle 2, wild-type IFN; calle 3,
mGMOP-IFN; calle 4, mGMOP2-IFN; calle 5, mGMOP3-IFN; calle 6, mGMOP2-IFN-mGMOP; calle 7,
mGMOP3-IFN-mGMOP; calle 8, marcador de masa molecular; calle 9, GMOP-IFN; calle 10, una variante de
IFN altamente N-glicosilada (IFN4N).
3. CONFIRMACIÓN DE LA PRESENCIA DE GLICANOS DE TIPO O
La presencia de O-glicanos fue confirmada mediante reacciones de deglicosilación
enzimática utilizando las enzimas indicadas en la Figura 4A. El éxito de la deglicosilación
fue analizado mediante SDS-PAGE (Figura 4B).
Figura 4. (A) Estructura de O-glicanos más comunes en células eucariotas. (B) SDS-PAGE de variantes
nativas y deglicosiladas de hIFN-α2b. Calle 1, IFN wild type; calle 2, IFN no glicosilado; calles 3 y 4,
mGMOP-IFN nativo y deglicosilado; calles 5 y 6, mGMOP2-IFN nativo y deglicosilado; calles 7 y 8, mGMOP3-IFN
nativo y deglicosilado; calles 9 y 10, mGMOP2-IFN-mGMOP nativo y deglicosilado; calles 11 y 12,
mGMOP3-IFN-mGMOP nativo y deglicosilado.
4. CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE GLICOISOFORMAS
Las variantes O-glicosiladas presentaron homogeneidad en los patrones de isoformas
comparadas con una proteína altamente N-glicosilada, observándose un enriquecimiento
en la región ácida. Además, se observó que conforme se aumentó el número de etiquetas
peptídicas mGMOP, se produjo la disminución del punto isoeléctrico, lo que podría ser
debido a un mayor contenido de ácido siálico.
Figura 5. Análisis del perfil de glicoisoformas de variantes de hIFN-α2b. Calle 1, IFN wild type; calle 2,
mGMOP-IFN; calle 3, mGMOP2-IFN; calle 4, mGMOP3-IFN; calle 5, mGMOP2-IFN-mGMOP; calle 6,
mGMOP3-IFN-mGMOP; calle 7, una variante de hIFN-α2b altamente N-glicosilada (IFN4N).
5. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA IN VITRO
La actividad biológica in vitro de IFN-α2b y sus derivados fue evaluada midiendo:
A- el efecto antiviral citoprotector en células MDBK infectadas por el virus de la estomatitis
vesicular (VSV)
B- el efecto antiproliferativo sobre el crecimiento de células de la línea Daudi
Actividad Biológica Específica in vitro (UI/ng)
Variante hIFN-α2b* mGMOP-IFN mGMOP2-IFN mGMOP3-IFN mGMOP2-
IFN-mGMOP
mGMOP3-
IFN-mGMOP
Antiviral 200 ± 20 240 ± 40 170 ± 70 71 ± 15 70 ± 20 50 ± 20
Antiproliferativa 150 ± 20 100 ± 20 30 ± 20 12 ± 6 2 ± 1 8 ± 4
Tabla 1. Actividades específicas antiviral y antiproliferativa in vitro de las variantes de hIFN-2b
* Valor reportado para rhIFN-2b producido en células CHO-K1. [Ceaglio et al. Novel long-lasting interferon alpha
derivatives designed by glycoengineering. Biochimie, (2008) Vol. 90 (3): 437-449]
Todas las variantes de IFN retuvieron en mayor grado la actividad antiviral con respecto a
la antiproliferativa, ambas evaluadas in vitro; aunque en las dos situaciones, en general, se
observó disminución de la actividad en forma concomitante con el número de etiquetas
fusionadas. Sin embargo, es ampliamente conocido que la actividad in vitro generalmente
no refleja la eficacia in vivo de un agente bioterapéutico.
6. ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD TÉRMICA
Se determinó la actividad biológica antiviral residual de las variantes mGMOP luego de ser
sometidas a temperaturas entre 25 °C (control) y 95 °C. Para cada variante se determinó la
temperatura a la que su actividad inicial a 20 °C disminuye al 50% (Tm).
Variante Tm (°C)
mGMOP-IFN 60,8
mGMOP2-IFN 63,8
mGMOP3-IFN 63,8
mGMOP2-IFN-
mGMOP 69,0
mGMOP3-IFN-
mGMOP 67,1
Tabla 2. Valores de Tm para las variantes mGMOP
Figura 6. Análisis de la estabilidad térmica de las variantes
de hIFN-α2b.
Todas las proteínas retuvieron, en promedio, el 100% de actividad biológica antiviral en el
rango de temperaturas entre 25 °C y 55 °C. La incubación a temperaturas mayores provocó
una pérdida gradual de la actividad biológica. Para la variante mGMOP-IFN, se observó una
pérdida total de actividad luego de la incubación a 65 °C. No obstante, el agregado de 2 o
más etiquetas permitió incrementar su estabilidad térmica, obteniéndose una Tm superior.
7. EVALUACIÓN FARMACOCINÉTICA DE LAS NUEVAS VARIANTES DE hIFN-α2b
La evaluación de los parámetros farmacocinéticos de las quimeras mGMOP/IFN en animales de experimentación se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de la presencia de los O-
glicanos sobre el tiempo de vida media en circulación y la velocidad de depuración de las mismas. A partir de los resultados obtenidos se graficaron los perfiles farmacocinéticos y se
calcularon los parámetros Cmáx, Tmáx, t1/2, CLapp y AUC.
CONCLUSIONES
Molécula Cmáx
(UI.ml-1)
Tmáx
(h)
t1/2
(h)
AUC
(UI.h.ml-1)
CLapp
(ml.h-1)
mGMOP-IFN
60 ± 20
6,4 ± 0,6
9 ± 1
1500 ±
300
140 ± 20
mGMOP2-IFN
50 ± 10
6 ± 1
10 ± 2
1070 ± 60
190 ± 10
mGMOP3-IFN
90 ± 10
6 ± 1
10 ± 1
2600 ±
100
78 ± 4
mGMOP2-IFN-
mGMOP
110 ± 10
10 ± 1
21 ± 4
4400 ±
300
46 ± 3
mGMOP3-IFN-
mGMOP
140 ± 50
9 ± 1
34 ± 4
5700 ±
600
35 ± 4 Figura 7. Perfiles farmacocinéticos de las quimeras
mGMOP-IFN.
Tabla 3. Parámetros farmacocinéticos de las variantes mGMOP-IFN.
Los perfiles farmacocinéticos resultaron notablemente
mejorados como consecuencia de la estrategia de
O-glicoingeniería aplicada.
El clearance aparente disminuyó de forma concomitante con
el número de etiquetas fusionadas.
Además, las variantes hiperglicosiladas
(mGMOP2-IFN-mGMOP y mGMOP3-IFN-mGMOP) mostraron
un tiempo de vida media 2 y 4 veces mayor, y un clearance 3
y 5 veces menor que la variante con una sola etiqueta
peptídica mGMOP.
Como conclusión general del trabajo, la fusión de múltiples unidades del péptido mGMOP a los extremos amino y/o carboxilo de una proteína constituye una estrategia de glicoingeniería
muy atractiva que permite incrementar el grado de O-glicosilación y, como consecuencia, mejorar las propiedades farmacocinéticas de proteínas con corta vida media en circulación como
hIFN-α2b. El péptido mGMOP constituye una valiosa herramienta para el desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de proteínas recombinantes terapéuticas con
mejores propiedades biológicas.
Generación de las
líneas
recombinantes
mediante
transducción
lentiviral de células
CHO-K1
Producción en
condiciones de
adherencia
Cuantificación
por ELISA
Sándwich
indirecto
Purificación por
inmunoafinidad
(mAb anti- hIFN-
α2b)
1. Generación de las variantes de hIFN-α2b 2. Perfiles de masa molecular
5. Actividad Biológica in vitro 6. Estabilidad Térmica 7. Farmacocinética
4. Perfiles de glicoisoformas
CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA
3. Presencia de O-glicanos
CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA
SDS-PAGE y
posterior tinción
con Coomasie
Blue
Deglicosilación
enzimática y
evaluación por
SDS-PAGE
Isoelectroenfoque.
Rango de pH: 3,5-
5,5
Evaluación de
Actividad
Antiviral y
Antiproliferativa
Incubación a
diferentes
temperaturas.
Rango: 25-95 °C
Evaluación en
ratas Wistar
por vía
subcutánea