Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 2. Isozymy
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 9 . Restrikční metody
description
Transcript of Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 9 . Restrikční metody
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice
rostlin
9. Restrikční metody
Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011
Restrikční metody - úvod
Restrikční metody
využívají restrikční enzymy – endonukleázy (RE) variabilita tvořena štěpením DNA - vznikající fragmenty vykazují
délkový polymorfizmus = elektroforetický banding pattern
zejména před nástupem sekvenování DNA, nebo pro analýzu většího množství vzorků
RFLP, PCR-RFLP, T-RFLP – základem je Restriction Fragment Length Polymorphism
Restrikční metody - úvod
Restrikční endonukleázy (RE) skupina enzymů štěpící DNA - působí uvnitř dsDNA (× exonukleázy: štěpí
DNA od konců, např. Exonuclease I – odstraňování PCR primerů před sekvenací)
rozeznávají specifický sekvenční motiv (4-8 párů bází), často tzv. palindrom:
např. EcoRI:
délka motivu ovlivňuje pravděpodobnost výskytu daného restrikčního místa v genomu:
4-base cutters: 44 = restrikční místo v Ø na každých 256 bp
8-base cutters: 48 = restrikční místo v Ø na každých 65536 bp
5´- nnnnnnnnGAATTCnnnnnnnn - 3´
3´- nnnnnnnnCTTAAGnnnnnnnn - 5´
Restrikční metody - úvod
Restrikční endonukleázy (RE) restrikčně-modifikační systém bakterií - obrana proti virům
názvy odvozené od bakterií, ze kterých byly vyizolované
isoschizomery: enzym izolovaný z jiné bakterie, ale rozeznává stejnou cílovou sekvenci
např. XmnI: isoschizomery PdmI, Asp700I, MroxI
Restrikční metody - úvod
Restrikční endonukleázy (RE)
5´- nnnnnnGATCnnnnnn - 3´
3´- nnnnnnCTAGnnnnnn - 5´
▼
▲
5´- nnnnnn - 3´ 5´- GATCnnnnnn - 3´
3´- nnnnnnCTAG - 5´ 3´- nnnnnn - 5´
MboI+
kohezivní konce (sticky ends): 5´ overhangs
5´- nGACCGAnnnnnnnnnnnnn - 3´
3´- nCTGGCTnnnnnnnnnnnnn - 5´
▼
▲
TaqII
kohezivní konce (sticky ends): 3´ overhangs
5´- nGACCGAnnnnnnnnnnn - 3´ 5´- nn - 3´
3´- nCTGGCTnnnnnnnnn - 5´ 3´- nnnn - 5´+
5´- nnnnnnnnAGCTnnnnnnnn - 3´
3´- nnnnnnnnTCGAnnnnnnnn - 5´
5´- nnnnnnnnAG - 3´ 5´- CTnnnnnnnn - 3´
3´- nnnnnnnnTC - 5´ 3´- GAnnnnnnnn - 5´
▼
▲
AluI+
tupé konce (blunt ends)
štěpí mimo vlastní rozeznávanou sekvenci
Restrikční metody: PCR-RFLP
PCR-RFLP (CAPS = Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)
detekce sekvenční variability pomocí restrikčních enzymů + využívá výhody PCR - stačí málo startovací genomové DNA
např. rozlišení sekvenčně odlišných druhů (nebo haplotypů) na základě výsledného banding patternu restrikce
PCR amplifikace konkrétního úseku DNA (případně lze pro zvýšení variability v multiplexu naamplifikovat více úseků najednou)
restrikce jedním nebo více enzymy generuje délkovou variabilitu fragmentů
jak vybrat vhodný restrikční enzym?
• dříve naslepo zkoušeny dostupné RE, vybrány ty co generují variabilitu banding patternu
• nebo nejdříve osekvenovat, a pak přímo vybrat RE cílený na dané variabilní místo (místa) → někdy se zjistí, že pro dané variabilní místo neexistuje enzym...
Restrikční metody: PCR-RFLP
PCR-RFLP – jak vybrat restrikční enzym:
např. v programu BioEdit: vybrat konkrétní sekvenci → Sequence → Nucleic Acid → Restriction Map
druh A
druh B
Restrikční metody: PCR-RFLP
PCR-RFLP - vlastní provedení:
restrikční reakce: s enzymy pracovat na ledu, respektovat manuál od výrobce! u některých enzymů lze štípat přímo PCR produkt, u jiných je potřeba
PCR produkt před restrikcí purifikovat PCR clean-up kitem ~0.1-1 µg PCR produktu + 5-20 U restr. enzymu + příslušný reakční
pufr daného enzymu enzymy se liší optimální teplotou restrikce: 37° nebo 65° inkubace (1-)4 h (-přes noc) některé enzymy poté možné tepelně inaktivovat (80-85° - 15 min) pozor na star activity - nespecifické štěpení i mimo cílové oblasti RE:
• míru SA lze zjistit v např. materiálech od výrobce, způsobena např. nevodným reakčním pufrem
• někdy problém, když se produkt v 1 reakci štěpí více enzymy, které se liší optimálním reakčním pufrem
Restrikční metody: PCR-RFLP
PCR-RFLP - vlastní provedení:
vizualizace na PAA nebo agarozovém gelu (1.5-3% agaróza, post-staining)
• agaróza - designovat tak, aby nejmenší fragmenty byly alespoň (50-)100 bp, menší fragmenty jsou obtížně detekovatelné, případně
splývají s dimery PCR primerů
• PAA - daleko větší senzitivita, teoreticky rozliší 1bp rozdíly v délce
PCR-RFLP agarozový gel: cpDNA úsek (rpoC1), enzym PdmI, Spergularia echinosperma a S. rubra – Pavel Kúr
nedoštípaný původní PCR produkt
kratší fragmenty jsou vždy méně intenzivní (protože mají méně bází které můžou svítit na gelu)
s čím počítat při interpretaci:
S. echinosperma S. rubra
nespecif. PCR produkty (ne produkty restrikce!)
dimery primerů (ne produkty restrikce!)
Restrikční metody: PCR-RFLP
Lihová J., Kochjarová J., Marhold K. (2007): Hybridization between polyploids Cardamine enneaphyllos and C. glanduligera in the West Carpathians: evidence from morphology, pollen fertility and PCR-RFLP patterns. – Preslia 79: 101-125.
jaderná rDNA (ITS): aditivní pattern u hybridů (kombinuje bandy z obou rodičů)
cpDNA: hybridi s patterny obou druhů = obousměrná hybridizace(jako ♀ rostliny při hybridizaci C. enneaphylos i C. glandulifera)
Hybridizace Cardamine enneaphyllos a C. glandulifera
Restrikční metody: PCR-RFLP
Výhody PCR-RFLP ušetření peněz za sekvenaci → umožňuje analyzovat relativně velký
počet vzorků kodominantní (u biparentálně děděných markerů – tj. neplatí u cpDNA)
Nevýhody PCR-RFLP nemusí existovat vhodný enzym menší detekční schopnost:
• nemusí odhalit jinou sekvenční variabilitu než cílová místa použitého enzymu
• odlišné sekvence vygenerují identický banding pattern (pokud se liší v oblastech mimo cílové místo enzymu)
Restrikční metody – studie společenstev
Využití restrikčních enzymů při studiu společenstev
např. pro molekulární studie složení společenstev mikroorganismů
mykorrhizní společenstvacyanobacterial mats
Restrikční metody – studie společenstev
Využití restrikčních enzymů při studiu společenstev
1. Izolace celkové DNA vzorku
↓
2. PCR amplifikace úseku, který slouží jako marker
(= umožňuje rozlišit taxony společenstva, primery specificky amplifikují pouze zkoumanou tax. skupinu; prokaryota – 16S, eukaryota – LSU, SSU
nrDNA)
klonování PCR produktu:
1 klon = 1 molekula PCR prod. = informace z 1 jedince společenstva
sekvenace klonů, nebo jejich PCR-RFLP analýza PCR-RFLP jednotlivých klonů: každý unikátní banding
pattern hodnocen jako samostatný ´druh´, případně možné klony dodatečně ověřit/analyzovat sekvenací
↓
3. Analýza směsi molekul PCR produktu
× stále urč. liminace rozsahu analýzy: na 1 vzorek reálné analyzovat desítky až stovky klonů
Restrikční metody – studie společenstev
Využití restrikčních enzymů při studiu společenstev
klonování PCR produktu:
1 klon = 1 molekula PCR prod. = informace z 1 jedince společenstva
sekvenace klonů, nebo jejich PCR-RFLP analýza
T-RFLP:PCR produkt fluorescenčně značen, štěpen exonukleázami a vizualizován fragmentační analýzou
1. Izolace celkové DNA vzorku
↓
2. PCR amplifikace úseku, který slouží jako marker
(= umožňuje rozlišit taxony společenstva, primery specificky amplifikují pouze zkoumanou tax. skupinu; prokaryota – 16S, eukaryota – LSU, SSU
nrDNA)↓
3. Analýza směsi molekul PCR produktu
Restrikční metody – studie společenstev
fragmenty denaturovány zahřátím a formamidem → vznik ssDNA fragmentů → separace a vizualizace T-RFs fragmentační analýzou (FA) v kapilárním sekvenátoru
Princip T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)
1. PCR s fluorescenčně značenými primery – ideálně oba primery a každý jinou barvou
štěpení restrikčními endonukleázami - když se použijí oba primery značené, z 1 molekuly templátu vznikají 2 různě obarvené terminální fragmenty – T-RFs
(píky – produkty primerů značených modrou a zelenou barvou)
RE
FA
(´vnitřní´ fragmenty nenesou fluor. barvivo → nebudou detekovány)
Restrikční metody – studie společenstev
Optimalizace a úskalí T-RFLP
nejdříve nutné zvolit vhodně variabilní marker (úsek pro PCR amplifikaci):
• optimální je otestovat více různých úseků, klonovat a sekvenovat produkty jejich amplifikace na vlastních cílových vzorcích
• případně použít sekvence z databází jak vybrat vhodný RE?
• opět na základě klonovaných sekvencí, in silico testovat více enzymů
ideální je převzít již publikovanou metodiku (primery + RE atd.) fungující pro dané studované společenstvo... (např. 16S pro bakterie)
Restrikční metody – studie společenstev
Optimalizace a úskalí T-RFLP PCR bias: některé molekuly se snadněji (preferenčně) amplifikují, pro
omezení bias se doporučuje minimalizovat počet PCR cyklů (pozn.: platí i pro analýzu klonováním)
pseudo-T-RFs: artefaktní jednovláknové molekuly, tvoří píky při fragment. analýze
• někdo pro jejich odstranění před fragment. analýzou prosazuje ošetření vzorku Mung Bean exonukleázou (selektivně rozštěpí ssDNA)
radši nepoužívat endonukleázy které tvoří 5´ overhangs – fragmenty mohou být nekonzistentně ovlivněné zbytkovou aktivitou PCR polymerázy → víc artefaktních píků:
5´- nnnnnn - 3´3´- nnnnnnGA - 5´
5´- nnnnnnCT - 3´3´- nnnnnnGA - 5´
5´- nnnnnnC - 3´3´- nnnnnnGA - 5´
5´- nnnnnn - 3´3´- nnnnnnGA - 5´
5´- nnnnnn - 3´3´- nnnnnnGA - 5´
5´- nnnnnn - 3´3´- nnnnnnGA - 5´
+C´ +CT
Taq polymerase
Restrikční metody – studie společenstev
Hodnocení T-RFLP dat
nutné stanovit tzv. bins – rozmezí velikosti fragmentu (bp), píky v daném intervalu hodnoceny jako T-RF - ´druh´
• názory na optimální šířku binů různé
• ideálně ověřit konzistenci píků - replikáty
př.: bin width ±1 bp
vytvoření binární matice přítomnosti/absence každého konkrétního T-RF (0/1 data)
některé studie využívají i kvantitativní přístup - odhad četnosti T-RFs z výšky píku
´druhová´ data – ordinační metody, indexy diverzity apod.
Restrikční metody – studie společenstev
Výhody T-RFLP detekuje i nízce abundantní ´druhy´ (ale problém thresholdem – co
ještě považovat za pík) citlivější než běžná RFLP – rozliší délkový polymorfizmus v počtu
jednotl. bází levnější a časově úspornější než klonování pravděpodobně přináší více informace
Neýhody T-RFLP detekované píky - ´druhy´ jsou anonymní, prakticky je nelze dále
sekvenovat podobně jako u ostatních RFLP metod může odlišná sekvence
generovat stejný pattern + metoda nemusí rozlišit všechny sekvenční typy
předpokladem je, že analyzované patterny skutečně pochází ze studované skupiny (značné požadavky na specifitu primerů)
Studie společenstev - DGGE
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, nerestrikční metoda)
PCR produkt přímo analyzován na denaturačním PAA gelu s gradientem močoviny nebo formamidu
jednotlivé sekvenční typy separovány na základě odlišnosti vlastní sekvence - GC obsah ovlivňuje rychlost denaturace
bandy lze z gelu vyříznout a přímo sekvenovat