MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES.
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MÉTODOS PARA
DIAGNÓSTICO
IMUNOLÓGICO DE
PARASITOSES
AMOSTRA
• A amostra a ser colhida para o
teste imunológico dependerá
do sítio de infecção do
parasita e do tipo de teste
utilizado.
• Ex.: soro, líquor, urina, fezes,
tecidos etc.
• Na maioria dos testes,
trabalha-se com diluições
(seriadas ou não) das
amostras títulos
Formação de agregados visíveis como resultado da interação de Ac
específicos e partículas insolúveis que contenham determinantes Ag em
sua superfície.
Pode ocorrer em:
partículas que apresentem Ag naturais de superfície (hemácias,
bactérias, protozoários) – aglutinação direta
partículas inertes (látex) ou com células antigenicamente não
relacionadas, às quais se adsorvem ou se fixam Ag solúveis –
aglutinação indireta
Hemaglutinação
Aglutinação do látex
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO• Testa Ac IgG e IgM
• Hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, fixadas com
formaldeído ou glutaraldeído, sensibilizadas com o Ag
(polissacarídicos ou protéicos)
• Suspensão das hemácias em solução estabilizadora para evitar
reações inespecíficas
• Adição do soro em diluições progressivas
Teste positivo: formação de tapeteTeste negativo: formação de botão
TESTE DE AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
• Usado na detecção de Ag ou Ac
• Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser usadas
como suportes na adsorção de proteína solúvel a Ag polissacarídeos polissacarídeos
A ligação Ag-Ac promove a fixação do complemento, cujo consumo (in vitro) pode ser empregado para detecção de Ac, Ag ou ambos. O teste é realizado em duas etapas:
fixação do complemento: Ag incubado com Ac na presença de uma quantidade definida de complemento. Se Ag e Ac correspondentes estiverem presentes, há ativação da cascata do complemento e haverá consumo do complemento
adição do revelador da reação: hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (Ac anti-hemácia de carneiro obtido em coelhos)
A medida da atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite detectar a presença de Ag ou Ac na mistura inicial e sua quantidade.
REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
1. fixação do complemento 2. revelação da reação
Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem a Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem a
fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag. fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag.
Fluorocromos: substâncias que, quando excitadas com luz UV,
absorvem luz de um comprimento de onda menor e,
instantaneamente, emitem luz de comprimento de onda maior
(fluorescência).
• Teste de Imunofluorescência Direto:: usado geralmente usado geralmente
para detectar a presença do Ag em uma amostra clínica. para detectar a presença do Ag em uma amostra clínica.
• Teste Imunofluorescência Indireto: usado para detectar a usado para detectar a
presença, no soro, de Ac específicos. presença, no soro, de Ac específicos.
TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
Imunofluorescência Indireta (IFI)
IFI positivo para T. cruziIFI para T. gondii: (A)
positivo e (B) negativo
A
B
IF positivo para G. duodenalis
Ag
reação Ag-Ac monitorada por medida da atividade enzimática
(peroxidase).
leitura visual ou fotométrica, com substratos coloridos, fluorescentes
ou luminescentes.
para a peroxidase o substrato é o H2O2 e os cromógenos:
ortofenilenodiamina, ácido 5-amino salicílico, ortotoluidina etc , que
serão oxidados originando um produto solúvel e colorido. originando um produto solúvel e colorido.
ELISA Direto: detecta Ag
ELISA Indireto: detecta Ac
TESTE DE ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ELISA indireto
ELISA direto (ELISA “sandwich”)
Interpretação dos resultados:
• leitura visual• espectrofotômetro
(absorbância)
PARÂMETROS
SOROLÓGICOS
SENSIBILIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente
positivos em indivíduos comprovadamente infectados
ESPECIFICIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente
negativos em indivíduos comprovadamente sadios
EFICIÊNCIA: concordância dos resultados verdadeiros positivos e
negativos em indivíduos com e sem infecção
VALOR PREDITIVO POSITIVO: probabilidade do resultado
positivo ser verdadeiramente positivo
VALOR PREDITIVO NEGATIVO: probabilidade do resultado
negativo ser verdadeiramente negativo
indivíduosresultado
infectados não infectados total
positivoverdadeiro
positivo(VP)
falso positivo(FP)
VP + FP
negativofalso negativo
(FN)
verdadeiro negativo
(VN)FN + VN
total VP + FN FP + VN VP + FP+ FN + VN
SENSIBILIDADE (S) = VP / total infectados
ESPECIFICIDADE (E) = VN / total sadios
EFICIÊNCIA (Ef) = VP + VN / total indivíduos
VALOR PREDITIVO POSITIVO (VPP) = VP / total resultados positivos
VALOR PREDITIVO NEGATIVO (VPN) = VN / total resultados negativos
Variação da sensibilidade e especificidade do teste de acordo
com o cut-off
Influência da prevalência nos valores preditivos
Variação dos valores preditivos dependendo da
prevalência
exercícios