Metodos Instrumentales de Analisis
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MÉTODOS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS
APLICACIONES BIOLÓGICAS
CROMATOGRAFIA
INTRODUCCION A LAS SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS
Características básicas de análisis químico Sensible Selectivo Específico (pocos casos)
DESCRIPCION GENERAL
Mikhail Tswett1906
CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)
Las primeras “unidades cromatográficas” de M. Tswett para el análisis de pigmentos vegetales.
CLASIFICACION
Sgn. la manera en que la fase movil y la fase estacionarias se ponen en contacto Cromatografia en columna (FM: liquido, gas, fluido
supercritico) Cromatografia plana (FM: liquido)
Sgn. tipo de fase movil y estacionaria, y los procesos de transferencia de los solutos entre las fases Cromatografia de liquidos (FM: liquido) Cromatografia de gases (FM: gas) Cromatografia de fluidos supercriticos (FM: fluido
supercritico)
Cromatografia en columnaBlas. Gral. F. Movil F. Estacionaria Fenomeno de interaccion
LC Liquido L-L Distribucion entre liquidos inmiscibles
L-fase enlazada Distribucion entre liquido y superficie enlazada
L-S Adsorcion
Intercambio ionico Intercambio ionico
Exclusion por tamano
Distribucion / Exclusion
L-receptor Adsorcion por afinidad
GC Gas G-L Distribucion entre gas y liquido
G-fase enlazada Distribucion entre gas y superficie enlazada
G-S Adsorcion
SFC Fluido supercritico
Distribucion entre fluido supercritico y superficie enlazada
BASES DE LA SEPARACION
Fig. 3.1 y 3.2 Q
Interacciones posibles que condicionan la afiniadad de los distintos componentes Hidrofobicas Hidrofilicas Puente hidrogeno Dipolares Electrostaticas
Constante de distribucion:
MCC
K Am
Ae
A ;
NOMENCLATURA
Cromatograma Linea de base Volumen de elucion: Vi
Tiempo de retencion: tRi
Tiempo de retencion corregido: t’Ri=tRi-t0
Volumen de F. Movil: V0
Tiempo de elusion de F. Movil: t0
Fig 3.4 q
VELOCIDAD DE MIGRACION DE LOS COMPONENTES
Velocidad lineal media:
Velocidad lineal media del analito:
Factor de capacidad: k’i
Relacion entre K y tR
Relacion entre k’ y vel. lineal
Factor de selectividad:
min;
cmtL
R
v
min0
; cm
tL
u
m
e
V
VK
uv
1
1
0
0'
t
ttk R
'
'
A
B
kk
'1
1
kuv
CARACTERIZACION DE k’ y k’
K’ adecuado: 2-10 (pocos analitos) 0,5-20 (muchos analitos)
Ajustes de k’ mediante fuerza de elusion de F. Movil: modificacion de la proporcion del solvente de F. Movil de mayor afinidad con los analitos
Cambio en la proporcion del componenete activo de la F. Movil
referencia: 1 depende de la afinidad del
analito con la F. Movil y la F. Estacionaria
Ajustes de a variando la interaccion entre el analito-F. Movil-F. Estacionaria: Cambiando componente
activo de la F. Movil (MeOH, ACN)
Variacion de pH de F. Movil
Agregados de aditivos Cambio de Fase
estacionaria
ENSANCHAMIENTO DE BANDA – EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Numero de platos teoricos: N
Altura de plato teorico: H Sgn. Martin y Synge
(picos gausianos simetricos)
Sgn. Foley y Dorsey (picos gausianos asimetricos)
Fig 3.5 y 3.7Q
2
5,0
'2'
545.5;16
W
tN
W
tN RR
H
LN
25.17.41
2
1,0
AB
Wt
N
R
FACTORES QUE AFECTAN A H Y N
PROPIO DE COLUMNA Particulas de la F.
Estacionaria Diametro Morfologia Calidad de particula
Empacamiento de la F. Estacionaria Calidad Envejecimiento Canales (producido por
golpes)
EXTERNO A COLUMNA Tuberias
Longitud Diametro
Detector Volumen Geometria
Geometria del pico Anterior Posterior
UTILIDAD DE N Y H
Comparacion de materiales y metodos bajo iguales condiciones de trabajo
Optimizacion de metodo analitico Control de idoneidad de un metodo analitico Control del estado de la columna durante su vida util
PROCESOS DE ENSANCHAMIENTO DE BANDAS
Ensanchamiento de banda intracolumnar (H) Caudal de fase movil Difusion longitudinal Resistencia a la transferencia de masas en la F.
Estacionaria Resistenca la transferencia de masas en la F. Movil Proceso multipasos
Ensanchamiento de banda extracolumnar (2) Detector Volumen de las partes del cromatografo entre el
inyector y el detector Volumen de inyeccion
Ensanchamiento de banda intracolumnarCaudal de fase movil
Magnitud de efectos cineticos dependen del tiempo de contacto entre FE y FM
Los Hmin para LC se dan a caudales menores que para GC debido a los caudales de trabajo
En general HLC<HGC
Longitud de columnas de LC<<GC => eficiciencia GC>>LC
Fig 24.7 SL
Ensanchamiento de banda intracolumnar
Difusion longitudinal
Difusion de analitos desde zonas mas concentradas a mas diluidas
El ensanchamiento long. se produce en la direccion del flujo de la FM
A > u < tiempo de residencia del analito < difusion
B/uL 0; B/uG>0
Fig 24.7 SLu
Dk
u
B MD2
Ensanchamiento de banda intracolumnarCoeficientes de trasferencia de masa (CE y CM)
El equilibrio de particion entre las dos fases es MUY LENTO por lo que siempre se trabaja fuera del equilibrio. Las moleculas mas afectadas son las que se encuentran en el frente o cola de la banda.
Los analitos necesitan tiempo para difundir desde el interior de las fases hasta la interfase donde se produce el reparto
El ensanchamiento long. se produce perpendicular a la direccion del flujo de la FM
Ensanchamiento de banda intracolumnar Transferencia de masas en la F. Estacionaria
L-L: CE es directamente proporcional al cuadrado del espesor de pelicula inmobilizada e inversamente proporcional a la velocidad de difusion del analito
L-S: CE es directamente proporcional al tiempo necesario para adsorberse/desorberse de la superficie solida e inversamente proporcional a la constante de velocidad de primer orden con que se da este proceso
E
fE Dk
udqkuC
L 2'
2'
)1( 2'
'
)1(
2
k
uktuC D
ES
Ensanchamiento de banda intracolumnaTransferencia de masas en la F. Movil
Proceso muy complejo. Solo se conocen las variables que lo gobiernan. Velocidad de transferencia de masa: Inversamente proporcional a la velocidad de difusion
del analito en la fase movil Directamente proporcional al cuadrado del diametro
de la particula de la soporte solido Directamente proporcional a la velocidad lineal de la
F. Movil
uD
udfuC
M
pM
),( 2
Ensanchamiento de banda intracolumnaDifusion de Eddy (proceso multipaso)
Multitud de caminos posibles por donde puede atravesar el analito. A u > nro de transferecia de caminos por lo que la
velocidad analito tiende velocidad media A umod < nro de transferecia de caminos por lo que habra
mayor ensanchamiento de banda A u el efecto de ensanchamiento de banda por multiplicidad
de caminos es independiente del caudal.
Fig 24.8 SL y 3.8 Q
Ensanchamiento de banda intracolumna Difusion de Eddy
Fracciones de F. Movil estancada en fase estacionaria: el analito debe difundir de los liquidos estancados antes que pueda producirse la transferencia con la F. Movil en movimiento y la F. Estacionaria: Fenomeno directamente proporcional u Fenomeno inversamente proporcional a la DM
Fenomeno directamente proporcional al diametro de particulas debido a que aumenta el tamano de poro
Ensanchamiento de banda intracolumnarEcuacion de Van Deemter
Variable influyentes en el ensanchamiento de bandas Diametro de particulas Viscosidad de la F. Movil Diametro de columna Mejor empacamiento de
columna Temp.: reduce D Grosor de la F.
Estacionaria
Fig. 24.9 y24.10 SL
uCuCu
BH ME
Ensanchamiento de banda extracolumnar
Dispersion del pico: T2
En la T2, ec
2 es constante. Esto implica que el ec2 es mas
relevante: Para picos poco retenidos H pequenos Menor radio de la columna
porosidadHLr TTic
inyeccionectorunionestuberiaicT
ecicT
:;)( 222
22det
2222
222
Ensanchamiento de banda extracolumnarDetector
Contribuciones: Componenete hidraulicos:
Tuberia y uniones: Longitudes minimasDiametros minimos
Volumen de celda: 1/10 volumen del pico Geometria de celda: tal que evite turbulencias
Componente electronico Constante de tiempo (): 10% W½
muy pequena (rta. rapida): senal ruidosamuy elevada (rta. lenta): perdida del pico,
aplastamiento o confusion con el adyacente
Ensanchamiento de banda extracolumnarVolumen de partes del cromatografo (inyector –
detector); Volumen de inyeccion
Volumen de partes del cromatografo (inyector –detector) Longitudes y diametros de tuberias y conexiones minimos Efecto menos notorios para picos con k’ elevados
Volumen de inyeccion: Viny.max.
2=(Kr2)2HL incremento de variancia permitido (5%) K: cte. Dependiente del perfil de inyeccion (K2=12, perfil de
inyeccion normal) Valores recomendados:
Dolan: 1/6 volumen del pico de interes Novotny: 17 l, col. Convencionales y 1.7 l para col.
microbore
OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA Finalidad: lograr separacion de analitos en el menor
tiempo posible mediante: Reduccion de ensanchamiento de picos: H Modificacion de la velocidad relativa de migracion: y
k’ Resolucion: medida cuantitativa de la capacidad de
separacion R=1,5: separacion completa de 2 analitos R=0,75: separacion incompleta de 2 analitos
Fig 24.11 SL
22BA WW
zR
OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA
Influencia de la R sobre el tB
Efectos cineticos que contribuyen al ensanchamiento de bandas
Termino de selectividad que depende del analito Termino dependiente del analito y la columna Factores termodinamicos que no dependen de N ni L
Influencia de k’ y sobre R
4
1
1'
' N
k
kR
B
B
2
2'
3'2
1
116
B
BB
k
k
u
RHt
OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA
Efecto de la variacion de k’ sobre R
Qk
kR
B
B
1'
'
3
2'
'' 1
B
BB
k
kQt
Orden de variacion:
1. N
2. k’
3.
APLICACIONES: ANALISIS CUALITATIVO
Mediante identificacion de picos En función datos cromatograficos solamente
Tiempo de retencion Grafica de Log tR vs. Nro. de atomos de carbono Indice de Kovats Multiples columnas Respuesta de dectores relativas Pretratamiento de muestra Cromatografias secuenciales
En función datos cromatograficos y otros datos Analisis de grupos funcionales y elementales Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas Retencion de picos
Sin identificacion de picos
ANALISIS CUALITATIVO En función de tiempo de retencion
Principios fundamentales de la identificacion
1. Si el tR de un componenete A es igual al del componenete desconocio, esto no prueba que el compuesto desconocido es el componente A
2. Si el tR de un componenete A no es igual al del componenete desconocio, esto prueba que el compuesto desconocido no es el componente A
3. Si no se observa ningun pico al tR del compuesto A, esto prueba que el componente A no esta presente en la muestra, al menos a los niveles de deteccion de la tecnica
Factores a tener en cuenta en la precision de los datos
Control de temperatura 1% repetividad en tR, debe mantenerse la T en ± 0.3
oC Control de flujo del F. Movil
1% de variacion de flujo afectara 1% el tR
Volumen de inyeccion Sobrecarga varia los tR
Empaque, cantidad de F. Estacionaria, antigüedad, usos previos, etc.
ANALISIS CUALITATIVO En función de tiempo de retencion
tr = f(condiciones experimentales)Comparación anlito y compuesto de referencia analizado igual
condicionesMás aconsejable añadirlo a la mezcla
Cpto noretenido
Cpto referencia
Analito
tm tR(S)tR(a)
tR’ = tR - tm
r(a,s) = t’R(a)/t’R(s)
ANALISIS CUALITATIVO En función de tiempo de retencion
Basada en la dependencia lineal entre entre Log tR y Nro. de atomos de carbono de una serie homologa
Sencilla de armar: basta con 2 puntos Fig 7.3, pag399,Grob
ANALISIS CUALITATIVO En función de grafica de Log tR vs. Nro. de atomos de carbono
ANALISIS CUALITATIVO En función de Indice de Kovats
Basado en una serie normal de alcanos como referencia Teoria:
A: anlitoN y n: nro. de C alcanos
VA’: volumen de eluc. de A corregido Practica: requerimientos
Al menos 3 alcanos de serie homologa Al menos uno eluira antes y el otro luego del analito A
Fig 7.4 400 Grob
''
''
loglog
loglog100100
Nn
NA
VV
VVNI
El uso de 2 o mas columnas incrementa la probabilidad de acertar la identificacion de un pico desconocido, pero no es conclusivo
Las columnas deben ser diferentes basadas en los indices de Mc Reynolds
La caracterizacion se basa en el indice de retencion relativo del pico desconocido
Tambien debe corresponder la caracterizacion cuantitativa del pico desconocido con las distintas columnas
ANALISIS CUALITATIVO En función de multiples columnas
ANALISIS CUALITATIVO En función de respuesta de dectores relativas
Detectores selectivos El flujo de la salida de la
columna es dividido hacia 2 o mas detectores
Cromatografia de peso molecular (GC) Basada en la senal de
dos detectores de ensidad de gas, dos columnas y dos gases de distinta densidad (Ej: CO2 y SF6)
Fig 7.5 403 Grob
12
1
12
12
AA
K
MWMWAA
K
MWGCGC
ANALISIS CUALITATIVO En función de cromatografias secuenciales
Cromatografia bidimensional Precolumnas de retencion Precolumnas de reaccion Pirolisis controlada (GC)
Analisis de grupos funcionales y elementales Examinacion preliminar Medicion de variables fisicas (bp, ind. de refraccion,
densidad…) Reacciones selectivas
Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas LC-ESI-MS, LC-CI-MS, LC-TOF MS, LC-AAS, LC-
ICP-OES, LC-ICP-MS…. Retencion de picos
Purge and trap
ANALISIS CUALITATIVO En función de datos cromatograficos y otros datos
Fingerprints Para identificacion de un grupo de picos No se realiza una identificacion individual del pico Basado en la apariencia general de los picos, tR vs. Conc. y la
relacion de area de picos definidos
ANALISIS CUALITATIVO Sin identificacion de picos
APLICACIONES: ANALISIS CUANTITATIVO
Normalizacion de areas Estándar externo
Sin agregado de estándar interno Con agregado de estandar interno
ANALISIS CUALITATIVO
Tiempo de retencion Grafica del Log tR vs. Numero de carbono Indices de Kovats Multiples columnas Respuesta de diferentes detectores Pretratamiento de muestra Cromatografia en serie
Analisis cuantitativo Rapidez Simplicidad Costo bajo Gran aplicabilidad Informacion cuantitativa
APLICACIONESAnalisis cuantitativo
Calibracion baseada en: Altura de pico Area de pico
Metodos de cuantificacion: Estándar externo
Sin agregado patron Con agregado patron
Normalizacion de areas
CROMATOGRAFIA DE GASES
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Analisis de grupos funcionales y elementales
APLICACONES